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Manual de Técnicas Microbiológicas

Para la Evaluación de la Calidad Ambiental de Ecosistemas Marino costeros

HONORABLE AYUNTAMIENTO DE SOLIDARIDAD 2008-2011

CRÉDITOS

COMITÉ EDITORIAL

Honorable Ayuntamiento del Municipio de Solidaridad

C. Eduardo Román Quian AlcocerPresidente

Dirección General de Ordenamiento Ambiental y Urbano

Arq. Jorge Alonso Durán RodríguezDirector General

Dirección de Medio AmbienteM. en C. Gladys Pérez de la Fuente

Directora

MANUAL DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS PARA EVALUACIÓN

DE LA CALIDAD AMBIENTAL DE ECOSISTEMAS MARINO COSTEROS

Ministerio de Ciencia, Tecnología y Medio Ambiente

Instituto de Oceanología, CubaDepartamento de Microbiología-Necton

Dra. María Elena Miravet RegaladoM. en C. Diana Iris Enríquez Lavandera

Dra. Margarita Lugioyo Gallardo

Universidad Nacional Autónoma de MéxicoInstituto de Biología

Departamento de Botánica

Dra. María del Carmen González Villaseñor

ColaboradoresDirección de Medio Ambiente

M. en C. Gladys Pérez de la FuenteDirectora

M. en C. Nuria Joseph MonteroLic. María Cristina Capó de Paz

Técnico Francisca Rodríguez Acosta

Estamos conscientes de la importancia de este libro para los especialistas de habla hispana que se desenvuelven en el tema del medio ambiente e incluso, para los estudiantes que se inician en esta línea, ya que brindan los detalles necesarios para de-terminar la calidad ambiental del ecosistema marino a partir de diferentes indicadores microbiológicos, que como es conocido, permite tomar medidas inmediatas para la protección y/o recuperación de las condiciones naturales.

El presente Manual, resume las técnicas y metodologías de microbiología ma-rinas más utilizadas para abordar los aspectos siguientes:

evaluación de la calidad del agua de uso recreativo, desde el punto de •vista higiénico sanitario, evaluación de la calidad ambiental de las aguas y sedimentos en los •diferentes ecosistemas marinos (arrecifes, manglares, pastos marinos, playas), determinación de microorganismos indicadores del grado de contami-•nación tanto orgánica, como por la presencia hidrocarburos, en la zona costera marina, velocidad de autodepuración de las aguas marinas (importante para in-•ferir la capacidad de recuperación), parámetros microbiológicos útiles en estudios de factibilidad para situar •granjas para cultivo de organismos marinos, indicadores microbiológicos necesarios para hacer “líneas bases” en •sitios de desarrollo turístico, en aquellos donde se sitúen plataformas petroleras u otras industrias.

• Además de los indicadores de calidad ambiental, se incluyen técnicas para

aislar microorganismos de peces, crustáceos, algas y otros organismos marinos con di-versos fines, y de interés biotecnológico como:

técnicas para aislar microorganismos marinos productores de sustancias •biológicamente activas (tensoactivos, polisacáridos y luciferasa), técnicas para estudiar la diversidad de hongos marinos en playas, man-•glares, y arrecifes.

El Manual ofrece también detalles explícitos y recomendaciones prácticas para facilitar el montaje de las técnicas e interpretación de los resultados, y constituye un basamento adecuado para estudios de pre y postgrado de microbiólogos y biólogos ma-rinos.

Se merece destacar que es una importante contribución para el Programa Inte-gral de Playas Limpias en México, en el cual participa el H. Ayuntamiento del Munici-pio de Solidaridad, a través del Comité Local de Playas Limpias de la Zona Norte del Estado de Quintana Roo.

PREFACIO

Editores

La historia evolutiva de los microorganismos se remonta a más de 3 mil 500 mi-llones de años y una parte importante de ésta ha ocurrido en el medio marino. Desde entonces, los microorganismos constituyen un componente esencial de las redes tróficas de los ecosistemas marinos, con una gran abundancia y biomasa, contribuyendo a la re-generación de nutrientes e interactuando con una amplia gama de organismos.

Los microorganismos marinos juegan un papel importante en los ciclos bio-geoquímicos de carbono, el nitrógeno, el azufre, el fósforo, el hierro y los metales trazas, pero además constituyen nuevas fuentes de producción de sustancias biológicamente activas de interés para las industrias médico-farmacéutica, petrolera, alimenticia, etc.

Este Manual de Técnicas de Microbiología Marina, está dirigido a estudiantes, docentes y especialistas de América Latina que se proponen a estudiar e investigar dife-rentes aspectos relacionados con las bacterias y los hongos que habitan en el ecosistema marino. Su principal ventaja es que en él se han recopilado técnicas y metodologías de trabajo muy utilizadas en esta especialidad, que se encuentran dispersas en diferentes publicaciones en otros idiomas, lo que facilita al usuario de habla hispana su consulta en un único documento.

Otro aspecto importante de este documento, es que sirve de apoyo a los profeso-res en la preparación y desarrollo de los programas dre educación superior relacionados con las ciencias marinas, y a los jóvenes graduados que se inician en los trabajos de ecología microbiana marina.

El manual se ha conformado dividido en seis capítulos. En el primero se abordan aspectos teóricos generales sobre la distribución e importancia de los microorganismos marinos en el ecosistema y algunas generalidades de los principales biotopos que carac-terizan nuestra región.

El segundo capítulo reune algunas de las técnicas más utilizadas de enumeración de bacterias heterótrofas, sulfatoreductoras y coliformes, de suma importancia en estu-dios de contaminación orgánica y fecal en aguas marino costeras, así como las técnicas de aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos y productoras de tensioactivos, productoras de polisacáridos, bacterias luminicentes, bacterias asociadas a peces inverte-brados marinos, y bacterias asociadas a macroalgas y fanerógamas marinas.

En el tercer capítulo se describen técnicas y metodologías de aislamiento de hongos marinos de playas, pastos marinos, manglares, y hongos asociados a gorgónidos, haciéndose referencia a las claves más actualizadas de identeificación de estos microor-ganismos.

El cuarto capítulo explica los métodos que se utilizan para la conservación de bacterias y hongos en el laboratorio, brindando referencias que permiten profundizar en detalles específicos para cada caso.

En el capítulo quinto se describen las técnicas de conteo total de mecroorganis-mos empleando microscopía de epifluorescencia, la determinación de bimasa a partir del

PRÓLOGO

Dra. Lina Domínguez AcostaViceministro

Ministerio de Ciencia , Tecnología y Medio Ambiente de Cuba

volumen celular y el conteo total y varios métodos para determinar la productividad bac-teriana. También, se presentan las técnicas para determinar la productividad bacteriana. También, se presentan las técnicas para determ,inar la fotosíntesis, producción primaria y respiración, aspectos sumamente importantes en los estudios sobre el funcionamiento del medio marino, y por último, se describen las técnicas para determinar la intensidad de los procesos de descomposición aerobia y anaerobia de la materia orgánica, respec-tivamente, empleando métodos que no requieren de una infraestructura compleja y re-cursos sofisticados.

El capítulo sexto y final, brinda la composición de los medios de cultivo que se han citado en los capítulos dos y tres, lo que permite disponer de toda la información técnica necesaria para realizar las técnicas descritas.

Las técnicas que se describen en este manual han sido probadas con éxito en el Laboratorio de Microbiología Marina del Instituto de Oceanía de Cuba y en el Labora-torio de Ascomicetos del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México.

Resulta meritorio el empeño colectivo de las autoras de poner a disponer del alumnos y profesores el resultado de sus experiencias para contribuir al conocimiento del mundo marino.

Esperamos que el noble propósito de las autoras les permita a los lectores seguir los caminos de los nuevos conocimientos para habitar un mundo más sano y mejor.

“Hay más microorganismos en el mar que estrellas en el universo”

Copley, J. 2002. All at sea. Nature 415: 572-574.

PREFACIO

PRÓLOGO CAPÍTULO 1. Introducción. 1.1. Distribución de los microorganismos en el mar ........................................................1.2. Importancia de los microorganismos marinos ............................................................1.3. Características de los Ecosistemas marinos ............................................................... CAPÍTULO 2. Técnicas de Bacteriología. 2.1. Enumeración de bacterias heterótrofas aerobias mesófilas ........................................2.2. Enumeración de bacterias sulfatoreductoras ..............................................................2.3. Enumeración de Coliformes totales y fecales ............................................................2.4. Enumeración de Estreptococos fecales ......................................................................2.5. Aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos ..........................................2.6. Aislamiento de bacterias productoras de sustancias tensioactivas .............................2.7. Aislamiento de bacterias productoras de polisacáridos extracelulares ....................... 2.8. Aislamiento de bacterias luminiscentes ......................................................................2.9. Aislamiento de bacterias asociadas a organismos marinos ........................................2.10. Aislamiento de bacterias asociadas a macroalgas y fanerógamas marinas............... CAPÍTULO 3. Técnicas Micológicas. 3.1. Aislamiento de hongos en las playas ..........................................................................3.2. Aislamiento de hongos de los pastos marinos ............................................................3.3. Aislamiento de hongos asociados al mangle ..............................................................3.4. Aislamiento de hongos asociados a organismos marinos ........................................... CAPÍTULO 4. Métodos de Conservación. 4.1. Bacterias .....................................................................................................................4.2. Hongos ........................................................................................................................ CAPÍTULO 5. Técnicas y Métodos en Ecología microbiana. 5.1. Conteo Directo del Número Total de microorganismos .............................................5.2. Determinación de biomasa .........................................................................................5.3. Determinación de la Productividad bacteriana ...........................................................5.4. Determinación de la Fotosíntesis, la Producción primaria y la Respiración ...............5.5. Determinación de la intensidad del proceso de mineralización aerobia de la materia orgánica .....................................................................................................5.6. Determinación de la intensidad del proceso de mineralización anaerobia de la materia orgánica en los sedimentos ................................................................... CAPÍTULO 6. Medios de Cultivo. 6.1. Bacterias .....................................................................................................................6.2. Hongos ........................................................................................................................

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ÍNDICE

Capítulo 1

Introducción

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

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Microorganismo es un término que incluye distintas formas de vida que comparten la característica común de tener un tamaño menor de 200 µm (Tabla 1). Estas formas de vida pueden pertenecer a cualquiera de los tres do-minios de la vida que existen en nuestro planeta, Archaea, Bacteria y Eukar-ya (Woese et al. 1990), e incluye desde procariotas (bacterias y arqueas) hasta eucariotas (algas y protistas fagotrofos), tanto autótrofos como heterótrofos. Asimismo, dentro del ámbito de estudio de la Microbiología se incluyen los virus y otros agentes subvíricos que no presentan estructura celular (López y Zaballos, 2005). Recientemente, se ha propuesto un nuevo dominio biológico denominado Akamara para incluir estas formas de vida (Hurst, 2000). Dentro de este nuevo dominio se propone incluir dos reinos, Euviria (virus verda-deros) y Viroidia (viroides y virusoides), y una organización en phyla, clases, órdenes, géneros y especies similar a la del resto de seres vivos (Hurst, 2000).

Categoría Grupo Microbiano Tamaño (µm)Femtoplancton Viruses 0.01-0.2 Picoplancton Procariotes

Bacterias Fotoautótrofos Proclorofitas Cianobacterias cocoides Cianobacterias- filamentosas Quimioautótrofas Heterótrofas

Archaea Picoalgas Flagelados picoheterótrofos

0.5 – 1.00.5 – 2.01.0 – 2.07-10 ancho <= 100 longitud

0.3-1.00.3-1.0

1.0-2.0

Nanoplancton Nanoalgas Nanoheterotróficos- (flagelados)

2.0-20

Microplancton Microalgas Protistas microheterótrofas Ciliados Dinoflagelados heterótrofos

20-200

Tabla 1. Diferentes categorías en que se agrupan los microorganismos de acuerdo a su tamaño (Tomado de Sherr, E. y Sherr, B. 2000. Marine microbes: an overview. En: Microbial Ecology of the Oceans. Ed. D.L. Kirchman, Wiley-Liss, New York. 13-46).


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1.1. Distribución de los microorganismos en el mar.

En el mar, los microorganismos se encuentran distribuidos en toda su extensión: desde la costa hasta zonas oceánicas muy distantes, y desde la super-ficie hasta profundidades abismales, ocupando una gran variedad de habitats.

En la distribución y abundancia de los microorganismos marinos en el océano se reconoce que influyen, de manera general, tres gradientes:

Gradiente de profundidad, en el cual varía la cantidad y calidad •de la luz, la concentración de nutrientes, la temperatura y la pre-sión, Gradiente nerítico-oceánico, en el cual varía la disponibilidad de •materia orgánica teniendo en cuenta que en las aguas costeras-neríticas hay mayor influencia del escurrimiento terrígeno y el aporte de los ríos, yGradiente latitudinal, que ocurre debido a las variaciones en la •energía solar, es decir, las bajas latitudes reciben más energía por m2 que las altas latitudes, creándose vientos que causan mezclas, afloramientos y corrientes en el océano.

Para facilitar su estudio, el ecosistema marino se ha dividido de manera empírica (Fig.1).

Fig.1. Habitats marinos (Tomado de Taylor, B.F. 1992. Marine Habitats, Bacteria. Enciclopedia of Microbiology, Vol.3, p.29-44).

Una primera subdivisión se hizo entre las aguas (hábitat pelágico) y los sedimentos (hábitat béntico). Ambos habitats pueden corresponder a zonas de plataformas insulares o continentales conocidas como neríticas (desde la costa


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hasta 100 m de profundidad), o a zonas oceánicas de mas de 100 m de profun-didad, hasta profundidades abismales.

También la interfase superficie del mar-atmósfera constituye un hábitat especializado donde habitan organismos llamados “neuston”.

Otro hábitat lo constituyen los vegetales y organismos marinos ver-tebrados o invertebrados que proveen a los microorganismos de sus propios cuerpos como superficies sobre las cuales pueden formar sus colonias, e inclu-so, establecer relaciones de interacción muchas veces de beneficio mutuo.

Los restos de plantas y animales (detritus) y en general, los agregados de materia orgánica (“nieve marina”), las partículas fecales e inorgánicas, así como las estructuras sumergidas construidas por el hombre, constituyen tam-bién superficies inanimadas que promueven el crecimiento microbiano en el medio marino.

La composición química de los agregados es heterogénea, contienen cantidades significativas de carbohidratos y proteínas por lo que constituyen un micro hábitat rico en nutrientes con concentraciones de carbono y nitró-geno varios órdenes de magnitud mayor que la encontrada en las aguas circun-dantes (Alldredge y Silver, 1988). En estos agregados se han registrado elevadas tasas de producción primaria (Gotschalk y Alldredge, 1989) y se ha comproba-do que las bacterias que se desarrollan en ellos suelen ser fácilmente cultivables y de tamaño mayor que las de vida libre (Eguchi y Kawai, 1992).

Los agregados constituyen reservorios de nutrientes para las bacterias de vida libre, que pueden tomar su alimento directamente de ellos, aunque también se ha constatado que las células que forman parte de los agregados son responsables de la solubilización de las partículas de detritos mediante actividad exohidrolasa, produciendo la liberación de carbono orgánico al me-dio circundante (Smith et al. 1992). Los compuestos de bajo peso molecular solubilizados pueden ser entonces utilizados por la comunidad de bacterias pelágicas oligotróficas.

En la zona costera, la celulosa es el componente predominante del detri-tus. Proviene tanto de la vegetación costera como de la submarina.

Las partículas de materia orgánica están formadas por proteínas, po-lisacáridos (incluyendo quitina) y lípidos; algunos de estos compuestos son degradados por los microorganismos en la columna de agua y otros menos ase-quibles a la actividad microbiana (refractarios) se depositan en el fondo donde ocurre su descomposición final.


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Las partículas inorgánicas llegan al mar a través del escurrimiento te-rrígeno y los ríos y también, provienen de dientes, esqueletos y conchas de organismos marinos.

En resumen, los microorganismos pueden encontrarse libres en la co-lumna de agua formando parte del plancton, en los sedimentos, o adheridos a organismos o sustratos inanimados.

1.2. Importancia de los microorganismos marinos.

La historia evolutiva de los microorganismos se remonta a más de 3 500 millones de años y una parte importante de ésta ha ocurrido en el medio mari-no. Desde entonces, los microorganismos constituyen un componente esen-cial de las redes tróficas de los ecosistemas marinos, con una gran abundancia y biomasa, contribuyendo a la regeneración de nutrientes e interactuando con una amplia gama de organismos (López y Zaballo, 2005).

Dentro de la diversidad de microorganismos que habitan en el medio marino, las bacterias y los hongos juegan un papel predominante, ya que se ocupan de descomponer la materia orgánica presente en el mar dando lugar a compuestos menos complejos asequibles a otros organismos de la trama ali-mentaria.

Un ejemplo importante es la capacidad de los hongos de despolimerizar la celulosa y la pectina en la materia vegetal residual, con lo cual ablandan y ayudan a la descomposición de dicho material, haciéndolo accesible para otros invertebrados que pueden así devorarlo.

Paralelo al proceso de descomposición, las bacterias y los hongos asi-milan los compuestos orgánicos disueltos para formar su propia biomasa, la que a su vez, queda disponible para ser consumida como alimento por pro-tozoos y flagelados, así como por otros organismos. Esta vía microbiana de reincorporación de materia orgánica a la trama alimentaria se conoce como “lazo microbiano” (“microbial loop”, Azam, 1998) y es de suma importancia en el funcionamiento del ecosistema marino.

En aguas oceánicas profundas donde la presión hidrostática es como promedio, 400 veces mayor que en la superficie, la temperatura es baja, y por lo general, la materia orgánica es escasa, existen bacterias barotolerantes y barófi-las adaptadas a la escasez de materia orgánica (oligotróficas) y a las bajas tempe-raturas (psicrófilas) que juegan un papel preponderante en la descomposición de los restos fecales producidos por los organismos (Taylor, 1992).


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También, existen bacterias que viven en el intestino de anfípodos de aguas profundas proveyéndolos de nutrientes que no pueden absorber por otras vías.

Un descubrimiento de gran impacto fue conocer que determinados mi-croorganismos quimiolitotrófos viven en asociación directa con invertebrados (gusanos tubícolas) que habitan en fuentes hidrotermales submarinas que ex-pulsan fluidos a 270-380°C. Estos invertebrados dependen de la actividad de los microorganismos que crecen a expensas de las fuentes de energía inorgá-nicas procedentes de las propias fuentes hidrotermales, e incorporan dióxido de carbono, que se encuentra en abundancia en el agua de mar en forma de CO3

2- y HCO3-, a la forma orgánica. Estos microorganismos quimiolitotrófos proporcionan alimento a los animales, ya que estos se nutren de los productos de excreción de los simbiontes y de las células muertas de los mismos, por lo que se consideran la base de la corta trama alimentaria en la que se encuentran los organismos que viven junto a las fuentes hidrotermales (Madigan et al. 1999).

Los microorganismos juegan un papel importante en los ciclos bio-geoquímicos del carbono, el nitrógeno, el azufre, el fósforo, el hierro y los metales trazas.

En la mayoría de los ecosistemas, el nitrógeno es eficientemente recicla-do debido a la actividad descomponedora de los microorganismos que da lugar a formas inorgánicas como nitratos o amonio. En los pastos marinos, el nitró-geno es fijado por las cianobacterias que viven en las hojas y por las bacterias anaerobias que viven en las raíces, en los rizomas y en los sedimentos.

En los sedimentos, la oxidación de la materia orgánica ocurre a partir del uso de diferentes aceptores de electrones en la medida que aumenta la pro-fundidad y cambia la disponibilidad de estos compuestos (Fig.2).

Fig.2. Distribución típica de los compuestos aceptores de electrones que utilizan las bacterias en los sedimentos (Tomado de Taylor, 1992).


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Cuando se agota el oxígeno, más del 50% de la mineralización de la materia orgánica ocurre gracias a la actividad de las bacterias sulfatoreducto-ras, las cuales llevan a cabo este proceso a partir de la reducción de sulfatos en condiciones anaerobias.

Entre los ciclos del azufre y el hierro se producen interacciones com-plejas en muchos ambientes. Una de las formas más corrientes del hierro y el azufre es la pirita (FeS2), la cual forma una estructura cristalina altamente insoluble. La oxidación bacteriana de este compuesto tiene gran importancia para el desarrollo de las condiciones de acidez en las minas y en los drenajes mineros, y también, en el proceso de lixiviación de los metales.

Otra actividad de importancia económica y ambiental donde participan los microorganismos es la descomposición del petróleo y sus derivados. La eliminación del petróleo o de otros contaminantes mediante el uso de micro-organismos se conoce como “bioremediación” y ha sido ampliamente utilizado para descontaminar zonas donde se han producido vertidos de crudos.

También, se conoce que existen hongos y bacterias capaces de degradar compuestos químicos sintéticos (xenobióticos) como los plaguicidas y herbi-cidas, lo cual es de gran utilidad para el saneamiento del medio ambiente, pero además, tiene un significado evolutivo, ya que estos compuestos no existían en la Tierra hasta hace poco más de 50 años (Madigan et al. 1999).

Desde el punto de vista biotecnológico, además de la bioremediación, se reconoce la importancia de los microorganismos marinos como potencia-les productores de sustancias biológicamente activas para la industria médico-farmaceútica. Los grupos de microorganismos más estudiados con estos fines son las microalgas, las bacterias y los hongos marinos (Fenical y Jensen, 1993; De la Rosa y Gamboa, 2003).

Existen numerosas publicaciones de diferentes autores que refieren la detección de microorganismos productores de antibióticos, agentes antitumo-rales, antivirales y enzimas (Atlas y Bartha, 2002; De la Rosa y Gamboa, 2003; Nishihara et al. 2008), sin embargo, aún existen microorganismos que no cre-cen en los medios de cultivo tradicionales, o después de crecer, pierden la ca-pacidad de producir determinado compuesto. El hecho de que las condiciones que prevalecen en el medio marino sean difíciles de reproducir en laboratorio provoca que un elevadísimo porcentaje de estas bacterias (hasta un 99%) no haya podido ser cultivado, y por tanto, se desconozca qué papel ecológico jue-gan de manera individual.

Hoy en día es posible también abordar el estudio de la dinámica de un ecosistema natural a nivel genómico. Mediante el análisis de los genomas com-


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pletos se puede intentar reconstruir el funcionamiento de los microorganis-mos, así como su potencial fisiológico y metabólico, y relacionarlo con los compuestos existentes en el ambiente en el que se desarrollan (López y Zaba-llos, 2005; Amann y Fuchs, 2008).

1.3. Características de los ecosistemas marinos.

Arrecifes coralinos.Los arrecifes coralinos son estructuras geológicas sólidas, masivas, de

origen biológico, y con formas variadas, que cubren la matriz rocosa de algu-nos fondos marinos tropicales y subtropicales. Éstos crecen hacia la superficie y son creados por organismos fijos al fondo que forman esqueletos pétreos de carbonato de calcio. En el Gran Caribe, los organismos fijos que los confor-man son principalmente, los corales pétreos, las esponjas, los octocorales, las ascidias y las algas, y los móviles, una rica fauna de peces e invertebrados.

Los arrecifes coralinos, además de una alta diversidad biológica, poseen grandes valores naturales y socio-económicos. Tienen gran valor intrínseco por su carácter único. A pesar de su muy limitada extensión sobre el océano, los arrecifes coralinos albergan la cuarta parte de las especies marinas del mun-do (Alcolado, 2006). Más del 25% de las capturas comerciales de los países en desarrollo provienen de especies que habitan o guardan alguna relación de dependencia con ese biotopo (Jameson et al. 1995).

Según Costanza et al. (1997) los arrecifes del mundo en conjunto pro-veen bienes y servicios por valor de cerca de 375 000 millones de USD/año. Spalding et al. (2001) estimaron un total mundial de 284 300 km2 de arrecifes, por tanto, estas dos cifras arrojan un estimado grueso de ingresos de 1 319 millones de USD/año por km2 de arrecife (Alcolado 2006).

En los arrecifes habita una gran diversidad de microorganismos, vege-tales e invertebrados portadores de sustancias biológicamente activas, que se emplean o constituyen recursos potenciales como fármacos y reactivos de in-terés bioquímico. Muchas de sus especies se utilizan para la elaboración de objetos de artesanía y bisutería. Los arrecifes constituyen una de las principales fábricas de la arena blanca que nutre las playas, principal recurso turístico de la mayoría de los países caribeños. Sus barreras o crestas brindan protección a las costas contra la erosión producida por el oleaje y también protegen poblados y edificaciones de las costas.

Además de constituir un extraordinario atractivo para el turismo de bu-ceo, los arrecifes coralinos poseen un gran valor educacional, científico y ético. Según Alcolado (2006) también son indicadores de la calidad de las aguas marinas y de los efectos de los cambios climáticos globales.


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Sobre la diversidad de bacterias y hongos en arrecifes de coral, existe escasa información, el mayor énfasis se ha puesto en el estudio del efecto de los microorganismos sobre la “salud” de los arrecifes, ya que algunas enferme-dades de los corales se han atribuido a la acción de microorganismos patógenos específicos (Borneman, 2008).

Los fondos duros no arrecifales. Los fondos duros no arrecifales se localizan en las macrolagunas, fuera

de las zonas pre-arrecifales y arrecifales. Se caracterizan por poseer básicamente un fondo rocoso cubierto por una capa de arena predominantemente delgada o localmente ausente, y a menudo, por parches de pastos marinos o de pequeños depósitos de arena. Con frecuencia suelen presentar corales aislados, típica-mente del género Solenastrea o pequeños cabezos coralinos y gorgóneas de los géneros Pterogorgia y Pseudopterogorgia entre otros. Tiende a ser un biotopo más bien mixto a manera de mosaico, lo que lo hace portador de una notable diversidad de especies, en comparación con la que corresponde a los biotopos componentes. A diferencia de los arrecifes sus aguas son menos transparentes por la mayor concentración de fitoplancton. No deben confundirse con los fondos de cabezos o de arrecifes de parche, ni con los que algunos denomi-nan fondos duros no colonizados o “comunidades de corales”, ya que no son arrecifes porque el cubrimiento de corales es inferior al 10%. Estos aparecen comúnmente dentro del perfil de los arrecifes a poca profundidad (general-mente a menos de 6 m de profundidad) y se corresponden con la terraza somera o superior, conocida como zona de Pseudopterogorgia (Goreau, 1959), pavi-mento rocoso o explanada abrasiva. También aparecen en bajos de muy escasa profundidad formando crestas que actúan como rompientes.

Este biotopo sostiene una pesca que incluye esponjas, langostas y varias especies de peces. Alberga especies de corales que son muy raras en los arreci-fes coralinos. Algunos sitios pueden resultar de interés contemplativo para el turismo de naturaleza y la recreación (Alcolado, 2006).

Fondos de sedimentos no consolidados.

Biotopo arenoso y de playa. El biotopo arenoso o arenal puede ser: desde puramente arenoso hasta

areno-fangoso, según la proporción de fango o cieno (partículas más finas). Su existencia se debe a la relativa inestabilidad producida por un fuerte hidrodina-mismo (oleaje y corrientes) que limitan la deposición de sedimentos de fango o cieno y de materia orgánica particulada, e impiden el desarrollo de yerbas ma-rinas. En Cuba la composición de la arena tiende a estar dominada por restos de algas calcáreas, de moluscos y de corales, aunque en lugares específicos está compuesta mayormente por oolita (granos de arena casi esféricos que se forman por deposición de carbonato de calcio bajo condiciones físicas específicas de tem-peratura, salinidad, y pH).


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Debido a su inestabilidad, este biotopo se caracteriza por su relativa-mente baja diversidad de especies y poca productividad. En él pueden habi-tar macroalgas (comúnmente algas verdes calcáreas como Halimeda, Penicillus, Udotea, Rhipocephalus, etc.) o delgados tapices de microfitobentos. Ejemplos de este tipo de fondo son las playas, médanos, bancos, depósitos en lechos rocosos, cangilones de arrecifes y algunas terrazas arrecifales. Constituye un hábitat de especies especializadas, brinda refugio y alimento a algunas especies que se entierran en la arena (rayas, algunos peces teleósteos, poliquetos, holotu-rias, etc.), proporciona arena para las playas y construcciones y contribuye a la formación y mantenimiento de las dunas de las playas y las cuencas arenosas.

