manual metodos de tipagem

MESTRADO EM MICROBIOLOGIA MOLECULAR

Artur Alves, Isabel Henriques, Ana Santos, Marta Tacão & António Correia

Tipagem Genética de Microrganismos

AVEIRO - 2003

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A . A L V E S , I . H E N R I Q U E S , A . S A N T O S , M . T A C Ã O & A . C O R R E I A

Tipagem Genética de Microrganismos

Lab. de Diversidade MicrobianaCentro de Biologia CelularDep. de Biologia, U. de Aveiro3810-193 AveiroTel: 234.370778 • Fax 234.426408http://sweet.ua.pt/~f426

ii

Í n d i c eIntrodução 1

RFLP's - Ribotipagem 2

Rep - PCR 3

Electroforese em campo pulsado 4

Sequências nucleotídicas 6

Protocolos experimentais 9

Extracção de DNA total bacteriano 9

Digestão de DNA com endonucleases de

restrição 10

Transferência por vácuo 12

Marcação por PCR da sonda de DNA 16S 13

Hibridação e Detecção 14

Preparação de DNA em blocos de

agarose 16

Digestão de DNA embebido em agarose 17

Electroforese em campo pulsado 17

BOX-PCR 18

Ligação de produtos de PCR a vector 19

Transformação 19

Extracção de DNA plasmídico 20

Preparação de um gele de agarose 21

Referências 23

11

Introdução

A correcta identificação e classificação de microrganismos é de extrema importânciaprática, não só no aspecto clínico mas também na fitopatologia, biotecnologia e estudosambientais.

Os métodos usados na discriminação de géneros, espécies e estirpes de microrganismospodem ser divididos em métodos fenotípicos e genotípicos. Os métodos fenotípicosbaseiam-se em fenómenos bioquímicos, fisiológicos e biológicos, enquanto os métodosgenotípicos detectam polimorfismos ao nível dos ácidos nucleicos, ou variação alélica aonível de enzimas.

A tipagem de microrganismos, i.e., a capacidade de os identificar ao nível da espécie, e dediscriminar entre indivíduos da mesma espécie conheceu grandes avanços nos últimosanos, tendo sido galvanizada por uma série de novos métodos que fazem uso da tremendavariação encontrada no DNA destes microrganismos.

O desenvolvimento de técnicas moleculares de tipagem de microrganismos, abriu novaspossibilidades nos campos da classificação, identificação e diagnóstico. O conhecimentosobre a filogenia e evolução dos microrganismos foi também grandemente ampliado.

Qualquer método de tipagem genética deve permitir a diferenciação clara de estirpes, eprincipalmente, deve ter uma elevada reprodutibilidade. Nem todos os métodosmoleculares de tipagem são igualmente eficazes, diferindo nomeaedamente na capacidadediscriminatória em diferentes níveis taxonómicos (Fig 1). Como tal, a escolha do métodoa ser aplicado deve ser feita de acordo com a finalidade pretendida (e.g. identificação,diferenciação), entre outros aspectos, (reprodutibilidade, poder discriminatório, custosenvolvidos, etc).

Figura 1: Capacidade discriminatória de diferentes métodosde tipagem genética de microrganismos.

T I P A G E M G E N É T I C A D E M I C R O R G A N I S M O S

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RFLP’s - Ribotipagem

RFLP’s - “Restriction Fragment Length Polymorphisms”, polimorfismos detamanho de fragmentos de restrição

Este método tem por base a digestão de DNA com endonucleases de restrição (ER’s), eposterior separação dos fragmentos obtidos por electroforese em gel de agarose,originando padrões de restrição. Os padrões de restrição obtidos podem sercaracterísticos ao nível da espécie ou mesmo da estirpe, dependendo do grau deheterogeneidade genómica intraespecífica. Este é um dos primeiros métodos de tipagemde DNA utilizado para avaliar a relação entre estirpes.

A detecção de fragmentos comuns a estirpes pertencentes a uma mesma espécie, oumesmo perfis típicos de determinados grupos, tornam esta técnica de grande interessetaxonómico. Assim, podem ser identificados fragmentos de restrição que passam afuncionar como marcadores moleculares diagnosticantes, por exemplo ao nível daespécie.

