módulo 8 - manual de microbiologia - anvisa

7/24/2019 Mdulo 8 - Manual de Microbiologia - ANVISA

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Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA

Mdulo 8: Deteco e identificao dosfungos de importncia mdica

MANUAL DE MICROBIOLOGIACLNICA PARA O CONTROLE

DE INFECO RELACIONADA ASSISTNCIA SADE


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Copyright 2012 Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.

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1 edio 2010

Elaborao, distribuio e informaes:

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Magda Machado de Miranda

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Projeto Grfico e Diagramao

All Type Assessoria Editorial Ltda

Ficha Catalogrfica

Brasil. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

Manual de Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade. Mdulo

8: Deteco e identificao de fungos de importncia mdica /Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Bra-

slia: Anvisa, 2013.

47p..: il.9 volumes

ISBN

1. Infeco Hospitalar Controle. 2. Infeco em Servios de Sade. 3. Microbiologia Clnica. 4. Vigilncia

Sanitria em Servios de Sade. 5. Resistncia microbiana. I. Ttulo.


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SUMRIO

A p r e s e n t a o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica . . . . . . . . . . . .7

1.1 Introduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.1.1 Fungos e infeco hospitalar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.2 Coleta, transporte e armazenamento de amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12

1.2.1 Recomendaes gerais de coleta e transporte de amostras . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.3 Processamento de amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.3.1 Exame microscpico de amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.3.2 Exame microscpico direto com hidrxido de potssio (KOH) a 20% . . . . . . . 17

1.3.3 Exame microscpico direto com tinta nanquim (tinta da China) . . . . . . . . . . . 17

1.3.4 Exame microscpico com colorao pelo mtodo de Gram . . . . . . . . . . . . . . . . 18

1.3.5 Exame microscpico com colorao pantica (Giemsa, Leishman

ou Wright) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

1.3.6 Cultura de amostras biolgicas para isolamento de fungos . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.3.7 Meios de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.3.8 Procedimentos para cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

1.4 Identificao de fungos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.4.1 Identificao de leveduras (morfolgica e bioqumica) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25

1.4.2 Prova do tubo germinativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281.4.3 Cultivo em lmina para prova de filamentao e produo de

clamidsporo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

1.4.4 Prova da urease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

1.4.5 Prova de assimilao de fontes de carbono e nitrognio ou

auxanograma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

1.4.6 Fermentao de acares ou zimograma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30

1.4.7 Mtodos comerciais para identificao de leveduras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30

1.4.8 Identificao de fungos filamentosos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30

1.4.9 Tcnica de microcultivo para fungos filamentosos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .311.4.10 Identificao de fungos dimrficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32

1.5 Descrio das principais micoses observadas no Brasil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32

1.5.1 Micoses superficiais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

1.5.2 Micoses subcutneas e profundas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

1.5.3 Micoses oportunistas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

1.6 Corantes e meios de cultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

Corante Azul de lactofenol-algodo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

1.7 Glossrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

1.8 Referncias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44


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5OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 8: Deteco e identificao dos fungos de importncia mdica

APRESENTAO

A resistncia microbiana um grave problema mundial, estando associada ao aumento dotempo de internao, dos custos do tratamento e das taxas de morbidade e mortalidade dos

pacientes. O uso indiscriminado e incorreto dos antimicrobianos na comunidade e no am-

biente hospitalar reconhecidamente um importante fator de risco para o aparecimento e a

disseminao da resistncia microbiana.

Nesse contexto, insere-se o Laboratrio de Microbiologia, que tem como objetivo no ape-

nas apontar o responsvel por um determinado estado infeccioso, mas tambm indicar,

atravs do monitoramento de populaes microbianas, qual o perfil dos micro-organismos

que esto interagindo com o organismo humano, possibilitando a indicao de tratamen-

tos mais adequados. Para o desempenho satisfatrio dessa funo, fundamental que os

laboratrios de microbiologia possuam estrutura capaz de estabelecer informaes sobre

a melhor amostra biolgica, reconhecer a microbiota e os contaminantes, identificar micro-

-organismos associados infeco ou com propsitos epidemiolgicos, obter resultados

rpidos em casos de emergncia, realizar o transporte rpido das amostras e manter uma

educao contnua em relao aos aspectos da infeco relacionada assistncia sade.

Tendo em vista esses aspectos e considerando que a microbiologia um campo muito din-

mico, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa, em cooperao com a Organiza-

o Pan-Americana da Sade OPAS, prope a terceira reviso do Manual de ProcedimentosBsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia

Sade, buscando atualizar informaes nos temas considerados essenciais e contando com

um seleto e conceituado corpo editorial. O manual composto por nove mdulos, a saber:

Mdulo 1 Biossegurana e manuteno de equipamentos em laboratrio de microbiolo-

gia clnica; Mdulo 2 Controle externo da qualidade; Mdulo 3 Principais Sndromes In-

fecciosas; Mdulo 4 Procedimentos laboratoriais: da requisio do exame anlise micro-

biolgica e laudo final; Mdulo 5 Tecnologias em Servios de Sade: descrio dos meios

de cultura empregados nos exames microbiolgicos; Mdulo 6 Deteco e identificao

de bactrias de importncia mdica; Mdulo 7 Deteco e identificao de micobactriasde importncia mdica; Mdulo 8 Deteco e identificao de fungos de importncia m-

dica e Mdulo 9 Infeces virais.

A Anvisa e a OPAS esperam com essa publicao contribuir para que os laboratrios de micro-

biologia possam assimilar e alcanar novos nveis de complexidade laboratorial, atendendo s

exigncias e caractersticas prprias de cada unidade hospitalar, alm de subsidiar a adoo

de procedimentos bsicos padronizados nesses servios.


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Captulo 1:

Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

Anglica Zaninelli Schreiber

Farmacutica - Profa. Dra .do Departamento de Patologia ClnicaResponsvel pelo Laboratrio de Investigao em Fungos - Faculdade de Cincias

Mdicas da UNICAMP

Diviso de Patologia Clnica - Setor de Micologia do

Laboratrio de Microbiologia - HC-UNICAMP

Claudia Maria Leite MaffeiMdica - Profa. Dra. do Departamento de Biologia Celular

e Molecular e Bioagentes Patognicos

Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto da Universidade de So Paulo

Laboratrio de Micologia Mdica do Hospital das Clnicas de Ribeiro Preto

Marcia de Souza Carvalho MelhemFarmacutica Bioqumica , Pesquisadora Cientfica do Instituto Adolfo Lutz

Docente do Programa de Ps-Graduao em Cincias

da Coordenadoria de Controle de Doenas

Secretaria Estadual da Sade de So Paulo

Coordenao do Captulo

Carlos Emilio LevyMdico - Prof. Dr. do Departamento de Patologia Clinica

Fac. Cincias Mdicas da UNICAMP

Diviso de Patologia Clnica - Setor de Bacteriologia - Hospital das Clnicas da UNICAMP


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OPAS/OMS Anvisa/MS8

Captulo 1: Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

1.1 Introduo

1.1.1 Fungos e infeco hospitalar

Os avanos da medicina que permitem a sobrevida de pacientes crticos eimunocomprometidos, uso de antimicrobianos de amplo espectro, imple-

mentao das tcnicas de transplantes de rgos slidos e de medula ssea

so alguns dos fatores que tm transformado a rotina diagnstica dos la-

boratrios de microbiologia e micologia. Antes preocupados apenas com a

deteco de patgenos fngicos clssicos (Quadro 1), hoje se deparam cada

vez mais com a visualizao e isolamento de fungos considerados saprfitas,

oportunistas e potencialmente patognicos, com a difcil tarefa de identifi-

c-los e, em conjunto com o clnico, valorizar ou no esse achado no material

clnico coletado.

Quadro 1 Principais infeces micticas que acometem os seres humanos no Brasil

MICOSES

CLSSICAS OPORTUNISTAS

SuperficiaisPitirase versicolor

CutneasDermatofitoses

Subcutneas

Cromomicose, esporotricoseProfundasParacoccidioidomicose, Histoplamose

SuperficiaisCandidases Dermatomicoses

Invasivas

- Candidemia- Criptococose- Aspergilose- Fusariose- Zigomicoses-Outras hialohifomicoses- Feohifomicoses

Agentes como espcies deAspergillus, Candida, Cryptococcuse zigomicetos,

considerados, anteriormente, como contaminantes ambientais e, portanto,

de pouca importncia clnica, so agora conhecidos agentes causais de en-

fermidades disseminadas, tais como as endocardites, infeces pulmonares,ceratites, entre outras, em pacientes imunodeprimidos. Dessa forma, esses

fungos devem ser considerados, ao lado dos patgenos clssicos, como pos-

sveis agentes de quadros infecciosos.

Dentre as centenas de espcies descritas, leveduras do gnero Candidaso

os importantes agentes de infeco hospitalar e representam um desafio

para a sobrevida de pacientes com doenas graves e aqueles em perodo

ps-operatrio. Hospitais norte-americanos com sistema de vigilncia ope-

rante notificaram espcies de Candida como 6

o

patgeno nosocomial e a


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9OPAS/OMS Anvisa/MS


4acausa mais comum de infeces de corrente sangunea, adquiridas em

hospitais.

Diferentes espcies de Candidapodem causar quadros de fungemia, a saber:Candida albicans, Candida glabrata (Torulopsis glabrata), Candida tropicalis;

Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida guilliemondii, Candida lusita-

niae, Candida lipolytica, Candida kefyr, Candida inconspicua, Candida norver-

gensise Candida catenulata. Um grupo europeu realizou na dcada de 90 um

estudo multicntrico e, por anlise univariada, concluram ser C. glabrataa

espcie associada maior taxa de mortalidade e que o bito estava relacio-

nado com maior idade e severidade da doena de base do paciente.