Biotopo fangoso. Como su nombre lo indica, el fondo fangoso o fanguizal, está formado

por sedimentos en que predomina la fracción fangosa o cieno. De acuerdo a la granulometría y la hidrodinámica local, los fangos pueden ser más o menos blandos o compactos, llegando a ser casi “líquidos” cuando son pelíticos, es decir, el diámetro promedio de las partículas es menor de 0.0625 mm. La falta de luz, la sedimentación excesiva y la “liquidez” del fondo suelen ser las causas que impiden el desarrollo de las yerbas marinas en ellos. Los fangos “líquidos” son menos propicios para el desarrollo del bentos que los más compactos y es-tables. Si bien su diversidad de especies es comparativamente baja, su produc-tividad neta (explotable) puede ser localmente alta. Su ambiente como regla es fluctuante e impredecible, y además se caracteriza por un régimen hidrodiná-mico comparativamente débil. Es típico de ambientes eutrofizados y también, de plataformas profundas protegidas, donde la luz que llega al fondo es insufi-ciente para el desarrollo de pastos marinos. Como fauna típica pueden mencio-narse camarones, telestáceos, algunas esponjas, erizos irregulares y peces.

Los fondos fangosos saludables son altamente productivos y constitu-yen una fuente de importantes recursos pesqueros como camarones, moluscos y peces. Este biotopo, mediante la descomposición de materia orgánica que produce e importa, genera y exporta nutrientes a otros ecosistemas marinos (Alcolado, 2006).

Pastos marinos (vegetación sumergida). Los pastos marinos, conocidos como seibadales, son fondos de sedi-

mentos no consolidados con desarrollo de yerbas marinas (fanerógamas) y algas. Las yerbas son principalmente Thalassia testudinum, Syringodium fi-liformis y Halodule wrighti. En lugares afectados por altas salinidades o en médanos muy bajos sometidos a altas temperaturas suele dominar H. wrighti. Estos despliegan una alta productividad neta que es exportada a los arrecifes y explotada por el hombre.


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Los pastos marinos son la principal vía de entrada de la energía que ga-rantiza la productividad biológica y pesquera en la plataforma cubana y cons-tituyen una fuerte reserva ecológica de materia y energía en forma de biomasa, parte de la cual es exportada a los arrecifes y al océano lo que en cierta me-dida aumenta la productividad de éstos biotopos. Se ha estimado el valor de los bienes y servicios de los pastos marinos en unos 19 000 USD/ha año, to-mando como referencia solamente su importancia en el reciclaje de nutrientes (Constanza et al. 1997). También actúan como estabilizadores del fondo, pre-viniendo su erosión y la afectación de los arrecifes y de las playas colindantes, regulan la concentración de oxígeno y gas carbónico en el mar, y condicionan fuertemente los procesos biogeoquímicos locales. Muchos pastos marinos son formadores de gran parte de las arenas de las playas gracias al desarrollo de algas calcáreas, principalmente Halimeda (Alcolado, 2006).

Las lagunas costeras y estuarios Las lagunas costeras son cuerpos de agua relativamente pequeños, poco

profundos (menos de 2 m), con conexión limitada, permanente o temporal con el mar. Poseen, en su mayoría, considerable aporte de agua dulce, sedimentos, nutrientes y materia orgánica procedentes de tierra, lo que determina en parte su alta productividad biológica, o en caso de exceso de los dos últimos, su degradación. El sedimento principal es el fango o cieno de color oscuro, casi siempre con penetrante olor a sulfuro de hidrógeno. Cerca de las desembo-caduras puede haber sustrato rocoso a causa de las corrientes de marea que impiden la acumulación de sedimentos. Se caracterizan por sufrir fluctuaciones relativamente grandes en la salinidad y temperatura, y en muchos casos de la propia biota. Generalmente, están bordeadas por bosques de mangle y pueden abundar los pastos marinos sobre todo, hacia las orillas.

Las lagunas costeras constituyen el hábitat de diferentes fases de la vida (larvas, juveniles y adultos) de muchos recursos pesqueros como camarones, lisas, róbalos, corvinas, sábalos, ostiones, etc.. En ellas y su entorno suelen habitar de forma permanente o temporal numerosas especies de aves y otros organismos silvestres, algunos en peligro de extinción, como el manatí.

En cierta medida las lagunas costeras protegen a los ecosistemas ex-teriores contra pulsos de excesivos nutrientes y de sedimentos suspendidos, al retenerlos (efecto amortiguador). Muchas poseen gran valor paisajístico, re-creativo y turístico. Las lagunas y estuarios son los ecosistemas marinos de mayor productividad pesquera, y son zonas potenciales para el desarrollo del maricultivo. Por otra parte, son áreas de reproducción y cría de camarones y de otras especies comerciales (Alcolado 2006).


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Manglares.Se localizan en las costas de origen biológico, acumulativas, cenagosas

y en esteros con escurrimientos de agua dulce, aunque también en ambientes salinos como por ejemplo, los cayos que bordean la plataforma submarina cu-bana, muchos de ellos formados por los propios manglares.

En zonas con aportes de aguas dulces y nutrientes los bosques de man-gle alcanzan 20-25 m de altura y una alta densidad, mientras que en aguas muy saladas y pobres en nutrientes pueden ser de pequeña talla, achaparrados o enanos. Los bosques de manglar pueden ser monodominantes o mixtos (Me-néndez-Cabrera y Priego-Santander, 1994).

Asociados al bosque de manglar habita una rica fauna, destacándose las aves endémicas o de hábitat reducidos, algunas de las cuales lo utilizan como área de anidamiento y/o refugio, y muchas son migratorias.

Sobre las raíces de los mangles y alrededor de estos, habita una gran diversidad de organismos, algunos de forma permanente (esponjas, ascidias, hi-drozoos, anémonas, briosos, crustáceos, peces, etc.), otros de tránsito como peces en etapas juveniles y crustáceos.

Las raíces de los manglares sirven de sustrato a numerosos invertebrados y peces. Entre los primeros prevalecen los crustáceos y moluscos. Además, se fijan al mangle escaramujos, varias algas epífitas y esponjas que son hospederos de numerosos organismos, como los ascidiáceos coloniales y los celenterados.

La composición de la ictiofauna del manglar depende de las caracterís-ticas ambientales de cada sitio. Asociados a los manglares estuarinos prodo-minan los peces típicos de las lagunas costeras: robalos (Centropomidae), mo-jarras y pataos (Gerridae), lisas (Mugilidae), corvinas (Sciaenidae) y algunas especies arrecifales altamente tolerantes a diferentes salinidades como algunos pargos (Lutjanus griseus, L. apodus y L. jocu) o sus etapas juveniles. En los manglares de los cayos, donde prevalecen aguas con salinidad y transparen-cia más parecidas a las de los arrecifes coralinos, habitan peces típicos de ese biotopo más algunas poco comunes en estos, como las sardinas (Clupeidae), mojarras, pataos y otros.

Los manglares aportan energía al ecosistema acuático, mediante sus ho-jas, ramas y raíces (y su microbiota asociada), las cuales pasan a formar parte del detrito acumulado en los sedimentos. Las raíces de los mangles sirven de refugio a las etapas juveniles de langostas y peces. La mayoría de los peces del manglar forman parte de las pesquerías que se realizan en el complejo seibadal-arrecife. En la parte aérea los manglares proveen madera, leña, carbón, taninos para curtir pieles, y productos apícolas como miel, cera y propóleos. Además,


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los manglares protegen las costas de la erosión provocada por el oleaje, el vien-to y las corrientes costeras y filtran los contaminantes y los sedimentos evitan-do que lleguen a los arrecifes coralinos y otros biotopos. De vital importancia es la protección que brindan a la población e infraestructuras costeras contra las violentas penetraciones del mar y el efecto de los huracanes.

Costa rocosa baja y costa acantilada. La costa rocosa baja y la costa acantilada, por su constitución rocosa

predominantemente cársica, gozan de una gran solidez, aunque el batir cons-tante del oleaje y el intemperismo tallan el complicado microrelieve (mezcla de grietas, puntas y crestas afiladas, concavidades) y macrorelieve (cavernas, buza-mientos, charcas, fracturas, desprendimientos, etc.) que los caracteriza.

El ambiente a que está sometida la biota en estos sitios es harto severo, con una mezcla casi constante (pero con pulsos extremos de insolación, rocia-miento, desecación, mareas, inundación, golpes de olas, lluvias, etc.). La flora y la fauna, están generalmente distribuidas a manera de cinturones sucesivos perpendiculares al gradiente de influencia marina y de la altura de la costa. En estas costas son típicos los cangrejos grápsidos, gran diversidad de moluscos como quitones, neritas, litorinas, siguas, mejillones, etc. Las algas en el estrato más bañado por el mar son variadas y las especies dominantes dependen ma-yormente del grado de eutrofización y agitación del agua, la estación del año, y el régimen de desecación; este último determinado en gran medida por la in-clinación y la distancia del sitio al nivel medio de las mareas. En los lugares con aguas extremadamente eutrofizadas suelen ser abundantes las algas del género Ulva. En las charcas suelen estar presentes de manera casi siempre temporal peces clínidos, eleótridos, góbidos y ciprinodontidos. Estos últimos son peces de agua dulce, algunas de cuyas especies resisten altas salinidades (Alcolado 2006).


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Capítulo 2

Técnicas de Bacteriología

TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA

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2.1. Enumeración de bacterias heterótrofas aerobias mesófilas

Dentro de las comunidades microbianas las bacterias heterótrofas cons-tituyen, después de los virus, la población más numerosa (Marie et al. 1999) en los ecosistemas acuáticos. Este grupo de bacterias comprende una amplia diversidad de géneros y en términos numéricos de abundancia, constituyen el componente biológico más importante involucrado en la transformación y mi-neralización de la materia orgánica en la biosfera (Cho y Azam, 1988), ya que controlan los flujos de nutrientes en el sistema a través de la mineralización de la materia orgánica (Schut et al. 1997) y la producción secundaria de carbono (Azam et al. 1983). Además, son capaces de utilizar la materia orgánica disuelta (MOD) que deriva de los organismos autótrofos y de la actividad metabólica de otros organismos heterótrofos de mayores dimensiones presentes en el am-biente pelágico (López y Zaballos, 2005).

Las bacterias heterótrofas contribuyen a los ciclos de carbono y nu-trientes por dos vías principales: a través de la producción de biomasa bac-teriana (producción secundaria) y mediante la remineralización del carbono orgánico y los nutrientes (del Giorgio y Cole, 1998).

Objetivo: Determinar la concentración de bacterias heterótrofas aero-bias mesófilas en muestras de agua y sedimentos marinos.

Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados.

Materiales.Erlenmeyers.Frascos de vidrio estériles de 250 mL de capacidad.Frascos de vidrio estériles de 50 mL de capacidad.Pipetas de 10 y de 1 mL.Tubos de ensayo con tapones de algodón.Gradillas.Placas Petri.Espátulas de vidrio estériles. Tubo plástico para la toma de muestra de sedimento (“corer”).Jeringuilla despuntada. Papel de pH.

Reactivos y medios de cultivo.Soluciones para ajustar el pH del medio.Buffer Fosfato. Medio 2216E para bacterias marinas (Oppenheimer y ZoBell, 1952).


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Equipos. Autoclave.Baño termostatado.Incubadora bacteriológica.Detalles experimentales.

Para el recuento y aislamiento de bacterias heterótrofas se pueden uti-lizar varios medios de cultivo: 2216E (Oppenheimer y ZoBell, 1952), Medio 6 (Gorbienko, 1961), Agar marino, etc. Actualmente se considera que el Agar marino comercial desarrollado a partir de Oppenheimer y ZoBell, (1952) está muy cargado en nutrientes e inhibe el crecimiento de bacterias oligotróficas, por lo que se han desarrollado una variedad de medios con bajas concentracio-nes de nutrientes para aislar este tipo de bacterias (Weiner et al. 1980; Austing y Allen, 1982).

En la preparación del medio de cultivo cuando se va a trabajar con muestras de aguas marinas se puede emplear agua de mar sin diluir (salinidad promedio entre 32 y 35 °/oo), o diluida con agua corriente (750 mL agua de mar y 250 mL de agua corriente), en dependencia de la salinidad del lugar de aisla-miento. Cuando se trata de bacterias aisladas de aguas interiores (lagos, ríos, subterráneas), se puede utilizar agua destilada o agua corriente.

Después de esterilizar el medio a 121°C 15 min el pH debe ajustarse hasta 7.0-7.2 para el caso de siembra de muestras marinas, y hasta 6.9 para muestras de aguas interiores.

Cuando se siembra una porción o dilución de la muestra por vertido en placa (“pour plates”) se debe tener en cuenta que el medio de cultivo tenga la temperatura apropiada (entre 42°C y 45°C) para evitar la muerte de las células por exceso de temperatura. Cuando la temperatura del medio al verterlo en las placas es superior a 50°C generalmente el vapor de agua que desprende se condensa en la tapa de la caja Petri y si no se elimina esta agua puede causar un crecimiento continuo o mezclado de colonias sobre el medio, lo que impide el recuento de colonias individuales y/o el aislamiento de cultivos puros (Schnei-der y Rheinheimer, 1988).

Si se emplea el método de siembra en superficie (“spread plates”) se vier-te el agar en las placas y se deja secar en una estufa a 45°C toda la noche antes de usarlas. Posteriormente, se extiende por toda la superficie del medio un volumen no mayor a 0.1 mL de la dilución apropiada, utilizando una espátula de vidrio estéril. La placa se incuba hasta que aparezcan las colonias.


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Procedimiento.

Muestras de agua de mar.

Método de siembra por vertido en placa (“pour plates”). Las muestras de agua se colectan preferiblemente por triplicado utili-

zando frascos de vidrio estériles de 250 mL de capacidad.

A partir de cada muestra de agua se hacen las diluciones a conveniencia, según el tipo de agua (Tabla 2), en agua de mar estéril.

Tabla 2. Diluciones recomendadas según el tipo de muestra

Tipo de muestra DilucionesAguas superficiales limpias 10-1, 10-2, 10-3, 10-4

Aguas moderadamente contami-nadas o aguas residuales tratadas 10-2, 10-3, 10-4, 10-5

Aguas contaminadas o aguas re-siduales sin tratamiento 10-4, 10-5, 10-6, 10-7

Nota: Dilución 10-1 es igual a 1/10, es decir, 1 mL de muestra en 9 mL de diluyente (agua de mar estéril, en este caso), dilución 10-2 es igual a 1/100, es decir, 1 mL de muestra en 99 mL de diluyente, y así sucesivamente.

De cada muestra o dilución se vierte 1 mL en placas Petri (Colwell y Grigorova, 1986). Seguidamente, se añaden de 12 a 15 mL del Medio 2216E para bacterias marinas heterótrofas (Oppenheimer y ZoBell, 1952) previamente fundido y mantenido en un baño de María a una temperatura de 43-45°C.

Se mezcla los volúmenes de muestra (o dilución) añadidos con el medio de cultivo mediante movimientos suaves y rotatorios de la placa, y se deja soli-dificar. Se debe preparar una placa “control” conteniendo únicamente el medio de cultivo y una segunda placa “control” conteniendo el medio de cultivo y el agua de dilución.

Las placas se incuban a la temperatura seleccionada, teniendo en cuenta el rango óptimo de temperatura para el crecimiento de bacterias mesófilas (en-tre 25 y 40°C) y la temperatura del agua en el lugar donde se tomó la muestra, y se realiza el conteo de colonias a las 24, 48 y 72 h de incubación con ayuda de un contador de colonias o empleado un microscopio estereoscópico.

Se recomienda contar las colonias en las placas que presenten entre 30 y 300 colonias, excepto en el caso de que el medio inoculado con 1 mL de agua no diluida contenga menos de 30 colonias.


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Si el conteo no se realiza inmediatamente después del tiempo de incu-bación, las placas se pueden conservar en refrigeración hasta que se efectúe el conteo siempre que este período no exceda las 24 h.

Método de siembra en superficie (“spread plate”).Si la siembra es “en superficie” se vierte 0.1 mL de la muestra, o de la

dilución, sobre el medio ya solidificado y se riega sobre la superficie con la ayuda de una espátula de vidrio estéril (espátula Drygalski). Es importante que la superficie esté bien seca para que el líquido que se extiende por la superficie empape rápidamente el medio. Durante esta operación, debe tenerse cuidado de no romper la superficie del agar.

Muestras de sedimentos.Los sedimentos se colectan con un tubo plástico o “corer”, si hay interés

en seleccionar una profundidad específica, o directamente de la capa superfi-cial, se pueden emplear frascos de vidrio estériles de 50 mL de capacidad. De cada muestra se toma 1 cm3 con una jeringuilla despuntada estéril y se añade a un tubo conteniendo 10 mL de agua de mar estéril o Buffer Fosfato. Se agita por unos minutos el tubo en un “vortex” para propiciar la separación de las células de las partículas de sedimento y se deja reposar por 2 o 3 min. También se puede emplear ultrasonido para la separación de las células adheridas a las partículas (Torreton, 1991). A partir del sobrenadante se hacen diluciones se-riadas en agua de mar estéril o Buffer Fosfato, hasta 10-6 u otra dilución mayor si se cree conveniente, y se procede igual que se describió para la siembra de muestras de agua anteriormente.

Conteo y cálculos.El número de colonias obtenido en un conteo de viables depende no

sólo del tamaño del inóculo, sino también del medio de cultivo empleado, la temperatura y el tiempo de incubación. No todas las células desarrollarán las colonias al mismo tiempo ni del mismo tamaño, por lo que deben establecerse bien estos requisitos para evitar errores. El conteo de viables se expresa como “unidades formadoras de colonias”, en lugar de células viables, ya que una uni-dad de colonia puede contener más de una célula.

Para el cálculo del número de unidades formadoras de colonia por mi-lilitro, se cuentan las colonias crecidas en las placas, se calcula la media arit-mética entre las réplicas y se multiplica el promedio del número de colonias por el reciproco de la dilución usada. Los resultados se reportan en Unidades Formadoras de Colonias por mililitros (UFC/mL) para las muestras de agua.


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En el caso de las muestras de sedimentos se puede dar el re-sultado en UFC/g de peso húmedo o de peso seco, para lo cual:

1gUFC/g (peso seco) = UFC/g (peso húmedo) x -------------------------------

Peso seco de la muestra (g)

El procedimiento habitual es determinar el peso seco después de secar las muestras durante una noche a 90 - 110°C. La masa seca de las células bacte-rianas es aproximadamente, entre el 10 y el 20% de la masa húmeda.


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2.2. Enumeración de bacterias sulfatoreductoras

Las bacterias sulfatoreductoras (BSR) son una de las formas de vida mas antigüas del planeta, datan de al menos 2.72 mil millones de años (NAI, 2003). Constituyen un grupo diverso de bacterias con capacidades metabólicas diferentes, agrupadas por la característica común que tienen de usar el sulfato como aceptor terminal de electrones durante la respiración anaerobia.

Las BSR son anaerobias y requieren un potencial redox bajo (alrede-dor de -100 mV), para poder crecer. Sin embargo, el hecho de poseer enzimas como la superoxido dismutasa y la catalasa les permite sobrevivir en agua de mar oxigenada hasta niveles de tolerancia específicos de cada cepa (Cypionka et al. 1985).

La ubicuidad de las BSR en el agua de mar ha producido problemas de corrosión, toxicidad y pérdidas en las industrias del petróleo y gas donde se utilizan grandes volúmenes de agua de mar como lastre y para el mantenimien-to de la presión (Battersby et al. 1985).

Las BSR son abundantes en fondos fangosos con o sin vegetación (Smi-th et al. 2004), siendo mas activas en los 20 cm superiores de los sedimentos costeros donde hay abundantes sulfatos y condiciones reducidas de poten-cial redox. Generalmente, en estos sedimentos los sulfatos no son limitantes (aproximadamente, >2mM SO4

2-), por tanto, predomina la respiración anaero-bia mediante sulfatos como aceptor de electrones, pudiendo llegar a represen-tar el 50% de la mineralización de carbono orgánico.

Las BSR juegan un papel importante en el ciclo del azufre en el océano removiendo la mayor parte del sulfato (aproximadamente 1011 kg) que llega al mar cada año por el aporte de los ríos debido al escurrimiento terrígeno (Battersby, 1988).

Objetivo: Determinar el número de bacterias sulfatoreductoras en muestras de aguas y sedimentos marinos por el método de Número Más Pro-bable.

Materiales, reactivos, medio de cultivo y equipos empleados.

Materiales.Frascos de vidrio de 150 mL de capacidad.Frascos de vidrio de 50 mL de capacidad.Pipetas estériles de 10 y 1 mL.Tubos con tapas de rosca.


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Reactivos y medio de cultivo.Buffer Fosfato.Medio API (Overzil, 1970).Equipos.Incubadora bacteriológica.Jarra mezcladora estéril.Zaranda.

Detalles experimentales.La mayoría de las BSR crece bien a temperaturas entre 25 y 35°C, aunque

usualmente se cultivan a una temperatura de incubación de 30°C. El sustrato es el factor selectivo determinante para el crecimiento de un tipo u otro de BSR procedente de aguas marinas o de otro medio en particular, por tanto, existen varios medios de cultivos recomendados para los diferentes tipos de BSR.

En este acápite se utiliza el medio API (American Petroleum Institute)

recomendado por Overzil, (1970), y se emplea la metodología de diluciones se-riadas en tubos múltiples para determinar el Número Mas Probable (NMP).

Procedimiento.Se inoculan 10, 1 y 0.1 mL de la muestra de agua de mar en series de

cinco tubos estériles y posteriormente, se le añade 10 mL de medio API a la primera serie de cinco tubos (muestra sin diluir) y 9 mL a las series siguientes de tubos (diluciones 1/10 y 1/100, respectivamente). Se cierra cada tubo con tapa de rosca y después de rotularlos convenientemente, se incuban a 30°C de 2 a 4 semanas. Debe prepararse un tubo “control” sin inóculo. Se consideran positivos aquellos tubos donde ocurre un cambio de color de rojo a negro.

En el caso de que sean muestras de sedimento, se toman 50g de muestra del horizonte seleccionado, y se suspenden en 450 mL de agua de mar estéril o en Buffer Fosfato. Se homogenizan en una jarra mezcladora estéril por 1 a 2 min, o en zaranda por 15 min, obteniéndose de esta forma la dilución 1:10. A partir de esta dilución, se preparan las restantes diluciones decimales: se toma 1 mL de la dilución 1:10 y se lleva a un tubo que contiene 9 mL de agua de mar estéril o Buffer Fosfato, se homogeniza el contenido obteniéndose así la dilución 1:100. Si se requiere mayor número de diluciones se seguirá el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estéril para cada dilución.

Posteriormente, se inoculan series de 5 tubos y se rellenan con medio API. Los primeros 5 tubos inoculados con 10 mL de la dilución 1:10 se les añaden 10 mL de medio API y constituyen las porciones de 1g. Se tomarán 5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución 1:10 y se inocularan en 5 tubos a los cuales se les añaden 10 mL de medio API, éstos constituyen las porciones de 0.1g. Se tomarán 5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución 1:100, 1:1000, 1:10000, así sucesivamente, hasta la última dilución empleada y se inocularán en tubos que se llenan con el medio API, éstos constituyen las porciones de 0.01g, 0.001g, 0.0001g y demás respectivamente. Se incuban los tubos a 30°C


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de 2 a 4 semanas y al igual que en el caso de las muestras de agua, un cambio de coloración del medio de rojo a negro se considera positivo.

Conteo y cálculosLa densidad de bacterias sulfatoreductoras en las muestras de agua se

expresa como el NMP de BSR por 100 mL de muestra, y en el caso de los sedimentos, se puede expresar NMP de BSR/ 100g de peso seco o por gramo de peso húmedo.

La Tabla de NMP también puede ser utilizada cuando volúmenes ma-yores y menores de la muestra son inoculados. En este caso se procesa un código formado por los números de tubos con resultados positivos para BSR obtenidos en las tres series consecutivas inoculadas, verificándose el valor de NMP correspondiente a el.

Para el cálculo del NMP de bacterias sulfatoreductoras en los sedimen-tos, el NMP/100g será dada a través de la siguiente fórmula:

NMP correspondiente al código x 10 NMP/100g (peso seco)= -----------------------------------------------------

Mayor vol. inoculado seleccionado para conformar el código Ejemplo:

Porciones en los tubos inoculados

A B C D E NMP del Código 530 Cálculo NMP/100g

1g0.1g

0.01g

+ + + + + 5+ + + - - 3 - - - - - 0

80 80x10/1 = 800

+ : tubos con cambio de color de rojo a negro- : tubos que no muestran cambio de color del medio

NMP/100g (peso húmedo) = 800.NMP/ g (peso húmedo) = 8.Resultado del peso seco obtenido = 0.4g

1g (peso seco)NMP/g (peso seco) = NMP/g (peso húmedo) x ----------------------- Peso seco (g)

Por tanto: NMP/g (peso seco) = 8 x 1g/ 0.4 = 20 NMP/g

En los casos considerados como negativos (código 000) el resultado se expresará como <0.2.


31Página

BIBLIOGRAFIA

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32

2.3. Enumeración de bacterias coliformes totales y fecales.

Las bacterias coliformes son un grupo grande y heterogéneo de bacilos gram negativos, anaerobios facultativos y asporógenos que pertenecen a la fa-milia Enterobacteriaceae. Son bacilos cortos que pueden formar cadenas y en condiciones de cultivo desfavorables (por ejemplo, exposición a la penicilina) aparecen formas filamentosas largas. Dentro de los coliformes se agrupan: Es-cherichia coli, Klebsiella y Enterobacter. Actualmente dicha agrupación inclu-ye a los integrantes llamados organismos paracólicos: Serratia, Edwarsiella y Citrobacter, aunque algunos autores incluyen también Arizona y Providencia (Rojas y Coto 1989).

Las bacterias coliformes constituyen una gran parte de la microbiota normal aerobia del intestino, dentro de él, estos microorganismos por lo gene-ral no provocan enfermedades y pueden incluso contribuir al funcionamiento normal y a la nutrición. Estas bacterias se transforman en patógenas cuando alcanzan tejidos fuera del intestino, particularmente las vías urinarias, las vías biliares, los pulmones, el peritoneo o las meninges, provocando inflamaciones en estos sitios (Jawetz, 1985).

En las aguas la presencia de coliformes totales funciona como una alerta de que ocurrió contaminación, sin identificar el origen. Indican que hubo fallas en el tratamiento, en la distribución o en las propias fuentes domiciliarias de agua. Su presencia acciona los mecanismos de control de calidad y de procesa-miento dentro de las plantas de tratamientos de agua, e intensifica la vigilancia en las redes de distribución (CYTED, 2002).

Por otra parte, los coliformes fecales, cumplen todos los criterios usa-dos para definir los coliformes totales, pero en adición, estos son capaces de crecer y fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 44 ± 0.2°C en las primeras 48 h de incubación. Por esta razón, algunos especialistas consideran que el término de coliformes «fecales» que se les aplica no es correcto y que debería utilizarse en su lugar «coliformes termotolerantes» (ISO, 1990).

Aproximadamente el 95% del grupo de los coliformes presentes en he-ces fecales, están formados por Escherichia coli y ciertas especies del género Klebsiella. Debido a que los coliformes fecales se encuentran casi exclusiva-mente en las heces de animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminación fecal (WHO, 1999; CYTED, 2002).

Cuando están suficientemente diluidas en una gran masa de agua las bacterias coliformes fecales sobreviven sólo por lapsos cortos de tiempo, por lo que su presencia puede tomarse, por lo general, como evidencia de con-taminación reciente. Sin embargo, en algunos ríos y puertos que están muy


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contaminados con las aguas del desagüe urbano, las bacterias coliformes no sólo sobreviven, sino que mantienen una población significativa mediante mul-tiplicación lenta a partir de substancias orgánicas (Jawetz, 1985).

En la actualidad muchos países consideran las bacterias coliformes como indicadores de la calidad higiénico sanitaria en las aguas costeras que se usan para el baño, aunque las concentraciones permisibles para estos microor-ganismos varían ligeramente de un lugar a otro (Norma cubana NC: 22-1999; Norma mexicana, 2004).