A técnica de RFLP´s apresenta como vantagens o facto de ser altamente reprodutível ede não necessitar de informação prévia sobre a sequência de DNA. Recorre-se àdesignação de RFLP’s directos quando se analisam directamente os perfis obtidos porelectroforese. Embora esta análise seja dificultada pelo elevado número de fragmentos, épossível restringi-la a uma gama de pesos moleculares correspondentes à zona de maiorresolução do gel. Obviamente apresenta-se uma desvantagem, que é o facto de apenasuma fracção do genoma ser analisada.

A combinação da análise de fragmentos de restrição com hibridação, usando sondasespecíficas de modo a reduzir o número de bandas a analisar, é a versão mais utilizadadesta técnica. Como os genes de rDNA estão presentes em várias cópias no genoma, autilização dos rDNA’s como sondas permite detectar, após hibridação, vários fragmentosde restrição (Fig. 2). Algumas sequências desta região genómica são altamenteconservadas que mesmo sondas heterólogas hibridam fortemente com elas, enquantooutras regiões genómicas variam consideravelmente, mesmo entre níveis taxonómicospróximos. Esta variante dos RFLP’s recebe a designação de ribotipagem.

M 1 2 3 4 5 6

23.1 –

9.4 –6.6 –

4.4 –

2.3 –2.0 ¯

0.6 –

Kb

Figura 2: Padrões de bandas resultantes deribotipagem. O DNA total das estirpes 1 a 6 foidigerido com EcoRI e os fragmentos resultantes,após separação electroforética, foram transferidospara uma membrana de nylon. A hibridação comuma sonda para rDNA 16S resultou nos padrões dafigura. 1 a 6 - estirpes de Brevibacterium linens; M- marcador de peso molecular.


33

rep-PCR

Método de tipagem baseado na amplificação via PCR de elementos de DNArepetitivos presentes em genomas bacterianos.

A técnica de rep-PCR faz uso de “primers” complementares de sequências de DNArepetitivas altamente conservadas, e presentes em múltiplas cópias nos genomas damaioria das bactérias Gram-negativas e várias Gram-positivas. Três famílias de sequênciasrepetitivas foram identificadas, incluindo a sequência REP (“Repetitive ExtragenicPalindromic”) de 35-40 pb, sequência ERIC (“Enterobacterial Repetitive IntergenicConsensus”) de 124-127 pb, e o elemento BOX de 154 pb.

Estas sequências parecem estar localizadas em posições intergénicas distintas no interiordo genoma. Os elementos repetitivos podem estar presentes em ambas as orientações, eos “primers” foram desenhados de modo a promover a síntese de DNA a partir darepetição invertida nos REP e ERIC, e da subunidade boxA nos BOX, amplificandoassim regiões genómicas distintas localizadas entre os elementos repetitivos. Osprotocolos correspondentes são designados REP-PCR, ERIC-PCR, BOX-PCR, e rep-PCR colectivamente.

A amplificação com os “primers” REP ou ERIC pode ser efectuada com um só “primer”,ou com um ou vários conjuntos de “primers”. No caso do elemento BOX utiliza-se umúnico “primer” (Fig. 3). A aplicação de diferentes abordagens a uma amostra aumenta opoder de discriminação.

O método de tipagem designado por rep-PCR é extremamente fiável, reprodutível,rápido e altamente discriminativo. Esta técnica tornou-se uma ferramenta valiosa naidentificação e classificação de bactérias, e em estudos epidemiológicos de patogénicos dehumanos e fitopatogénicos .

12.0 -

5.0 -

2.0 -

1.0 -

0.5 -

Kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 3: Padrões obtidos por ampliação deDNA total de várias estirpes do géneroBrevibacterium com o primer BOX A1R. 1a 6 - estirpes de B. linens; 7, 8 - estirpes deB. casei; 9, 10 - estirpes de B. iodinum; M -marcador de peso molecular.


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Electroforese em campo pulsado

PFGE - "Pulsed-Field Gel Electrophoresis"

Com o advento da técnica de PFGE, que permite a separação de fragmentos de DNA degrande tamanho (desde as centenas de quilobases até às megabases), surgiram novasabordagens ao estudo da organização de genomas. A electroforese convencional limita aanálise de DNA a fragmentos que poderão ter no máximo, 20 a 50 kb, necessitando ouso de agarose a muito baixa concentração para a separação de fragmentos de mais de 20kb. Acima destes tamanhos, não há diferenças de mobilidade que permitam a separaçãode fragmentos de acordo com o peso molecular.