A manifestao clnica mais comum nas candidases hospitalares febre. A

candidemia pode ser definida como a ocorrncia de duas ou mais culturas

positivas para a mesma espcie de Candidaprovenientes de amostras dife-

rentes, coletadas aps 72 horas da admisso. A infeco invasiva por Can-

didaspp pode ser tambm considerada quando seu isolamento ocorrer a

partir de material clnico estril, associado a, pelo menos, um outro sinal de

infeco. A sensibilidade da hemocultura para Candida spp baixa, aproxi-

madamente 50% dos pacientes com infeco invasiva podem ter culturas

negativas. Alm disso, se houver infeco bacteriana concomitante, essa

pode diminuir a chance do isolamento da levedura.

Os fatores de risco reconhecidos para infeco invasiva por Candidaspp so:

Permanncia > 4 dias em UTI

Antibitico-terapia de largo espectro

Cirurgia abdominal

Cateterizao venosa central

Nutrio parenteral total

Imunodepresso

ndice APACHE II > 10 Ventilao mecnica > 48h

Neutropenia

Quimioterapia citotxica

O gnero Candida, sem dvida, o mais importante, mas existem outras le-

veduras no ambiente hospitalar, tanto em vegetais, ar atmosfrico e gua

quanto na pele e no trato gastrointestinal dos pacientes e funcionrios, que

podem causar quadros infecciosos. Os principais gneros so Pichia spp

(Hansenula spp), Rhodotorula spp e Trichosporonspp.


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OPAS/OMS Anvisa/MS10


Em adio, fungos filamentosos presentes no ambiente hospitalar tambm

podem causar infeco em pacientes suscetveis. O gnero Aspergillusspp

(Aspergillus terreus, A. fumigatus, A. flavuse A. niger) o mais citado na lite-

ratura como fungo oportunista, especialmente em pacientes submetidos atransplante de medula ssea e neutropnicos. A inalao de esporos a via

mais comum de transmisso e os surtos de aspergilose podem ser associa-

dos a reformas e construes, dentro e ao redor de hospitais.

Doena pulmonar e, mais raramente, sinusite so as manifestaes de asper-

gilose. Outros gneros tais como: Fusariumsp,Acremoniumsp, Penicilliumsp,

outros hifomicetos como zigomicetos (Rhizopussp, Mucorsp) e alguns feo-

hifomicetos (fungos negros ou demcios), tambm dispersos no ar, so ca-

pazes de causar formas localizadas ou disseminadas de infeco hospitalar.

Diante dessas condies, recomenda-se monitorao com exames micolgi-

cos de amostras biolgicas dos pacientes, tais como sangue, escarro, pontas

de catteres intravasculares, lquido peritoneal e urina. Culturas positivas po-

dem significar apenas colonizao, mas podem conduzir doena invasiva

subsequente.

Estudo prospectivo em pacientes cirrgicos de UTI mostrou que 38% de 29

pacientes desenvolveram infeco aps colonizao. A colonizao pode ser

demonstrada por anlise de trs ou mais amostras, coletadas do mesmo lo-cal ou de locais diferentes, do mesmo paciente, em dias consecutivos.

Nesse mdulo, ser apresentada uma viso geral das principais infeces

fngicas, para que os microbiologistas possam adquirir certa habilidade

para identificar fungos isolados de amostras biolgicas. Para um estudo mais

completo sobre diagnstico de infeces fngicas, recomendam-se as refe-

rncias citadas ao final do captulo.

Caractersticas gerais dos fungosFungos so seres dispersos no meio ambiente, em vegetais, ar atmosfrico,

solo e gua e, embora sejam estimados em 250 mil espcies, menos de 150

foram descritos como patgenos aos seres humanos.

Os fungos de interesse mdico, agentes de micoses, apresentam-se sob dois

tipos morfolgicos: leveduras, prevalentemente unicelulares e bolores ou

fungos filamentosos, que so multicelulares (Figura 1). H ainda importan-

tes agentes de micoses endmicas que, na dependncia principalmente da

temperatura, mas sob influncia tambm do teor de CO2e condies nutri-


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11OPAS/OMS Anvisa/MS


cionais, podem se apresentar sob ambas as formas sendo chamados fungos

dimrficos.

Figura 1 Estruturas microscpicas bsicas de fungos filamentosos (a, b, c) e leveduras (d, e).

Leveduras so fungos capazes de colonizar o homem e animais e, frente

perda do equilbrio parasita-hospedeiro, podem causar diversos quadrosinfecciosos com formas clnicas localizadas ou disseminadas. De modo con-

trrio, fungos filamentosos, ou bolores, normalmente, no fazem parte da

microbiota animal e, portanto o homem no um reservatrio importante

para esse grupo de fungos. As portas de entrada no hospedeiro so as vias

areas superiores ou quebra na barreira epidrmica aps traumatismos com

objetos perfuro-cortantes.

As leveduras tm como estrutura primria, visvel ao microscpio tico a

partir de material clnico ou colnias em cultura, clulas que se reproduzempor brotamento, nico ou mltiplo, em geral, de forma arredondada. Essas

clulas so esporos de origem assexual e so denominadas blastocondios.

Alguns gneros de leveduras menos importantes em micologia mdica, re-

produzem-se por fisso. Sob determinadas condies, as leveduras podem

produzir pseudohifas (importantes para o processo de identificao presun-

tiva de espcies do gnero Candida) ou at mesmo hifas verdadeiras.

A macromorfologia das colnias de leveduras a partir de crescimento em

meios no diferenciais como gar sabouraud dextrose no permite a dife-renciao de gneros. A exceo a colnia mucoide caracterstica do g-


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nero Cryptococcus. Assim, a identificao de leveduras realizada, principal-

mente, por caractersticas fisiolgicas.

Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte bsico a hifa,que pode ser septada ou no septada (cenoctica), hialina (hifomicetos) ou

demcea (feo-hifomicetos). A partir da hifa formam-se esporos, para propa-

gao das espcies. Na grande maioria dos fungos, os esporos podem ser

chamados de condios, pois nascem diretamente delas ou sobre estruturas

ligadas a elas.

Esses conceitos fundamentais representam a base para a identificao de

um fungo, pois a classificao de filamentosos feita, em geral, pela associa-

o de caractersticas morfolgicas macroscpicas (cor, aspecto, textura da

colnia, produo de pigmento difusvel no meio, etc.), microscpicas (for-

ma e cor da hifa, presena ou no de septos, tipo e arranjo de esporos, etc.) e

de velocidade de crescimento (lenta, moderada ou rpida).

1.2 Coleta, transporte e armazenamento de amostras

O tipo e a qualidade da amostra biolgica, submetida ao laboratrio de micologia,

so fatores pr-analticos extremamente importantes para o sucesso do isolamento e

identificao do verdadeiro agente etiolgico de infeces fngicas.

Para tanto, a coleta do material biolgico, seu transporte e armazenamento adequa-

dos devem ser cuidadosamente considerados.

O correto diagnstico laboratorial micolgico tambm depende de outros aspectos

como:

experincia do profissional que vai executar o exame;

adequada comunicao entre os clnicos, vigilncia e laboratrio, essencial paradirecionamento do tipo de amostra e quantidade a ser coletada;

cuidados de coleta, frascos e meios utilizados para transporte e armazenamento

das amostras;

identificao correta das amostras, incluindo a identificao do paciente, data de

coleta, presuno de diagnstico, para auxiliar no direcionamento das anlises la-

boratoriais e tempo de resposta ao clnico pelo laboratrio.

1.2.1 Recomendaes gerais de coleta e transporte de amostras

A esterilizao e desinfeco dos materiais necessrios dever ser realiza-da previamente, conforme recomendaes especficas.


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Lavar as mos e sec-las.

As amostras devem ser identificadas com nome do paciente, nmero de

registro hospitalar (quando for o caso), tipo de amostra e data da coleta,

entre outras informaes adicionais para auxiliar o laboratrio no direcio-namento dos exames.

Coletar a amostra biolgica aps antissepsia e coloc-la em recipiente es-

tril e vedado, conforme orientao para pesquisa de agente, em quan-

tidade suficiente (>2 mL ou 0,5 cm3 ou duplicada) e no perodo de coleta

apropriado, conforme especificao de agente em estudo, para permitir

todos os procedimentos laboratoriais necessrios.

Os swabsso usados para coleta apenas para realizao do exame cultu-

ra, de materiais tais como: ouvido, nasofaringe, orofaringe e boca. Esses

devem ser colocados em tubos contendo salina estril e devem ser trans-

portados o mais rpido possvel e/ou conservados a 4C durante o prazo

de 8 a 10 horas, de modo a evitar a dessecao da amostra.

Os materiais ditos contaminados, tais como urina, fezes, pus, secrees de

feridas ou trato respiratrio, devem ser enviados, sob refrigerao a 4C,

ao laboratrio, o mais rpido possvel, at 18 horas.

Lquor e lquidos cavitrios devem ser coletados sob cuidados de antis-

sepsia antes da puno e enviados em tubo estril selado hermeticamen-

te e transportados o mais rpido possvel, para assegurar o diagnstico,

mantidos temperatura ambiente.

Sangue e material de puno de medula ssea so os nicos materiaisbiolgicos que devem ser semeados diretamente, em frascos contendo

meio de cultura lquido ou bifsico (lquido sobre slido), de modo a evi-

tar coagulao e consequente diminuio da sensibilidade do exame, o

transporte deve ser em temperatura ambiente, entretanto encaminhar o

mais rpido possvel ao laboratrio, uma vez que o processamento dessas

amostras deve ser realizado em, no mximo, 8 a 9 horas.