Objetivo: Determinar el número de bacterias coliformes totales y fe-cales en muestras de agua y sedimentos marinos por el método de diluciones seriadas en Tubos Múltiples.


Materiales.Frascos de vidrio de 250 mL de capacidad estériles.Frascos de vidrio de 50 mL de capacidad estériles.Pipetas de 10 y 1 mL estériles.Tubos de cultivo con tapón de algodón.Tubos Durham.Gradillas.

Reactivos y Medios de Cultivo.Agua de mar estéril, solución salina o agua peptonada.Buffer Fosfato.Caldo Lactosado (Lactose Lauryl Tryptose Broth).Caldo Bilis Verde Brillante (Brilliant Green Lactose Broth).Caldo EC (EC Broth).

EquiposJarra mezcladora,Baño termostatado,Incubadora bacteriológica,

Detalles experimentales.Este procedimiento se puede aplicar para muestras de agua de diferentes

fuentes: marinas, riverinas, potables, residuales, entre otras.

Se utiliza el método de Tubos Múltiples mediante siembra en medio líquido y el cálculo del Número Más probable (NMP). El método se basa en el enriquecimiento de las muestras de agua en Caldo Lactosado, al cual se ha añadido un indicador de pH, a una temperatura de 35 ± 2°C, donde el cambio


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de color del medio evidencia la presencia de microorganismos del grupo coli-formes. Este primer paso se conoce como “prueba presuntiva”. Posteriormen-te, se hace una “prueba confirmativa” de la presencia de coliformes mediante la siembra de una asada tomada de los tubos que dieron positivos en la prueba anterior, en tubos con Caldo Bilis Verde Brillante. La turbidez y presencia de gas confirma la existencia de coliformes totales en la muestra analizada (Gon-zález et al. 2000).

Actualmente, para detectar la presencia de coliformes existen algunos ensayos menos complejos que permiten obtener los resultados más rápidos, pero sólo puede considerarse una información preliminar (presencia-ausencia). En estas pruebas, se mezcla grandes volúmenes de muestra de agua (100 mL) en una botella de cultivo con Caldo Lactosa Lauril Triptosa (LLTB) triple fuerza. Como indicador de pH se añade bromocresol púrpura. Si los coliformes están presentes, fermentan la lactosa produciendo ácido y gas y cambiando de color el medio de púrpura a amarillo. Para detectar coliformes y Escherichia coli, puede usarse la prueba del Colilert que consiste en mezclar 100 mL de muestra de agua con un medio que contiene como únicos nutrientes orto-nitrofenil-β,D-galactosido (ONPG) y 4-metil umbeliferil-β,D-glucoronido (MUG). Si los coliformes están presentes, el ONPG es metabolizado, resultando un color amarillo. Si hay presencia de E. coli, será degradado el MUG a un producto fluorescente que puede detectarse por observación en luz UV de larga longitud de onda.

Procedimiento

Determinación del Número Más Probable de Coliformes totales en mues-tras de agua por el método de diluciones seriadas en tubos múltiples.

Preparación de las diluciones decimales. Las diluciones se harán en dependencia del tipo de agua a analizar.Tabla 3. Diluciones recomendadas según el tipo de agua a analizar

Tipo de muestra DilucionesAguas superficiales limpias 100,10-1, 10-2, 10-3, 10-4

Aguas moderadamente contami-nadas o aguas residuales tratadas 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6

Aguas contaminadas o aguas re-siduales sin tratamiento 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7

Se toma asépticamente 1 mL de la muestra de agua y se transfiere a un tubo de ensayo con 9 mL de agua de mar estéril, solución salina o agua pepto-nada, obteniéndose una dilución de 1:10. Se homogeniza, se toma 1 mL y se lleva a otro tubo de ensayo con 9 mL de la solución de la dilución, se homo-geniza, y se obtiene una dilución 1:100. De ser necesarias más diluciones se seguirá el mismo procedimiento (Se utilizará una pipeta para cada dilución).


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Prueba presuntiva.Se toman 10 mL de muestra empleando una pipeta estéril graduada de

10 mL y se transfieren a un tubo de ensayo que contenga 10 mL de Caldo Lactosado de doble concentración y se mezcla el contenido. Se repite cinco veces este procedimiento.

Para agua de mar se realiza además lo siguiente: se toman 5 mL de agua y se añade 1 mL en cada uno de los tubos con medio a simple concentración de la segunda hilera y se toman 0.5 mL de muestra y se añade 0.1 mL en cada tubo de la tercera hilera con medio Caldo Lactosado de simple concentración. Cuando se analiza agua no tratada, se inoculan porciones de la muestra y sus diluciones respectivas.

Se incuban los tubos entre 35 ± 0.5°C durante 24 - 48 h. Al cabo de 24 h se examina cada tubo inoculado y si no se ha producido algún cambio de color y turbidez, se reincuban y se examinan nuevamente después de otras 24 h (48 en total).

La producción de ácido o gas dentro de las 48 ± 3 h constituye una re-acción presuntiva positiva y la ausencia de formación de ácido o gas al finalizar las 48 ± 3 h constituye una prueba negativa.

Prueba confirmativa.A partir de cada uno de los tubos presumiblemente positivo en Caldo

Lactosado, se inoculan con un asa de platino tubos que contengan Caldo Bilis Verde Brillante y tubos de fermentación Durham invertidos. Se incuban de 35 ± 0.5°C por 48 h y se observa la producción de gas. La producción de gas en cualquier cantidad en el tubo invertido Durham dentro de las 48 ± 3 h es considerada una fase confirmativa positiva.

Recomendaciones importantes.1. Utilice una pipeta estéril para la inoculación de cada tubo. Si •la pipeta se contamina antes de que la transferencia se haya com-pletado, reemplace con otra pipeta estéril. Tome precauciones cuando retire la pipeta del pipetero, para evitar contaminaciones. No arrastre la punta de la pipeta sobre la parte final expuesta de las otras pipetas del pipetero o sobre los bordes y cuellos de los tubos de la dilución. Cuando remueva la muestra, no inserte las pipetas mas de 2.5 cm por debajo de la superficie de la muestra.2. Cuando descargue las porciones de muestra, sostenga la pi-•peta en un ángulo de aproximadamente 4°C, con la punta tocan-do el cuello del tubo de ensayo.3. En el examen de residuales o de agua turbia, utilice un inocu-•lo de 0.1 mL de la muestra original o prepare una dilución ade-cuada.


36

4. Límite del número de muestras a ser analizadas de forma •tal, que el tiempo entre la inoculación de la primera muestra y la última no excedan los 20 min (Preferiblemente 10 min).

Determinación del Número Más Probable de Coliformes fecales.A partir de cada uno de los tubos gas positivos en Caldo Bilis Verde

Brillante, se inoculan con un asa tubos que contengan caldo EC y tubos de fermentación Durham. Se incubaran a 44.5 + 0.1°C durante 24 - 48 h. Antes de la inoculación los tubos se mantendrán sumergidos, a un nivel por encima del medio de cultivo, en un baño termostatado a 44.5 oC durante 30 min.

La producción de gas en un tubo de fermentación Durham dentro de 24 h o menos se considera una reacción positiva.

Cálculos y expresión de los resultados.La densidad de coliformes (totales y fecales) se expresa como el NMP de

coliformes totales o fecales, según se trate, por 100 mL de la muestra de agua.

Para formar el código se seleccionan las diluciones según los números de tubos positivos y negativos obtenidos en las tres series de diluciones con-secutivas inoculadas.

El NMP/100 mL de agua se obtendrá a través de la siguiente fórmula:

NMP correspondiente al código de la tabla x 10NMP/100 mL = ------------------------------------------------------------------ Mayor volumen inoculado seleccionado para formar el código

Ejemplo 1:

Volúmenes de agua

inoculados

TubosA B C D E Código NMP Cálculo

NMP/100mL

1mL0.1mL

0.01mL

+ + + + + 5+ + - - - 2 - - - - - 0

520 50 50x10/1 = 500

Se selecciona la serie donde los tubos sean positivos en su mayoría y las dos diluciones siguientes para formar el código.


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Ejemplo2:

Volúmenes de agua

inoculados


NMP/100mL

10 mL1 mL

0.1 mL0.01 mL

+ + + + + 5+ + + - - 3+ - - - - 1 + - - - - 1

532 140 140x10/10= 140

En este ejemplo el resultado positivo de la última dilución se adiciona al de la serie anterior para formar el código.

Determinación de Coliformes totales y fecales en muestras de sedimentos

Preparación de las diluciones decimales. Se suspenden 50g de muestra en 450 mL de Buffer Fosfato y se homo-

genizan en una jarra mezcladora estéril por 1 a 2 min, o en zaranda por 15 min, obteniéndose de esta forma la dilución 1:10.

Se preparan diluciones decimales apropiadas de acuerdo al grado de contaminación de la muestra. Se toma 1 mL de la dilución 1:10 y se lleva a un tubo que contiene 9 mL de Buffer Fosfato, se homogeniza el contenido obteniéndose así la dilución 1:100. Si se requiere mayor número de diluciones se seguirá el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estéril para cada dilución.

Prueba presuntiva.Se inoculan series de cinco tubos (a, b, c, d, e) de Caldo Lactosado con

tubos de fermentación de Durham invertidos. Los primeros 5 tubos inocula-dos con 10 mL de la dilución 1:10 contienen 10 mL de Caldo Lactosado de doble concentración y constituyen las porciones de 1g. Se tomarán 5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución 1:10 y se inocularan en 5 tubos que contie-nen 10 mL de Caldo Lactosado de simple concentración, éstos constituyen las porciones de 0.1g. Se tomarán 5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución 1:100, 1:1000, 1:10000, así sucesivamente hasta la última dilución empleada y se inocularán respectivamente en tubos con Caldo Lactosado de simple con-centración y con tubos de Durham invertidos, éstos constituyen las porciones de 0.01g, 0.001g, 0.0001g y demás respectivamente.

Se incuba a 35 ± 0.5°C. Después de 24 ± 2 h se observará si hay pre-sencia de ácido o gas en los tubos invertidos, si no hay, se reincuban hasta las 48 ± 3 h.

La producción de ácido o gas dentro de las 48 ± 3 h constituye una re-acción presuntiva positiva y la ausencia de formación de ácido o gas al finalizar las 48 ± 3 h constituye una prueba negativa.

}2


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Prueba confirmativaDe todos los tubos que resultaron positivos en la fase presuntiva se

toma muestra con asa de platino y se inoculan tubos conteniendo Caldo Bilis Verde Brillante. Se incuban los tubos a 35 ± 0.5°C por 48 ± 3 h.

La producción de gas en cualquier cantidad en el tubo invertido de Cal-do Bilis Verde Brillante dentro de las 48 ± 3 h es considerada una fase confir-mativa positiva.

Se calcula el valor NMP del número de tubos positivos de Caldo Bilis Verde Brillante.

Cálculos y expresión de los resultadosLa densidad de coliformes totales se expresa como el NMP de colifor-

mes totales por g de peso seco.

NMP correspondiente al código x 10NMP/100g (peso seco) = ------------------------------------------------------ Mayor volumen inoculado seleccionado para conformar el código

Ejemplo 1:

Volúmenes de agua

inoculados


NMP/100g

1g0.1g

0.01g

+ + + + + 5+ + + - - 3 - - - - - 0

530 80 80x10/1 = 800

+ presencia de gas en Caldo Bilis Verde Brillante - ausencia de gas en Caldo Bilis Verde Brillante

NMP/100g (peso húmedo) = 800NMP/ g (peso húmedo) = 8Resultado del peso seco obtenido (ejemplo) = 0.4g

1g (peso seco)NMP/g (peso seco) = NMP/g (peso húmedo) x ----------------------- Peso seco (g)

Por tanto:NMP/g (peso seco) = 8 x 1g/ 0.4 = 20 NMP/g

En los casos considerados como negativos (código 000) el resultado se expresará como <0.2.


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40

2.4. Enumeración de estreptococos fecales.

Los estreptococos fecales son cocos Gram positivos, no móviles, cata-lasa negativa, anaerobios facultativos que se agrupan en cadenas cortas, pares y células simples. Pueden crecer en presencia de sales biliares, en concentracio-nes de azida de sodio inhibitorias para organismos coliformes y otras bacterias Gram negativas y a temperatura de 45 °C. Hidrolizan la esculina y algunas especies resisten calentamiento a 60 °C por 30 min, crecen en Caldo Nutriente conteniendo 6.5% de cloruro de sodio y a pH 9.6.

El hábitat de los estreptococos fecales es el intestino de humanos y muchos animales de sangre caliente, aunque con frecuencia se encuentran en infecciones urinarias, leche, productos lácteos, carnes, aguas y suelos (Suárez, 2002).

Aunque este grupo de microorganismos ha sido utilizado por las au-toridades sanitarias de diferentes países para evaluar la calidad sanitaria de sus aguas costeras, en los últimos años se ha incrementado la utilización de los enterococos fecales en lugar de los estreptococos (Secretaria de Salud, 2004).

Los enterococos fecales son un subgrupo de los estreptococos fecales, que generalmente se usa para referirse a las especies Enterococcus faecalis y sus variedades, y a E. faecium, las cuales tienen mucha importancia clínica. Según Suárez (2002) se ha propuesto que sea adoptado el término “enterococos y es-treptococos intestinales”, ya que las especies de origen fecal o intestinal pertene-cen principalmente a los géneros Enterococcus y Streptococcus.

Para la detección y enumeración de estos microorganismos se utiliza el método de Tubos Múltiples mediante siembra en medio líquido y el cálculo del Número Más Probable (NMP), aunque también puede emplearse la técnica de Filtro de Membrana y por vertido en placa, en dependencia del tipo de muestra a analizar.

Tejedor et al. (2005) incuban las membranas en Agar Slanetz a 37 °C por 24 h, las transfieren a placas de Agar Bilis-Esculina-Azida e incuban a 35 °C entre 1 y 4 h. Las colonias crecidas formadas por cocos gram positivos, catalasa negativos y que hidrolizan la esculina, los consideran estreptococos fecales.

El método de Tubos Múltiples se basa en el enriquecimiento de las mues-tras de agua en Caldo Azida-Dextrosa donde el cambio de color del medio de púrpura a amarillo evidencia la presencia de este tipo de microorganismo.


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Objetivo: Determinar el número de estreptococos fecales en muestras de agua y sedimentos marinos por el método de diluciones seriadas en Tubos Múltiples.

Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados

Materiales.Frascos de vidrio estériles de 250 mL .Tubos de ensayo.Gradillas.Pipeta de 10 mL.Pipeta de 0.1 mL.Placas Petri.

Reactivos y medios de cultivo. Caldo Azida-Dextrosa a doble concentración.Caldo Azida-Dextrosa a simple concentración.Buffer Fosfato.Caldo KF 1.5 concentrado y de simple concentración.Agar Tristona Soya (ATS).Caldo Etil Violeta Azida o Medio selectivo para enterococos Pfizer -(PSE).Agar Slanetz-Bartley .Caldo Corazón.

Equipos.Incubadora bacteriológica.

Procedimiento .Colecta de las muestras de aguas.La colecta de las muestras de aguas se debe realizar con frascos de vidrio

estériles, preferiblemente durante el horario de marea baja. Si no se procesa inmediatamente, la muestra deberá permanecer refrigerada (sin llegar nunca a la congelación) hasta el momento de su procesamiento. El análisis debe reali-zarse tan pronto como sea posible, para minimizar los cambios en la población microbiana y si la muestra ha sido mantenida en frío, el tiempo máximo reco-mendado es de 24 h.

Determinación del Número Más Probable de estreptococos fecales en muestras de aguas marinas.

Preparación de las diluciones decimales.Se toma asépticamente 1 mL de la muestra de agua y se transfiere a un

tubo de ensayo con 9 mL de solución salina, agua de mar estéril o agua pepto-


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nada, obteniéndose una dilución 1:10. Se homogeniza, se toma 1 mL y se añade a otro tubo de ensayo con 9 mL de la solución de disolución, se homogeniza, y se obtiene una dilución 1:100. De ser necesaria mas diluciones se seguirá el mismo procedimiento, cuidando utilizar una pipeta para cada dilución.

Se recomienda marcar cada tubo de la serie con el número de la muestra y dilución. Dicho rotulo deberá hacerse en dirección vertical, para evitar con-fusiones entre diluciones.

Prueba presuntiva.A partir de la muestra de agua se toman 5 porciones de 10 mL cada una,

empleando pipetas estériles graduadas de 10 mL, y se transfieren a tubos de en-sayo que contienen 10 mL de Caldo Azida-Dextrosa de doble concentración. Se homogeniza el contenido. Seguidamente, se toman 5 mL de la muestra y se añade 1 mL a cada uno de los tubos de la segunda hilera con medio de simple concentración y a continuación, se toman otros 0.5 mL de muestra y se añade 0.1 mL de la misma en cada tubo de la tercera hilera con medio de simple con-centración.

Se incuban todos los tubos a 35 ± 0.5 °C .durante 48 h. Al cabo de 24 h se examina cada tubo inoculado y si no se ha producido cambio de color, se re-incuban y se examinan nuevamente después de otras 24 h (48 en total).

El cambio de color de amarillo a púrpura dentro de las 48 h del ensayo, constituye una prueba presuntiva positiva.

Prueba confirmativaSe toma con un asa muestra de los tubos que dieron positivos en la fase

presuntiva y se siembra en Caldo Etil Violeta Azida o en medio selectivo para enterococos Pfizer (PSE).

Los tubos se incuban a 35 oC durante 48 h y las placas con medio PSE durante 24 ± 2 h.

En el caldo la respuesta positiva se manifiesta por presencia de turbidez y un botón color púrpura en el fondo del tubo y en el medio PSE por la pre-sencia de colonias marrón con halos marrones.

Cálculos.A partir de los tubos considerados positivos se conforma el código y se

consulta la tabla de Número Más Probable (NMP) que corresponda, según el número de tubos utilizados como réplicas.


43Página

Los resultados del NMP de estreptococos fecales se expresan en NMP por 100 mL.

Si se usaron para la siembra porciones de 1.0, 0.1 y 0.01 mL, el NMP se calcula por la tabla y se registra multiplicando por 10 la cifra correspondiente; o si se usó una combinación en porciones de 0.1, 0.01 y 0.001 mL la cifra de la tabla se multiplica por 100.

Determinación del Número Más Probable de Estreptococos fecales en muestras de sedimentos.

Preparación de las diluciones decimales. Se suspenden 50g de muestra en 450 mL de Buffer Fosfato y se homo-

genizan en una jarra mezcladora estéril por 1 a 2 min, o en zaranda por 15 min, obteniéndose de esta forma la dilución 1:10.

Se preparan diluciones decimales apropiadas de acuerdo al grado de contaminación de la muestra. Se toma 1 mL de la dilución 1:10 y se lleva a un tubo que contiene 9 mL de Buffer Fosfato, se homogeniza el contenido obteniéndose así la dilución 1:100. Si se requiere mayor número de diluciones se seguirá el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estéril para cada dilución.

Fase presuntiva.Se procede de igual forma que se explica para las muestras de agua, pero

el medio utilizado es Caldo KF 1.5 concentrado y de simple concentración. Se incuba a 37 °C por 48 h.

La aparición de una coloración amarilla en los tubos de Caldo KF debi-do a la producción de ácido indica una reacción positiva.

Fase confirmativa.De todos los tubos positivos en la prueba presuntiva se toma muestra

con un asa y se siembra por estrías en placas de Agar Slanetz-Bartley. Las placas se incuban a 37 °C 48 h.

De las colonias crecidas, se seleccionan al menos tres colonias y se siem-bran cada una en Caldo Corazón. Se incuban a 37 °C por 24 h y a partir de cada colonia crecida en Caldo Corazón realizar las siguientes pruebas:

Coloración de Gram • (cocos Gram +, mayormente en pares ó ca-denas cortas).Siembra en placas de Agar Nutriente para la prueba de Catalasa •(-).


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Crecimiento en Agar Bilis Esculina • (+).Crecimiento a 45 oC • (+).Crecimiento en medio con 6.5% de cloruro de sodio • (+ o -).

Cálculos La densidad de estreptococos fecales se expresa como el NMP de es-

treptococos fecales por gramo de peso seco. El cálculo se realiza de acuerdo al resultado de la fase confirmativa y se expresa según se explica en el Cap.2.3 para muestras de sedimentos.


45Página

BIBLIOGRAFIA

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46

2.5. Aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos.

La biodegradación o bioxidación, es el mecanismo más importante, efectivo y económico para la eliminación final de los hidrocarburos no voláti-les del petróleo presentes en el medio marino. Bajo su acción se ponen en juego múltiples reacciones de oxidación que conducen a la formación de hidrocarbu-ros de menor peso molecular, además de la formación de dióxido de carbono, agua y biomasa microbiana.

Las diferencias en la composición y concentración de hidrocarburos en el petróleo determinan una alta especificidad en el proceso de oxidación mi-crobiana (Jackson y Pardue, 1999). En el ambiente marino las n-parafinas son degradadas más rápidamente, seguido por los aromáticos, isoalcanos, ciclopa-rafinas, y policíclicos aromáticos de cadenas largas (Prince, 1993). Cuando se trata de petróleos pesados se mantiene esta secuencia de degradación incluidas las resinas y los asfaltenos, compuestos de alto peso molecular (Haines et al. 1996).

La microbiota marina capaz de utilizar los crudos o fracciones refinadas del petróleo como única fuente de carbono y energía, está ampliamente repre-sentada en diversos géneros. Sin embargo, ésta solo se corresponde con el 1 % de la población heterótrofa total en ecosistemas no contaminados y puede alcanzar hasta un 10 % cuando ocurre un derrame de petróleo (Venosa et al. 2000).

Entre las bacterias hidrocarbonoclastas marinas que refiere la literatura especializada se incluyen los géneros Pseudomonas, Rhodococcus, Flavobacte-rium, Acinetobacter, Achromabacter, Bacillus, Corynebacterium y Mycobacte-rium; entre las levaduras los géneros Candida y Rhodotorula son los más re-presentativos, mientras que entre los hongos filamentosos los más frecuentes son Cladosporium, Penicillium y Aspergillus.

La capacidad de los microorganismos biodegradadores de petróleo y sus derivados tiene implicación práctica para el saneamiento de ambientes impac-tados por petróleo, tanto en aguas marinas como interiores, en la industria de extracción de crudos (donde se emplean directamente o sus metabolitos), en la obtención de biomasa microbiana y solventes, así como, en la transformación de esteroides.


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Objetivo: Aislar bacterias degradadoras de hidrocarburos de muestras de agua y sedimentos marinos.

Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos

MaterialesFrascos de vidrio estériles de 250 mL de capacidad.Placas Petri.Replicador.Pipetas.Reactivos y medios de cultivo.Petróleo pesado.Petróleo ligero.Combustible Diesel.

Equipos.Incubadora bacteriológica.

Procedimiento.Para la colecta de muestras, tanto de agua como de sedimentos superfi-

ciales, se pueden emplear frascos de vidrio estériles de 250 mL de capacidad. Si las muestras no pueden procesarse de inmediato, deben conservarse en refrige-ración por un máximo de 4 h.

En el caso de las muestras de agua, se puede sembrar directamente 1 mL de la muestra en un erlenmeyer conteniendo 100 mL de medio salino descrito por Vela y Ralston (1978) empleando como fuente de carbono petróleo pesa-do, petróleo ligero o combustible Diesel indistintamente, al 2%.

En el caso de las muestras de sedimentos, se hacen diluciones seriadas

en agua de mar estéril hasta 1:100 y se siembra 1 mL de cada dilución en erlen-meyers conteniendo cada uno 100 mL del mismo medio salino citado anterior-mente, con la fuente de carbono seleccionada.

Los erlenmeyers inoculados se colocan en zaranda termostatada a 28 ºC.

Cada cinco días, y por tres veces sucesivas, se hacen subcultivos em-pleando el mismo medio de cultivo (estático) y se incuba a 28ºC ± 2 ºC. Luego de 15 días de incubación, se inoculan diluciones seriadas de los subcultivos en placas Petri conteniendo medio para bacterias heterótrofas (Gorvienko, 1961), en agar GELP (Van Uden y Fell, 1968) y en agar –petróleo (Finnerty y Singer, 1984), respectivamente, y se incuban todas las placas a 28º C ± 2 por 72 h.


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Una vez crecidas las colonias, se conservan en tubos de cultivo con es-tos mismos medios.

Los cultivos mixtos capaces de degradar petróleo se aíslan, conserván-dolos después del enriquecimiento en medio líquido con pases mensuales a medio salino fresco con petróleo como única fuente de carbono.

Para detectar la capacidad de cada cepa de degradar hidrocarburos aro-máticos, cíclicos y combustible diesel se siembra en placas Petri contenien-do medio Vela y Ralston (1978) agarizado, utilizando un replicador múltiple (Shiaris y Cooney, 1983). Para la siembra con replicador, se preparan suspen-siones de cultivos jóvenes (24h) de cada cepa en agua de mar estéril y se añade una gota de cada suspensión celular en una placa estéril de porcelana con po-citos. El replicador múltiple estéril se aplica sobre los pocitos que contienen las suspensiones celulares y luego se aplica sobre el medio salino agarizado contenido en placas Petri. Para el caso de los hidrocarburos aromáticos y cí-clicos, previamente se aplican, sobre el medio salino agarizado, soluciones al 0.5% P/V de estos sustratos en acetona; mientras que para los cíclicos volátiles se conservan las placas inoculadas dentro de un recipiente en atmósfera del compuesto volátil.

Se deben preparar controles utilizando el medio salino agarizado con la fuente de carbono seleccionada sin inocular.


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2.6. Aislamiento de bacterias productoras de sustancias tensioactivas

Los biotensioactivos son moléculas con una parte polar (hidrófila) y una parte apolar (hidrófoba) producidos durante el crecimiento de una gran variedad de microorganismos sobre sustratos de diferente naturaleza (Lang y Wullbrandt, 1999, Banat et al. 2000; Kenneth et al. 2001).

Numerosos autores han referido la producción de agentes con activi-dad superficial a partir de la degradación microbiana de sustratos hidrófobos. Durante este proceso aumenta la superficie de contacto entre las fases inmis-cibles favoreciéndose el transporte del sustrato hacia la célula necesario para llevar a cabo los procesos metabólicos que conducen a la multiplicación celular (Köhler et al. 2000; Iwabuchi et al. 2002).

La producción de biotensioactivos a partir de fuentes de carbono hidro-solubles se utiliza con frecuencia por la simplicidad del proceso fermentativo y su fácil comercialización, aunque las funciones fisiológicas de su producción en presencia de estas fuentes, no han sido totalmente aclaradas.

Los biotensoactivos se clasifican atendiendo a su naturaleza química en: glicolípidos, lipopolisacáridos, fosfolípidos, ácidos grasos, aminolípidos, lipoproteínas y lipopéptidos (Lang y Wullbrandt, 1999). La amplia variedad de estructura posibilita diversas aplicaciones en la industria como emulgen-tes, detergentes, humectantes, espumantes, floculantes, inhibidores de la co-rrosión, entre otras. Estos compuestos pueden ser utilizados en procesos de polimerización, mediante emulsiones, para pinturas y cubiertas de papel; en el tratamiento de asfaltos, cemento, textiles y fibras, metales; así como en el tratamiento de las aguas (Kosaric, 1993; Desai y Banat, 1997).

El uso de tensioactivos de origen biológico, no tóxicos y biodegrada-bles, constituye una alternativa atractiva de aplicación en la industria teniendo en cuenta su eficacia y la tendencia actual de disminuir el uso de productos obtenidos por síntesis química (Aynechi, 1998; Banat et al. 2000).

Objetivo: Detectar bacterias productoras de tensioactivos entre aisla-dos provenientes de muestras de agua y sedimentos marinos

Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados

Materiales.Tubos de cultivo.Placas Petri.Papel de filtro Whatman.Membranas de acetato de celulosa de 0.22 μm de diámetro de poro


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Reactivos y medios de cultivo.Glóbulos rojos de carnero.Hexadecano.Medio salino.