Com a alternância periódica do campo eléctrico, as moléculas são permanentementeforçadas a modificar a orientação em que se movem. Quanto mais longa for a molécula,maior o tempo que necessita para que encontre uma orientação que favoreça omovimento ao longo do gel. Estes são os princípios que determinaram a criação deconfigurações que permitissem a aplicação de dois campos eléctricos, com diferenteorientação, a um gel de agarose.

Foram desenvolvidos aparelhos com diversos tipos de configurações de eléctrodos. Osistema de campo eléctrico homogéneo, (CHEF, "contour-clamped homogeneouselectrical field") é actualmente o mais usado e apresenta uma série de eléctrodos dispostosnos lados de um hexágono e com os dois campos eléctricos formando um ângulo de 120º(Fig. 4). Ao longo de cada um dos lados do hexágono forma-se uma distribuição gradualde potenciais, resultando num campo eléctrico homogéneo em todo o gel e,consequentemente, carris perfeitamente rectos.

Este tipo de configuração é actualmente muito usada para tipagem de estirpesbacterianas, nomeadamente bactérias entéricas. Outras aplicações, incluem a elaboraçãode mapas físicos de pequenos genomas e a cariotipagem electroforética de pequenosorganismos eucariotas.

--

--- - - --

--

-

++

++

+ + + +

+

++

+ + + + +

- - - -

--

--

+

++

+

---

-

++

++

Figura 4: Funcionamento do sistema CHEF. Os campos eléctricosfuncionam alternadamente segundo cada uma das diagonais do gel. Comoresultado, as moléculas de DNA migram num percurso rectilíneo ao longodo gel.


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Os perfis de restrição obtidos com endonucleases de baixa frequência de corte (Fig. 5)têm sido usados por diversos autores para diferenciar estirpes da mesma espécie. Oprocedimento pode revelar-se interessante para análise de estirpes com interessecomercial, para comparação de isolados ambientais com interesse agrícola, ouinclusivamente encontrar aplicações na análise epidemiológica de isolados clínicos.

A electroforese de campo pulsado utiliza uma matriz de agarose, com o gel submersonum tampão de alta força iónica, normalmente TBE. O ideal é correr o gel a umatemperatura compreendida entre 12 e 15 ºC: temperaturas superiores originam bandasmal definidas e a temperaturas muito baixas são necessárias electroforeses muitoprolongadas. A concentração de agarose ideal é de 1%, não apresentando concentraçõessuperiores qualquer melhoria na resolução.

Para moléculas de tamanhos na ordem de várias megabases, pode ser útil baixar aconcentração de agarose para valores da ordem dos 0.5% de modo a diminuir o tempo deelectroforese, embora com obtenção de bandas menos definidas.

Para separação de fragmentos lineares até 1 Mb, o potencial do campo eléctrico é emgeral de 6 V/cm. Para moléculas de grande tamanho como por exemplo cromossomas defungos, usam-se valores de 2 a 2.5 V/cm. As moléculas de DNA de topologia circular,apresentam uma mobilidade em campo eléctrico pulsado que parece não dependerdirectamente do tempo de alternância de campo.

Kb

600 -

365 -

200 -

100 -

50 -

1 2 3 4

Figura 5: Perfis de restrição PacI (TTAATTAA)de Corynebacterium lactofermentum (3) e C.glutamicum (4) resolvidos por PFGE. 1 -Cromossomas de S. cerevisiae; 2 - concatâmerosde DNA do fago ë.


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Sequências nucleotídicas

Discriminação e/ou identificação através de sequências de DNA

A discriminação entre microrganismos superficialmente semelhantes pode também serefectuada através da determinação das sequências nucleotídicas de genes evolutivamenteconservados. Desta forma, é possível detectar diferenças subtis entre estirpes.