Recomendaes adicionais:

Sempre que possvel, coletar amostras antes do incio da terapia espe-cfica e, particularmente, para leses cutneas de pele e unhas, orientar

o paciente para evitar uso de medicao tpica por 4 a 5 dias antes da

coleta de escamas.

A requisio mdica que acompanha a amostra deve conter, sempre que

possvel, as hipteses diagnsticas que auxiliaro o micologista na esco-

lha da colorao e do meio de cultura mais adequado para o isolamento

do agente etiolgico suspeitado.

Em pacientes imunodeprimidos ou muito debilitados o estudo de um

mesmo tipo de amostra biolgica, coletada em 2 ou 3 dias consecutivos, importante para a interpretao correta de resultados positivos para


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fungos considerados como saprfitas, ou seja, contaminantes do meio

ambiente, ou mesmo, constituinte da microbiota normal do paciente.

Nesses pacientes, os fungos saprfitas podem se tornar oportunistas e

comportarem-se como patgenos.

Quadro 2 Procedimentos para coleta de amostras

Material Clnico Procedimento de coleta

Escarro Recolher, de preferncia, a primeira expectorao da manh, aps gargarejocom gua limpa ou fervida, em frasco de boca larga, esterilizado. No deveconter saliva.

Aspirado gstrico Aspirar cerca de 5 a 10 ml de suco gstrico, atravs de sonda nasogstrica,pela manh, em jejum.

Aspirado traqueal esecreo obtida porbroncoscopia

Procedimento realizado por mdico treinado. O material colhido deve sercolocado em recipiente estril.

Sangue e aspirado demedula ssea

Fazer antissepsia rigorosa no local da puno e coletar cerca de 5 a 6 ml desangue venoso, que dever ser injetado diretamente em frasco contendomeio de cultura (ver detalhes no prximo tem). A ltima gota de materialdeve ser distendida em uma lmina de microscopia, para colorao deGiemsa.

Lquor Fazer antissepsia rigorosa no local da puno. Coletar 2 ml ou mais, paraexame microscpico e cultura para fungos. Os tubos na rotina hospitalardevem ser usados na seguinte sequncia: 1aexame bioqumico, 2aexame

de celularidade, 3

a

microbiolgico, reduzindo assim a possibilidade deisolamento de contaminantes da pele. Entretanto, a coleta da amostra emtubos especficos para cada um desses exames aumenta a sensibilidade doexame micolgico e, por isso, deve ser recomendada.

Tecido obtido porbipsia, necropsia epeas operatrias

Colher assepticamente, utilizando instrumentos estreis e colocar o materialem recipiente estril, com salina. No adicionar nenhum lquido fixador.

Urina A amostra biolgica mais apropriada para o diagnstico de micose do tratourinrio obtida por sondagem ou citoscopia. Quando no for possvel, epara evitar contaminao com microrganismos presentes nas reas vizinhas,fazer limpeza prvia da regio perineal com gua e sabo, desprezar oprimeiro jato de urina da manh, e colher 3 a 5 ml de urina em frasco estril.Colees de 24 horas no tm valor para diagnstico micolgico.

Fezes Fazer lavagem prvia da regio anal com gua e sabo, coletar pores defezes em recipiente estril com tampa ou swabanal, mergulhar o swabemsalina estril e enviar o tubo ao laboratrio.

Secreo de condutoauditivo externo

Colher material por curetagem da leso ou com swabestril. Mergulhar oswabumedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio.

Material de Micose ocular O melhor mtodo para recuperao de fungos requer raspado de crnea,aspirao de lquido intra-ocular ou bipsia. A coleta com auxlio de swabno indicada em local de drenagem.

Leso de nariz e seios

paranasais

Coletar secreo, material necrtico ou tecido obtido por bipsia em

recipiente estril.


15/48



Material Clnico Procedimento de coleta

Mucosa oral e orofaringe Coletar com swabestril o material de leso de mucosa jugal, papilas linguaisou regio tonsilar. Mergulhar o swabumedecido em salina estril e enviar otubo ao laboratrio.

Secreo vaginal Com auxlio de espculo, coletar material da leso ou do fundo de sacovaginal com swabestril. Mergulhar o swabumedecido em salina estril eenviar o tubo ao laboratrio.

Lquidos corporais(pleural, asctico,pericrdico e sinovial)

Fazer assepsia rigorosa no local da puno. Coletar cerca de 5 a 10mL delquido em tubo de ensaio estril.

Pus e material deabscesso

Devem ser colhidos de preferncia, por aspirao de abscessos fechados,com seringa e agulha estril. Se a leso for aberta, limpar o local comgaze esterilizada embebida em salina estril, para eliminar os exsudatossuperficiais que so altamente contaminados com bactrias. A seguir, colhero material com swab. Mergulhar o swabumedecido em salina estril e enviaro tubo ao laboratrio.

Pele e pelos Se possvel, descontaminar a pele com lcool 70% antes da coleta. Rasparcom lmina de bisturi as escamas cutneas da borda das leses. Pode-seutilizar tambm uma lmina de microscopia. Colocar o material entre duaslminas limpas, de preferncia esterilizadas, vedando-se as bordas daslminas com fita adesiva para evitar perda do material. Os pelos tonsurados,devem ser retirados com pina estril e acondicionados entre lminas ou empotes, de preferncia esterilizados.

Unhas Fazer limpeza prvia das unhas escovando com gua e sabo. Cortar comtesoura e desprezar a parte descolada da unha e, com lmina de bisturi,raspar as reas mais profundas e pulverulentas. Colocar esse material entre

lminas e ved-las com fita adesiva.

1.3 Processamento de amostras

O sucesso na visualizao e isolamento do agente etiolgico depende, alm da co-

leta, transporte, conservao e armazenamento adequados e volume suficiente da

amostra, de seu processamento correto antes do exame micolgico. As seguintes re-

comendaes devem ser cuidadosamente seguidas para boa resoluo diagnstica:

Pelos, cabelos, escamas de unha e peledevem ser aliquotadas para exame mi-croscpico direto e cultura, pois para exame so clarificadas com soluo aquosa

de KOH a 20% e, para cultura, no podem sofrer nenhum tratamento prvio, sendo

por isso, inoculadas diretamente na superfcie do meio de cultura.

Lquor, secrees e fludos corporaiscomo lquido pleural, asctico, sinovial, pe-ricrdico, aspirado transtraqueal, lavado gstrico e broncoalveolar (BAL) devem

ser concentrados por centrifugao (1500 a 2000 rpm por 10 minutos). Os mate-

riais coletados com swabsdevem ser eludos em soluo salina e tambm devem


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ser centrifugados. O sedimento obtido o material adequado para o exame mi-

croscpico e semeadura em meios de cultura.

Para urina, recomendvel que uma alquota (ala calibrada) seja semeada, por

esgotamento, sobre o meio de cultura distribudo em placa de Petri, para examequantitativo, pela contagem de unidades formadoras de colnias (UFC). A outra

alquota deve ser centrifugada (1500 a 2000 rpm por 10 minutos) e o sedimento

ser utilizado para exame microscpico e nova semeadura em tubo (cultura qua-

litativa).

Escarropode ser digerido com enzima (v/v) N-acetil-L-cisteina (250 mg de enzimadissolvidas em 1 L de soluo-tampo citrato ou soluo fisiolgica), que fluidifica

e facilita a manipulao da amostra e formao de sedimento aps centrifuga-

o. Porm, no foi comprovado que esse tratamento melhore a recuperao de

fungos da amostra sendo, portanto, opcional. Pode-se utilizar, como alternativa,

para digesto da amostra, soluo de KOH 20%. A poro purulenta da amostra

prefervel e pores liquefeitas no so adequadas para isolamento do agen-

te. A poro da amostra tratada com KOH, porm, s pode ser usada para exame

microscpico, pois a potassa destri, aps algumas horas, as estruturas do fungo,

inviabilizando seu isolamento em meio de cultura. Nesse caso, outra poro da

amostra deve ser centrifugada e o sedimento usado para cultura.

Tecidosobtidos por bipsia requerem fragmentao, com o auxlio de um bisturiestril ou macerao (gnglio) com pistilo em almofariz; pode ser feito dentro de

uma placa de Petri estril. Esse procedimento visa aumentar a rea de superfcie e

expor o microrganismo ligado ao tecido, ao maior contato com o meio de cultura. Sangue e aspirado de medula sseano necessitam preparao, sendo que o

exame microscpico tem baixa sensibilidade e, portanto, a cultura importante

para identificao do agente. Para cultura, as amostras so semeadas imediata-

mente, aps a coleta, em frascos contendo meio de cultura. O meio pode ser bif-

sico (15 ml de gar inclinado sob 50 ml de caldo) composto de infuso de crebro-

-corao (meio BHI) ou Sabouraud. Meios contendo saponina para lise e poste-

rior centrifugao da amostra so indicados. Na prtica, frascos para hemocultura

bacteriolgica (simples ou automatizada) proporcionam isolamento adequado de

fungos, desde que respeitados os perodos necessrios ao seu desenvolvimento.Para fungos dimrficos, de crescimento lento (>15 d), muitos autores consideram

o mtodo de lise-centrifugao o mais sensvel. Sangue e medula ssea no de-

vem ser coletados em seringas contendo EDTA, pois essa substncia se combina

com elementos da parede dos fungos, diminuindo a sensibilidade do exame. Um

dos procedimentos recomendados a inoculao de 5 a 6 ml da amostra no frasco

com meio bifsico sendo uma parte para 10 partes do meio lquido, que deve ser

ento incubado temperatura de 30C.