Equipos.Incubadora bacteriológica.Zaranda termostatada.Centrífuga. Tensiómetro.Agitador magnético.

Procedimiento.A partir de cultivos axénicos de bacterias aisladas de aguas o sedimentos

marinos, se realiza una primera selección de aquellos aislados potencialmente productores de tensioactivos por el método de lisis de los glóbulos rojos (Mu-lligan et al. 1989). Este método se basa en la actividad hemolítica que presen-tan estos compuestos, que provocan zonas claras de hemólisis (ß hemólisis) alrededor de las colonias de microorganismos potencialmente productores de agentes con actividad superficial.

Una vez seleccionados los aislados que provocaron la hemólisis de los glóbulos rojos, se siembra una asada de cada cultivo, en tubos conteniendo caldo nutriente al 0.8 % y se incuban a temperatura ambiente por 18-24 h. Posteriormente, a partir de estos caldos inoculados se siembra un volumen tal que contenga 108 celulas/mL en erlenmeyers conteniendo 200 mL de un medio basal (Finnerty, 1994), conteniendo hexadecano al 2% como única fuente de carbono y energía (pueden usarse tambien almidón, arabinosa, lactosa, gluco-sa, etc.). Debe prepararse un tubo control con medio de cultivo estéril. Luego de 72 - 96 h de incubación a 28-30 ºC en zaranda termostatada, se procede a evaluar los cultivos en cuanto a crecimiento celular y actividad superficial con respecto al medio de cultivo estéril.

Para la determinación de la actividad superficial se procede a obtener el caldo libre de células por centrifugación a 7 025 x g a 4 °C durante 20 min. El sobrenadante se filtra primero por papel de filtro Whatman para separar la capa oleosa y después, por filtros de membrana de acetato de celulosa de 0.22 μm de diámetro de poro para eliminar las células. La actividad superficial del sobrenadante se evalúa a partir de la tensión superficial y tensión interfacial las cuales se determinan por el método de anillo de Du Noüy (Lin, 1996) uti-lizando para esto un tensiómetro. La determinación de tensión interfacial del caldo fermentado puede ser realizada utilizando como fase oleosa keroseno, hexadecano u otro hidrocarburo.


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Los valores de tensión superficial y tensión interfacial que determinan las características tensiométricas de los caldos de cultivo fermentados permi-ten clasificar los microorganismos como productores o no de estas sustancias. Según proponen Finnerty y Singer (1984) las clases generales se pueden con-siderar como un método válido para reconocer y seleccionar microorganismos capaces de sintetizar productos con actividad superficial. Según ese criterio, los microorganismos se clasifican en tres grupos:

Aquellos que disminuyen la tensión superficial del medio de •cultivo.Los que aumentan la tensión superficial del medio.•Los que no modifican la tensión superficial del medio de •cultivo.

La determinación de la concentración micelar crítica (CMC) se define como la concentración de tensioactivo necesaria para iniciar la formación de micelas (Kim et al. 2000; Ábalos, 2001). La CMC es una medida de la eficiencia y concentración de los tensioactivos ya que representa la concentración a par-tir de la cual, al saturarse la superficie y comenzar el proceso de formación de micelas, no se produce una disminución significativa de la tensión superficial (Songh y Rosen, 1996). El valor absoluto de este índice está dado, fundamental-mente, por las características del tensioactivo (concentración, balance hidrófilo lipófílo, estructura, etc.).

La concentración micelar crítica (CMC) se determina gráficamente a partir de la bisectriz del ángulo que forman las dos partes rectas de la curva ca-racterística de un gráfico de Tensión Superficial vs. diluciones de tensioactivos en agua destilada (Kim y Vipulanandan, 1998; Ábalos, 2001).

También la determinación del número de saponificación permite cono-cer la concentración de tensioactivos aniónicos, muchos de los cuales, han sido obtenidos a partir de microorganismos (Inczédy, 1981).

La actividad emulsionante se determina mezclando volúmenes iguales del medio de cultivo fermentado y keroseno, con un agitador magnético a alta velocidad por 10 min (Cooper y Goldenberg, 1987). Transcurridas 24 h de re-poso, se miden la altura de la capa emulsionada y la altura total. El cociente de ambos valores multiplicado por 100 representa el índice de emulsión. Deben realizarse tres repeticiones de cada prueba.


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Cap.2.7. Aislamiento de bacterias productoras de polisacáridos extracelulares

Para mantener la estructura celular los microorganismos sintetizan polisacáridos o macromoléculas con componentes sacarídicos como consti-tuyentes de la pared celular, sin embargo, muchas especies también excretan polisacáridos al medio circundante. A veces estos compuestos extracelulares pueden observarse con el microscopio óptico formando una especie de cápsula alrededor de las células y otras veces, se observa una matriz viscosa y amorfa conocida como biofilm o biopelícula, donde quedan atrapadas numerosas cé-lulas.

En ambientes marinos oligotróficos el crecimiento de bacterias adheri-das a superficies se considera una estrategia nutricional, ya que sobre las super-ficies suelen concentrarse nutrientes que son utilizados por estos microorga-nismos. Miles y Morris, (1989), afirman que estos polisacáridos extracelulares protegen a las bacterias contra la desecación y el ataque de bacteriófagos.

Según Mancuso et al. (2005), los exopolisacáridos microbianos son abundantes en el ecosistema marino de la Antártica, lo que posiblemente, con-tribuya a la sobrevivencia de las comunidades microbianas ante las condiciones extremas de temperatura, salinidad, y disponibilidad de nutrientes. Estos auto-res también refieren que en las aguas hidrotermales profundas, caracterizadas por la existencia de altas presiones, temperaturas extremas y presencia de me-tales pesados, los exopolisacáridos producidos por los microorganismos que ahí habitan son inusuales y pueden tener un elevado valor comercial.

La composición química de los exopolímeros ha sido ampliamente estu-diada ya que se consideran inmunógenos y antígenos bacterianos importantes relacionados con infecciones en plantas, animales y humanos. Entre las espe-cies de bacterias que más se estudian actualmente por su capacidad de producir biofilm y ser causa de múltiples enfermedades se encuentran el Staphylococ-cus epidermidis y otras del género Staphylococcus, incluyendo S. aureus. Estas bacterias patógenas se adhieren a dispositivos plásticos (prótesis ortopédicas, válvulas cardiacas artificiales, marcapasos, etc.) y comienzan a formar el bio-film, que impide la desecación, la acción de fagocitos y anticuerpos que tratan de eliminarlos. En cultivos puros de estas bacterias se ha encontrado que las moléculas de antibióticos no logran atravesar la estrecha red de glicoproteínas del biofilm para llegar a su sitio de acción (Diemond y Miranda, 2007).

Muchos polisacáridos producidos por bacterias han sido caracterizados y comercializados, como el alginato, el xantano y el curdlano, por su aplicación como aditivo en la industria alimenticia, farmacéutica (Colliec-Jouault et al. 2004), de cosméticos (Sutherland, 1989) y en la industrial petrolera .


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Objetivo: Aislar bacterias productoras de polisacáridos de sedimentos marinos o de portaobjetos químicamente limpios sumergidos en el mar.

Materiales, Reactivos, medios de cultivo y equipos empleados.

Materiales.Portaobjetos.Tubos de cultivo.Pipetas estériles.Erlenmeyers de 500 mL.Papel de filtro Whatman GF/F.Filtros de membrana de acetato de celulosa de 0.22 micras de diámetro de poro. Membrana de diálisis de 12 000 cutoff.Varilla de vidrio.

Reactivos y medios de Cultivo.Agua de mar estéril.Agua destilada.Etanol absoluto (99%).

Equipos.Cámara de Newbauer.Zaranda rotatoria.Centrifuga refrigerada.Roto evaporador.Cámara fría.Liofilizadora.

Detalles experimentales.Existen diferentes medios de cultivo para la producción microbiana de

polisacáridos o glicoproteinas extracelulares. En todos los casos el denomina-dor común es que en el medio de cultivo se emplea como fuente de carbono glucosa, sucrosa, galactosa u otro azúcar.

En ocasiones, se han encontrado bacterias capaces de producir dos tipos diferentes de polisacáridos durante una misma fermentación, asociados a dife-rentes fases de crecimiento (Christensen et al. 1985).

Harada et al. (1987) refieren que Nakanishi et al. (1974, 1976) demos-traron que el medio de cultivo con anilina azul es muy útil para la detección de colonias que tienen la capacidad de producir curdlano porque éste forma un complejo con el colorante y se observan las colonias azules.


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Procedimiento.Los cultivos de bacterias que producen polisacáridos extracelulares por

lo regular son mucosos y con frecuencia provienen de muestras de sedimentos, de organismos, u objetos sumergidos, que brindan una superficie donde las células pueden adherirse.

En este procedimiento se parte de cultivos puros de bacterias heterótro-fas aisladas de sedimentos marinos o de portaobjetos (químicamente limpios) que se encontraron sumergidos en el mar por 72 h. Las colonias aisladas, de las cuales nos interesa conocer cuáles son capaces de producir polisacáridos extracelulares, se mantienen en tubos con medio Agar marino.

De cada cultivo a evaluar, se prepara una suspensión celular con agua de mar estéril, y se cuenta el número de células en cámara de Newbauer. De esta suspensión se inocula un volumen tal que al añadir en 200 mL del medio seleccionado (medio PS o medio Okami, u otro) la concentración final resulte 108 células/mL.

Los 200 mL del medio de cultivo deben estar contenidos en un erlenmeyer de 500 mL o 1 L de capacidad con tapón de gasa que permita una adecuada aireación.

El erlenmeyer con el medio inoculado se coloca en zaranda rotatoria (150 rpm) a 25 °C por cinco días. Se centrifuga a 4 800 x g a 4 °C por 20 min para remover las células, y el sobrenadante resultante se filtra, primero por papel Whatman GF/F y después por membrana de acetato de celulosa de 0.22 µm de diámetro de poro.

El filtrado se concentra en un rotoevaporador a temperatura ambiente hasta la mitad de su volumen, y se dializa exhaustivamente por membrana de 12 000 cutoff durante 24 h contra agua destilada, para eliminar restos de gluco-sa que no hayan sido consumidos.

Al filtrado dializado se le añade 2 vol. de etanol (99%) frío, se deja re-posar por unas h, preferiblemente en cámara fría, y posteriormente, se recoge el precipitado obtenido con una varilla de vidrio. En ocasiones se liofiliza para su conservación a largo plazo.

Al polímero obtenido se le determina sus propiedades físicas y su com-posición química. En algunos casos, en dependencia de los objetivos de la in-vestigación, también se le mide su viscosidad específica y sus propiedades reológicas.


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2.8. Aislamiento de bacterias luminiscentes.

Las bacterias luminiscentes pueden encontrarse en aguas costeras, oceá-nicas y en ambientes no marinos, generalmente, como simbiontes en los órga-nos luminosos de diferentes organismos hospederos. Aunque no contribuyen a la fosforescencia del océano, (la cual es causada por algunos dinoflagelados, hidrozoos, poliquetos, moluscos, crustáceos y peces), participan en el reciclaje de nutrientes y muchas de ellas, forman parte de la flora intestinal de los peces (Goto, 1980).

Las bacterias luminiscentes emiten luz continuamente, sólo que a dife-rentes intensidades, en dependencia del contenido celular específico de enzima y sustratos que participan en la reacción. Estos niveles de enzima y sustratos son diferentes de acuerdo a una variedad de factores que inducen o reprimen la biosíntesis (Nealson, 1977).

Los mecanismos que intervienen en el control de la luminiscencia indi-can que la síntesis de luciferasa, al igual que la represión de esta enzima, ocurre en determinadas condiciones y que la luminiscencia no significa una ventaja selectiva para las bacterias. La luz es emitida como resultado de una reacción de oxidación de luciferina donde interviene como catalizadora la enzima lu-ciferasa y como oxidante el oxígeno. Se conoce que en bajas concentraciones (menores de 0.5%) el oxígeno resulta limitante y en condiciones de anaerobio-sis estricta, cesa la luminiscencia (Hasting, 1978).

El uso de bacterias luminiscentes para detectar la presencia de oxígeno en bajas concentraciones fue probado por Beijerinck en 1902 en experimentos para detectar el oxígeno formado por la fotosíntesis en un extracto de hojas de trébol machacadas (Hasting, 1978).

Entre las aplicaciones de las bacterias luminiscentes se encuentran la de-tección de micotoxinas en productos agrícolas (Yates y Porter, 1982), la detec-ción de antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas (Naven et al. 1984), y la detección de compuestos de bajo peso molecular con actividad antitumoral potencial (Steinberg et al. 1985).

Actualmente también existen sistemas de ensayos que utilizan las bac-terias luminiscentes liofilizadas o desecadas para determinar toxicidad del agua como el BioFix ® Lumi y el producto Microtox® desarrollado por AZUR Environment, (Strategic Diagnostics, Inc. Neware, DE, USA), recomendado para medir la toxicidad aguda de efluentes industriales líquidos por su rapidez, alta sensibilidad y reproducibilidad y según Doherty (2001), el Microtox® también se puede utilizar para medir la toxicidad en suelos y sedimentos.


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Objetivo: Aislar bacterias luminiscentes de muestras de agua de mar.


Materiales.Tubos de cultivo con tapón de algodón.Pipetas estériles.Placas Petri.

Reactivos y medios de cultivo.Medio líquido LM (Baumann y Baumann, 1981).

Equipos.Incubadora bacteriológica.Luminómetro, Bioluminómetro o Fotómetro.

Detalles experimentales.Cuando se realiza el aislamiento de bacterias luminiscentes a partir de

muestras de aguas se recomienda utilizar cultivos enriquecidos en medio líqui-do LM (Baumann y Baumann, 1981).

Procedimiento.Se preparan tubos de cultivo con 9 mL de medio líquido LM (Baumann

y Baumann, 1981), a los cuales se les añade 1 mL de muestra, y se incuban a 25 oC hasta siete días. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se reali-zan diluciones seriadas hasta 10-8 empleando el mismo medio de cultivo y se siembra superficialmente 0.1 mL de cada dilución en placas Petri con el medio LM agarizado.

Las placas sembradas se incuban a determinada temperatura, en depen-dencia de la especie que nos interese aislar, y se revisan cada 24 h hasta tres días. Las placas deben chequearse en la oscuridad, esperando unos segundos que la visión del observador se adapte para captar si es visible la luminiscencia.

Cuando el crecimiento es positivo, se observará una luminiscencia ca-racterística (Foto 1) que puede cuantificarse empleando un luminómetro, un bioiluminómetro o un fotómetro (Foto 2).


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Foto 1. Apariencia de un cultivo de bacteria luminiscente en erlenmeyer con medio líquido.

Foto 2. Fotómetro modelo 500 Analyzer


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64

2.9. Aislamiento de bacterias asociadas a organismos marinos.

Las bacterias que viven asociadas a peces e invertebrados marinos pue-den ser patógenas o formar parte de su microbiota normal, sin embargo, se co-noce más sobre las patógenas, debido al interés que existe por evitar o contro-lar las enfermedades en los organismos que son consumidos por el hombre.

Las infecciones causadas por bacterias en peces e invertebrados marinos son más frecuentes entre los organismos en cultivo que entre los de vida libre, y es uno de los aspectos que se le presta mayor atención en la acuicultura.

Según Sanders y Fryer (1988) a nivel mundial se han aislado aproxima-damente, 35 especies de bacterias, pertenecientes a 21 géneros, asociadas a peces enfermos.

Desde el punto de vista ecológico, la flora bacteriana de invertebrados acuáticos constituye un componente significativo de los microorganismos que contribuyen, de manera global, a la productividad en lagos y océanos (Tietjen, 1980).

También, existen evidencias de que algunas bacterias son consumidas por el fitoplancton (Bird y Kalff, 1986), así como por invertebrados de niveles tróficos superiores, lo que puede influir en el flujo de energía en la trama ali-menticia (Jannach, 1985).

Otro aspecto de interés es la capacidad de algunas bacterias que viven asociadas a peces e invertebrados de producir antibióticos y enzimas de interés médico farmacéutico (Nishihara et al. 2008).

Objetivo: Aislar bacterias de peces e invertebrados marinos.


Materiales.Aplicador estéril.Tijeras quirúrgicas estériles o bisturí.Pinzas.Jeringuilla estéril.Pipetas estériles.Placas Petri estériles.


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Reactivos y medios de cultivo.Agua destilada estéril.Tintura de yodo o etanol 10 70%.Tinción Gram.Agar infusión cerebro-corazón (BHI) o el Agar triptona soya (TSA) suplementado con NaCl (1-3%).Agar Marino.Agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sucrosa (TCBS).Agar nutriente.Caldo tioglicolato.Medio líquido tripticasa- peptona- glucosa.Agar Cytophaga.Agar KDM-2.Mueller -Hinton suplementado con 0.1% de L-cisteína.Agar sangre.Medio Löwenstein-Jensen, Medio Ogawa o Medio Sauton para micobacterias.Agar feniletil (BBL).

Equipos.Homogenizador.Incubadora bacteriológica.Cámara húmeda.

Detalles experimentales.No existe un solo método para aislar todos los microorganismos que

pueden encontrarse en un organismo, pero en todos los casos, es recomendable obtener información sobre las características biológicas básicas del organismo con que vamos a trabajar, ya que esta información puede resultar de utilidad a la hora de escoger el método de aislamiento y el medio de cultivo a emplear.

Tanto los peces como los invertebrados colectados deben analizarse tan pronto como sea posible para evitar cambios en la microbiota durante el alma-cenamiento.

Procedimiento.

Peces.Si trata de peces enfermos, se recomienda primeramente, realizar una

detallada descripción de la lesión (superficial o interna) y consultar la literatura existente para orientarse sobre el posible agente causante de la enfermedad, ya que existe bastante información sobre las especies microbianas patógenas en peces.


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En general, para el aislamiento se desinfecta el área donde vayamos a trabajar con tintura de yodo o etanol al 70%, se toma una muestra directamen-te de la lesión con un aplicador estéril o se corta parte del tejido con tijeras qui-rúrgicas estériles y se homogeniza en una pequeña cantidad de agua destilada estéril. Una vez se observe que la muestra está uniformemente desintegrada, se deja reposar por unos min y se siembra una porción del sobrenadante en el medio seleccionado.

Especies de los géneros Vibrio y Aeromonas se consideran constituyen-tes de la flora normal de peces de aguas marinas y dulces, aunque algunas cau-san vibriosis, furunculosis y septicemias.

Para el aislamiento de vibrios se pueden emplear el Agar infusión cere-bro-corazón (BHI) o el Agar triptona soya (TSA) suplementado con NaCl (1-3%) o preparado con agua de mar estéril. También se puede usar Agar Ma-rino y el Agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sucrosa (TCBS), este último es selectivo para vibrios enteropatógenos como el V. cholerae y el V. parahaemo-lyticus.

Para el aislamiento de Aeromonas salmonicida, la especie patógena de peces más ampliamente distribuida en el mundo, se emplea BHI y TSA. Des-pués de incubar a 25 °C de 2 a 3 días, aparecerán colonias circulares, elevadas y traslúcidas. Las cepas típicas producen un pigmento carmelita soluble en agua que se difunde al medio alrededor de la colonia.

Aeromonas hydrophila, A. caviae y A. sobria pueden aislarse de la su-perficie externa o de los intestinos de los peces usando medio BHI y TSA o Agar nutriente. En Agar nutriente después de 24 a 48 h de incubación a 25 °C aparecerán colonias blancas, convexas, de bordes circulares y entero.

Otra bacteria aislada de peces es la especie Plesiomonas shigelloides que puede crecer en los medios BHI y TSA.

Pasteurella piscicida es una especie patógena de peces que fue descrita en 1963 a partir de una mortandad masiva de perchas blancas (Roccus americanus) y lubinas (R. saxatilis) que tuvo lugar en la costa este de Estados Unidos. Esta bacteria crece en los medios BHI y TSA con al menos, 0.5% de NaCl y tem-peratura de incubación entre 17 y 31°C.

Todos los géneros de la familia Enterobacteriaceae, excepto Erwinia, pueden considerarse aislamientos potenciales de peces y como grupo, se con-sideran, patógenos oportunistas. Tres especies de los géneros Edwardsiella y Yersinia son reconocidos como importantes patógenos de peces: E. tarda, E. ictaluri y Y. ruckeri, Edwardsiella tarda y E. ictaluri crecen en medio BHI o


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TSA. En ambos medios, se debe incubar de 2 a 3 días a una temperatura entre 22 y 26 °C. Las colonias son pequeñas, transparentes, circulares, elevadas y convexas. También se puede favorecer el aislamiento de E. tarda inoculando la muestra homogenizada de tejido lesionado en Caldo tioglicolato 4 días a temperatura de 22 °C previo al cultivo en BHI.

La especie Yersinia ruckeri es causante de la enfermedad entérica “boca roja” en salmones, muy conocida en el norte y sur de América, Europa y Aus-tralia. Esta bacteria puede aislarse en los medios de cultivo BHI y en TSA don-de crece formando colonias pequeñas, suaves, circulares y elevadas después de 48 h de incubación a 20-25 °C. También puede emplearse un medio de cultivo diferencial (Medio Shorts-Waltman).

Las colonias de Y. ruckeri son verdes y están rodeadas de una zona clara producida por la hidrólisis.

Con frecuencia, también se aíslan de peces especies de la Familia Pseu-domonadaceae, algunas de las cuales, pueden causar septicemias. Para aislar estas especies se pueden emplear los medios BHI, TSA o Agar nutriente, y temperatura de incubación entre 20 y 25 °C.

Pseudomonas chlororaphis crece en agar nutriente produciendo un pig-mento verde que forma cristales semejantes a agujas y P. fluorescens forma colonias redondas, brillosas y produce un pigmento amarillo-verdoso que se difunde en el medio y es soluble en agua. Las colonias de estas dos especies fluorecen cuando se exponen a luz UV.

De la Familia Cytophagaceae, dos especies están consideradas patógenas potenciales de peces de agua dulce: Flexibacter columnaris y Citophaga psychro-phila, mientras que, Flexibacter maritimus y Sporocytophaga se han descrito como patógenas de peces marinos.

Flexibacter columnaris causa lesiones amarillentas externas en las agallas y sobre la superficie del cuerpo. Se pueden aislar bacterias de esta especie sem-brando tejido homogenizado en Agar Cytophaga e incubando las placas a 25 °C de 3 a 5 días. Las colonias son amarillas con el centro extendido, retorcido, bordes rizoides y adheridos a la superficie del agar.

De la superficie externa de las agallas de salmones en cultivo que pre-sentan signos de la enfermedad conocida como “bacterial gill” también se ha aislado bacterias pertenecientes al género Flavobacterium. Estas bacterias pue-den aislarse sembrando tejido infectado directamente en Agar Cytophaga o en TSA muy diluido (20 veces). Después de cinco días de incubación a 18 °C crecerán colonias redondas, transparentes, suaves y de color amarillo claro.


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Las especies de Flavobacterium aisladas de peces (F. aquatile y F. balustinum) difieren de otras especies de este género por su incapacidad para crecer a 37 °C y su habilidad para hidrolizar almidón.

Cuando se estudia la microbiota normal de los peces se encuentra una población significativa de bacterias no patógenas en formas de bacilos pleo-mórficos gram positivas que no forman esporas, pertenecientes a los géneros Renibacterium, Lactobacillus y Eubacterium.

Renibacterium salmoninarum es una bacteria parásita obligada de peces que ha sido aislada de salmones de vida libre o de cultivo. Para aislarla se em-plea el medio Agar KDM-2, aunque también se puede reemplazar el suero fetal bovino que contiene este medio por carbono activado al 0.1%. Otro medio que se usa es el Mueller.-Hinton suplementado con 0.1% de L-cisteína o el Agar KDM-2 adicionándole antibióticos selectivos.

En Agar KDM-2 las colonias son circulares, convexas, de color blanco hasta amarillo crema. La temperatura óptima de crecimiento es de 15 a 18 °C y requiere de cinco a seis semanas para que aparezcan las colonias. Las colonias contaminantes que crecen rápido deben eliminarse asépticamente de las placas para lograr aislar posteriormente las de crecimiento más lento.

La especie Eubacterium tarantellus ha sido aislada del cerebro de peces estuarinos empleando medio tioglicolato o Agar BHI e incubando anaerobica-mente a 25 °C. Las colonias, visibles después de 48 h de incubación, tienen de 2 a 5 mm de diámetro, son traslúcidas, planas, rizoides con una apariencia de remolino. En placas con medio BHI con sangre de oveja ocurre ß hemólisis. Morfológicamente, las células de esta bacteria forman largas cadenas o fila-mentos de bacilos pleomórficos.

Como parte de la flora normal de peces de agua dulce y marina también se han aislado especies del género Lactobacillus, reconociéndose sólo la especie L. piscícola como patógena. Para su aislamiento se pueden emplear los medios BHI o TSA, y una temperatura de incubación de 25 °C. A los 2 días aparecerán colonias no pigmentadas con un diámetro menor a 2 mm, redondas y comple-tas. Aunque los cultivos jóvenes son Gram positivos, con frecuencia después de 24 h se observan como Gram variables.

Entre los cocos Gram positivos, el Staphylococcus epidermidis fue aisla-do e identificado en 1976 y 1977 de brotes de enfermedades en serviola y breca roja en Japón. Esta especie forma colonias circulares, convexas, lisas y blancas o blanco-amarillentas en medio BHI después de incubar a 25 °C.


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Especies de Streptococcus también se han aislado de peces enfermos de aguas dulces y marinas, sin embargo, no se han identificado los nombres. Para mayor rapidez, se ha determinado el antígeno del grupo Lancefield a que per-tenecen.

Del grupo de bacilos y cocos Gram positivos formadores de endospo-ras, se han aislado especies no patógenas del género Bacillus de la superficie externa y del tracto digestivo de peces. Estas bacterias pueden aislarse em-pleando los medios BHI, TSA o Agar nutriente y temperatura de incubación de 20 a 25 °C.

Del género Clostridium se conoce que la toxina tipo E de la especie C. botulinum causó la muerte en salmones en cultivo en Estados Unidos, Inglaterra y Dinamarca (Eklund et al. 1984), sin embargo el C. botulinum no es una especie invasiva y se considera que la muerte de los peces ocurre por el canibalismo de peces que se encuentran en descomposición en el fondo anóxi-co de los estanques y presentan la toxina. Para aislar esta especie del contenido intestinal y los tejidos de los peces se usa un medio enriquecido con yema de huevo, Agar sangre y medio líquido tripticasa- peptona- glucosa. Se incuba en anaerobiosis estricta a 25-30 °C. También se ha aislado esta bacteria directa-mente a partir de muestras de sedimentos del estanque donde ha ocurrido la muerte de peces por la ingestión de la toxina tipo E.

Entre las micobacterias, tres especies han sido descritas como patógenas de peces: Mycobacterium marinum, M. fortuitum y M. chelonei. El crecimiento de estas bacterias requiere adicionar al medio de cultivo basal factores de creci-miento y generalmente, cuando se aíslan por primera vez se necesitan periodos de incubación de hasta 30 días.

Se han descrito cuatro formulaciones de medios de cultivo específicos para el aislamiento de estas bacterias: Löwenstein-Jensen, Petrognani, Ogawa y Sauton.

Dos especies de bacterias pertenecientes al género Nocardia se han ais-lado de peces: Nocardia asteroides y N. campachi. Pueden aislarse de los órga-nos internos o de las lesiones (frecuentemente en las agallas) empleando medios bacteriológicos como el BHI, el TSA o el Agar Nutriente y temperatura de incubación de 20-30 °C.

Invertebrados marinos.Los crustáceos deben manipularse cuidadosamente para evitar daños en

sus carapachos que pueden provocar que se contamine su hemolinfa, y trans-portarse en cámara húmeda para evitar la desecación. Si no es posible transpor-tarlos en agua de mar con adecuada oxigenación, es preferible congelarlos.