A sequenciação de DNA tem vindo a ser aplicada por exemplo, na epidemiologiamolecular de doenças bacterianas. Para esse efeito, utiliza-se a reacção de PCR paraamplificar os genes a sequenciar. As sequências alvo incluem genes para proteínas desuperfície, genes de resistência a antibióticos, "housekeeping genes" e maisfrequentemente, os genes codificando para rRNA 16S. Para cada situação pode sernecessário determinar empiricamente qual o gene cuja sequenciação é mais indicada. Porvezes, a sequenciação é usada em conjunto com outros métodos de tipagem,nomeadamente PFGE, permitindo examinar a transferência horizontal de genes entreestirpes da mesma espécie. Este método, embora mais dispendioso é muito útil paraidentificar e discriminar microrganismos difícieis de cultivar.

O método pode ser aplicado a culturas complexas, em que por vezes alguns doscomponentes da população são difíceis ou impossíveis de cultivar. Para esse efeito, ujmacolecção de fragmentos representando a sequência-alvo e resultantes de amplificação porPCR a partir de uma população mista, podem ser clonados num vector apropriado,introduzidos em E. coli e após selecção dos transformantes, os insertos presentes emdiferentes clones são sujeitos à determinação da sequência nucleotídica.

i)

ii)

AMOSTRAClínica, ambiental,

industrial

PCRLigação ao

VectorTransformação

de E. coli

Sequenciaçãodirecta

Sequenciaçãode insertos

Análise de sequências

Figura 6: Os dois procedimentos mais utilizados para caracterizarsequências nucleotídicas com fins de identificação e/ou discriminação demicrorganismos.i


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Assim são possíveis dois procedimentos alternativos (Fig. 6): i) amplificação por PCR esequenciação directa dos fragmentos amplificados, sem necessidade de clonagem; ii)clonagem dos fragmentos amplificados procedendo-se depois à determinação dasequências de insertos individuais. O primeiro procedimento é normalmente utilizadopara microrganismos em cultura pura e abundante, o segundo, para culturas mistas oupara microrganismos de difícil cultivo.

L I G A Ç Ã O A O V E C T O R

A ligação dos produtos de PCR é feita na presenca de DNA ligase e de um vectorapropriado. Existem vectores plasmídicos que replicam em E. coli particularmenbteadequados à clonagem de fragmentos obtidos por amplificação por PCR A figura 7apresenta o mapa de um desses vectores, pCR 2.1, da Invitrogen. O vector contém umaregioão com múltiplos locais de restrição, genes de resistência a antibióticos paraseleccionar os transformantes que adquiriram o plasmídeo e um gene lacZ, cuja sequênciaé interrompida pela presença de um inserto, passando o gene a ser não-funcional.

T R A N S F O R M A Ç Ã O

A transformação é o tipo mais simples de transferência de genes: uma célula receptoraadquire genes de moléculas de DNA solúveis no meio. É este o procedimento usado emlaboratório para transferir para E. coli o produto de uma reacção de ligação. O processode transformação, embora ocorrendo nos ambientes naturais, é optimizado nolaboratório com a preparação prévia das células: a cultura de E. coli a utilizar é tratada deforma a ser tornada "competente", tornando-se mais eficiente na aquisição de DNAexógeno.

Figura 7: Mapa do vector de E. coli pCR 2.1, para clonagem de fragmentos deDNA obtidos por PCR.

pCR ® 2.1: 3929 nucleotidesLacΖα gene: 1-545M13 Reverse priming site: 205-221Multiple Cloning Site: 234-355T7 promoter: 362-381M13 (-20) Forward priming site: 389-404f1 origin: 546-983Kanamycin resistance ORF: 1317-2111Ampicillin resistance ORF: 2129-2989pUC origin: 3134-3807


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Após a transformação, as células são semeadas em placas de meio de cultura com agenteselectivo adicionado (um antibiótico, normalmente ampicilina ou canamicina, por vezesambos) e incubadas durante cerca de 18 horas a 37 ºC. Neste tipo de meio, apenas se irãodividir as células que receberam vector. As células não transformadas, não terãooportunidade de formar colónias. A diferenciação entre colónias contendo plasmídeocom inserto das que contêm plasmídeo sem inserto é feita pela cor: branca e azulrespectivamente (Fig. 8). A coloração azul resulta da presença do composto X-Gal, que éalterado pelo gene LacZ, como se de lactose se tratasse. Por isso, nas colónias em que apresença de inserto interrompe o gene LacZ, não há lugar ao desenvolvimento de corazul.