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1.3.1 Exame microscpico de amostras

Na dependncia do material clnico, a observao de um fungo na amostra

biolgica tem grande valor diagnstico, pois demonstra sua presena no te-

cido e permite uma informao imediata ao mdico, a qual pode ser crucialpara determinar a terapia apropriada ao paciente. No entanto, se a quantida-

de da amostra biolgica for insuficiente para o exame microscpico e cultura

do material, a cultura, na maioria das amostras, tem prioridade sobre o exa-

me microscpico, por ser mais especfico e, em muitos casos, mais sensvel.

O exame microscpico da amostra realizado por vrias tcnicas, depen-

dendo do tipo da amostra e suspeita clnica.

1.3.2 Exame microscpico direto com hidrxido de potssio (KOH) a 20%

Tcnica utilizada para exame de pelos, pele, unha, tecido obtido por bip-

sia, exsudatos espessos e outros materiais densos. Colocar uma gota de KOH

(aquoso a 20%) em uma lmina de microscopia e sobre essa uma poro

da amostra a ser examinada. Cobrir a preparao com uma lamnula e, para

intensificar a clarificao, aquecer ligeiramente, sobre a chama de um bico

de Bunsen, sem deixar ferver a mistura. Examinar a preparao aps 20 mi-

nutos, em microscpio ptico comum, inicialmente, com objetiva de 10x,

seguida de 40x.

1.3.3 Exame microscpico direto com tinta nanquim (tinta da China)

Utilizado em amostras de lquor, urina, secrees ou exsudatos, para visuali-

zao de leveduras capsuladas do gnero Cryptococcus, que se tornam mais

evidentes contra o fundo negro proporcionado pela tinta. Colocar uma gota

de tinta nanquim e uma gota do sedimento da amostra centrifugada sobre

uma lmina. Cobrir a preparao com lamnula e observar ao microscpio

ptico (objetivas de 10x e 40 x). Nessa tcnica, um erro bastante frequente

confundir linfcitos com clulas de leveduras. A diferenciao feita pela

refringncia da parede celular e das incluses no citoplasma das leveduras,

alm da presena de brotamentos (Figura 2).


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Figura 2 Cryptococcus sp: leveduras em brotamento rodeadas de halo transparente (cp-

sula polissacardica), sobre fundo negro formado pela tinta nanquim

1.3.4 Exame microscpico com colorao pelo mtodo de Gram

Todos os fungos so Gram-positivos, assim a utilizao da colorao no visa

a diferenciao dos microrganismos, mas possibilita discriminar elementos

fngicos de artefatos existentes em urina, secrees e fezes. A amostra es-

palhada de modo homogneo, em movimentos circulares, em uma lminade microscopia, fixada com calor e submetida colorao.

1.3.5 Exame microscpico com colorao pantica (Giemsa, Leishman ou

Wright)

Essas coloraes so usadas para pesquisa de Histoplasma capsulatumem

diversas amostras biolgicas: medula ssea, sangue, aspirados e secreo

cutnea. Nesses casos, faz-se um esfregao semelhante ao usado para colo-

rao de Gram. Fixa-se com metanol e cora-se segundo o mtodo escolhido.

Podem ser usadas ainda para corar imprints de tecidos obtidos por bipsia.

A seguir esto esquematizados os principais aspectos morfolgicos obser-

vados ao exame microscpico e os possveis agentes etiolgicos de acordo

com a amostra biolgica.


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Quadro 3 Interpretao de aspectos morfolgicos encontrados em exames microscpicos

de amostras biolgicas

Amostra Biolgica Aspecto Morfolgico Interpretao

Pelos a. Hifas hialinas e/ou artrosporos(1) a. Dermatfitos

Unhas, escamas depele

a. Hifas regulares, septadas,ramificadas, hialinas,artrosporadas(1)

a. Dermatfitos

b. Leveduras e pseudo-hifas b. Candidaspp

c. Grupo de leveduras e/ou pequenashifas tortuosas, hialinas(1)

c. Malasseziasp

Lquor a. Levedura capsulada(2) a. Cryptococcussp

Secreo vaginal a. Levedura e pseudo-hifa(1,3) a. Candidaspp

Secrees (tratorespiratrio, nasal, oral,naso-faringe)

a. Hifas ramificadas, hialinas,septadas(3)

a. Fungos filamentosos hialinos(5)

b. Levedura capsulada(2) b. Cryptococcus sp

c. Levedura e pseudo-hifa(1,3) c. Candidaspp

d. Leveduras globosas oumultiformes, de parede espessa,incluses citoplasmticas, commltiplos brotamentos(1)

d. Paracoccidioides brasiliensis

Tecidos, pus e

aspirados (subcutneo,ganglionar, cerebral,pulmonar, mucosa ououtro)

a. Hifas irregulares, largas,

cenocticas(1,3)

a. Zigomicetos

b. Hifas ramificadas, hialinas,septadas(1,3)

b. Fungos filamentosos hialinos(5)

c. Hifas septadas de cor castanha oumarrom(1,3)

c. Feohifomicetos (fungos demcios)

d. Estruturas ovaladas, com ou semseptos, de cor castanha (estruturasmuriformes)(1)

d. Cromomicetos (agentes decromomicose)

e. Levedura e pseudohifa(1,2) e. Candida spp

f. Levedura capsulada(2) f. Cryptococcus sp

g. Levedura globosa ou ovide,de parede espessa, inclusescitoplasmticas, com brotamentonico ou mltiplos(1)

g. Paracoccidioides brasiliensis

h. Leveduras pequenas, tipo charuto(achado muito raro)(3)

h. Sporothrix schenckii

i. Leveduras pequenas emmacrfagos(4)

i. Histoplasma capsulatum


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Amostra Biolgica Aspecto Morfolgico Interpretao

Fludos oculares a. Fragmentos de hifas, hialinas,septadas(1,3)

a. Fungos filamentosos hialinos(5)

b. Leveduras e pseudohifas(1,3)

b. CandidasppSangue e medula ssea a. Fragmentos de hifas ramificadas,

hialinas, septadas(3,4)a. Fungos filamentosos(5)

b. Levedura capsulada(2) b. Cryptococcus sp

c. Leveduras em brotamento(3,4) c. Leveduras(6)

d. Leveduras pequenas emmacrfagos(4)

d. Histoplasma capsulatum

(1) Exame microscpico com KOH(2) Exame microscpico com tinta nanquim(3) Exame microscpico com colorao de Gram

(4) Exame microscpico com colorao de Giemsa ou pantica(5) So fungos saprfitas que podem se tornar oportunistas, por exemploAspergillus, Fusarium,Acremonium, cujaidentificao s possvel pela cultura.

(6) No sangue, leveduras do gnero Candidano formam pseudohifas e a identificao de gnero e espcie possvelsomente, aps isolamento em meio de cultura.

1.3.6 Cultura de amostras biolgicas para isolamento de fungos

A amostra, aps o processamento, poder ser usada para isolamento do

agente etiolgico. Para tanto, dever ser semeada em movimentos de estrias

(ziguezague) sobre a superfcie de meios slidos de cultura, distribudos em

tubos de ensaio, tamponados com tampo hidrfilo.

1.3.7 Meios de cultura

O meio de cultura pode ser selecionado segundo tipo de amostra e agente

etiolgico, conforme a suspeita clnica. De acordo com os aspectos observa-

dos ao exame microscpico da amostra, pode-se ainda redirecionar o pro-

cedimento para isolamento do agente. Recomenda-se sempre 2 tubos de

meio para semeadura da amostra biolgica, os quais devero ser incubados

temperatura de 30C, usada atualmente para todos os tipos de amostras.

Quando a hiptese diagnstica apontar para um fungo dimrfico, incubar

um dos tubos a 35OC.

Para isolamento de fungos a partir de qualquer tipo de amostra, devem ser

utilizados meios no seletivos, que permitam crescimento de fungos pato-

gnicos e bolores de crescimento rpido (< de 7dias). Esses fungos, apesar

de serem contaminantes de meio ambiente, podem ser agentes de micoses

em pacientes suscetveis, ou seja, so potencialmente oportunistas.

O meio bsico em laboratrio de micologia o gar Sabouraud dextrose

(ASD), chamado simplesmente, gar Sabouraud. O ASD o meio mais utili-zado, por ser relativamente barato e permitir o crescimento de todos os fun-


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gos, com rarssimas excees. Em regra, usa-se um antibitico para impedir o

crescimento de bactrias que poderiam prejudicar o isolamento de fungos.

O cloranfenicol o mais indicado, pois resiste autoclavao. Pode ser colo-

cado tanto no ASD como em outros meios de cultura para fungos.

Meios ditos seletivos para fungos patognicos contm cicloheximida que

inibe parcialmente, ou totalmente, fungos anemfilos. Esses meios so in-

dicados para cultivo de materiais coletados de leses com suspeita de der-

matofitose, para aumentar a sensibilidade no isolamento de dermatfitos.

Deve-se ressaltar que essa substncia poder inibir o isolamento de fungos

oportunistas, como Aspergillussp, alm de Histoplasma capsulatumna fase

leveduriforme e certas leveduras patognicas dos gneros Candidae Cryp-

tococcus.

Existem meios presuntivos que indicam presena de certos grupos de fungos

ou determinados gneros, como por exemplo gar contendo compostos fe-

nlicos para Cryptococcus sp(gar contendo sementes de niger ou Guizzotia

abssinica) ou gar especial para dermatfitos (Dermatophyte Test Medium).

Existem ainda meios presuntivos, por reao enzimtica e colorimtrica, de

espcies de Candidaspp (Candida Medium, ChromAgar, Biggy gar, etc). So

meios mais caros que ASD e, alm disso, sua maior aplicao no isolamento

primrio de leveduras, a partir de amostras biolgicas muito contaminadas,

tais como: secreo vaginal, fezes e urina. A identificao, no entanto, feitasomente aps anlise morfolgica e fisiolgica.