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Para detectar la bacteria patógena Aerococcus viridans Subs. homari (Stewart, 1984) causante de la enfermedad conocida como Gaffkaemia en lan-gostas se requiere del análisis de la hemolinfa. La hemolinfa se extrae del seno cardiaco de los animales por punción a través de la membrana intersegmental usando una jeringuilla estéril de 5 mL. Esta membrana se localiza entre la parte posterior del carapacho y el abdomen, cuidando no tocar el hepatopancreas. Otra variante es obtener la hemolinfa del seno ventral pinchando en la mem-brana no calcificada en la base de las patas natatorias. Para evitar la contamina-ción, el sitio donde se pinche debe desinfectarse con tintura de yodo o etanol al 70% antes de hacer la punción.

La hemolinfa se puede examinar directamente con una tinción Gram o se puede sembrar en medio de cultivo selectivo para el microorganismo pató-geno como el Medio Gaffkya (Stewart et al. 1966).

Se inocula 0.5 mL de hemolinfa en 4.5 mL de caldo y se incuba por 5 días a 28 °C. Los tubos que muestren producción de ácido deben subcultivarse en Agar feniletil u otro medio nutriente no selectivo. Las colonias de Aerococ-cus viridans Subs. homari están formadas por cocos gram positivos en tétradas y son catalasa negativa.

La extracción de los órganos internos de los crustáceos para su análisis es posible sólo con el animal muerto, ya que así se puede remover fácilmente el carapacho.

Es frecuente observar lesiones necróticas en los exoesqueletos de los crustáceos que pueden deberse a la acción de bacterias quitinolíticas que pue-den aislarse directamente tomando muestra de la lesión y sembrando en un medio específico como el descrito por West y Colwell (1984), o cortando una muestra de la parte infectada con un instrumento estéril, homogenizar en agua estéril y sembrar una alícuota.

En cuanto a los moluscos, estos después de colectados deben lavarse con abundante agua para remover el fango de sus conchas y posteriormente, deben transportarse al laboratorio en cámara húmeda a una temperatura entre 8 y 10 °C. Los moluscos bivalvos no deben introducirse en agua durante la transportación porque continuarán filtrando, lo que puede alterar el conteo de su microbiota bacteriana en pocas horas.

En general, los moluscos deben abrirse con la concha plana o somera hacia arriba, cortarse las ataduras de sus músculos y retirar esta concha, para dejar los órganos internos en la concha más profunda.


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En moluscos bibalvos grandes, si es necesario colectar diferentes órga-nos internos para examen bacteriológico, la víscera entera del animal debe ser enjuagada con agua estéril pera remover las bacterias de la superficie y el fluido asociado con el órgano. Este líquido también puede ser extraído antes de ex-traer el órgano usando una pipeta estéril.

En general, para el análisis de las bacterias presentes en los invertebra-dos debe desintegrase el organismo y homogenizar la víscera o el pedazo de tejido. Homogenizar la muestra facilita la inoculación en medio de cultivo, sobretodo, si se quiere contar el número de células. Se puede batir a 12000 rev min -1 por hasta 2 min con intervalos de 15 seg, para evitar el calentamiento de la muestra. También se puede usar un digestor (“Stomacher”) por un tiempo de hasta 10 min o hasta que se visualice que la muestra se desintegró completa-mente. Debe emplearse un diluyente adecuado, como es agua filtrada y auto-claveada, preferiblemente tomada del lugar donde se colectó el organismo, que asegure la sobrevivencia de las bacterias hasta que se realice la siembra.

Para erizos marinos se emplea un procedimiento que es aplicable a los invertebrados grandes. Se abre la testa del erizo con unas tijeras estériles y se toman muestras del fluido intestinal y de varias membranas internas por di-sección y aspiración, usando jeringuillas y agujas y lavando repetidamente las superficies, respectivamente.

Allongi (1985) describió un procedimiento usando ultrasonido para la separación de bacterias de la superficie de poliquetos, pero debe emplearse con cuidado para evitar la destrucción de las células bacterianas durante el trata-miento.


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2.10. Aislamiento de bacterias asociadas a macroalgas y fanerógamas marinas.

Las macroalgas se caracterizan por tener organización celular, denomi-nándose “talo” el vegetal completo. En zonas templadas las macroalgas pueden formar densos bosques submarinos de más de 20 m de alto. Se conocen tres filos de macroalgas: Rhodophyta (algas rojas), Ochrophyta (algas pardas) y Chlorophyta (algas verdes).

Por su parte, las fanerógamas (Magnoliophyta) son plantas superiores con flores, sin tallo desarrollado, adheridas al sustrato por rizoides y con una morfología adecuada para soportar la presión hidrostática.

A nivel mundial, existen alrededor de 15 000 especies de algas, de las cuales más del 50 % son macroalgas marinas; mientras que de las fanerógamas, que forman los pastizales marinos en las plataformas continentales e insulares, se han registrado 45 especies. La zona de mayor diversidad es el Indo-Pacífico, en biotopos de fondos duros y pastizales (Suárez, 2006).

El macrofitobentos sirve de refugio y alimento a una fauna muy di-versa y constituye la base de la producción primaria en la zona nerítica. Tam-bién, pueden ser indicadoras de impacto ambiental, ya que su aparición masiva puede ser la respuesta a la eutrofización del medio o a la desaparición masiva de herbívoros por causas naturales o antrópicas. De muchas especies del ma-crofitobentos se obtiene alimento humano y pienso animal, y además, se ha utilizado para la recuperación de los suelos. De algunas algas se han obtenido sustancias bioactivas como: antitumorales, antinflamatorios, antioxidantes y otros, que forman parte de muchos medicamentos. Entre los productos más tradicionales obtenidos de las algas están sus ficocoloides (agar, alginatos y carragenanos) utilizados en varias industrias, como la alimenticia y la de cos-méticos, entre otras (Suárez, 2006).

Objetivo: Observación y aislamiento de bacterias de macroalgas y fa-nerógamas marinas.


Materiales.Bolsas de plástico estérilesTijeras estérilesPinzasCristalizadoraCubreobjetosPlacas PetriPipetas.


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Reactivos y medios de cultivo.Solución fenólica de azul de anilina.Fenol……………………………………….3.75gAzul de anilina soluble en agua…………0.05gÁcido acético 20% (v/v)…………………..100 mLEsta solución se debe pasar por un filtro Whatman No.1 antes de - usarse. Es estable a temperatura ambiente por un período de 3 meses.Glicerina o barniz de uñas.Metanol.Solución de eosina amarilla (BDH, 0.2g/L).Aceite de inmersión.

Equipos.Homogenizador, Digestor (“Stomacher”) o SonicadorMicroscopio biológico.Incubadora bacteriológica.

Detalles experimentales.Aunque el objetivo que se persiga sea el aislamiento de bacterias epífitas

de macroalgas y fanerógamas marinas, se recomienda ante todo hacer una ob-servación directa sobre la parte de la planta que se vaya a estudiar. Esta obser-vación directa es sencilla y puede brindarnos información sobre las diferentes formas de bacterias que ahí se encuentran.

Si las muestras colectadas no se pueden observar inmediatamente, se pueden conservar en una solución acuosa de thiomersal (BDH, 0.2g/L).

Procedimiento.

Observación directa.Se colectan las muestras en bolsas plásticas conteniendo agua del lugar

de la colecta y se trasladan al laboratorio donde se limpian de otros organis-mos.

Se corta con un bisturí o unas tijeras estériles la parte de la planta que se va a estudiar, y se coloca en una placa Petri estéril.

Para realizar observaciones empleando microscopía de campo claro, se recomienda teñir con una solución fenólica de azul de anilina. Una vez teñido el material por unos 2 a 3 min, se cubre con un cubreobjeto, se coloca una gota de aceite de inmersión y se observan las bacterias al microscopio biológico. La preparación puede guardarse sellada con glicerina o con barniz de uñas.

Si el material presenta una pigmentación muy oscura y se hace difícil la observación a la luz del microscopio, se requiere decolorar la muestra antes de teñirla.


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Para macrófitas acuáticas, el metanol es un buen decolorante, aunque también se puede emplear cloroformo o cloro gaseoso.

La planta se sumerge en una cristalizadota con metanol durante toda una noche. Este tratamiento tiene el inconveniente que algunas bacterias pue-den ser lavadas de la planta, por lo que no las tendremos en cuenta.

Cuando la planta absorbe la solución fenólica de azul de anilina, se di-ficulta la observación de las bacterias epífitas, por lo que se puede hacer una pretinción. La pretinción se hace tiñendo primero la planta con una solución de eosina amarilla (BDH, 0.2g/L) por 1 h. Después se procede a la tinción con la solución fenólica de azul de anilina, y se observarán las bacterias epífitas de color rojo oscuro sobre un fondo naranja claro.

Existen otros procedimientos para observar bacterias epífitas como son microscopia de fluorescencia o electrónica, a los que no se harán referencias.

Aislamiento.Para el aislamiento debe emplearse un medio de cultivo acorde con las

bacterias que se quieren aislar. No existe un medio donde puedan crecer todas las bacterias de una población, por lo que a veces, se escoge un atributo espe-cífico y se prepara el medio acorde con estos requerimientos, obteniéndose entonces un cultivo de una sub población.

Tradicionalmente, para separar las bacterias de la superficie de la planta se emplean procedimientos de homogenización, digestión o ultrasonido pero en todos los casos debe tenerse sumo cuidado de no dañar las células, y ade-más, se debe evaluar la eficiencia del tratamiento.

Una vez que las bacterias son removidas de la planta por el tratamiento que se haya aplicado, se trata la suspensión como cualquier otra, procediéndo-se a la siembra en el medio de cultivo seleccionado.

Para aislar bacterias de plantas de agua dulce Fry y Humphrey (1978) describieron el Medio Caseína-peptona-almidón.

Debe tenerse en cuenta que las hojas más viejas tiene mayor cantidad de bacterias que las hojas más jóvenes y también, que la cantidad de bacterias difiere de una parte de la planta a otra y de una especie a otra.

Para la identificación de bacterias aisladas de plantas vasculares y al-gas macrófitas se utilizan los mismos esquemas que se emplean para bacterias acuáticas, debiendo tenerse en cuenta que la composición de especies también varía con la edad de la planta y la especie.


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Capítulo 3

Técnicas Micológicas

TÉCNICAS MICOLÓGICAS

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3.1. Aislamiento de hongos en las playas.

Aislamiento de hongos arenícolas.El espacio que media entre los granos de arena de las playas, alberga una

gran variedad de animales y plantas microscópicas, donde también están inclui-dos los hongos marinos. Los hongos marinos que habitan entre los granos de arena de las playas se conocen como “hongos arenícolas”. Este grupo posee una importancia ecológica relevante porque juegan un papel primordial como des-componedores primarios de la mayoría de los sustratos orgánicos que se en-cuentran en la playa, principalmente lignocelulósicos, por lo que contribuyen a remineralizar y reciclar los nutrientes en ese ambiente (Hyde et al. 1998).

A escala internacional, el ambiente marino arenícola ha sido poco ex-

plorado desde el punto de vista micológico, por lo que la biodiversidad de hongos presentes en este medio aún ofrece la posibilidad de descubrir nuevas especies.

Objetivos: Aislar e identificar hongos arenícolas a partir de restos vege-tales cubiertos de arena.

Materiales, reactivos y equipos empleados.

Materiales.Pinzas y agujas de disección.Portaobjetos.Cubreobjetos 18 x 18 mm y de 24 x 24 mm. Bolsas de polietileno con cierre hermético.Lupa.

Reactivos.Bálsamo de Canadá para elaborar preparaciones microscópicas permanentes.Barniz de uñas transparente para sellar las preparaciones.EquiposMicroscopio estereoscópico.Microscopio biológico.

Procedimiento.La colecta de muestras debe realizarse a lo largo de la zona intermareal

o anteplaya, durante la marea baja. Se toman 30 unidades de muestra formadas por restos orgánicos (restos de madera, algas, etc.) cubiertos ligeramente con arena húmeda y se colocan de manera individual, en bolsas de polietileno ce-rradas herméticamente (Foto 3).


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Foto.3. Bolsa de polietileno con restos vegetales cubiertos de arena.

Las muestras se incuban por un período de cuatro meses, a temperatura ambiente, siguiendo el método de incubación de restos vegetales en cámara hú-meda (Volkmann-Kohlmeyer y Kohlmeyer, 1993; González y Herrera, 1993).

Después de incubadas, las muestras se revisan al microscopio estereos-cópico para localizar las estructuras de reproducción de los hongos sobre los diferentes restos vegetales (Foto 4).

Foto.4. Ascocarpos de Corollospora maritima sobre granos de arena después de cuatro meses de incubación.


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Las estructuras fúngicas encontradas se prepararan en fresco para ser identificadas al microscopio óptico mediante la Clave de identificación que propone Hyde et al. (2000).

La conservación de las especies identificadas se realiza mediante prepa-raciones microscópicas permanentes (Ver Cap.4).

Aislamiento de hongos en la espuma de mar.La morfología de las ascosporas y conidios de los hongos marinos fa-

vorece su transporte a través del oleaje, quedando muchas atrapadas entre las burbujas de aire de la espuma de mar.

En la espuma de mar los hongos más comunes son los arenícolas, entre los que se encuentran las especies Corollospora sp y Varicosporina ramulosa (Capó, 1986). También, pueden encontrarse Dendryphiella arenaria y Lepthos-paheria sp. (Vrijmoed, 2000).

Las esporas fúngicas encontradas en la espuma de mar pueden caracteri-zar la micobiota de una playa en particular (Kirk, 1983; Vrijmoed, 2000).

Objetivos: Aislar e identificar hongos de la espuma de mar aplicando el método de incubación de restos vegetales en cámara húmeda.


Materiales.Espumadera o beaker.Frascos estériles de boca ancha de 250 mL.Pipeta estéril.Portaobjetos.Cubreobjetos 18 x 18 mm y de 24 x 24 mm.

Reactivos.Bálsamo de Canadá para elaborar preparaciones microscópicas perma-

nentes 50 mL.Barniz de uñas transparente para sellar las preparaciones.Formalina al 45%EquiposRefrigerador Microscopio biológico. Procedimiento


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La espuma de mar se colecta fácilmente a lo largo de la costa, cuidando no colectar restos de arena o agua (Foto 5). Para esto puede utilizarse una es-pumadera convexa o un beaker.

Foto.5. Espuma de mar que arriba a la zona intermareal.

La espuma se vierte en frascos estériles de 250 mL de boca ancha.

Las muestras son refrigeradas por dos horas a 5 °C para evitar la germi-nación de las esporas. A continuación, se deja que la espuma se disuelva y las esporas precipiten.

Se toma parte del precipitado con una pipeta y se realiza una prepara-ción en fresco para observar al microscopio biológico.

Las esporas fúngicas se observan con un aumento de 40 x, preferible-mente utilizando microscopía de campo oscuro o contraste de fase, donde las esporas se distinguen por refracción de las partículas amorfas no refractarias.

Si las muestras no pueden ser analizadas inmediatamente, se le adiciona formalina al 45% a la espuma disuelta hasta obtener una concentración final del 5%.


83Página

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3.2. Aislamiento de hongos de los pastos marinos.

Los pastos marinos son comunidades conformadas por angiospermas que se han adaptado a vivir en condiciones de inmersión permanente en el mar (Hemminga y Duarte, 2000). Numerosas especies de estas como: Posidonia oceanica, Ruppia maritima, Thalassia testudium, Zostera marina, Syringodium filiforme y Halodule wrightii, son fácilmente colonizados por hongos marinos (Kohlmeyer-Volkmann – Kohlmeyer, 1991). Las estructuras superiores no su-mergidas de estas plantas pueden estar habitadas por hongos terrestres.

Las hojas de angiospermas marinas frecuentemente son trasladadas por las corrientes hasta los manglares o las orillas de las playas cercanas a los mis-mos, donde se acumulan hasta su descomposición, por lo que el intercambio puede ir en uno y otro sentido (Hemminga y Duarte, 2000).

En la región litoral del occidente de Cuba existe una arribazon casi constante de Thalassia testudinum (Foto 6), que es la especie predominante en los pastos marinos de la plataforma insular cubana (Suárez, 2006).

Foto 6. Praderas de Thalassia testudinum frecuentes en los fondos de la plataforma submarina cubana.


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Objetivos: Determinar la abundancia de hongos marinos en los pastos marinos.


Materiales.Bolsas de polietileno estériles con cierre hermético.Bisturí.Cubres y portaobjetos.

Reactivos.Bálsamo de Canadá para elaborar preparaciones microscópicas permanentes.Barniz de uñas transparente para sellar las preparaciones.

Equipos.Microscopio estereoscópico.Microscopio biológico.

Procedimiento.La colecta de los rizomas, tallos y hojas de los vegetales que forman los

pastos marinos se puede realizar directamente por un buzo o utilizando una draga. Las muestras colectadas se colocan en bolsas de polietileno estériles con cierre hermético para su traslado al laboratorio.

Las manchas carmelitas y blanquecinas en los extremos de las hojas in-dican el ataque de hongos. Los cuerpos fructíferos pueden ser encontrados directamente sobre las hojas, o desarrollarse después de incubar las hojas daña-das, aproximadamente, por un mes.

Los ascocarpos y picnidios están casi siempre embebidos en el sustra-to, en este caso, en los tallos y hojas, lo que dificulta su visualización desde el exterior, por tanto, la cutícula o las células de las capas externas de tallos y hojas deben cortarse tangencialmente con una cuchilla debajo del microscopio estereoscopio. También estas muestras pueden ser divididas longitudinalmente con el fin de hacer visibles las esporas, las cuales están generalmente dispuestas en filas paralelas al axis largo del tallo.

Las manchas negras en los tallos y en la envoltura de las hojas indican la presencia de ascocarpos ocultos (Foto 7).


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Foto 7. Ascocarpos de Lindra marinera embebidos en una hoja de Tha-lassia testudinum.

Una vez extraídas estas estructuras de reproducción se realiza una preparación en fresco para su identificación y posteriormente, se procede a la elaboración de la preparación microscópica permanente para mantener en colección.

Si se quiere obtener cultivos puros de estos hongos se puede empler el medio de cultivo Thalassia agar (Meyer y Simms, 1965).


87Página

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3.3. Aislamiento de hongos asociados al mangle.

Los manglares juegan un papel importante en la productividad de las zonas costeras de diversas partes del mundo, sin embargo, a pesar de su mag-nitud, importancia ecológica y significación económica, no poseen un nivel de estudios que permita evaluar la riqueza biológica que alberga en toda su extensión.

Los manglares del Caribe antillano acogen en sus raíces una gran diver-sidad de organismos como hongos, algas, esponjas, ascidias etc., algunos de los cuales son fuentes potenciales de fármacos (Garateix y Ortiz, 2007).

Por esto, el conocimiento integral del estado de conservación del eco-sistema de manglar así como, el estudio de su biota asociada adquiere una gran importancia, además de contribuir al conocimiento y preservación de la biodi-versidad marina.

Las hojas secas y ramas de muchos de los árboles y arbustos que com-ponen el bosque de manglar caen al agua espontáneamente o forzadas por las lluvias y el viento.

Allí se disponen entre las raíces donde son usadas como substrato, re-fugio o ingeridas como alimento por disímiles organismos, hasta ser completa-mente destruidas con la ayuda de los microorganismos.

Todo ello permite que estos fondos, y los que se extienden a continua-ción del manglar, sean ricos en nutrientes derivados de la descomposición de la materia orgánica generada por el bosque y los organismos que en él habitan (Bulte et al. 2005).

Los manglares son el medio ideal para el crecimiento y reproducción de los hongos, lo que se corrobora con la variedad de especies encontradas en estudios recientes (Besitulo et al. 2002; Nieves–Rivera, 2005).

De la parte sumergida del manglar han sido aislados ascomicetes, lo que ratifica la amplia distribución geográfica de este grupo. Sin dudas, este ecosis-tema aporta sustratos favorables para el crecimiento de los hongos, en especial los lignícolas (Hype y Sarma, 2000), aunque la mayor diversidad de hongos está generalmente asociada al material que permanece sumergido por largos periodos de tiempo (Foto 8).


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Foto. 8. Mangle sumergido, sustrato ideal para ser colonizado por los hongos marinos.

Objetivos: Aislar e identificar hongos marinos asociados a hojas, ramas y raíces de mangle sumergidos.


Materiales.Tijeras.Bisturí.Bolsas de polietileno estériles con cierre hermético.Porta y cubre objetos para preparaciones microscópicas permanentes.

Reactivos.Bálsamo de Canadá para elaborar preparaciones microscópicas permanentes.Barniz de uñas transparente para sellar las preparaciones.

Equipos.Refrigerador.Microscopio estereoscópico .Microscopio biológico.

Procedimiento.Las muestras de las raíces y ramas de mangle sumergidas se cortan justo

encima del sedimento, desechándose las partes embebidas en el suelo, pues


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generalmente carecen de oxígeno y están pobladas por bacterias anaerobias, como lo indica el color negro y el fuerte olor a H2S.

Debe tenerse el cuidado de colectar solamente aquellas par-tes que están sumergidas, al menos, en algún momento del día, nunca aquellas que se encuentren por encima de la superficie del agua, pues estarán habitadas por hongos terrestres.

Se toman pedazos de hojas, raíces o ramas que hayan perdi-do la corteza, o que presenten manchas, pues aquí se desarrollan los cuerpos fructíferos y conidios de los hongos con mayor facilidad (Foto 9).

Foto 9. Hojas de Rhizophora mangle colonizada por el hon-go mitospórico Cercospora sp.

Las muestras se colocarán en bolsas de polietieno estériles y serán examinadas o conservadas a 5 °C en el laboratorio. Pos-teriormente, se realizan preparaciones microscópicas para exami-nar el material y se identifican las especies empleándose las claves Kohlmeyer y Kohlmeyer, (1979), Jones y Hyde, (1988) y Hyde y Sarma, (2000).


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3.4. Aislamientos de hongos asociados a organismos marinos.

La presencia de hongos filamentosos en sustratos calcáreos sumergidos por lo general, pasa inadvertida, sin embargo, la presencia de estos microor-ganismos en los arrecifes coralinos ha sido descrita por Kohlmeyer y Volk-mann- Kohlmeyer (1987, 1989, 1992). Estos autores identificaron 22 especies de ascomicetes y hongos anamórficos asociados a esponjas costrosas, algas co-ralinas, fragmentos de corales y moluscos.

Las investigaciones acerca de los hongos asociados a los arrecifes co-ralinos se han dirigido principalmente, al estudio de enfermedades en corales blandos como los abanicos de mar (Gorgoniidae) (Geriser et al. 1998; Bor-neman, 2008), y sus síntomas en varios hospederos, usualmente en forma de necrosis del tejido o biomineralizacion (Rand et al. 2000). Datos recientes se-ñalan la especie Aspergillus sydowii como responsable de la destrucción masiva de corales en el mar Caribe (Harwksworth, 2003).

A pesar del interés del tema, los estudios sobre la biodiversidad de hon-gos marinos, así como sobre las interacciones de los hongos con los orga-nismos que viven en los arrecifes, son aún insuficientes (Morrison-Gardiner, 2002).

Objetivo: Aislamiento e identificación de hongos marinos asociados a gorgónidos.


Materiales.Bolsas Ziploc estériles.Nevera o hielera (4oC de temperatura).Papel de filtro.Cajas Petri. Pinzas.Tubos de cultivo.

Reactivos y medios de cultivo.Caldo Extracto de Malta.Harina de maíz agua de mar con antibióticos (estreptomicina 0.6 mL,penicilina 1mL y cloranfenicol 2.5 mL).Jugo de ocho verduras- agar (J8V).Solución de hipoclorito de sodio al 0.06%.


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Equipos. Microscopio estereoscópico.Microscopio biológico.Nevera portátil o hielera.

Procesamiento.El procedimiento que se describe a continuación es el método de Mo-

rrison-Gardier (2002) modificado (Medina, 2005).

En el área de muestreo, se toma una muestra del gorgónido o coral blan-do y se divide en seis submuestras que se colocan inmediatamente, de manera individual, en bolsas Ziploc estériles.

Las bolsas con las submuestras se cierran convenientemente y se trans-portan al laboratorio en una nevera o hielera a 4 °C aproximadamente, para su procesamiento antes de las 2 h de colectadas.

Debe preparase un control negativo y otro positivo. Para el control ne-gativo se toma un tubo de cultivo con 10 mL de agua destilada estéril y se vierte en una bolsa Ziploc estéril con pedazos de papel de filtro. Este control demuestra la esterilidad del material y del proceso al no obtener crecimiento de ningún hongo al final del procedimiento.

Para preparar el control positivo se toma un tubo de cultivo con 10 mL de caldo extracto de malta y se inocula con Aspergillus fumigatus. El tubo con el caldo inoculado se vierte sobre los pedazos de papel de filtro contenidos en una bolsa Ziploc estéril. Esto demuestra que el método es efectivo si al obtener al final del proceso solamente el hongo que se inocula inicialmente.

En el laboratorio, las submuestras del gorgónido o coral blando se cor-tan con tijeras flameadas y estériles, ayudándose de unas pinzas estériles, para obtener 120 pedazos pequeños (aproximadamente de 5 cm2 del tejido del orga-nismo), y se desinfectan superficialmente con solución de hipoclorito de sodio al 0.06 % y agua de mar estéril.

Sobre la superficie de cinco placas Petri conteniendo medio de cultivo harina de maíz-agua de mar (HMA) con antibióticos (estreptomicina 0.6 mL, penicilina 1mL y cloranfenicol 2.5 mL para 1 L de medio), se colocan cuatro pedacitos separados del tejido del organismo (inóculos) y de la misma forma, se procesan las submuestras restantes.

Procesamiento de los controles: Del control negativo, se colocan 20 pedazos de papel de filtro embebido con el agua destilada estéril en cinco cajas Petri con medio HMA y para el control positivo, de igual manera, se colocan


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20 pedazos de papel de filtro inoculados con A. fumigatus en cinco cajas Petri con medio HMA.

Todas las cajas Petri (muestras y controles) se incuban a temperatura am-biente por 25 días y se revisan diariamente.

Todas las colonias de hongos obtenidas que crecen con diferente mor-fología, se transfirieren a cajas de Petri con medio de cultivo jugo de ocho verduras agar (V8A) y se valora su incidencia. Posteriormente, las colonias se pasan a tubo con este mismo medio.

Para la identificación de los hongos obtenidos, se consultan las claves taxonómicas especializadas como Barnett y Hunter (1998), Kohlmeyer y Vo-lkmann-Kohlmeyer (1991) y Hyde y Pointing (2000).


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Capítulo 4

Métodos de Conservación

MÉTODOS DE CONSERVACIÓN

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4.1. Conservación de Bacterias.

Para conservar correctamente las cepas de microorganismos en los labo-ratorios deben cumplirse tres requisitos: que el cultivo esté puro, que durante el tiempo de conservación sobrevivan, al menos, el 70-80 % de las células, y que estas células permanezcan genéticamente estables (García y Uruburu, 2001).

Teniendo en cuenta que no existe un método general para la conser-vación de microorganismos, debe determinarse cual es el más apropiado para cada caso particular.

Existen varios métodos de conservación, que se utilizan según el objeti-vo del trabajo, los requerimientos del microorganismo a conservar, las posibi-lidades técnicas del laboratorio y la disponibilidad de recursos. Estos métodos pueden dividirse en tres grupos:

Métodos de conservación a largo plazo•Métodos alternativos•Métodos restringidos•

Métodos de conservación a largo plazo.Los métodos de conservación a largo plazo son los mejores porque ga-

rantizan al máximo la estabilidad genética ya que se paraliza el crecimiento de las células microbianas, lo que evita la aparición de generaciones sucesivas, sin que las células mueran. No obstante esta ventaja, no se puede descartar que ocurra algún cambio originado en la etapa de preparación de las condiciones para la aplicación del método. A este grupo pertenecen dos métodos: la con-gelación y la liofilización.

Conservación por congelación.Consiste en la congelación de las células en suspensión en un líquido

conteniendo un agente crioprotector. Los tubos cerrados o sellados se guardan a temperatura inferior a cero grado celsius (-195 °C) en nitrógeno líquido, o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido con una temperatura de -140 °C.

En el mercado existen varios tipos de armarios congeladores, de los cua-les los más aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de -70 °C. Para conservan las cepas en estos armarios se utilizan unos tubos plásticos esterilizables resistentes a la congelación, que se cierran herméticamente co-nocidos como “criotubos”.