Figura 8: Colónias brancas e azuisresultantes do crescimento em meioselectivo de E. coli transformada com umvector com selecção pelo LacZ.

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Protocolos Experimentais

Genomic DNA purification kit MBI Fermentas

1. Inocular meio TSB com uma colónia isolada e incubar a 37 °C com agitação,durante 15 a 18 horas (”overnight ”).

2. Transferir 2 ml de cultura para um microtubo e sedimentar as células centrifugando5 min. à velocidade máxima (13 200 rpm).

3. Retirar todo o sobrenadante.

4. Ressuspender o sedimento em 200 µl de TE.

Procedimento utilizado para bactérias Gram -. Para bactérias Gram +, adicionarlisozima (25 µµl de solução stock a 10 mg/ml; 1 hora a 37ºC).

5. Adicionar 400 µl de solução de lise e incubar a 65 ºC durante 5 min.

6. Adicionar 600 µl de clorofórmio e misturar por inversão (3 a 5 vezes).

7. Centrifugar durante 3 min. à velocidade máxima.

8. Preparar a solução de precipitação misturando 720 µl de água desionizada com 80 µlde solução concentrada 10 vezes.

9. Transferir a fase superior aquosa de DNA para outro tubo e adicionar 800 µl desolução de precipitação.

10. Misturar suavemente à temperatura ambiente durante 1 a 2 min.

1

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Extracção de DNA total bacteriano

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1010

11. Centrifugar durante 2 min. à velocidade máxima (13 200 rpm).

12. Remover o sobrenadante e dissolver o DNA em 100µl de solução de NaCl 1.2 M.

13. Adicionar 2 µl de solução de RNase e incubar a 37 °C durante 10 min.

Solução stock de RNase a 10 mg/ml, previamente fervida.

14. Adicionar 300 µl de etanol absoluto, frio (-20 ºC).

15. Precipitar o DNA a –20 ºC durante 10 min.

16. Centrifugar durante 3 a 4 min. à velocidade máxima.

17. Descartar o etanol.

18. Lavar o sedimento com etanol a 70 %, frio (centrifugar 3 min. à velocidade máxima).

19. Desprezar o etanol e secar o DNA sedimentado.

20. Ressuspender o DNA em 100 µl de TE.

Que quantidade de DNA digerir?

O DNA digerido pode ter por destino apenas o registo da imagem do gel (gelanalítico) ou pode ser usado para extrair uma banda do gel de agarose (gelpreparativo). Em qualquer das situações é necessário que a(s) banda(s) sejamvisíveis ao UV após coloração pelo EtBr. Para este efeito, é necessário que cadabanda contenha pelo menos 50 ng de DNA.

Exemplo 1: digere um plasmídeo recombinante que inclui 3 kb de vector e 2 kbde inserto; usa uma enzima de cuja acção resultam três fragmentos: o vectorlinearizado (3 kb), o extremo 5' do inserto (0.5 kb) e o extremo 3' do inserto(1.5 kb). A menor banda (0,5 kb) representa 1/10 do plasmídeo. Para visualizaresta banda terá que digerir 10 x 50 ng ou seja, 500 ng de DNA (0.5 µµg). As trêsbandas presentes no gel conterão 300 ng, 50 ng e 150 ng de DNA,respectivamente. Serão claramente visíveis no gel e a banda maior deverá teruma intensidade 6 x superior à da banda menor.

Exemplo 2: digere o mesmo plasmídeo com uma enzima que efectua apenasum corte. Se digerir 500 ng de DNA obtém uma banda no gel demasiadointensa; o gel estará sobrecarregado. Demasiado DNA pode resultar num

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Digestão de DNA com endonucleases de restrição

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padrão de migração alterado, tornado difícil calcular as dimensões dosfragmentos.

A. Protocolo típico:

1. Marque os microtubos onde vai efectuar as digestões.

2. Em cada microtubo prepare uma reacção do tipo da indicada na tabela I.

Tabela I: Reacção típica de digestão com enzima de restrição.

Volume

Tampão 10x 1 µl

ddH2O 6.5 µl

DNA a digerir 2 µl

Enzima 0.5 µl

3. Adicione primeiro o volume de água, depois o tampão.

ddH2O: Água bidestilada; é conveniente misturar primeiro o tampão e a água. Se aenzima for colocada directamente em água, pode desnaturar irreversivelmente.