Para isolamento ou subcultivo de dermatfitos recomenda-se o gar batata,

encontrado no comrcio, sob forma desidratada, para aumentar a esporula-

o e facilitar a identificao do gnero e espcie do fungo.

Para fungos dimrficos, de crescimento lento (> 15 dias), recomenda-se o

uso de meios enriquecidos como o gar infuso de cerebro-corao (BHI)

para obteno, em menor tempo, de culturas melhor desenvolvidas. Podeser acrescido de 5 a 10% de sangue de carneiro e de antibiticos (de prefe-

rncia, cloranfenicol ou penicilina e estreptomicina).

1.3.8 Procedimentos para cultura

Os materiais devidamente processados devem ser semeados na superfcie

dos meios de cultura, com ala de nquel-cromo ou pipeta Pasteur, com mo-

vimentos em estrias em ziguezague, para permitir separao de eventuais

contaminantes da amostra. O material no deve ser colocado em profundi-

dade no gar, mas apenas aderido superfcie do meio. A temperatura de in-cubao recomendada para todas as amostras 30C, devido possibilidade


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de o agente etiolgico ser oportunista, e desse modo, crescer melhor a 30C

do que a 37C no primo isolamento. Alm disso, pensando em Brasil, em que,

as temperaturas so muito altas nas regies Norte e Nordeste, dificilmente

alcanam 25C, a menos que se utilize estufa BOD (body oxigen demand).A temperatura de 30C verificada, mais facilmente, durante muitas horas

do dia.

Hemoculturas fazem parte da rotina diagnstica para casos de infeco

hospitalar e merecem algumas recomendaes parte para isolamento

de fungos. Os frascos contendo meio bifsico e sangue ou aspirado de

medula ssea devem ser submetidas agitao manual peridica, para

maior homogeneizao do oxignio na fase lquida do frasco. Exames ma-

croscpicos dirios da superfcie da fase slida so indicados para verificar

aparecimento de colnias de: leveduras dos gneros Candida, Cryptococ-

cuse outros (24 h-7 dias), fungos filamentosos e Sporothrix schenckii (2 a

15 d) e fungos dimrficos, como: Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma

capsulatum (15 a 30d). Qualquer colnia de fungo deve ser repicada em

ASD, para posterior identificao.

O crescimento de fungos, ao contrrio de bactrias, no resulta em tur-

vao imediata do meio lquido, de modo que a anlise microscpica de

uma gota do meio, abrevia o prazo de resultados positivos. Recomenda-se

a pesquisa microscpica do crescimento de fungos corando por Gram,

duas gotas do meio lquido, periodicamente, em cada um dos perodosacima citados. Alm do exame microscpico da fase lquida, um proce-

dimento que resulta em maior sensibilidade da cultura a realizao de

repiques de 1 ml da fase lquida para tubos contendo ASD ou BHI em dias

alternados: 2, 10 e 30 dia.

Visto que a maioria dos laboratrios brasileiros no trabalha com o meio

bifsico, pode-se inocular a amostra, na mesma proporo de 10%, em

frascos de hemocultura bacteriolgica e fazer a leitura como anterior-

mente descrito. Entretanto, sistemas automatizados para hemoculturas,

que acusam o crescimento de qualquer microrganismo em at 7 dias,no permitem identificar a presena de fungos de crescimento mais len-

to. Nesses casos, a incubao por perodo de at 30 dias, com repiques

do caldo em ASD. O procedimento para sangue e aspirado de medula

ssea, denominado lise-centrifugao, no muito difundido no Brasil,

pelo custo de importao do sistema. O material biolgico inoculado di-

retamente no frasco do sistema, que contm saponina, que lisa as clulas

liberando assim os microrganismos intracelulares. A seguir, deve-se reali-

zar centrifugao que direcionar os elementos fngicos para o fundo do

tubo que j contm o meio de cultura. O sobrenadante desprezado e,dessa forma, a cultura foi realizada, evitando-se subcultivos que so ne-


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cessrios quando se inocula o material em meios bifsicos ou lquidos. A

incubao feita a 37C por perodo de at 30 dias.

Abaixo esto os procedimentos recomendados para exame direto e cul-

tura, visando obter melhor rendimento no isolamento primrio de fun-gos, de acordo com tipo de amostra biolgica.

Quadro 4 Procedimentos laboratoriais para exame direto e isolamento de fungos, segun-

do amostra biolgica

Amostra Biolgica Processamento Exame Microscpico Meio de Cultura*

Secreo respiratria - Fluidificaorecomendada

- Centrifugao- Uso do sedimento

- a fresco- KOH a 20%- Giensa- Tinta naquim

- ASD- BHI

Lquor - Centrifugao- Uso do sedimento

- Tinta naquim- Gram

- ASD

Urina** - Centrifugao- Uso do sedimento

- a fresco- Gram

- ASD

Fluidos corporais(pleural, asctico,sinovial, pericrdico,gstrico, brnquico)


- KOH 20%- Giemsa

- ASD- BHI

Pus e secrees deabscessos

- Nenhum - KOH 20%- Giemsa

- ASD- BHI

Swab embebidoem salina (mucosaoral, nasal, vaginal,anal, olhos, condutoauditivo)


- Gram - ASD

Pele, pelos e escamasde unhas

- Nenhum - KOH 20% - ASD

Tecidos e peas - Fragmentao oumacerao

- Imprint em lmina

- KOH a 20%- Giensa- Tinta naquim

- ASD- BHI

Sangue e medula ssea - Semeadura emmeio de cultura

- Esfregao oudistenso emlmina

- Giemsa - BHI bifsico oulquido

- ASD bifsico oulquido

* Todos os meios slidos para isolamento de fungos devem conter cloranfenicol.** Para contagem de colnias (UFC/ml), semear 0,1 ml de urina em ASD distribudo em placa de Petri, antes de

centrifugar.


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1.4 Identificao de fungos

O isolamento de um fungo em meio de cultura no significa, necessariamente, que

ele o agente etiolgico da infeco. A presena de fungos na microbiota (flora) depacientes, por exemplo Candida sp,e no meio ambiente, por exemplo Aspergillus sp,

pode resultar em cultura positiva. Isso explica o grande nmero de culturas positi-

vas para fungos a partir de uma amostra biolgica. A relao entre o fungo isolado

em meio de cultura e sinais e sintomas critrio clnico-epidemiolgico. No entanto,

deve-se sempre valorizar o isolamento de um fungo procedente de:

Qualquer amostra biolgica que mostrou resultado positivo ao exame microsc-

pico.

Micose cutnea.

Fludos corporais normalmente estreis.

Tecidos obtidos por bipsias ou peas operatrias.

Urina, obtida por sondagem ou cistoscopia, independentemente da contagem de

colnias.

Raspado de crnea.

Paciente imunossuprimido (transplantado ou com Aids).

Paciente em uso de antibiticos por longo tempo, internado em unidade de tera-

pia intensiva ou submetido a ventilao mecnica, cateterismo ou outra manipu-

lao.

Paciente de hemodilise ou debilitado que apresente algum sintoma ou sinal dedoena infecciosa independentemente do tipo de amostra clnica.

Alm desses casos, tm importncia as culturas de fungos:

Dimrficos.

Fungos isolados mais de uma vez do mesmo tipo de amostra biolgica coletada

em diferentes dias e procedentes do mesmo paciente.

Isolados de ponta de cateter (alimentao parenteral, infuses venosas, etc.).

O profissional de laboratrio deve tentar identificar todas as culturas positivas rele-

vantes e emitir o resultado mais acurado possvel. Muitas vezes, o exame microscpi-

co direto da cultura suficiente para direcionar as medidas de controle da infeco,

outras vezes somente a identificao do fungo pode orientar adequadamente a con-

duta clnica.

A identificao dos fungos, de modo ideal, deve contemplar o gnero e a espcie; po-

rm, muitas vezes, em especial para os fungos filamentosos, isso no possvel pelo

grau de dificuldade e complexidade desses microrganismos. Nesses casos, a identi-


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ficao do grupo de fungos pode ser suficiente para o diagnstico da micose, por

exemplo, zigomicetos, feo-hifomicetos, dermatfitos, leveduras, etc.

1.4.1 Identificao de leveduras (morfolgica e bioqumica)A macromorfologia das leveduras, em especial as do gnero Candida, no

apresenta muita diversidade e, portanto, nem sempre um parmetro sufi-

ciente para sua identificao.

Colnias de levedura obtidas de amostra biolgica s devem ser identifica-

das quando estiverem puras, ou seja, sem contaminao bacteriana ou em

mistura de espcies. Para tanto, deve ser realizado o plaqueamento de cada

colnia morfologicamente distinta e confirmada sua pureza, por microsco-

pia. De cada colnia deve ser feito um repique em ASD para sua identifi-

cao. Para isolamento e identificao presuntiva ao mesmo tempo de al-

gumas espcies de Candidamais frequentes, est disponvel no mercado o

meio comercial Chromagar Candida .

A pesquisa de cpsula, caracterstica marcante do gnero Cryptococcus, fei-

ta com uma gota de tinta nanquim e uma alada da cultura. A cpsula, cons-

tituda de material polissacardico, aparece como um halo claro ao redor dos

blastocondios de Cryptococcuse contrastam com o fundo negro da lmina.

As provas fisiolgicas mais comuns e mais simples para identificao de Can-dida albicanse Candidasp so: tubo germinativo e filamentao em cultivo

em lmina.