Se recomienda preparar varios lotes de tubos por cepa y utilizar uno para cada ocasión necesaria, lo que evita la congelación y descongelación sucesiva de las cepas. También, se pueden preparar tubos con “criobolas” impregnadas con la solución celular a congelar.


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El método de las criobolas no debe emplearse con microorganismos anaerobios, ya que al estar las células adheridas a una superficie, hay un mayor contacto con el oxígeno y puede afectarse la viabilidad.

En cuanto a los agentes crioprotectores, aunque existen muchos com-puestos que se pueden usar, como el dimetilsulfóxido, la leche descremada y algunos azúcares, el agente más utilizado es el glicerol a una concentración del 15 al 20%.

Para trabajar con células que están conservadas por congelación, solo se tiene que incubar nuevamente a una mayor temperatura. Se recomienda que las variaciones de temperatura, para congelar o descongelar, sean rápidas y se recomienda descongelar las células a una temperatura de 37 °C.

Este método tiene algunos inconvenientes, entre estos, que requiere equipos especializados y que algún fallo en el sistema puede producir una subi-da de temperatura durante el almacenamiento.

Conservación por liofilización.Consiste en la sublimación del hielo en las células, por tanto, primero

hay que congelar el agua libre en las células y luego eliminarla mediante el va-cío. Para realizar este proceso se utilizan los liofilizadores.

Este es un método muy recomendado por la comodidad que tiene el al-macenamiento y el envío de los liofilizados. El almacenamiento puede hacerse a temperatura ambiente (18 °C -20 °C).

Para liofilizar no debe utilizarse glicerol como agente crioprotector, de-bido a su elevado punto de evaporación y su higroscopicidad que provoca que los liofilizados queden muy viscosos. Tampoco debe utilizarse dimeltilsulfóxi-do, porque es algo tóxico y al concentrarse puede dañar las células.

Las suspensiones celulares para liofilizar deben tener una concentración de 108 -109 células/mL y la temperatura durante la sublimación debe ser lo más baja posible.

Hay algunos microorganismos que no resisten la liofilización, y enton-ces hay que recurrir a otros métodos.

Métodos alternativos de conservación.Estos métodos se utilizan cuando la cepa no resiste los métodos an-

teriores o cuando carecemos de los equipos y recursos necesarios. En este caso, se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.


101Página

Pueden ser:Conservación por transferencia periódica.•Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar •estéril.

Conservación por transferencia periódica.Este método consiste en guardar la cepa en un tubo con el mismo medio

de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, no puede permanecer por tiempo indefinido en el mismo tubo, pues las células excretan productos tóxicos del propio metabolismo que se acumulan y provocan envejecimiento y muerte ce-lular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio fresco.

Este método es el peor para mantener la estabilidad genética, ya que al cabo del tiempo, las células que se están guardando son descendientes lejanas de las que se tenían originalmente y es posible que ya no conserven algunas de sus características.

Con el fin de alargar los periodos entre las resiembras, se recomienda disminuir la cantidad de inóculo, o rebajar la proporción de algunos nutrien-tes en el medio de cultivo, inocular en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, y también, almacenar los cultivos a 4-8 °C.

Para evitar la desecación del medio de cultivo, se suele recubrir el creci-miento con una capa de aceite mineral estéril.

La transferencia periódica también facilita la contaminación de los culti-vos, teniendo en cuenta que requieren de una manipulación más seguida.

Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.Consiste en suspender en agua estéril o en agua de mar al 75% estéril,

células del cultivo que se quiere conservar.

Si se preparan las suspensiones en criotubos, la concentración celular (para bacterias y levaduras) no debe ser mayor a 104-105 células/mL.

Este método ha mostrado altos porcentajes de viabilidad en periodos hasta de 5 años, pero aunque la estabilidad para caracteres morfológicos y fi-siológicos es buena, no se ha comprobado la estabilidad de caracteres específi-cos como virulencia, poder fermentativo, etc.


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Métodos restringidosLos métodos restringidos son aquellos que no se emplean habitualmen-

te, pero que pueden usarse cuando hay que conservar microorganismos que no resisten la liofilización o la congelación. Se basan en la paralización del creci-miento por eliminación del agua disponible para las células.

Desecación en papel de filtro.Se utiliza papel Whatman No.3 (bastante absorbente) que se impregna

con una solución muy densa de células y se deja secar al aire en condiciones estériles. También puede utilizarse el procedimiento de “desecación líquida” (L-Dry) en el cual, se usa el liofilizador pero sin que se haya hecho una conge-lación previa de las células.

Debe evitarse que un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congela-ción descontrolada de las células.

Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán de desecar. Ese

método es muy bueno para microorganismos productores de esporas.

Consiste en esterilizar en autoclave pequeñas porciones de suelo o arena, en tubos con tapa de rosca, por dos días sucesivos, y posteriormente, añadirle a cada tubo 1 mL de la suspensión de células del microorganismo (o suspensión de esporas), y colocar los tubos con las tapas cerradas suavemente, en una desecadora con sílica gel cerrando la tapa de la desecadora firmemente. Luego, sacar los tubos, cerrar las tapas fuertemente y colocarlos en otra dese-cadora que puede mantenerse en el refrigerador a temperatura entre 5 y 8 °C.

También, pueden emplearse discos o tiras de papel embebidos en una suspensión del cultivo que se quiere conservar. Los discos se secan y mantie-nen igual que se describió antes, en tubos con tapas de rosca. Para revivir las células se toma un disco o una tira con una pinza estéril y se coloca en otro tubo con medio adecuado, con cuidado no contaminar el stock.

Desecación en bolitas de alginato.Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del

agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas entre 4 y 18 °C, e incluso a -80 °C debido al bajo contenido de agua y la protección que ofrece el alginato.


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Desecación en sal gruesa para halobacterias.Se mezclan las células con sal y se dejan desecar espontáneamente. En

este método, la desecación no es total debido a la higroscopicidad de la sal, pero las células dejan de multiplicarse por insuficiencia de agua disponible.


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105Página

4.2. Conservación de Hongos.

Hay varias formas de preservar los hongos, entre estas se encuentran: conservación en cultivos puros, congelados, deshidratados, en líquidos o en preparaciones permanentes. No existen reglas que establezcan la superioridad de un método con respecto a otro, pero probablemente, la congelación, la lio-filización y las preparaciones permanentes sean los más acertados.

Congelación. Los hongos que viven en la madera y en las algas se conservan muy

bien mantenidos a temperaturas cercanas a los -18 °C (Kohlmeyer y Kohlme-yer, 1979). Los ascomycetes y deuteromycetes permanecen morfológicamente inalterables aún después de repetidos procesos de congelación y descongela-ción.

Para evitar la deshidratación del sustrato durante la refrigeración, este se guarda en bolsas plásticas con agua salada. Los hongos almacenados de esta forma pueden permanecer así indefinidamente sin que varíe su morfología.

Deshidratación. La aplicación de las técnicas de deshidratación depende del sustrato en

que ha sido encontrado el hongo. Los materiales duros o gruesos como la ma-dera, corteza, rizomas o algas calcáreas se pueden secar al aire libre y a la som-bra. Las algas más blandas se secan prensando entre pedazos de tela (Dawson, 1967, citado por Kohlmeyer y Kohlmeyer, 1979). Con los sustratos secos se hacen cultivos puros según el método descrito por Pollack (1967), citado por Kohlmeyer y Kohlmeyer (1979).

Para remover el agar seco de la placa Petri, se vierten 15 mL de Agar gli-cerol caliente (2.5%) en la tapa de la placa y se pone a flotar el cultivo en el agar caliente hasta que este se solidifique. Luego se destapa con la placa invertida, se separa y se seca completamente.

La liofilización de los hongos marinos se recomienda cuando se dispone de buenos equipos. Este método garantiza una mejor conservación del mate-rial, evitando la ruptura de los cuerpos fructíferos que tiende a ocurrir con el secado al aire libre.

Conservación en líquidos. Los líquidos que más se usan en la preservación de los hongos marinos

son las soluciones de etanol (70%) y de formol (5%) preparadas con agua de mar, aunque no siempre se obtienen buenos resultados. Las ascas, el tejido in-tersticial y los apéndices de las esporas son estructuras muy delicadas y pueden encogerse, perdiendo su utilidad para trabajos futuros, por tanto, la identifi-


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cación de especies conservadas en etanol o formol es dudosa. El uso de estos compuestos como fijadores es conveniente si el material se secciona después de la deshidratación y es embebido en cera, pero siempre es mejor conservar el sustrato vivo en un criostato. Los líquidos que contengan esporas deben examinarse lo más rápido posible después de la colecta. Pueden conservarse añadiendo formalina hasta obtener una solución al 5%.

Preparaciones microscópicas permanentes. Las preparaciones microscópicas permanentes se realizan con el objeti-

vo de conservar los materiales observados y protegerlos de la deshidratación para que puedan ser utilizados en futuras investigaciones, además de que son constancia de la existencia de las especies descritas. La técnica del doble cubre-objetos descrita por Volkmann-Kohlmeyer y Kohlmeyer (1996) es una de las más utilizadas.

Procedimiento.Colocar un cubreobjeto (de 22 mm x 22 mm) sobre un portaobjetos

(de 26 mm x 76 mm) y hacer que este se adhiera al porta añadiendo unas gotas de agua destilada a ambos lados del cubreobjetos.

Seguidamente, colocar una gota grande de agua destilada en el centro del cubre, y en ella el material. Después, cubrir con un cubreobjeto más pe-queño (de 18 mm x 18 mm) e inmediatamente, hacer las observaciones micros-cópicas del material vivo para asegurarnos que se encuentra la estructura que deseamos conservar.

Después de las observaciones, adicionar una gota de glicerina al agua por uno de los lados y guardar el cubreobjetos en una atmósfera seca para que el agua se evapore.

Limpiar los residuos y sellar la preparación por los bordes con esmalte de uñas.

Separar el cubreobjeto grande del portaobjetos y colocar una gota gran-de de Bálsamo de Canadá sobre el cubreobjeto pequeño.

Virar la preparación sobre la gota de montaje y colocar sobre el por-taobjetos.

La gota de Bálsamo de Canadá sale hacia los bordes y rodea las termina-ciones del cubreobjetos pequeño y de esta forma, se cubre permanentemente el anillo de esmalte de uñas. Después de rotuladas convenientemente las pre-paraciones con los datos de la especie, sustrato, lugar de colecta y fecha, se guardan en cajas apropiadas.


107Página

BIBLIOGRAFIA

Kohlmeyer, J. y Kohlmeyer, E. 1979. Marine mycology.The higher marine fungi. Academic Press, New York.

Volkmann-Kohlmeyer, B. y Kohlmeyer, J.1996. How to prepare truly permanent microscope slides. Mycologia 10:107- 108.

Capítulo 5

Técnicas y Métodos en Ecología Microbiana

TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA

111Página

5.1. Conteo directo del número total de microorganismos.

El número total de microorganismos es una información importante para entender el papel ecológico de las bacterias en cualquier ecosistema. A partir de este valor se pueden calcular la biomasa y la productividad bacteriana en el medio marino, lo cual es de mucho interés para la elaboración de modelos tróficos.

El conteo directo del número total de microorganismos empleando mi-croscopía epifluorescente se considera el mejor método disponible en la ac-tualidad para la enumeración de bacterias en muestras naturales. Este método tiene la ventaja de que permite un estimado más exacto del número total de bacterias, ya que incluye el conteo de células vivas, muertas, activas e inactivas y viables no cultivables.

Los colorantes más empleados en esta técnica son la naranja de acridi-na (3,6-bis[dimetilamino]acridinium cloruro) y el DAPI (4´,6-diamidino-2-fenilindol), los cuales permiten identificar las bacterias no sólo por su color, sino también, por su forma y tamaño.

En general, el método se basa en la filtración de la muestra a través de un filtro de membrana que es sometido posteriormente a tinción con el colo-rante seleccionado. Kepner y Pratt (1994) hicieron un detallado análisis de las ventajas e inconvenientes del método e incluyen recomendaciones para que se generalice un único procedimiento y se brinde mayor información sobre los detalles técnicos en las publicaciones, de manera que los resultados obtenidos por diferentes autores puedan ser comparados.

Objetivo: Determinar el número total de microorganismos en una muestra de agua de mar.


Materiales.Filtros de membrana de policarbonato de 0.2 µ de diámetro de poro.

Reactivosa. Preservativos.Glutaraldehído buffereado 10% (w/v).0.40 g de NaH2PO4.1.23 g de Na2HPO4.80 mL de agua destilada.20 mL de 50% (w/w) glutaraldehído.Formalina.


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b. Dispersantes.0.1 M tetrazolium Ppi.44.61 g de Na4P2O7. 10 H2O.1L de agua destilada.c. Fluorocromo: solución patrón de naranja de acridina al 1%.

Equipos.Microscopio epifluorescente.Bomba de vacío.Portafiltros.

Detalles experimentales.

Preservación de las muestras.Las muestras para conteo directo de bacterias deben preservarse ense-

guida, si no van a ser procesadas inmediatamente después tomadas, ya que en menos de 24 h pueden ocurrir cambios en el número, el tamaño y hasta en la forma celular de las bacterias en las muestras.

Los preservativos más utilizados son el formaldehído al 4%, la forma-lina (solución acuosa de formaldehído al 40% vol/vol), el glutaraldehído al 1%, la mezcla lugol-formalina-tiosulfato, el glutaraldehído al 4% congelado, y una combinación de glutaraldehído y paraformaldehído. Aunque se use un preservativo químico, es recomendable que se guarden en frío (4 o 5 °C) y en oscuridad hasta su procesamiento, que en cualquier caso, es mejor hacerlo lo más rápido posible después de colectada la muestra.

Desagregación y dispersión de las partículas en muestras de sedimentos.En las muestras de sedimentos, las partículas de sedimento, algas u otras

partículas de materia no viva pueden interferir en la visualización de los micro-organismos, por tanto, antes de la filtración, es necesario separar las bacterias adheridas a partículas y detritus. Para esto se puede usar agitación, digestiones, ultrasonido, u otros tratamientos que combinan dispersantes químicos como el Tween 80 o el Tritón X-100, con la agitación mecánica de la muestra.

Membranas de filtración.Las membranas de policarbonato deben teñirse antes de la filtración

para reducir la fluorescencia del fondo y aumentar el contraste, lo que favorece el conteo. El colorante más usado es el Irgalán negro (2g/L en solución de ácido acético al 2%) en el cual se sumergen las membranas de 2 hasta 24 h. Después se lavan en agua previamente esterilizada por filtración, y se secan a tempera-tura ambiente


113Página

En el mercado se pueden adquirir membranas ya teñidas (Black policar-bonate membrane), lo que facilita las operaciones.

La presión de vacío que se aplique para la filtración debe ser mínima para evitar el rompimiento de las células y su penetración en la membrana. Se recomienda aplicar una presión menor de 30 mm Hg (<4 kPa) y membranas de policarbonato con un diámetro de poro de 0.2 µm.

El tiempo de la tinción varía de acuerdo con el colorante y el tipo de muestra (Tabla 4) pero generalmente, es menor el tiempo que se requiere cuando se usa naranja de acridina que el colorante 4´6 –diamino-2- fenilindol (DAPI).

Tabla 4. Tiempo de exposición empleado para tinciones usando como colorantes naranja de acridina (NA) o 4´6 –diamino-2- fenilindol (DAPI), n: número de muestras comparadas. Tomado de Kepner y Pratt, (1994).

Tiempo de exposición (min) (promedio+ D.S.)

Colorante Agua dulce Agua marinaSuelos/

sedimentosSuperficies

NA 3.1+ 1.8 3.5 + 3.8 4.5 + 6.1 2.8 +2-5

DAPI 8.4 + 6.5 9.6 + 6.2 10.0 + 5.0 5.5

n 15 12 7 1

Cuando es de interés del técnico el conteo de fototrofos, se recomienda usar DAPI como colorante en lugar de naranja de acridina porque éste último puede enmascarar la autofluorescencia roja de la clorofila.

El volumen de muestra a filtrar también es importante; generalmente se usan volúmenes desde 0.5 hasta 15 mL, recomendándose un volumen mínimo de 2 mL para membranas de 25 mm de diámetro.

Método de conteo.Para el conteo se usa una rejilla ocular cuadriculada y un aumento de

1250 X.La precisión del conteo depende del número de bacterias contadas.

Asumiendo que las bacterias se distribuyen en la membrana siguiendo una dis-tribución de Poisson y para reducir el 95 % de intervalo de confianza al 10 % de la media, la mayoría de los investigadores cuentan por lo menos, 400 células por filtro.

Para aumentar la exactitud del conteo, se recomienda hacer réplicas al nivel de submuestras y filtros.


114

No puede dejar de considerarse el error que introduce cada observador.

Este error no puede evitarse pero sí disminuye cuando la persona que cuenta gana en experiencia en el reconocimiento de la morfología de las bac-terias.

Procedimiento.Colectar las muestras de agua con frascos estériles de 200 mL de capaci-

dad y preservar con glutaraldehído bufereado (concentración final, 1%) o con formalina (concentración final, 2 %).

Añadirle la naranja de acridina teniendo en cuenta que la concentración final debe ser 0.01% (W/V). Se tiñe por 3 min si son muestras de aguas y por 4 min si son de sedimentos, y se procede a la filtración por membrana de poli-carbonato de 0.2 µm de diámetro de poro.

El volumen de agua a filtrar puede determinarse por prueba y error, pu-diendo variar desde 0.5 hasta 15 mL, de acuerdo a las características del lugar. Si son aguas oligotróficas, como las oceánicas, de 10 a 15 mL será suficiente, y en aguas eutróficas o mesotróficas (con mayor cantidad de células), el volumen requerido es menor.

Si se filtran pequeñas cantidades de agua puede usarse una jeringuilla estéril, cuidando ejercer una presión homogénea. Si se requiere filtrar mayores cantidades, puede usarse una bomba de vacío y <4 kPa de presión.

Lavar la membrana con agua (esterilizada previamente por filtración), empleando igual volumen que el de la muestra filtrada, para remover el exceso de colorante que pueda quedar.

Desconectar el vacío, safar el portafiltro y retirar la membrana con unas pinzas.

Coloque una pequeña gota de aceite de inmersión no fluorescente sobre un portaobjeto limpio y rotulado. Asegúrese que quede hacia arriba el lado correcto de la membrana. Coloque otra gota de aceite de inmersión sobre la membrana y cúbrala con un cubreobjeto. Presione el cubreobjeto para eliminar las burbujas de aire si fuera necesario.

Si no puede contarse inmediatamente, el portaobjeto puede guardarse en refrigeración (4 °C) y oscuridad hasta 1 mes, pero es recomendable contar el mismo día.


115Página

Conteo y cálculosDetermine el área efectiva de filtración, teniendo en cuenta que el área

que queda disponible para el paso del agua, después de puesta la membrana en el portafiltro es menor.

Determine el área del campo del ocular (o de la rejilla que utilizará) con el aumento que usará para el conteo y una regla micrométrica.

Cuente un mínimo de 400 células por filtro, garantizar un 95% de in-tervalo de confiabilidad.

Cuando se usa naranja de acridina las células pueden verse de color na-ranja, rojizo o verdes.

El conteo se hace mejor en un cuarto oscuro.

Para calcular el número total de bacterias en la muestra original se utili-za la siguiente fórmula:

NTB = (N x At) / (d x Vf x G x Ag) donde,NTB: número total de bacterias (células/mL)N: número de células contadas (células)At: área efectiva del filtro (mm2 o micras cuadradas) Vf: volumen de la muestra diluida (mL)d: factor de dilución, que incluye el preservativo y el dispersante si se

añadió también, (Vfinal/Vmuestra) (mL)

Se puede hacer un “blanco” y restarle la densidad de células del cálculo final.

En el caso de muestras de suelos o sedimentos, el número total de bac-terias se reporta por volumen de sedimento (cm3) o por gramo (peso seco). Si se trata de bacterias asociadas a superficies, se expresa en número de células por unidad de área (mm2).


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BIBLIOGRAFIA

Hobbie, J. E., Daley, R. J. y Jasper, S.1977. Use of Nucleopore filters for counting bacteria by epifluorescence microsco-py. Applied Environmental Microbiology 33:1225-1228.

Kepner, R. L. y Pratt, J. R. 1994.Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environ-ment Samples: Past and Present. Microbial Review vol.58, 4:603-615.


117Página

5.2. Determinación de biomasa.

Las bacterias marinas son las principales consumidores del carbono or-gánico disuelto (COD) que existe en el océano, el cual, representa una parte significativa del pool de carbono orgánico que existe en la biosfera.

Paralelamente al consumo de COD las bacterias llevan a cabo el pro-ceso de mineralización mediante el cual el COD se convierte en CO2 con la consiguiente producción de biomasa (materia orgánica particulada), la cual es consumida a su vez por los organismos de niveles tróficos superiores.

La biomasa bacteriana puede considerarse como el carbono celular aso-ciado a la célula intacta, independientemente de que se encuentre viva o muer-ta, activa o inactiva, y constituye uno de los parámetros más importantes en los estudios de Ecología Microbiana ya que a partir de este valor, se puede evaluar su disponibilidad como alimento para otros organismos de la trama alimentaria (Bratbak, 1993; Ducklow, 2000).

Para la estimación de la biomasa microbiana existen varios métodos en-tre los cuales se encuentran:

A partir del número total de microorganismos y el cálculo del •biovolumen promedio (Alongi, 1988; Bratbak, 1993; Fukuda et al. 1998; Heinanen, 1992; Norland, 1993). A partir de la determinación del trifosfato de adenosina • (ATP) (Holm-Hansen, 1969).A partir de las mediciones del ácido murámico como un compo-•nente de la pared de las células procarióticas (Morearty, 1975).A partir de la determinación de lipopolisacáridos • (Dobbs y Fin-dlay, 1993).

•En la actualidad la determinación de la biomasa bacteriana a partir del

conteo total y el cálculo del biovolumen es uno de los métodos más empleados ya que es fácil y rápido. Para expresar la biomasa en unidades de carbono se debe utilizar un coeficiente de conversión, el cual debe ser determinado para el lugar donde se está investigando, ya que en dependencia de las condiciones ambientales varía. En la literatura especializada están reportados diferentes co-eficientes que también pueden ser utilizados según las condiciones y tipo de ecosistema (Tabla 5).

Dos de los coeficientes más usados para convertir las densidades bacte-rianas en unidades de concentración de carbono son:

2.2 x 1013 gC/µm3 = 18 mol C/L-volumen celular (Bratbak y Dundas, 1984).

16 moles C/L- volumen celular (Christian y Karl, 1994).


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Tabla 5. Valores de volumen celular y factores de conversión expresados en unidades de carbono a partir de diferentes metodologías y condiciones de cultivo (Tomado de Marine Microbiology. Methods in Microbiology Vol. 30. Ed. John H. Paul. Academic Press. 2001).

FuenteTipo de cultivo

Método de determi-

nación del biovolumen

Biovolumen (BV)(µm3)

Factor de con-versión (FC)

(fgC/µm3)

BVmedio variación FCvaria-ción

Cultivo puro de agua de mar

M e d i o n a t u r a l enrique-cido

Microsco-pio electró-nico y foto-micrografía epifluores-cente

0.376 0.11 – 0.71 567 238-964

Aguas de estuario

M e d i o n a t u r a l no enri-quecido

Microsco-pia epifluo-rescencia y análisis de imágenes

0.195 0.08 – 0.34 351 178–728

A g u a dulce


Microsco-pia epifluo-rescencia y rejilla ocu-lar

0.163 0.09 – 0.26 106 39– 188

Cult ivo puro de agua de mar


C o n t a d o r de partículas

1.253 0.52 – 2.02 209 155–292

Agua de mar


C o n t a d o r de partículas

0.290 0.17 – 0.53 186 84-353

A g u a dulce


F o t o m i -c r o g r a f í a epifluores-cente

0.545 0.17 – 1.75 136 59–252


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Objetivo: Determinar la biomasa bacteriana en una muestra de agua de mar a partir del número total de microorganismos y el biovolumen celular.

Materiales, reactivos y equipos empleados

Materiales.Frascos de vidrio, estériles, de 250 mL de capacidad.Filtros GF/F de 47 mm.Membranas de acetato de celulosa de diámetro de poro de 0.2 µm.

Reactivos.a. Preservativos (Ver Cap. 5.1).Naranja de acridina.

Equipos.Equipo de refrigeración (15 – 20 °C).Microscopio de epifluorescencia.Bomba de vacío.Balanza analítica.Desecadora.Autoanalizador de carbono.Estufa.Sistema computadorizado para la captación y procesamiento.de imágenes.

Procedimiento.Las muestras colectadas, tanto de aguas como de sedimentos, se pre-

servan inmediatamente después de tomadas, utilizando una solución acuosa de formaldehído a una concentración final del 4 % vol/vol. Posteriormente, los frascos deben ser guardados en refrigeración (15 – 20 °C) hasta su proce-samiento.

Una vez en el laboratorio, se realiza el conteo total de microorga-nismos utilizando el método de conteo directo con el empleo de un coloran-te fluorescente (naranja de acridina) y microscopía de epifluorescencia. (Ver Cap.5.1).

Cálculo del biovolumenPara el cálculo del biovolumen, se determina el volumen de las diferentes

formas celulares, tomando como base la forma geométrica que más se asemeja: cocos (esfera), formas bacilares (cilindro y elipsoide promediando ambos). De cada muestra se realizan mediciones de no menos de 30 células. En el caso de los cocos, se determina su diámetro y para los bacilos se tiene en cuenta el largo y el ancho. Las mediciones se pueden realizar directamente en el microscopio


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biológico, a partir de una tinción y empleando regla micrométrica, o también, se pueden obtener las imágenes utilizando un sistema digitalizado de imágenes de video el cual es capaz de captar las células teñidas con un fluorocromo en un campo del microscopio. Esta metodología presenta una notable ventaja ya que la imagen digitalizada puede ser almacenada, editada y analizada.

Cálculos. Volumenesfera=4πr3/3donde:π:3.1416 r: radio de la esfera

Volumenparaformabacilares1=πA2/4(L–A/3)donde:π:3.1416L: largo del baciloA: ancho del bacilo Volumenparaformabacilares2(elipsoide)=πA2L/6donde:A: ancho del elipsoide.L: largo del elipsoide. El biovolumen medio se obtiene por la suma del volumen medio de las

diferentes formas celulares de la muestra.

Biovolumenmedio=∑(Volumenmediococos+Volumenmedio bacilos).

Determinación del coeficiente de conversión.Tomar alrededor de 50 muestras de agua en estaciones con diferentes

características (costeras, oceánicas).

Filtrar un volumen entre 250 – 300 mL a través de una membrana de acetato de celulosa de diámetro de poro de 1 µm con el fin de eliminar la ma-yor cantidad de los organismos consumidores de bacterias. A continuación, inocular los frascos con agua filtrada de cada estación hasta obtener una con-centración de inóculo del 10% e incubar durante 24 h en agitación a tempe-ratura ambiente. Posteriormente, se filtran los diferentes cultivos a través de filtros GF/F de 47 mm (previamente pesados en balanza analítica), los cuales se colocarán en una estufa a 60 °C durante 24 h. Finalmente, se pesan los filtros y se conservan en desecadora hasta su procesamiento. El procedimiento de cada muestra se realiza por triplicado.

Para la determinación de la concentración de carbono celular se emplea un analizador de carbono.


121Página

BIBLIOGRAFIA

Alongi, D. 1988. Bacterial productivity and microbial biomass in Tropical mangrove sediments. Microbial Ecology 15:59-79.

Bratbak, G. 1993. Microscope methods for measuring bacterial biovolumen: epifluorescence mi-croscopy Scanning Electron microscopy and Trasmission electron microscopy. En: Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. Lewis Publishers, New York. p. 303-307.

Dobbs, F.C. y Findlay, R.H. 1993. Analysis of microbial lipids to determinative biomass and detect the response of sedimentary microorganisms to disturbance. En: Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. Paul F. Kemp, Barry, F. Sherr, Evelyn B. Sherr (eds.). p. 347-358.

Ducklow, H.W. 2000. Bacterial Production and Biomass in the Oceans (Chapter 4). En: Microbial Ecology of the Oceans. Ed. D.L. Kirchman, Wiley-Liss, New York. p. 85-120.