4. Dissolva bem o DNA a digerir.

5. Adicione o volume de enzima.

Enzima: 0.5 a 1 µµl de enzima é em geral suficiente; não se deve usar um volume deenzima superior a 10 % do volume final da reacção, já que as preparações comercias deenzimas de restrição contêm glicerol, o qual, em excesso, pode inibir a reacção.

6. Incubar a 37 ºC durante 3 a 5 horas.

A maioria das enzimas de restrição têm uma temperatura óptima de 37 ºC; no entanto,existem enzimas que devem ser incubadas a temperaturas diferentes (25 º C, 50 ºC, etc.);verificar as instruções do fabricante.

B. Precipitação do DNA após a digestão (opcional)

1. No final da incubação, adicione 2, 5 volumes de EtOH a –20 ºC.

2. Misture bem.

3. Coloque o tubo a –20 ºC durante pelo menos uma hora.

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As digestões podem ser conservadas por períodos longos em EtOH a – 20 ºC.

4. Centrifugue à velocidade máxima durante 10 a 15 minutos para recolher o DNAprecipitado.

5. Seque totalmente de modo a eliminar todo o EtOH.

6. Dissolva em TE.

Adaptado de Sambrook et al., 1989.

1. Tratar o gel com solução despurinizante durante 10 minutos, com agitação suave.

O volume de solução deve ser suficiente para manter o gel submerso.

2. Retirar a solução despurinizante e adicionar aproximadamente o mesmo volume desolução desnaturalizante.

3. Manter durante 30 minutos com agitação suave.

4. Retirar a solução anterior e adicionar o mesmo volume de solução neutralizante.

5. Manter durante 30 minutos com agitação suave.

6. Entretanto cortar uma membrana de nylon cujas dimensões sejam superiores em 1cm às dimensões do gel.

7. Humedecer a membrana em água destilada.

8. Colocar a membrana na unidade de transferência e efectuar a montagem do sistemade acordo com as instruções do fabricante.

9. Colocar suavemente o gel sobre a membrana.

Evitar que se formem bolhas de ar entre o gel e o filtro.

10. Com o auxílio de uma pipeta de vidro, deitar sobre o gel a solução de transferência(SSC 20X).

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Transferência por vácuo

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11. Transferir durante 60 minutos aplicando uma pressão de 50 mBar.

12. Retirar todo o líquido; remover o gel e, finalmente, a membrana.

13. Lavar o filtro em SSC 2X durante 5 minutos.

14. Secar e fixar o DNA durante 5 minutos num transiluminador de UV.

Solução despurinizante: 0.25 N HCl

Solução desnaturalizante: 1.5 M NaCl; 0.5 M NaOH

Solução neutralizante: 1.5 M NaCl; 0.5 M Tris-HCl, pH 7.2; 1 mM EDTA

SSC 20x: 3 M NaCl; 0.3 M Citrato de sódio; pH 7.0

Durante as reacções de PCR a enzima Taq DNA polimerase tem a capacidade deincorporar DIG-dUTP nas cadeias de DNA que são sintetizadas de novo.

1. Preparar a reacção de PCR de acordo com a tabela II.

Tabela II: Reacção de marcação por PCR (50 µl)

Quantidade [ ] final

H2O Variável ------

Tampão de PCR 10X, sem MgCl2 2.5 µl 0.5 X

Tampão de PCR 10X, com (NH4)2SO4 2.5 µl 0.5 X

MgCl2 6 µl 3 mM

PCR DIG Labeling Mix 5 µl 200 µM

Primer fd1 1.5 µl 0.3 µM

Primer rd1 1.5 µl 0.3 µM

DNA molde variável, 50-100 ng

Taq polimerase 1U/µl 1 µl 1 UPCR DIG Labeling Mix (Roche): 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dCTP, 1,9 mM dTTPe 0,1 mM DIG-11-dUTP;Primer fd1: 5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3' ; Primer rd1: 5' AAG GAGGTG ATC CAG CC 3' (Weisburg et al, 1991)

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Marcação por PCR da sonda de DNA 16S

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2. Após a reacção de amplificação, carregar 5 µl da reacção num gel de agarose, usandomarcadores de peso molecular adequados.