No cultivo em lmina, avalia-se a capacidade de produo de hifas/pseudo-

hifas. Desse modo, a presena de hifas hialinas, ramificadas e sem fragmen-

tao, sugestiva do gnero Candidasp e se, alm disso, desenvolver cla-

midsporos (clulas de reserva), em adio ao tubo germinativo positivo,

identificada como Candida albicans. A presena de hifas hialinas ramificadas

que podem se fragmentar em esporos, denominados artrocondios, indicaespcies dos gneros Geotrichume Trichosporon. Assim, gneros tais como

Cryptococcus, Rhodotorula, Geotrichum e Trichosporon tambm podem, na

maioria das vezes, serem identificados apenas por sua morfologia caracte-

rstica.

O restante dos gneros e a classificao em espcies, porm, necessita de

provas bioqumicas para sua identificao. No entanto, do ponto de vista

clnico, nem sempre importante a identificao acurada da levedura. Por

outro lado, a simples identificao de C.krusei, intrinsecamente resistente afluconazol, extremamente importante.


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A prova de urease, disponvel em todo laboratrio de microbiologia, muito

utilizada em micologia. A reao positiva para urease, junto com a anlise

morfolgica, permite identificao presuntiva de Cryptococcussp. Leveduras

do gnero Rhodotorulaso tambm urease positiva, mas, como normalmen-te, apresentam colnias com pigmento avermelhado ou salmo, so distin-

guidas de Cryptococcussp.

A identificao tambm pode ter interesse epidemiolgico. Para leveduras

relacionadas a episdios de infeco hospitalar, por exemplo, h grande pre-

ocupao no estudo das espcies dos agentes, como marcador epidemiol-

gico temporal e espacial de infeces, como no caso de espcies de Candida

que tm menor sensibilidade a antifngicos azlicos.

O esquema a seguir prope um fluxo para identificao das principais leve-

duras de interesse mdico.

Figura 3 Esquema simplificado para identificao de alguns gneros de leveduras

Tubo Germinativo

Candida albicans

Trichosporon sp Geotrichum sp

Rhodotorula sp

Cultivo em lminaPositivo

Positiva

Positiva

Negativo

Negativa

Negativa

Artroporadas

Hifas Somente blasrocondios

Prova da Ureaseno-artrosporadas+ blastocondios

com blastocondios sem blastocondios

Associar pesquisa de cpsula

Associar cor da colnia

Auxanograma eZimograma

Laranja, Avermelhada, Salmo Branca Bege

Candida sp

Cryptococcus sp

Se as provas no conduzirem identificao presuntiva do gnero, provas

de assimilao de fontes de carbono e nitrognio (auxanograma) e fermen-

tao de carboidratos (zimograma) devem ser realizadas e interpretadas se-

gundo tabelas existentes na bibliografia recomendada ao final deste captu-lo. Um exemplo simplificado o Quadro 5.


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+

+

+

-

-

+

-

+

-

-

V

C.k

rusei

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

C.g

uilliermondii

-

+

-

-

+

+

-

+

+

+

+

-

-

+

+

-

-

+

V

C.g

labrata

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

+

-

-

-

-

+

C.n

eoformans

-

-

-

+

+

+

-

V

+

V

+

+

-

-

-

-

-

-

-

Geo

trichum

-

+

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

V

-

-

-

-

-

Tric

hosporon

-

+

+

V

+

+

+

+

V

V

+

V

-

-

-

-

-

-

-

Rho

dotorulasp

-

-

-

+

+

V

-

V

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

Sac

charomyces

-

-

-

-

+

+

-

-

V

+

-

-

-

+

+

+

-

+

V

Tg=

tubogerminativo,

Ar=artrsporo,U

R=urease,

Sa=sacarose,

Ma=matose,

La=

lactose,

Ce=celubiose,

T=

trealose,

Ra=rafinose,

X=xifose,I=

inositol,

NO

2

=nitrato,

GI=glicose,

+=pos,-=ne

g,

V=varivel


28/48



1.4.2 Prova do tubo germinativo

A partir de uma alada da colnia isolada, fazer uma suspenso em tubo de

ensaio contendo 0,5 ml de soro humano (pode-se usar tambm soro estril

de bovino, cavalo ou coelho). Incubar a 37C durante perodo mximo de 3horas. Esse prazo importante porque, aps esse perodo, outras espcies

de Candidae de outros gneros formam tambm tubo germinativo. Depo-

sitar ento uma gota da suspenso sobre lmina, cobrir com lamnula e exa-

minar ao microscpio ptico. A presena de tubo germinativo, na forma de

pequeno filamento que brota do blastocondio, sem formar constrio com

a clula-me, permite a identificao presuntiva de Candida albicans (Figura

4).

Figura 4 Prova do tubo germinativo com blastocondios, tubo germinativo e pseudohihas

de Candida albicans

1.4.3 Cultivo em lmina para prova de filamentao e produo de

clamidsporo

Depositar 3 ml de gar-fub fundido sobre uma lmina contida sobre um

suporte dentro de uma placa de Petri. O suporte para a lmina pode ser umbasto de vidro, outra lmina ou apenas dois palitos de madeira. Aps soli-

dificao do meio, semear a levedura, com auxlio de uma agulha em L, fa-

zendo 2 estrias paralelas. Recobrir as estrias com lamnula esterilizada. Fazer

uma cmara mida, acrescentando 2 ml de gua destilada estril na placa,

ou embebendo um algodo estril, para evitar dessecao do meio, durante

o perodo de incubao da prova. Tampar a placa e aps 24 horas, 48 horas

e 72 horas examinar a preparao em microscpio tico. A presena de hifas

hialinas, septadas e ramificadas caracteriza o gnero Candidae se houver

formao de clamidsporos indica Candida albicans. Formao exclusiva deartrsporos permite identificao de Geotrichum, mas quando so forma-


29/48



dos tambm blastocondios trata-se de Trichosporon. O meio de gar fub

ou farinha de milho pode ser adquirido no comrcio (CornMeal gar) mas

sua formulao simples, ressaltando-se que de todos as maneiras deve-se

acrescentar a substncia tensoativa tween 80, para que a prova d resulta-dos confiveis.

Figura 5 Cultivo em lmina para prova de filamentao e clamidsporo

1.4.4 Prova da urease

Semear uma alada da levedura na superfcie do meio de urease (gar

uria de Christensen).

Incubar a temperatura de 37C.

A mudana da cor do meio para rosa bispo em 24 horas indica reao posi-

tiva.

1.4.5 Prova de assimilao de fontes de carbono e nitrognio ou auxanograma

Nessa prova so usados 2 meios, que podem ser adquiridos no comrcio na

forma desidratada (Yeast Nitrogen Base e Yeast Carbon Base) ou formulados.

A levedura semeada pour plate, homogeneizando-se 2 ml de uma sus-

penso das colnias a cada meio fundido ou semeada na superfcie de cada

um dos meios previamente distribudos em 2 placas de Petri. So ento adi-

cionadas pequenas alquotas de diferentes carboidratos que servem de fon-

te de carbono sobre a superfcie do meio isento de carbono. Vrias substn-cias, incluindo lcoois, protenas e aminocidos servem de fontes de nitro-

gnio e so colocadas sobre a superfcie do meio isento de nitrognio. Aps

incubao temperatura ambiente ou 25C, por perodo de uma semana, a

levedura ir assimilar e crescer em volta de determinadas fontes, de acordo

com o metabolismo caracterstico de sua espcie. A leitura feita pelo halo

de turvao resultante do crescimento e indica prova de assimilao positiva

para a respectiva fonte. Os resultados so comparados a tabelas existentes

na bibliografia recomendada (exemplo simplificado consta no Quadro 5).


30/48



1.4.6 Fermentao de acares ou zimograma

A capacidade de fermentar carboidratos, ao lado do auxanograma, ir com-

pletar o perfil bioqumico da levedura permitindo a identificao acurada de

gnero e espcie (Quadro 5). As caractersticas morfolgicas so fundamen-tais para concluir a identificao, desde que diversas espcies tm perfis bio-

qumicos idnticos, mas morfologias distintas. Para o zimograma, diversas

fontes de carboidratos so colocadas em tubos respectivos contendo meio

bsico lquido. A levedura semeada em cada tubo e, aps um perodo de

at 15 dias a 25C, a fermentao revelada por formao de bolhas de gs,

observadas dentro de tubos de Durhan, colocados previamente durante a

preparao do meio bsico.

1.4.7 Mtodos comerciais para identificao de leveduras

Em se tratando de espcies de Candida, o mercado j dispe de Kits manuais

como API 20C AUX ( BioMerieux), ID 32C (BioMerieux), Candifast (Internatio-

nal Microbio) e metodologia semiautomatizada, como os cartes de identifi-

cao de fungos Vitek (BioMerieux).

1.4.8 Identificao de fungos filamentosos

Os fungos filamentosos, patognicos ou contaminantes ambientais, poten-

cialmente oportunistas, formam um grupo muito extenso impossvel de ser

tratado neste Manual. Para identificao das diversas espcies ou grupos

existe bibliografia especializada de textos, manuais e atlas, indicados no finaldo captulo. Dentro do objetivo deste Manual sero ilustrados apenas aspec-

tos macroscpicos e microscpicos de alguns fungos de interesse mdico,

isolados com maior frequncia no Brasil.

A identificao de fungos filamentosos tem, como fundamento, a observa-

o da morfologia da colnia e aspectos microscpicos. A anlise da colnia

visa observar: cor, textura, superfcie, pigmento difusvel no meio de cultura,

entre outros, e pode ser feita no tubo de ensaio contendo a cultura primria

do fungo. Porm, o mais adequado a anlise a partir da colnia gigante,ou seja, uma cultura feita no ponto central de uma camada de gar Sabou-

raud Dextrose ou gar batata distribudo em placa de Petri. A velocidade de

crescimento que pode ser rpida (< 7 dias), intermediria (8 a 14 dias) ou

lenta (> 15 dias) fundamental para identificao presuntiva do fungo.