Fukuda, R., Ogawa, H., Nagata, T. y Koike, I. 1998. Direct determination of carbon and nitrogen contents of natural bacterial as-semblages in marine environments. Applied Environmental Microbiology 64: 3352-3358.

Heinanen, A. 1992. Measuring thymidine incorporation in the open Baltic Sea, a brackish water estuary: comments in saturation level of thymidine 1-2. En Bacterioplankton in the open Baltic Sea. Finnish Marine Research No. 260.

Hobbie, J. E., Daley, R. J. y Jasper, S. 1977. Use of Nucleopore filters for counting bacteria by epifluorescence microsco-py. Applied Environmental Microbiology. 33:1225-1228.

Holm-Hansen, O. y Pearl, H.W. 1972. The application of ATP determination for estimation of microbial biomass and metabolic activity. Memories Instituto Italiano Hidrobiologia 29:149-168.

Karl, D.M. 1993. Microbial biomass estimation determined from the measurement of particula-te Adenosine-5- Triphosphate. En: Handbook of Methods in Aquatic Micro-bial Ecology. P. Kemp; B. Sherr; E. Sherr y J. Cole (eds.). Lewis Publisher. p. 359-368.


122

Morearty, D.J.W. 1975. A method for estimating the biomass of bacteria in aquatic sediments and its applications to trophic studies. Oecologia 20: 219-230.

Norland, S. 1993. The relationship between biomass and volume of bacteria. En: Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. P. Kemp; B. Sherr; E. Sherr y J. Cole (eds.). Lewis Publisher. p. 303-307.

Paul, J. H. (ed.) 2001. Marine Microbiology. Methods in Microbiology. Vol. 30. Acad. Press


123Página

5.3. Determinación de la Productividad bacteriana (Pb).

La producción bacteriana es una medida de la síntesis de materia orgá-nica por las bacterias, expresada en términos de número de células o biomasa, por unidad de volumen o peso y por unidad de tiempo. Se conoce tambien como “producción secundaria” porque se refiere a la síntesis de biomasa bacte-riana a partir de precursores orgánicos y algunos nutrientes inorgánicos.

La producción bacteriana es un proceso clave que origina el flujo de materia orgánica disuelta a travéz del lazo microbiano (“microbial loop”), por lo que su estimación establece la importancia de la trama alimentaria vía micro-organismos en el ecosistema marino.

Existen varios métodos para determinar la producción bacteriana, entre estos se encuentran:

A partir del conteo directo del número total de •microorganismos.A partir de la incorporación de compuestos radioisotópicos •como 3H-timidina o 3H-leucina .

Objetivo: Determinar la productividad bacteriana en una muestra de agua de mar

Detalles experimentales.Para minimizar las interferencias que provoca la manipulación de las

muestras en la veracidad de los resultados, se recomiendan tomar algunas me-didas desde el momento en que se colectan las muestras. Por ejemplo, la tem-peratura es un factor de suma importancia en las reacciones enzimáticas a nivel celular, por tanto, si no se puede incubar “in situ”, la temperatura de incubación de las muestras debe ser igual a la del lugar de donde se tomó la muestra.

Si la transportación de los frascos con muestras hasta el laboratorio es demorada, debe tenerse en cuenta en el análisis de los resultados el “efecto bo-tella” que provoca un aumento del número y la actividad celular de hasta tres órdenes en magnitud, aún manteniéndolas a bajas temperaturas (Ferguson et al. 1984). Este inconveniente sólo se elimina reduciendo el tiempo entre la colecta y el procesamiento o tomando grandes volúmenes de muestra, lo cual, no resulta práctico.

Otro aspecto que interfiere es la presencia de depredadores, como los protozoos. Para excluirlos, las muestras se pre filtran por mallas de diámetro de poro desde 1 hasta 3.0 µm, pero también el hecho de que estos organismos no estén presentes, puede alterar en cierto sentido, la actividad de las bacterias. La pre filtración también puede causar lesiones al fitoplancton y éste expulsar


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al medio aminas primarias, las que a su vez, pueden provocar un aumento en el número y actividad de las células (Ferguson et al. 1984).

Se reconoce que es imposible llevar a cabo un experimento sin determi-nada influencia de la manipulación, pero aún así, debe realizarse un esfuerzo para que sean mínimos los efectos y en todo caso, tenerlos en cuenta a la hora de interpretar los resultados obtenidos.

Método a partir del Conteo Directo del Número Total de microorganismos.


MaterialesLos mismos que se usan para el Conteo Directo del Número - Total de microorganismos (Ver Cap.5.1).

ReactivosLos mismos que se usan para el Conteo Directo del Número -Total de microorganismos. (Ver Cap.5.1).

ProcedimientoEn cada estación de muestreo, colectar cuatro muestras de agua con

frascos estériles de 200 mL de capacidad. Dos de las muestras prefiltrarlas por malla de 3 µm de diámetro para eliminar el microzooplancton presente en la muestra, evitando así las pérdidas de biomasa bacteriana por el efecto de depre-dación. Ambos grupos de pomos, filtrados y sin filtrar, se rotulan y se incuban, preferiblemente “in situ”, durante 6- 8 h. Después del período de incubación, todas las muestras se tratan según el procedimiento descrito para el conteo directo del número total de microorganismos empleando colorantes fluores-centes y microscopía de epifluorescencia (Ver Cap. 5.1.).

Cálculos:

Bo Bf - Bo P = ____ + ________ , donde: g t

P: Producción bacteriana (mgC. m-3.d-1).Bo: Conteo total de microorganismos al inicio del experimento- en la muestra sin pre filtrar por malla (cél/mL).Bf : Conteo total de microorganismos al final del experimento- en la muestra sin pre filtrar por malla (cél/mL).


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t x log 1.8g: Tiempo de generación* (horas)............... g = ________________ log Bff - logBof

t: Tiempo de incubación (horas). log 1.8: Es un valor empírico, teniendo en cuenta que en una- población mixta de bacterias no todas las células se- duplican al mismo tiempo.Bff : Conteo total de microorganismos al final del experimento- en la muestra pre filtrada por malla (cél/mL).Bof: Conteo total de microorganismos al inicio del experimento- en la muestra pre filtrada por malla (cél/mL).

También el tiempo de generación puede calcularse por la siguiente fórmula:

t x 0.693 g =_____________ ln Bf – ln Bof

donde:g : Tiempo de generación* (horas).t : Tiempo de incubación (horas).ln Bf : logaritmo natural del número total de microorganismos- al final del experimento en la muestra pre filtrada por malla- (cél/mL).ln Bof : logaritmo natural del número total de microorganismos- al inicio del experimento en la muestra pre filtrada por- malla (cél/mL).

Con el valor del tiempo de generación, se puede calcular la velocidad de crecimiento de las células en la muestra evaluada, mediante la siguiente fór-mula:

µ = 0.693/g.donde:µ: velocidad de crecimiento (cél/horas).0.693: ln 2.g: tiempo de generación (horas).

Método a partir de la incorporación de 3 H-thymidine

La utilización de timidina exógena es exclusiva de los organismos pro-cariontes, por tanto, su detección en el ADN bacteriano es un método muy utilizado para evaluar la actividad bacteriana.


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La timidina (timidina-2-deoxiribosa; Tdr) es un nucleótido cuya úni-ca función en la célula es participar en la síntesis del ADN. En esta reacción interviene la enzima timidina- kinasa, la cual está presente en la mayoría de los organismos, aunque hay algunas excepciones como son algunas especies de Pseudomonas, los hongos Neurospora crassa, Aspergillus nidulans y Saccha-romyces cerevisiae, y en un grupo de cianobacterias (Moriarty, 1984).

Este método se ha aplicado con éxito en aguas costeras (Fuhrman y Azam, 1980; Riemann y Søndergaard, 1984), aguas lacustres (Riemann y Søn-dergaard, 1984), y aguas oceánicas (Ducklow y Hill, 1985), considerándose uno de los más precisos.


Materiales Guantes de nitrilo.Membranas de filtro de acetato de celulosa de 0.45 mµ (Millipore).Tubos de microcentrífuga de 2.0 mL con tapas de rosca - (Fisher 02-681-344 y 02-681-360). Pipetas y puntas estériles de: 10 µl, 100 µl, 2500 µl Viales para líquido de centelleo (Fisher 03-337-26).

Reactivos.Metil- 3H-thymidina (40-60 Ci/mmol) Amersham.ácido tricloroacético 10% w/v (mantenido a 4°C).ácido tricloroacético 5% w/v (mantenido a 4°C).Acetato de etilo.Etanol 100%.Líquido de centelleo Aquasol-2.

Equipos. Incubadora regulada a la misma temperatura del lugar de donde- se toma la muestra. Contador de partículas ß. Aspiradora. Contenedor de desechos radioactivos.

Detalles experimentalesSe recomienda filtrar por malla de 3 µm a gravedad las muestras para

excluir las pérdidas de biomasa debidas a la depredación (Azam, 1980).

Debe tenerse en cuenta que una cantidad significativa de timidina pue-de ser incorporada al ARN, por lo que es importante purificar la fracción de ADN antes de medir la radioactividad.


127Página

Para determinar la producción bacteriana por este método se emplea una relación empírica entre la incorporación de timidina y la producción de células (células producidas/Timidina incorporada) y se refiere en unidades de células/mL /h.

Procedimiento, El procedimiento que se describe aquí es una modificación que propusie-

ron Riemann y Søndergaard (1984) al método de Fuhrman y Azam (1980).

Se toman réplicas de las muestras (10 mL) y se incuban con 2-20 nM de metil-3Htimidina (40-60 Ci/ mmol, Amersham) a la misma temperatura del lu-gar donde se colectaron las muestras. El tiempo de incubación puede ser desde 30 hasta 120 min, debiendo chequearse durante el mismo si está ocurriendo la fijación de timidina de forma lineal. El tiempo de incubación dependerá de las muestras utilizadas, se recomienda que sea tan corto como sea posible.

Después de la incubación, se toman submuestras de 3 mL y se colocan en un baño de hielo por 1 min y se les añade igual volumen de ácido tricloro-acético 10% (w/v) frío. Después de incubar en hielo 5 min más, la mezcla se filtra por membrana de acetato de celulosa 0.45 µm de diámetro de poro (25 mm HA Millipore) y se lava 2 veces con 3 mL de ácido tricloroacético 5 % (w/v) frío. Posteriormente, la membrana se coloca en el interior de un vial de centelleo y se le agrega 1 mL de etil acetato para disolverla (esto demora alre-dedor de 10 min).

Se añade entonces 10 mL de líquido de centelleo Aquasol-2 y se deter-mina la radioactividad en un contador Beckman LS-100C. Es importante pre-parar “blancos” usando formalina (concentración final de 1% v/v formaldehído) la cual se añade junto con la timidina a una muestra antes de la incubación. Debe restarse a los conteos de la muestra, los conteos de los controles para corregir la interferencia por adsorción y determinarse la eficiencia de las medi-ciones (quenching) con el fin de corregir los resultados.

Cálculos.Se han reportado diferentes factores de conversión para convertir los

moles de timidina incorporada a número de células producidas (Fuhrman y Azam, 1980, 1982; Moriarty y Pollard, 1981, 1982; Kirchman et al. 1982), el más utilizado es 1.3 x 1018 bacterias producidas/ mol de timidina incorporada (Fuhrman y Azam, 1980).

También, para convertir el número de células a unidades de carbono, se puede utilizar el coeficiente 1.7 x 10-15 g propuesto por Watson et al. (1977) y Furhman (1981).


128

El factor de conversión puede determinarse directamente midiendo la tasa de crecimiento de las bacterias en la muestra prefiltradas por malla e in-cubada en un tiempo “t”, utilizando conteo total por microscopia de epifluo-rescencia, y paralelamente, determinando la tasa de incorporación de timidina titriada al ADN. Los incrementos en el número de células se plotean contra la cantidad total de timidina incorporada durante la incubación (Kirchman et al. 1982).


129Página

BIBLIOGRAFÍA.

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131Página

5.4. Determinación de la Fotosíntesis, la Producción primaria neta y la Respiración.

La fotosíntesis es uno de los procesos más importantes que tiene lugar en el océano, ya que como resultado de esta actividad se produce oxígeno y materia orgánica.

A escala local, la eficiencia de este proceso depende fundamentalmente de la intensidad de la radiación solar, la abundancia y distribución vertical de los organismos fotosintéticos y la profundidad. Por cada gramo de oxigeno li-berado por los organismos fotosintéticos se sintetizan 1.43 g de CH2O, según la ecuación global:

6CO2 + 6H2O+ energía solar = C6H12O6 +6O2

Para determinar la intensidad de la fotosíntesis puede medirse el consu-mo de dióxido de carbono o la formación de glucosa o de oxígeno. Determinar el consumo de agua no es razonable, ya que es infinitesimal en proporción al promedio total de agua en la célula. Por consiguiente, si se determina la canti-dad de oxígeno liberado durante el proceso de fotosíntesis, es posible conocer la cantidad de materia orgánica sintetizada, asumiendo que el proceso en las muestras transcurre sin restricciones.

La producción primaria neta es la cantidad de carbono fijado por la fo-tosíntesis que excede la demanda de la respiración. En el océano la productivi-dad primaria no es uniforme ya que se encuentra limitada, principalmente, por la intensidad de la luz solar y la disponibilidad de nutrientes.

La respiración es el proceso contrario a la fotosíntesis, es decir, se refie-re al consumo de materia orgánica y oxígeno produciéndose CO2 y H2O. Este proceso puede representarse mediante la siguiente ecuación:

C6H12O6 + 6 O2 = 6CO2 + 6H2O+ energía

Entre los métodos más conocidos para determinar fotosíntesis están:A partir de la determinación de oxígeno disuelto en muestras •incubadas de agua de mar (conocido como “botellas claras y os-curas”).Mediante el empleo de Na• 2H

14CO3


132

Objetivo: Determinar la intensidad del proceso de fotosíntesis, pro-ducción primaria neta y respiración en una muestra de agua de mar.


MaterialesBotella oceanográfica Nansen o Niskin.Frascos de Winkler estériles.Bolsas de polietileno negro.Cristalería necesaria para la determinación del oxígeno disuelto-por el método de Winkler.

Reactivos.Los que requiere la técnica para determinar oxígeno disuelto -por el método de Winkler.

Método de “las botellas claras y oscuras”Este método es sencillo y su empleo sólo resulta válido en zonas que no

sean oligotróficas ya que no detecta cuando ocurren diferencias muy pequeñas entre la producción y el consumo de oxígeno. En estas condiciones se aconseja usar microelectrodos o emplear el método radioisotópico .

Procedimiento.Se colecta la muestra de agua de la profundidad fijada previamente, em-

pleando para ello una botella Nansen, Niskin u otro muestreador adecuado. A partir de esta muestra, se rellenan cuatro frascos Winkler de 50 mL, cuidando que no queden burbujas de aire, y se tapan herméticamente.

Dos de los frascos se utilizan para medir el oxígeno disuelto inmediata-mente (control) y los otros dos frascos se incuban, preferiblemente, a la misma profundidad de donde se tomó la muestra con la botella, cuidando forrar uno de los frascos con nylon de polietileno negro o con papel de aluminio para garantizar que no reciba luz.

Transcurrido el tiempo de incubación (de 6-8 o hasta 12 h), se determina el oxígeno disuelto en las muestras incubadas.

Cálculos.

F = Pn – R, donde:

F: Fotosíntesis (mgO2 / L . d-1). Pn: Producción primaria neta (mgO2 / L . d-1).R: Respiración (mgO2 / L . d-1).


133Página

Pn = (Oc – Oo) x 24 t

R = (Ok – Oo) x 24 tOc: valor promedio de oxígeno disuelto en el frasco claro- al final del tiempo de incubación (mgO2 / L). Oo: valor promedio de oxígeno disuelto en el frasco oscuro- al final del tiempo de incubación (mg O2 / L). t: tiempo de incubación (h).Ok: valor promedio de oxígeno disuelto en la muestra que- se midió al inicio (Control) (mg O2/ L).

Método radioisotópico (Na2H14CO3).


Frascos de vidrio de 100 mL de capacidad limpios y estériles- con tapas de goma y retapas metálicas.Ampulas de 5 mL de capacidad.Jeringuillas y agujas.Filtros de membrana de acetato de celulosa de 0.45 µ de- diámetro de poro.Placas Petri medianas.Bolsas de polietileno negro.Pipetas de 1 mL.Viales con líquido de centelleo.

Reactivos.NaOH 1 N.Formol 40%.Líquido de centelleo.HCl concentrado.HCl 5%.Na2H

14CO3 actividad 10 µ Cu/mLAgua destilada.

Equipos.Botella oceanográfica Nansen o Niskin.Campana de extracción de gases.Contador de partículas ß.


134

Procedimiento.

Preparación de la solución isotópica.El isótopo (Na2H

14CO3) se diluye con agua destilada hasta obtener una actividad final de 10 µCu/mL ajustándose el pH hasta 7 con NaOH 1 N. Una vez diluido, se distribuye en ámpulas para su mejor manejo posterior y se sellan cuidadosamente. Las ámpulas se esterilizan en autoclave a 110 °C durante 30 min y se conservan en refrigeración hasta su uso.

La muestra de agua se colecta con la botella oceanográfica a la profun-didad seleccionada según el objetivo del estudio. A partir de esta muestra, se rellenan seis frascos de vidrio de 100 mL de capacidad. En dos de estas submuestras se determina la concentración de carbonatos y de CO2 libre se-gún la técnica de Parson et al. (1984).

A los cuatro frascos restantes se les añade por separado 1 mL de la solu-ción radioisotópica e inmediatamente, se colocan dos de ellos en una bolsa de polietileno negro y los otros dos se incuban a la luz. Si no existen condiciones propicias para incubar los cuatro frascos “in situ” (a la misma profundidad a que se tomó la muestra), pueden colocarse en una cubeta adecuada con agua circu-lante tratando de mantener la temperatura constante y semejante a la tempera-tura del lugar de donde se tomó la muestra. Después de 8 a 12 h de incubación, se le añade a cada frasco 1 mL de formol al 40% y seguidamente, se filtran 50 o 100 mL de muestra a través de una membrana de acetato de celulosa de 0.45 µ de diámetro de poro. El volumen de muestra a filtrar está en dependencia de la abundancia de fitoplancton, si es poco abundante se filtran los 100 mL.

Después de filtrar, las membranas se colocan en una placa Petri pequeña y se exponen destapadas en una atmósfera de HCl por 10 min en una campana de extracción de gases y posteriormente, cada membrana se toma con pinzas y se introduce en el vial que contiene 10 mL de líquido centellante. Se agita suavemente y se lee cada muestra en el contador de partículas ß Al inicio de la experiencia deben preparase viales con líquido centellante y membranas a modo de “control” para así determinar las interferencias (“quenching”) y corre-gir el valor final de cada lectura en los frascos con las membranas empleadas en la filtración de las muestras.

Cálculos.

Ct = r x Ck x 24 , donde: R x tCt: Asimilación oscura del CO2 (µC/L . d-1).r: Diferencia de conteos entre muestras en los frascos incubados- en la luz y en la oscuridad (dpm).


135Página

Ck Valor promedio de concentración de carbonatos en la- muestra de aguas (µC/L).R: radioactividad real del isótopo utilizado (dpm).t: tiempo de incubación de las muestras (h).

En el caso que se quiera medir la intensidad de la fotosíntesis en una muestra “integrada”, es decir, de varios horizontes mezclados, se requiere em-plear un disco Secchi con el cual se medirá la transparencia. Si la visibilidad del disco llega hasta 5 m, se recomienda tomar muestras cada 1 m de profundidad. La muestra integrada se obtiene a partir de la unión de muestras de igual volu-men colectadas en las diferentes profundidades. El procedimiento que se sigue es el mismo que el descrito anteriormente para muestras no mezcladas.

Cálculos (Para muestras integradas).

F = F1 x 0.7 x p

Donde,

F: magnitud de la intensidad de la fotosíntesis (g C/m2).F1: intensidad de la fotosíntesis en la muestra integrada (mg C/L).p: distancia de la superficie a la tercera parte de la visibilidad - del disco Secchi.0.7: coeficiente que caracteriza la atenuación de la radiación- con la profundidad.


136

BIBLIOGRAFIA

APHA, 1992. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewaters. APHA-AWWA-WPCF. 18th Ed. 1134 p.

Parson, T., Maita, Y. y Llli, C. M. 1985. A Manual of Chemical and Biological Methods for Seawater Analysis. Perga-mon Press. 175 pp.

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Romanenko, V.I. y Kuznetsov, S. I. 1974. Ecología de microorganismos de aguas interiores. Manual de laboratorio. /En ruso/Ed. Nauka. 189 pp


137Página

5.5. Determinación de la intensidad del proceso de mineralización aerobia de la materia orgánica.

El proceso de degradación de la materia orgánica o mineralización se considera la actividad más importante de las bacterias heterótrofas en el océa-no. Mediante esta actividad se mantiene el equilibrio entre el material vivo y el muerto, por lo que constituye la clave del mecanismo de autodepuración (Kirchman y Williams, 2000).

Para determinar la intensidad con que ocurre el proceso de descompo-sición aerobia de la materia orgánica en las aguas se asume que el oxígeno con-sumido por los organismos en una muestra incubada en la oscuridad durante un tiempo “t”, es directamente proporcional a la intensidad con que ocurre la destrucción de la materia orgánica (Romanenko y Kuznetsov, 1981), y que el 60 % del gasto total de oxígeno corresponde al consumo de los microorganis-mos (Vinberg y Shilo, 1979; Sorokin, 1980).

Es cierto que el proceso de mineralización no es una actividad exclusiva de los microorganismos, también intervienen los procesos químicos y foto-químicos de oxidación de la materia orgánica, pero hasta el momento no se ha demostrado que estos procesos tengan una participación cuantitativamente importante (Williams, 2000).

Objetivo: Determinar la intensidad del proceso de descomposición ae-robia de la materia orgánica en muestras de aguas y sedimentos marinos.


Materiales.Frascos de vidrio de 50-100 mL de capacidad, limpios y estériles.Bolsas de polietileno negro.Cristalería para la determinación de oxígeno disuelto según- el método de Winkler.Tres tubos de vidrio o acrílico de 40 cm de longitud y 3.5 cm- de diámetro interno.Tapones de goma para ambos extremos de cada tuboManguera de goma finaAgitador de vidrio

Reactivos.Los que requiere la técnica para determinar oxígeno disuelto- por el método de Winkler.


138

Equipos.Botellas oceanográficas Nansen o Niskin.

Detalles experimentales.Los frascos para la toma de muestras para llevar a cabo esta técnica de-

ben ser los mismos que se usan para las determinaciones de oxígeno por la técnica de Winkler, por tanto, deben estar debidamente limpios y las tapas esmeriladas deben cerrar correctamente.

Para incubar las muestras “in situ” si no se cuenta con estructuras para incubar directamente en el mar, se sumergen los frascos forrados en nylon negro o papel de aluminio (para lograr oscuridad) en cubetas plásticas con un flujo de agua circulante continuo, que permita mantener la temperatura, y se colocan a la intemperie en la cubierta de la embarcación.

Procedimiento.

Muestras de aguas.A partir de la muestra de agua colectada con la botella oceanográfica, se

rellenan cuatro frascos de Winkler y se tapan con tapas esmeriladas, cuidando que no queden burbujas de aire. Inmediatamente, se fijan dos de las muestras para la valoración del oxígeno disuelto siguiendo la técnica del Winkler.

Los otros dos frascos se ponen a incubar en la oscuridad, preferible-mente “in situ”, o en condiciones lo más cercanas posible a las que existen en el lugar donde se colectaron.

Pasado el tiempo de incubación (entre 8 y 24 h) se fija el oxígeno en estos frascos y se procede a la valoración del oxígeno disuelto siguiendo la técnica de Winkler.

Muestras de sedimentos.Se entierran dos tubos plásticos de 40 cm de longitud y 3.5 cm de diá-

metro en el sedimento hasta 10 cm de profundidad aproximadamente, y se ta-pan ambos extremos con tapones de goma para sacarlos cuidando no perder el sedimento. Se destapa uno de los extremos y se rellena con agua de la interfase agua-sedimento cuidando que no queden burbujas de aire en el agua. Otros dos tubos (controles) se rellenan sólo con agua del lugar.

Los cuatro tubos se incuban en la oscuridad durante 4-8 h (en depen-dencia de las características de cada lugar), y posteriormente, se destapan por el extremo superior contrario al tramo con sedimento y con una varilla de vidrio se revuelve suavemente la columna de agua para homogenizarla.


139Página

Inmediatamente se determina el oxígeno disuelto en todos los tubos si-guiendo la técnica de Winkler y se aplica la fórmula propuesta por Romanenko y Kuznetsov (1974).

Cálculos.Para las muestras de aguas: (O2i-O2 f) x 24 O2 consumido = , tdonde:

O2 consumido = Gasto total de oxígeno = Degradación aerobia - (mgO2/mL. d-1).O2i : Oxígeno disuelto determinado al inicio del tiempo de incubación - (mgO2/mL).O2f : Oxígeno disuelto determinado al final del tiempo de incubación - (mgO2/mL).

24 : horas que tiene un día. t : tiempo de incubación (h).

La respiración debida al bacterioplancton representa el 60 % del total del gasto de oxígeno determinado en la destrucción de la materia orgánica en 24 h (Vinberg y Shilo, 1979; Sorokin, 1980).

Para convertir el valor de oxígeno consumido en unidades de carbono, se multiplica por 0.37 (1 mg O2 = 0.3750 mg C) obteniéndose mg C/mL.d-1 y para expresarlo en peso de materia orgánica se multiplica por 0.93 (1 mg O2 = 1 mg glucosa).

Para muestras de sedimentos:

d x 8 x N x pr2 x L x 10000 x 24 O2= ____________________________ , 50 x pr2 x t

donde:

O2 : oxígeno consumido (mgO2 / m2. d-1).

d: diferencia entre los volúmenes de tiosulfato consumidos- en la valoración del control y las muestras (mL).8: peso del equivalente de oxígeno. N: normalidad de la solución de tiosulfato.pr2: área interior del tubo (cm2).


140

L: altura del agua sobre el sedimento (cm).10000: factor de conversión a m2.24: factor de conversión a horas (h).50: volumen de agua a valorar (mL).t: tiempo de incubación (h).


141Página

BIBLIOGRAFIA

American Public Health Association. 1992. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 18th Ed. Washington, D.C.

Kirchman, D. L. y Williams, J. Le B. 2000. Introduction. En: Microbial Ecology of the Oceans. D.L. Kirchman (eds.). Wiley-Liss Inc. 542p.

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142

5.6. Determinación de la intensidad del proceso de mineralización anaero-bia de la materia orgánica en los sedimentos.

Para determinar el proceso anaerobio de degradación de la materia or-gánica, Romanenko y Kuznetsov (1981) describieron una técnica que se basa en la determinación del CO2 producido en la muestra de sedimento incubado en condiciones anóxicas al final de un tiempo “t” de incubación. También es posible medir la actividad de descomposición anaeróbica a partir de sustratos marcados con 14C (metanogénesis, degradación de celulosa, etc.) ó 35S (sulfato-reducción), en muestras de agua ó sedimentos incubadas durante un tiempo prefijado y a la temperatura que se registre en el propio lugar.

Objetivo: Determinar la intensidad del proceso anaerobio de descom-posición de la materia orgánica en una muestra de sedimentos marinos.

Materiales, reactivos y equipos

MaterialesFrascos de vidrio de 50-100 mL de capacidad, limpios y estériles.Bolsas de polietileno negro.Cristalería para la determinación de oxígeno disuelto, según- el método de Winkler. Tres tubos de vidrio o acrílico de 40 cm de longitud y 3.5 cm- de diámetro interno.Tapones de goma para ambos extremos de cada tubo.Manguera de goma fina.Erlenmeyer estéril.Agitador de vidrio.

Reactivos.Carbonato de sodio 0.02 N. Fenolftaleína.

Procedimiento.La muestra de sedimentos se colecta de la misma forma que se describe

en el Cap.5.5. para la determinación del proceso de mineralización aeróbica en muestras de sedimentos.