Apenas uma banda deve estar presente no gel de agarose após coloração com EtBr;quantidades mínimas de produtos secundários podem resultar em sinais inespecíficos nareacção de hibridação.

3. Verificar a qualidade da reacção de amplificação e quantificar o DNA obtido.

4. Caso necessário, purificar a banda a partir do gel de agarose.

Pré-hibridação: O processo de pré-hibridação tem como objectivo bloquear locais deligação inespecíficos na membrana.

1. Colocar a membrana num tubo de hibridação.

2. Adicionar 20 ml de solução de hibridação por cada 100 cm2 de filtro.

Solução de hibridação: SSC 5X; Agente bloqueador 1 %; Sarcosil 0,1 %; SDS 0,02 %.

3. Manter à temperatura de hibridação durante 2 horas.

Hibridação: A temperatura de hibridação é estimada com base no tamanho da sondamarcada e da percentagem de homologia esperada entre o DNA do fragmento sonda e oDNA alvo. Geralmente para sondas 100 % homólogas, a hibridação deverá decorrer a 65-68 ºC na ausência de formamida, ou a 42-45ºC na presença de 50 % de formamida.

4. Desnaturar a sonda, fervendo durante 10 minutos.

5. Colocar em gelo o tubo contendo a sonda.

6. Desprezar a solução utilizada na pré-hibridação.

7. Adicionar o mesmo volume de solução de hibridação na qual foi previamentediluída a sonda marcada.

8. Colocar no forno de hibridação, à temperatura de hibridação, durante 14-16 horas.

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Hibridação e Detecção

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9. Após a hibridação, retirar a membrana.

A solução de hibridação pode ser reutilizada; para esse efeito, deve conservar-se a -20ºC.

10. Lavar a membrana em solução I, duas vezes, durante 5 min. à temperatura ambiente.

11. Lavar a membrana em solução II, duas vezes, durante 15 min. à temperatura dehibridação.

Solução I: SSC 2 X; SDS 0.1 %.

Solução II: SSC 0.5 X; SDS 0.1 %.

12. Após a hibridação e lavagens, equilibrar a membrana durante 5 minutos em tampãode ácido maleico.

Detecção: A detecção de sequências homólogas é efectuada com o Sistema DIG deMarcação e Detecção Não-radioactiva de Ácidos Nucleicos (Roche).

13. Bloquear a membrana em solução bloqueadora durante 30 minutos.

14. Diluir o conjugado anti-digoxigenina-fosfatase alcalina (Roche) em soluçãobloqueadora (1:5 000).

15. Remover a solução bloqueadora.

16. Incubar a membrana com a solução contendo anticorpos, durante 30 minutos.

17. Descartar a solução de anticorpos.

18. Lavar a membrana duas vezes, durante 15 minutos com tampão de ácido maleico.

Estas lavagens permitem remover o anticorpo não ligado.

19. Equilibrar a membrana em tampão de detecção durante 5 minutos.

20. Entretanto, preparar a solução corante adicionando 200 µl de solução concentradade NBT/BCIP (Roche) a 10 ml de tampão de detecção.

21. Incubar a membrana com solução corante, na ausência de luz.

22. Observar periodicamente para verificar o desenvolvimento das bandas.

23. Parar a reacção lavando a membrana com água ou TE, quando o desenvolvimentodo sinal for satisfatório.

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Tampão de ácido maleico: ácido maleico 0.1 M; NaCl 0.15 M; pH 7.5

Solução bloqueadora: 1% de Agente bloqueador (Roche) em Tampão de àcido maleico

Tampão de detecção: Tris-HCl 0.1 M; NaCl 0.1 M; MgCl2 50 mM; pH 9.5

Adaptado de Gautom, 1997.

1. Crescer a estirpe em meio TSB a 30 ºC, com agitação.

2. Determinar a DO da cultura, e calcular o volume a utilizar de modo a usar napreparação dos blocos 5 x 108 células/ml de agarose (considerar que no caso debastonetes 1 DO = 8 x 108 células).