A observao das estruturas microscpicas, tais como: hifa hialina ou dem-

cia, septada ou cenoctica, forma, disposio e formao dos esporos so su-

ficientes, em geral, para a identificao dos gneros, mas nem sempre para

a caracterizao das espcies de fungos filamentosos. Em alguns grupos,


31/48



como o dos fungos demcios, pode ser necessrio tambm uso de provas

bioqumicas.

A morfologia microscpica mais bem visualizada com a tcnica de micro-cultivo que preserva a disposio original dos esporos sobre as hifas e man-

tm ntegras certas estruturas formadoras de esporos, por exemplo: os espo-

rngios que so rgos de reproduo de zigomicetos.

1.4.9 Tcnica de microcultivo para fungos filamentosos

Colocar sobre uma lmina esterilizada, contida em uma placa de Petri es-

tril, um cubo de gar: ASD ou gar batata. A lmina deve estar sobre um

suporte, que pode ser formado por outra lmina, ou um pequeno basto de

vidro recurvado, ou ainda, dois palitos de fsforo. Semear o fungo, a partir

de repique recente, nos 4 lados do cubo de gar. Recobrir com uma lamnula

esterilizada. Fazer uma cmara mida, adicionando 1 a 2 ml de gua destila-

da estril no fundo da placa ou embeber um pequeno chumao de algodo

estril, para evitar a dessecao do meio de cultura, durante o crescimento

do fungo. Tampar a placa e deixar temperatura ambiente por 7 a 10 dias,

at que se observe desenvolvimento de hifas com ou sem pigmentao (Fi-

gura 6).

Aps esse perodo inativar a esporulao, adicionando 1 ml de formol ao

algodo e vedando a placa com fita adesiva durante 24 horas - 48 horas. Ovapor de formol, alm de inativar o fungo, ir auxiliar na fixao das estrutu-

ras microscpicas. Retirar a lamnula com auxlio de uma pina, cuidadosa-

mente, uma vez que nela devero estar aderidas as hifas e esporos do fun-

go. Pingar uma gota de corante azul de lactofenol-algodo (Cotton Blue) e

montar sobre uma lmina. Desprezar o cubo de gar e, em seu lugar, pingar

outra gota de corante lactofenol-azul algodo e recobrir com lamnula, para

visualizar esporos e hifas tambm aderidos lmina. Observar em micros-

cpio tico com objetiva de 40 X, o tipo e cor da hifa, forma, disposio e

formao de esporos.

Figura 6 Tcnica de microcultivo para anlise microscpica de fungos filamentosos


32/48



Figura 7 Estrutura geral de um fungo filamentoso

1.4.10 Identificao de fungos dimrficos

Dimrficos so fungos filamentosos que podem, sob determinadas condi-

es, assumir forma de levedura, diminuindo a capacidade de filamentao

e dividindo-se por brotamento, conferindo s colnias aspecto cremoso.

Essa fase leveduriforme ocorre sob temperatura acima de 30C, de prefern-

cia a 37C. So fungos de crescimento lento (>15 dias) no primo-isolamento

(Histoplasma capsulatume Paracoccidioides brasiliensis)ou moderado (8 a 14

dias), como Sporothrix schenckii. A identificao feita pela comprovao do

dimorfismo e pelo aspecto microscpico caracterstico de cada fase.

1.5 Descrio das principais micoses observadas no Brasil

1.5.1 Micoses superficiais

Dermatofitoses (tineas)

So infeces fngicas limitadas s camadas superficiais queratinizadas da

pele, pelos e unhas, popularmente conhecida como epinge ou frieira, de-

pendendo da localizao das leses que so extremamente pruriginosas. Em

imunodeprimidos podem acometer tecidos subcutneos.

Agentes etiolgicos: Microsporum spp, Trichophyton spp e Epidermo-phyton floccosum

Ocorrncia: universal, acometendo indivduos de qualquer idade, sexoou raa.

Fontes de infeco:contgio direto com animais, solo ou indivduo in-fectado.

Procedimento laboratorial:

Amostra: escamas de pele, unha e cabelos.


33/48



Exame da amostra com KOH a 20% revela hifas regulares, hialinas, sep-

tadas, refrigentes, frequentemente artrosporadas.

Cultura: material deve ser semeado em ASD, com auxlio de uma ala

em L, de forma a ficar em perfeito contato com o meio de cultura. Ascolnias de dermatfitos geralmente crescem a partir do 10 dia de

incubao temperatura ambiente e os fungos so identificados pela

sua morfologia macroscpica e microscpica. No Brasil, os dermatfi-

tos mais frequentes so T. rubrum eT.mentagrophytes eM. canis.

Figura 8 Caractersticas microscpicas dos gneros de dermatfitos

1.5.2 Micoses subcutneas e profundas

Esporotricose

Infeco crnica cuja forma clnica mais frequente em nosso meio a formalinfangtica nodular ascendente. Atinge, em geral, uma das extremidades

sob forma de leso ulcerada no ponto de inoculao e acomete a drenagem

linftica regional com formao de gomas no trajeto. As formas dissemina-

das so raras em pacientes imunocompetentes, mas frequentes em pacien-

tes com Aids.

Agente etiolgico: Sporothrix schenckii Ocorrncia:doena de distribuio universal que acomete principalmen-

te trabalhadores rurais e floristas. Procedimento laboratorial:

Amostra: aspirado das leses gomosas ou tecido subcutneo.

Exame microscpico da amostra apresenta baixa sensibilidade, mas

exame de cortes de tecido corados pode revelar leveduras em forma

de charuto ou apenas formas ovaladas com diviso em brotamento

(blastocondios).

Cultura: fungo dimrfico que se desenvolve bem em ASD entre 7 a 12

dias e cuja forma filamentosa (< 30C) apresenta hifas hialinas finas e

septadas com esporos dispostos em arranjo semelhante flor mar-garida. A forma leveduriforme (> 30C) no caracterstica do gne-


34/48



ro e requer meios ricos acrescidos de sangue, cistena e submetidos

tenso de CO2. O interesse na obteno da fase leveduriforme para

diferenciar o agente da esporotricose do gnero Sporothricum, fungo

filamentoso no-dimrfico e anemfilo de meio ambiente. A forma fi-lamentosa apresenta na microscopia a forma adequada para identifi-

cao do agente.

Figura 9 Microscopia em cultura de Sporothrix schenckii cultivado temperatura ambien-

te (A) e a 37oC (B)

ParacoccidioidomicoseDoena granulomatosa crnica que pode acometer pele, mucosas, linfono-

dos, sistema respiratrio, trato gastrointestinal, adrenais, fgado, bao e SNC.Apresenta grande variabilidade de manifestaes clnicas, desde formas

localizadas at formas disseminadas de mau prognstico, na dependncia

da resposta imune do hospedeiro. Existe tambm a paracoccidioidomicose-

infeco, em que o indivduo no apresenta sinais e sintomas mas demons-

tra por testes intradrmicos positivos que entrou anteriormente em contato

com o fungo. Apresenta muitas semelhanas com a tuberculose.

Agente etiolgico:ComplexoParacoccidioides (P.brasiliensis e P.lutzii)

Ocorrncia: pases da Amrica Latina, principalmente Brasil. Procedimento laboratorial:

Amostra: raspado de leso e mucosa, secreo do trato respiratrio,

aspirado de linfonodos, tecido obtido por bipsia.

Exame direto com KOH a 20% revela a presena da forma leveduri-

forme constituda de clulas grandes (10m a 60 m), globosas, com

parede celular dupla e refringente e com mltiplos brotamentos,

semelhana de roda de leme, orelhas de Mickey Mouse ou argolas

entrelaadas.

Cultura: fungo dimrfico de crescimento lento (> 15 dias). Culturas de-senvolvidas a < 30C so filamentosas, de cor branca, cotonosa, com


35/48



sulcos centrais, composta de hifas hialinas finas, septadas e fragmenta-

das em esporos multiformes. As colnias incubadas entre 30C a 35C

so de cor creme, pregueadas e enrugadas, cuja microscopia revela as

formas caractersticas leveduriformes que permitem a identificao doagente.

Figura 10 Microscopia em cultura de Paracoccidioides spp cultivado temperatura am-

biente (A) e a 37oC (B)

Histoplasmose

Doena que acomete primariamente o sistema retculo-endotelial. A infec-

o pode ser localizada ou generalizada. A histoplasmose primria afeta o

sistema respiratrio e a histoplasmose progressiva atinge fgado, bao, lin-

fonodos, mucosas, mdula ssea, etc. Em indivduos hgidos, a infeco tembom prognstico, porm atualmente importante infeco oportunista as-

sociada a Aids, nos quais ocorre a forma grave e disseminada.

Agente etiolgico:Histoplasma capsulatum

Ocorrncia: distribuio universal, principalmente em pases de climatemperado.

Fontes de infeco:inalao de esporos presentes em aerossis forma-dos por solos contaminados com excretas de galinhas e morcegos.

Procedimento laboratorial: Amostra: secreo do trato respiratrio, sangue, puno de mdula s-

sea, tecido obtido por bipsia de mucosas e outros.

Exame microscpico direto, sem colorao, requer muita habilidade

do tcnico. Recomenda-se colorao por Giemsa para melhor visua-

lizao do agente em de cortes histolgicos, onde se evidencia, sob

imerso, pequenas leveduras (2-5 m) intracelulares, dentro de clulas

mononucleares.