La intensidad del proceso anaerobio de mineralización se calcula a partir de la determinación del CO2 producido en una muestra de sedimento incubada durante 8 h (Romanenko y Kuznetsov, 1981). Para esto, se procede como se describió antes para la mineralización aerobia en los sedimentos sólo que, se traspasa el agua del tubo a un erlenmeyer estéril y se valora el ácido carbónico libre con carbonato de sodio 0.02 N y fenolftaleína como indicador.


143Página

Al agua del tubo “control” se le determina la concentración de oxígeno disuelto al final del tiempo de incubación por el método de Winkler y entonces se calcula la relación C/CO2 según la expresión de Romanenko y Kuznetsov (1981).

Cálculos.

C/CO2 = (n x N x L x 1200 x 24) / t

donde:

C/CO2: cantidad de ácido carbónico producido por la - descomposición (aerobia + anaerobia) de la materia orgánica (mg/m2 d-1).n: diferencia entre los mL de carbonato de sodio gastados- al valorar 100 mL de muestra y del control (mL).N: normalidad de la solución de carbonato de sodio.L: longitud del tubo que quedó relleno de agua por encima- del sedimento (cm).1200: coeficiente de conversión a cm2.24: para convertir el valor a un día (h).t: tiempo de incubación (h).

Entonces, la intensidad del proceso anaerobio de destrucción de la ma-teria orgánica se calcula finalmente según la expresión:

DMOana = C/CO2 - (O2 x 0.44) donde,DMOana: intensidad del proceso de destrucción anaerobio de la- materia orgánica (mg/m-2 d-1).C/CO2: cantidad de ácido carbónico producido por la- descomposición (aerobia + anaerobia) de la materia orgánica- (mg/m2 d-1).O2 x 0.44: destrucción aerobia determinada por el oxígeno consumido

en el tubo control (O2 al inicio - O2 al final) y convertida a unidades de car-bono mediante el coeficiente de conversión 0.85 (Romanenko y Kuznetsov, 1981).


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BIBLIOGRAFIA

American Public Health Association. 1992. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 18th Ed. Washington, D.C.

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Williams, P.J. le B. 2000. Heterotrophic bacteria and the dynamics of dissolved organic material En: Microbial Ecology of the Oceans. D.L. Kirchman (ed.). p. 153- 200.

Capítulo 6

Medios de Cultivo

MEDIOS DE CULTIVO

147Página

6.1. Bacterias.

Medio 2216E • (Oppenheimer y ZoBell, 1952).Peptona-----------------------5gExtracto de Levadura------1gFeSO4-------------------------0.1gAgar----------------------------15gAgua destilada---------------250 mLAgua de mar------------------750 mLpH: 7.2± 0.2Esterilizar a 1atm. 20 min.

Medio para bacterias heterótrofas • (Gorbienko, 1961).Extracto de carne-------------- 3gExtracto de levadura-----------5gPeptona bacteriológica----- 5gAgar agar No 3 --------------- 20 gAgua de mar ------------------ 750mLAgua destilada---------------- 250 mLpH : 7.0 ± 0.2Esterilizar a 1atm. 20 min.

Agar agua de mar • (Austin y Allen, 1982).Lab-Lemco power (Oxoid)------------------8gPeptona bacteriologica---------------------10gAgar No.3 (Oxoid)----------------------------12gAgua de mar filtrada y envejecida--------750 mLAgua corriente---------------------------------250 mLpH : 7.0 ± 0.2Esterilizar a 1atm. 20 min.

Agar estuarino • (Weiner et al. 1980).Caldo marino Difco-------------------11.22gAgar bacteriológico-------------------15gAgua desionizada---------------------1000 mLpH : 7.0 ± 0.2Hacer hervir la mezcla por 1 min. Esterilizar a 1atm. 15 min.

Medio API para bacterias sulfatoreductoras • (Overzil, 1970).Lactato de sodio…………………….4gExtracto de levadura……………….1gSulfato de Magnesio………………..0.2gAcido ascórbico……………………..0.1g

MEDIOS DE CULTIVO

148

Hidrógeno fosfato dipotasico………0.01gSulfato de amonio…………………..0.2gResazorina………………………….0.001gCloruro de sodio……………………10gAgua destilada………………………1 LpH : 7.3-7.8Esterilizar a 1atm. 20 min.

Caldo Lactosado.•Extracto de carne ----------------------------------- 3.0 gPeptona ------------------------------------------------ 5.0 gLactosa ------------------------------------------------ 5.0 gAgua destilada ---------------------------------------1000 mLpH : 6.9 ± 0.2

Los ingredientes deshidratados se adicionan al agua, se mezclan vigo-rosamente y se calientan para disolverlos. El medio se distribuye en tubos de fermentación de tal dimensión que el líquido en el tubo cubra el vial invertido al menos parcialmente después de la esterilización a 121°C por 15 min.

Para preparar el Caldo Lactosado de doble concentración se duplican los ingredientes en igual volumen de agua y se distribuye en tubos de 20 x 180 mm.

Caldo Bilis Verde Brillante.•Peptona-------------------------------------- 10.0 gLactosa-------------------------------------- 10.0 gBilis de buey-------------------------------- 20.0 gVerde brillante------------------------------ 0.0133 gAgua destilada---------------------------- 1000 mLpH : 7.2 ± 0.2

Los ingredientes deshidratados se adicionan al agua, se mezclan vigoro-samente y se calientan hasta disolverlos. Se esteriliza a 121 °C por 15 min. El medio se distribuye en tubos de fermentación de tal dimensión que el líquido cubra el tubo Durham invertido al menos, parcialmente después de la esteri-lización.

Caldo Lactosa Lauril Triptosa.•Triptosa ------------------------------------------- 20.0 gLactosa ------------------------------------------ 5.0 g

MEDIOS DE CULTIVO

149Página

Fosfato dipotásico ----------------------------- 2.75 gFosfato monopotásico-------------------------2.75 gCloruro de sodio ------------------------------- 5.0 gLauril sulfato de sodio ------------------------ 0.1 gAgua destilada---------------------------------- 1000 mLpH : 6.8 ± 0.2

Se disuelven los componentes en el agua destilada. Se puede adicionar 0.01 g/L de púrpura de bromocresol al medio, como indicador de la produc-ción de ácido y la confirmación de crecimiento (este paso es opcional). Antes de la esterilización el medio se distribuye en tubos de fermentación con tubos Durham invertidos y suficiente medio de cultivo para cubrirlo, al menos par-cialmente, después de la esterilización a 121 °C durante 15 min.

Agua Peptonada buffereada•Peptona------------------------------------------------- 10.0 gCloruro de sodio ----------------------------------------5.0 gFosfato monohidrogenado de sodio ---------------3.5 gFosfato dihidrogenado de potasio ------------------1.5 gAgua destilada ----------------------------------------1000 mLpH : 7.2 ± 0.1

Se disuelven los componentes en el agua y se agitan hasta su completa disolución. Si es necesario, se suministra calor. Se distribuyen según los volú-menes deseados en frascos de capacidad adecuada de acuerdo a las porciones de muestra a adicionar para la prueba. Esterilizar a 121 °C durante 15 min.

La preparación de la solución de doble concentración es similar sólo que la composición de cada reactivo se debe multiplicar por el factor 2. Se almacena a temperatura ambiente por un período máximo de 4 semanas.

Caldo EC•Triptosa o Tripticasa---------------------------------------- 20.0 gLactosa--------------------------------------------------------- 5.0 g Sales biliares mezcladas ó sales biliares No 3------- 1.5 gFosfato hidrógeno dipotásico------------------------------- 4.0 gFosfato dihidrogenado de potasio------------------------ 1.5 gCloruro de sodio----------------------------------------------- 5.0 gAgua destilada-------------------------------------------------1000 mLpH : 6.9 ± 0.2

MEDIOS DE CULTIVO

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Los ingredientes se adicionan al agua, se mezclan vigorosamente y se ca-lientan para disolverlos. El medio se distribuye en tubos de fermentación cada uno con un tubo Durham invertido de forma tal que quede cubierto el vial al menos parcialmente después de la esterilización a 121 °C por 15 min.

Buffer Fosfato.•Solución de Stock de Buffer Fosfato:Fosfato dihidrogenizado de potasio ---------------- 34.0 gAgua destilada ------------------------------------------- 500 mLpH : 7.2 ± 0.5

Se ajusta el pH con solución 1N de hidróxido de sodio y se diluye a 1 litro con agua destilada.

Solución de Agua Bufferada:Solución de stock de buffer fosfato -------------------1.25 mLSolución de cloruro de magnesio --------------------- 5.0 mL(81.1g de MgCl2.6H2O/L de agua destilada)Agua destilada ----------------------------------------- 1000 mL

Se distribuyen las cantidades deseadas y se esteriliza en autoclave a 121 °C por 15 min.

Caldo Azida- Dextrosa.•Extracto de carne --------------------------------- 4.5 gTriptona o polipeptona ----------------------------15.0 gGlucosa ----------------------------------------------7.5 gCloruro de sodio ----------------------------------- 7.5 gAzida de sodio ------------------------------------- 0.2 gAgua destilada ------------------------------------- l000 mLpH : 7.2 ± 0.2

Se disuelven 35 o 70 g/L en dependencia de si es simple o doble con-centración. Se distribuye en tubos y se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min.

Caldo Etil Violeta Azida.•Triptona ------------------------------------------- 20.0 gGlucosa -------------------------------------------- 5.0 gCloruro de sodio --------------------------------- 5.0 gFosfato dipotásico ------------------------------- 2.7 gFosfato monopotásico --------------- -----------2.7 gAzida de sodio ------------------------- ---------- 0.4 gEtil violeta ------------------------------------------ 0.00083g Agua destilada ------------------------------------ 1000 mLpH : 6.8 ± 0.2

MEDIOS DE CULTIVO

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Se adicionan 35.7 g a un litro de agua destilada. Se calienta hasta disolver. Se distribuye en tubos y se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min.

Medio Pfizer • (PSE).Peptona C ------------------------------------------ 17.0 g Peptona B ------------------------------------------- 3.0 gExtracto de levadura ------------------------------ 5.0 gBilis bacteriológico --------------------------------10.0 gCloruro de sodio ----------------------------------- 5.0 gCitrato de sodio ------------------------------------ 1.0 gEsculina --------------------------------------------- 1.0 gCitrato férrico de amonio ------------------------ 0.5 gAzida de sodio ------------------------------------- 0.25 gAgar --------------------------------------------------- 15.0 gAgua destilada ----------------------------------- 1000 mL pH : 7.1

Se disuelven los ingredientes en el agua destilada y se esteriliza a 121 °C durante 15 min. El medio debe mantenerse por no más de 4 h a 45-50 °C, antes de verterlo en las placas. Se siembran las placas a partir de los tubos positivos de Caldo Dextrosa Azida.

Agar Slanetz-Bartley • (Selectivo para Enterococos).Triptosa --------------------------------------------20gExtracto de Levadura---------------------------5gD (+) Glucosa-------------------------------------2gFosfato hidrógeno dipotasio------------------4gAzida de sodio-----------------------------------0.4g2,3,5 trifeniltetrazolium cloruro--------------0.1gAgar-agar-----------------------------------------10gAgua destilada-----------------------------------1000 mLpH : 7.2 + 0.2

Esterilizar 20 min en calor (autoclave sin exceso de presión). Enfriar rá-pidamente.

Agar Nutriente•Peptona ------------------------------------------- 5.0 gExtracto de carne -------------------------------- 3.0 gAgar ----------------------------------------------- 15.0 gAgua destilada --------------------------------- 1000 mLpH : 6.8 ± 0.2

MEDIOS DE CULTIVO

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Se adicionan los ingredientes al agua, se mezclan vigorosamente y se calientan hasta disolverlos. El medio se distribuye en los tubos e inmediata-mente después de la esterilización a 121 °C por 15 min, se colocan en posición inclinada para que el agar solidifique con una superficie pendiente. Se vierten 15 mL del medio enfriado a 50 oC en placas Petri, después de la esterilización, si va a utilizarse de esta forma.

Agar Bilis Esculina•Extracto de carne--------------------------------- 3.0 gPeptona-------------------------------------------- 5.0 gAgar------------------------------------------------- 15.0 gBilis vacuna-------------------------------------- 40.0 gCitrato férrico------------------------------------ 0.5 gAgua destilada-----------------------------------1000 mLpH : 6.6 ± 0.2

Se disuelven los tres primeros ingredientes en 400 mL de agua destilada. Se disuelve la bilis vacuna en 400 mL de agua destilada. Se disuelve el citrato férrico en 100 mL de agua destilada. Se combinan las soluciones y se mezclan bien. Se calientan hasta 100 °C durante 10 min. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min. Enfriar hasta 50 °C. Se agregan asépticamente 100 mL de agua destilada conteniendo un gramo de esculina, previamente calentada sua-vemente para obtener una solución, y esterilizada por filtración. Se distribuye en tubos con tapa de rosca estériles de 15 mm x 125 mm y se enfría en posición de plano inclinado. Se inoculan aproximadamente 0.2 mL del cultivo en Caldo corazón con pipeta Pasteur. Se incuba a 35 ± 0.5 °C por 48 h. Si más de la mitad del plano inclinado se ennegrece en 24 ó 48 h, la prueba se considera positiva. Si menos de la mitad de la superficie se ennegrece ó no hay ennegrecimiento en 24 ó 48 h, la prueba es negativa.

Control positivo: Enterococcus faecalisControl negativo: Streptococcus pyogenes

Agar Triptona-Soya (TSA)•Casitona ------------------------------------------ 17.0 gFitona --------------------------------------------- 3.0 gCloruro de sodio ------------------------------- 5.0 gDextrosa ------------------------------------------ 2.5 gFosfato de potasio dibásico ------------------2.5 gAgar-------------------------------------------------15.0gAgua destilada -----------------------------------1000 mLpH : 7.3 ± 0.2

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Se disuelven los ingredientes en el agua destilada por calentamiento du-rante 1 a 2 min. Se mezclan bien y se distribuye. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min.

Control positivo: Streptococcus pneumoniaeControl negativo: medio no inoculado

Caldo KF•Proteosa peptona----------------------------------- 10.0 gExtracto de levadura------------------------------- 10.0 gCloruro de sodio----------------------------------- 5.0 gGlicerolfosfato de sodio--------------------------- 10.0 gMaltosa------------------------------------------------ 20.0 gLactosa------------------------------------------------ 1.0 gAzida de sodio------------------------------------- 0.4 gPúrpura de bromocresol------------------------- 0.015 gAgua destilada-------------------------------------- 1000 mLpH : 7.2 ± 0.2

Se disuelven los ingredientes en el agua destilada. La esterilización es a 121 °C por 10 min. Para preparar el Caldo KF 1.5 concentrado se realizan las pesadas correspondientes en igual volumen de agua y se distribuye en tubos de 20 mm x 180 mm.

Se inoculan volúmenes decrecientes de la muestra en los caldos 1.5 con-centrados y de simple concentración. Se incuba a 37 °C durante 48 h. Una reacción positiva es indicada por la aparición de una coloración amarilla en los tubos debido a la producción de ácido.

Control positivo: Enterococcus faecalisControl negativo: Escherichia coli

Medio salino Vela (Vela y Ralston, 1978).•Solución A:Ca (NO3)2 ---------- 30 gKNO3 ---------- 35 gNaHCO3 --------- 62.5 gDisolver en 2000 mL de H2O destilada. Utilizar 4 mL por -litro de medio.Solución B:FeSO4. 7 H2O ----------- 5 gMnCl2. H2O ------------ 3.5 gZnSO4 -------------------- 0.75 g Disolver en 1000 mL de H2O destilada. Utilizar 2 mL por litro-

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de medio. Solución C:KH2PO4 -------- 10gDisolver en 100mL de agua destilada. Esterilizar por separado.Utilizar 1mL por litro de medio

Se añaden 4 mL de solución A y 2 mL de la solución B en 900 mL de agua destilada y aparte, 1 mL de la solución C en 99 mL de agua. Ajustar pH a 7. Esterilizar a 121°C 15 min

Medio basal (Finerty, 1994)•(NH4)2SO4-------------------------5.3gMgSO4 7H2O---------------------0.2gCaCl2 2H2O-----------------------0.01gFeSO4 7H2O----------------------0.01gEDTA-NaOH-----------------------0.0014gExtracto de levadura-------------1gKH2PO4------------------------------4gNa2HPO4----------------------------6gAgua destilada---------------------1 LpH : 7 ± 0.2Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min.

Suplementar con keroseno al 2% como única fuente de carbono y ener-gía. Pueden emplearse otras fuentes (previamente esterilizadas), como almi-dón, arabinosa, lactosa, glucosa, etc., también al 2%.

Agar GELP (Van Uden y Fell,1968)•Glucosa ----------------------20gPeptona_----------------------10gExtracto de levadura -------5gAgua de mar------------------ 1000 mLpH : 5 ± 0.2Esterilizar a 115 °C 20 min

Agar Petróleo (Finnerty y Singer, 1984)•El agar petróleo se prepara por separado: 900 mL de Medio salino

agarizado estéril y 100 mL de una emulsión de petróleo crudo estéril (10g de crudo / 100 mL de agua destilada, sonicación a 60W; 20 min), enfriar a 50 °C antes de mezclar. Mezclar y distribuir en placas de Petri.

Medio PS • (para bacterias productoras de polisacaridos)Glucosa------------------1%Peptona------------------0.5%

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Agua de mar------------75%Agua destilada----------25%pH : 7.5 ± 0.2Esterilzar a 115 °C por 15 min.

Medio Okami • (1986).Glucosa o sucrosa-------------- 0.6%Polypeptona---------------------- 0.5%Extracto de levadura------------ 0.1%Agua de mar---------------------- 100 mLpH : 7.5 ± 0.2Esterilzar a 115 °C por 15 min.

Medio LM • (Baumann y Baumann, 1981).Estracto de levadura------------------------------5g.Tristona--------------------------------------------5g.Glicerol-----------------------------------------3 mL.CaCO2--------------------------------------------1g.Agua de mar----------------------------------750 mL.Agua destilada--------------------------------250 mL.pH : 7± 0.2Esterilizar a 1 atm, 15 min.

Agar Infusión Cerebro-Corazón (BHI)•Sustrato nutritivo (extracto de cerebro, extracto de- corazón y peptona)-------------------------------27.5g.D (+) Glucosa---------------------------------------2g.Cloruro de sodio-------------------------------------5g.Hidrógeno fosfato disódico-----------------------2.5g.Agar--------------------------------------------------15g.Agua destilada---------------------------------1000 mL.pH : 7.4 + 0.2 a 25 °C.Esterilizar en autoclave a 1 atm. 15 min.

Agar Tiosulfato-citrato-bilis-sucrosa • (TCBS Agar).Peptona de caseina------------------------------------5g.Peptona de carne--------------------------------------5g.Extracto de levadura----------------------------------5g.Citrato de sodio----------------------- --------------10g.Tiosulfato de sodio-----------------------------------10g.Ox bilis-------------------------------------------------5g.Carbonato de sodio -----------------------------------3g.Sucrosa------------------------------------------------20g.

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Cloruro de sodio----------------------------10gCitrato de Fe (III)----------------------------1gAzul timol-------------------------------------0.04gBromotimol azul----------------------------0.04gAgar-agar-------------------------------------14gAgua destilada-------------------------------1000 mLpH : 8.6+ 0.2 a 25 °CNo se esteriliza en autoclave.

Caldo Tioglicolato•Peptona de caseina----------------------15gExtracto de levadura---------------------5gD (+) Glucosa------------------------------5.5gL-cistina-------------------------------------0.5gCloruro de sodio--------------------------2.5gThioglicolato de sodio-------------------0.5gResarzurina sódica----------------------0.001gAgar-agar----------------------------------0.75gAgua destilada----------------------------1000 mLpH : 7.1+ 0.2 a 25 °C. Esterilizar a 1 atm 20 min.Debe usarse siempre acabado de preparar.

Medio Waltman-Shorts (Waltman y Shorts, 1984)•Tristona------------------------------------2gExtracto de levadura-------------------2gTween 80------------------------------------10 mLNaCl------------------------------------------5gCloruro de Calcio (CaCo2.2H2O)-----0.1gBromotimol azul----------------------------0.003gAgar-------------------------------------------15gAgua destilada------------------------------980 mLpH : 7.4. Esterilizar a 1 atm 20 min

Después de estéril y enfriado a 50 °C, añadirle al medio 10 mL de una solución de sucrosa (0.5g/mL) esterilizada por filtración.

Agar Cytophaga• (Pacha y Ordal, 1967).Triptona-------------------------------------0.5gExtracto de levadura---------------------0.5gAcetato de sodio--------------------------0.2gExtracto de carne-------------------------0.2gAgar------------------------------------------9-11gAgua destilada----------------------------1000 mL

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Los ingredientes del medio se disuelven en calor y el pH se ajusta a 7.2-7.4 antes de autoclavearlo 1 atm. 15 min.

Agar KDM-2 • (Evelyn, 1977).Peptona----------------------------------------10gExtracto Levadura---------------------------0.5gCisteina-HCl----------------------------------1gAgar---------------------------------------------15gAgua destilada-------------------------------800 mL

La peptona, el extracto de levadura y la cisteina se disuelven en el agua destilada y se ajusta el pH a 6.5 con NaOH. Se añade el agar, se disuelve con ca-lor y este medio base se esteriliza a 1 atm. 15 min. Inmediatamente ante de usar el medio, se le añade 20% (v/v) suero de feto de ternero frío (45 °C). El medio basal no debe guardarse más de 3 meses. Como Renibacterium salmoninarum crece muy lento, es necesario que las placas inoculadas sean envueltas de forma ajustada, para asegurar la adecuada humedad durante el tiempo de incubación.

Medio Mueller-Hinton con 0.1% L-cisteina.•Infusión de carne----------------------------------2gHidrolizado de caseína---------------------------17.5gAlmidón-----------------------------------------------1.5gL-cisteina---------------------------------------------0.1%Agar-agar---------------------------------------------13gpH : 7.4 + 0.2 a 25 °CEsterilizar en autoclave a 115 °C 10 min

Mantener en lugar seco a temperatura entre +15 y +25 oC y protegido de la luz. Se usa para siembra a profundidad o placa vertida y se incuba aeró-bicamente.

•EmulsiónEggYolk.(Esta emulsión se usa como aditivo).

A500mLdeemulsiónEggYolkseleañaden4.25gdeclorurodesodioy se completa hasta 1L con agua destilada. Se mantiene en refrigeración de 2 a 8 °C. Cuando se vaya a usar, se agita para disolver el precipitado, se toman 100 mL y se mezclan con 900 mL de medio de cultivo estéril y enfriado a 45-50 °C. Se usa para siembra a profundidad.

•AgarsangreA una base de Caldo Corazón, se agrega agar de forma que quede al

1.2%. Se esteriliza en autoclave a 121 °C por 15 min. Posteriormente, se funde la base esterilizada y se enfría en baño de agua a 50 °C, se agrega sangre de

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carnero desfibrinada o heparinizada estéril atemperada en la cantidad necesaria para que la concentración final sea de 7.5%. Se mezcla suave para evitar la for-mación de burbujas. Se distribuye de 12 a 15 mL en placas Petri.

Control positivo: Staphylococcus aureus (hemólisis alpha). Streptococcus pneumoniae (hemólisis betha).Control negativo: Streptococcus agalactiae.

•MedioLöwenstein-Jensen.Asparagina…………………………….3.6g.Fosfato Monopotásico………………..2.4g.Sulfato de magnesio………………….0.24g.Citrato de magnesio…………………..0.6g.Harina de Papa……………..…………30gVerde malaquita……………………….0.4g.Agua destilada…………………………600.0 mL.

•MedioOgawa(Tsukamura, 1967).Glutamato de sodio……………………1g.KH2PO4…………………………………..1g.Agua destilada………………………….100 mL.Huevos enteros…………………………200 mL.Glicerol…………………………………...6 mL.Verde malaquita…………………………6 mLde una solución al 2% (W/V).

Se disuelve el glutamato de sodio y el KH2PO4 en agua destilada y se mezclan el resto de los ingredientes. El consumo de hierro se demuestra por el crecimiento de colonias naranja-rojizas en medio basal conteniendo citrato de amonio férrico 2% (w/v). Ajustar el pH a 6.8, repartir el medio en tubos de cultivo, esterilizar a 90 °C por 1 h y poner en forma que se hagan planos inclinados.

•MedioSauton (Tsukamura, 1965).Glicerol………………………………50 mL.Glutamato de sodio………………...4g.KH2PO4……………………………....0.5g.MgSO4.7 H2O……………………….0.5g.Citrato de sodio……………………..2g.Citrato de amonio férrico.................0.05g.Agar.................................................30g.Agua destilada.................................950 mL.

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Los ingredientes se disuelven en agua destilada y se ajusta el pH a 7.0 con KOH al 10% (W/v). Se esteriliza en autoclave a 0.5 atm por 30 min.

Medio Gaffkya • (Steward et al. 1966).Glucosa………………………6.5g•

Extracto Bacto levadura…….4.5gTryptona………………………15gNaCl…………………………..6.4gAlcohol feniletil……………….2.5gBromocreso púrpua………….0.008gAgua destilada………………..1 LpH : 7.4Esterilizar en autoclave a 0.5 atm. 15 min.

Se inocula 0.5 mL de hemolinfa en 4.5 mL de caldo y se incuba por 5 días a 28 °C.

Agar quitina• (West y Colwell, 1984). La quitina cruda, powder (Sigma Chemical Co.) debe lavarse por 24 h

alternando con 1M NaOH y 1M HCl por 5 veces. Seguidamente, el material se lava cuatro veces con etanol 95% y se deja secar completamente. Posterior-mente, se disuelven con cuidado 20g de quitina en 600 mL de ácido sulfúrico 50% a temperatura ambiente y se filtra a través de un wool de vidrio. La qui-tina precipita adicionando lentamente la solución acidificada a 10 L de agua fría desionizada y neutralizando la mezcla con 10M NaOH. La suspensión así obtenida debe mantenerse 24 h a 4 °C antes de centrifugar y lavar el precipita-do varias veces con agua desionizada. La pasta coloidal de quitina debe suspen-derse hasta una concentración final de 10% (w/v) y esterilizarse en autoclave. Para usarla, se añade 1 mL de la suspensión de quitina coloidal a 9 mL de agar bacteriológico fundido y añadido como una sobrecapa sobre un medio agar nutriente apropiado.

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6.2. Hongos

Harina de maíz- agar- agua de mar • (HMA) con antibióticos.Oxoid cornmeal agar………………………..17 g.Agua de mar filtrada…………………………1 L.pH:7.2Esterilizar a 1 atm 15 min.

Suplementar antibióticos: estreptomicina 0.6 mL, penicilina 1mL y clo-ranfenicol 2.5 mL, por litro de medio.

MEA o EMA • (Agar Extracto de malta).Extracto de Malta......................................20.0g.Peptona........................................................1.0g.Glucosa......................................................20g.Agar...........................................................20g.Agua destilada.............................................1 L.pH:7.2Esterilizar a 0.5 atm 15 min.

CYA25yCYA• (Agar Extracto de levadura Czapek).K2HPO4.......................................................1.0g.Concentrado de Czapek..............................10.0g.Extracto de levadura....................................5.0g.Sacarosa.....................................................30.0g.Agar.............................................................15.0g.Agua destilada..............................................1 L.pH:7.2Esterilizar a 0.5 atm 30 min.

Concentrado de Czapek.NaNO3....................................................30.0g.KCl...........................................................5.0g.Mg SO4.7H2O..........................................5.0g.Fe SO4....................................................0.1g..Zn SO4……………………………………..0.1g.Cu SO4…………………………………….0.05g.

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Agua destilada……………………………1 L.pH: 7Esterilizar a 1 atm 15 min.

Medio Thalassia Agar • (Meyer y Simms, 1965).Hojas de Thalassia maceradas.....................20g.Extracto de levadura......................................1 g.Agar................................................................18g.Agua de mar...................................................1 L.pH: 7.2 Esterilizar a 1 atm 15 min.

•MedioYSWA(Meyer y Simms, 1967).Extracto de levadura..................1g.Agua de mar..............................1 L.pH: 7.2 Esterilizar a 1 atm 15 min.