Cultura: fungo dimrfico de crescimento lento (15 a 30 dias) sendo

que no primo-isolamento mais fcil obter a forma filamentosa de corbranca, aspecto cotonoso e sulcado, temperatura < 30C. A confir-


36/48



mao do dimorfismo feita atravs de repique em meio rico (BHI) e

incubao entre 30C e 35C. A transformao da forma filamentosa

ou miceliana fase leveduriforme vista com a formao de peque-

nas (2-5 m) leveduras em brotamento. A identificao, porm, feitapela micromorfologia da forma filamentosa, com a observao de es-

poros grandes macrocondios arredondados e com inmeras espculas

ou granulaes na parede celular, chamados hipnsporos ou esporos

tuberculados.

Figura 11 Microscopia em cultura de Histoplasma capsulatum cultivado temperatura am-

biente (A) e a 37C (B)

1.5.3 Micoses oportunistas

CandidaseCandidiase uma doena com manifestaes clnicas variadas. As infeces

aguda e crnica mostram leses na boca, faringe, pele, unhas, sistema bron-

copulmonar, intestinal e perianal. Ocasionalmente, endocardite, meningite,

fungemia ou infeces em outras localizaes podem ser observadas.

Agentes etiolgicos:Candida albicanse outras espcies, que esto fre-

quentemente envolvidas em casos de micoses oportunistas em pacientesdebilitados. So os principais agentes etiolgicos de infeces hospitala-

res. As espcies de Candidapodem ser isoladas de vrios locais do corpo

humano, como microbiota normal de cavidade oral, mucosa vaginal, re-

gio perianal e trato gastrointestinal.

Ocorrncia: universal, incluindo as formas graves que ocorrem sob fato-res predisponentes para desenvolvimento da doena, tais como: desnu-

trio, obesidade, diabetes, gravidez, antibioticoterapia, quimioterapia e

uso de corticosterides, manipulao endovenosa inadequada, neopla-

sias e outras doenas debilitantes.


37/48




Amostra: (depender da sintomatologia clnica) fragmentos de pele e

unhas; raspados da mucosa oral, vaginal ou anal; secreo do trato res-

piratrio, sangue, lquor, urina e fezes. Exame de fragmentos de pele e unhas devem ser feitos com soluo

de KOH 20%. Secreo do trato respiratrio ou material de mucosa

podem ser examinados pela colorao de Gram. A levedura aparece

como clulas arredondadas, com brotamentos com ou sem hifas. Pe-

quenas clulas podem ter dimetro de 2-6m, mas formas maiores so

tambm observadas.

Cultura: o crescimento rpido (24-72 horas) entre 25C e 37C. O apa-

recimento ocorre em torno de 3 a 4 dias, com formao de colnias

com colorao branca bege.

Criptococose

A criptococose uma infeco subaguda ou crnica que envolve primaria-

mente os pulmes, com tropismo pelo sistema nervoso central (meninges),

podendo atingir pele e outros tecidos.

Agente etiolgico:Cryptococcus neoformans Ocorrncia: no homem, a distribuio da doena universal.


Amostra: lquor, secreo do trato respiratrio ou de leso de pele, as-pirado de formao tumoral subcutnea e tecidos obtidos por bipsia.

O exame laboratorial dever incluir urina, de preferncia aps massa-

gem prosttica, para monitorar a presena do agente na prstata que

constitui seu rgo de reserva.

Exame obrigatoriamente com tinta nanquim para observao de clu-

las capsuladas com dimetro varivel, entre 5 m a 20 m, que suge-

rem Cryptococcus sp.

Cultura: secreo do trato respiratrio, lquor e tecidos podem ser cul-

tivados em ASD ou qualquer outro meio, desde que no contenhamcicloheximida que inibe Cryptococcus. O agente cresce rpido (< 7 dias)

entre 25C e 37C, sob forma de colnias mucides de colorao creme

parda.

A identificao de gnero e espcie feita atravs de provas bioqumi-

cas como teste da urease e auxanograma.

AspergiloseA aspergilosepode se apresentar em indivduos imunocompetentes, como

leses localizadas em unhas, ps, canal auditivo, olhos e forma bronco-pul-monar alrgica. Em pacientes imunocomprometidos, tende forma dissemi-


38/48



nada ou cerebral, de alta letalidade, geralmente associada a neutropenia ou

a doenas debilitantes.

Agente etiolgico:Aspergillus fumigatus(o mais comumente isolado) Ocorrncia:tem distribuio universal. crescente o nmero de relatos

dessa doena como infeco secundria em pacientes em tratamen-

to prolongado com antibitico e corticosterides, doenas debilitantes

como carcinoma, tuberculose, pacientes neutropnicos, e em leses de

tecidos subcutneos, da pele ou da crnea.


Amostra: secreo do trato respiratrio, material de bipsia e lavado

brnquico.

O exame microscpico revela hifas septadas e hialinas, com 4 a 6 m

de dimetro e que se ramificam em ngulo de at 45.

Cultura: colnias de Aspergillus fumigatus, a espcie mais associada

doena em humanos, podem ser facilmente isoladas em ASD, em at

7 dias (crescimento rpido) com desenvolvimento, na superfcie do

meio, de filamentos brancos-hifas - que se tornam verde a verde-acin-

zentado, com a formao de esporos.

Figura 12 Micromorfologia deAspergillus fumigatus

Fusariose

Hialo-hifomicose com quadros clnicos os mais variados, incluindo processos

generalizados em pacientes com neoplasias. Destaca-se atualmente sua im-

portncia como agente de ceratites e onicomicoses.


39/48



Agentes etiolgicos: as espcies de Fusariummais frequentemente rela-tadas em casos de infeces humanas soFusarium solani, F. oxysporum, F.

chamydosporum eF. verticillioides (F. moniliforme).

Ocorrncia: Fusariumspp so ubquos e raramente causam infeco emindivduos sadios, no entanto, as infeces disseminadas so, na maioria,

relatadas em locais de clima quente.

Procedimento laboratorial: Amostra: dependente da localizao da leso, bipsia ou raspado de

pele, crnea, fragmento de unha ou, em casos de suspeita de dissemi-

nao, sangue.

Cultura: colnia inicialmente branca e coberta por um miclio areo

plumoso que ao maturar produz um pigmento de cor lavanda a ver-

melho prpura na superfcie e no reverso. Apresentam hifas hialinas,

septadas, microcondios de 2 a 3 mm de dimetro, e macrocondios

com forma de banana ou de foice pela observao em microscopia

ptica.

Figura 13 Micromorfologia de Fusarium spp

ZigomicoseInfeco geralmente subaguda de evoluo rpida que acomete indivduos

debilitados, transplantados, diabticos descompensados ou ainda com Aids.

Pode acometer seios paranasais, tecido subcutneo, pulmo e vasos sangu-neos, causando embolia no SNC e trombose. A micose em indivduos imuno-

deficientes , em geral, fatal se o diagnstico no for rpido e o tratamento

especfico no for prontamente estabelecido.

Agentes etiolgicos:fungos da classe dos Zigomicetos, compreenden-do os gneros Mucor, Rhizopus,Absidia, entre outros.

Ocorrncia:distribuio universal. Procedimento laboratorial:

Amostra: secreo de sinus nasal ou tecidos obtidos por bipsia deseios paranasais ou leses subcutneas.


40/48



Exame com KOH a 20% revela hifas hialinas e largas (6-50m), cuja ca-

racterstica principal a ausncia de septos, que caracterizam as hifas

cenocticas desse grupo de fungos.

Cultura: fungos de crescimento rpido (< 72 h) a 25C em ASD, comhifas ereas abundantes. A identificao feita pela microscopia da

colnia que evidencia hifas cenocticas e esporos contidos dentro de

estruturas fechadas denominadas esporngios.

Figura 14 Micromorfologia de Rhizopus sp

As localizaes topogrficas mais frequentes, relacionadas aos agentes fn-

gicos esto resumidas na Tabela 1.


41/48



Tab

ela1

Agentesetiolgicose

localizaestopogrficas

Dermatfitos

H.

capsulatum

P.

brasil

iensis

S.

schenckii

Aspergillus

sp

Candida

sp

C.

neoforman

Zigomicetos

Tra

torespiratrio

x

x

x

x

x

x

San

gue

x

x

x

x

x

x

Osso

x

x

x

x

x

Me

dulassea

x

Pel

eeUnha

x

x

Pel

o

x

Crebro

x

x

x

x

x

x

Lq

uor

x

x

x

Ou

vidos

x

Olh

os

x

x

Fg

adoeBao

x

x

Naso-faringe

x

x

x

x

Mu

cosas

x

x

x

Tec

idossubcutneoegnglios

x

x

x

x

x

Tra

tourinrio

x

x

x

Tra

togastrointestinal

x

x


42/48



1.6 Corantes e meios de cultura

Esto detalhados aqui apenas os corantes e meios de cultura mais utilizados na rotina

diria e que podem ser preparados facilmente no laboratrio. Para maiores detalhese outros meios, recomenda-se a bibliografia no final do captulo.

Corante Azul de lactofenol-algodo

Composio:

cido ltico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20g

Cristais de fenol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20g

Glicerina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20g

Azul algodo* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05g

gua destilada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20ml

Preparo:

Fundir os cristais de fenol em banho-maria e juntar.

Esperar 24 horas e filtrar.

* O azul algodo pode ser substitudo pelo azul de metileno.

Os meios de cultura utilizados para o isolamento primrio de fungos a partir

de amostras biolgicas podem ser adquiridos no comrcio, sob a forma de-

sidratada, no precisando ser formulados no laboratri

módulo 8 - manual de microbiologia - anvisa

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