3. Sedimentar as células por centrifugação. Lavar em 1/10 de TE. Ressuspender em 500µl de TE.

4. Adicionar um volume de agarose de baixo ponto de fusão (preparada a 1 % em TE),previamente aquecida a 42 ºC.

5. Misturar e distribuir imediatamente por moldes. Deixar solidificar a 4 ºC.

6. Colocar os blocos de agarose em 10 volumes de solução de lise. Incubar durante 24horas a 37 ºC.

7. Descartar a solução de lise e adicionar 10 volumes de solução EPS. Manter a 50 ºCdurante 24 horas.

8. Incubar os blocos em TE 2 x 1 hora, com agitação suave.

9. Conservar os blocos em 20 mM Tris-HCl pH 8.0; 50 mM EDTA, a 4 ºC.

Solução de lise: Lisozima 1 mg/ml; Tris-HCl pH 7.2, 10 mM; NaCl 50 mM; EDTA 100mM; Deoxicolato sódico 0.2 %; Sarcosil 0.5 %

Solução EPS: EDTA, pH 8.0, 100 mM; Sarcosil 1 %; Proteinase K 50 µµg/ml

TE: Tris-HCl 10 mM, pH 7.5; EDTA 1 mM

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Preparação de DNA em blocos de agarose

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Utilizam-se enzimas de restrição que reconhecem sequências pouco frequentes, de modoa obter fragmentos de DNA de grande tamanho. Na preparação das reacções de hidrólisedevem ser tomadas precauções de forma a evitar a quebra do DNA embebido emagarose.

1. Colocar o bloco a digerir em TE, durante 2 horas a 4 ºC.

2. Retirar o TE e adicionar 1 ml de tampão de digestão; manter 2 horas a 4 ºC.

3. Renovar o tampão de digestão até um volume final de cerca de 100 µl.

4. Adicionar 10 a 25 U de enzima.

5. Manter 12 a 16 horas a 4 ºC.

6. Incubar à temperatura recomendada para cada enzima durante 3 horas.

7. Retirar o tampão e adicionar 500 µl de TE.

8. Lavar durante 1 hora, à temperatura ambiente, com agitação.

9. Carregar o bloco tratado no gel ou renovar o TE e conservar a 4 ºC

1. Preparar o gel TBE 0.5 X e com uma concentração de agarose de 1%.

2. Ajuste a temperatura do sistema de arrefecimento do aparelho para uma temperaturaentre os 10 e os 14 ºC.

3. Carregue os blocos de agarose digeridos nos poços do gel, com o gel fora da tina.

4. Selar os poços com agarose de baixo ponto de fusão.

5. Coloque o gel na tina e ajuste as condições de electroforese.

6. Verifique a temperatura do tampão e a sua circulação na tina.

7. Inicie a corrida.

Digestão de DNA embebido em agarose

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Electroforese em campo pulsado


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1. Preparar a reacção de amplificação de acordo com a tabela III:

Tabela III: Reacção para BOX-PCR (50 µl)

Volume [ ] final

H2O variável

10x PCR buffer sem MgCl2 2.5 µl 0.5 x

10x PCR buffer com (NH4)2SO4 2.5 µl 0.5 x

MgCl2 6 µl 3 mM

dNTP’s 5 µl 200 µM

Primer BOX A1R * 2 µl 0.4 µM

DNA molde variável (50-100 ng)

Taq polimerase 1 U/µl 1 µl 1 U

* Primer BOX A1R - 5'-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3'

(Versalovic et al, 1994)

2. Proceder à amplificação por PCR.

Perfil de temperatura para a amplificação:

desnaturação inicial de 7 min. a 95 ºC;

30 ciclos: desnaturação a 94 ºC, 1 min.; “annealing” a 53 ºC, 1 min.; extensão a65 ºC, 8 min;

extensão final de 16 min. a 65 ºC. No final, manter os tubos a 4 ºC.

3. Observar uma alíquota de cada reacção de PCR num gel de agarose a 1% em TAE1X.

BOX-PCR

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1. Num microtubo preparar a reacção de ligação, segundo a composição indicada natabela IV.

Tabela IV: Reacção de ligação de produtos de PCR.

Quantidade

Vector pCR2.1 (25 ng/µl) 2 µl

Produto de PCR 0.5 a 1 µl

Tampão de ligase 10x 1 µl

Ligase do fago T4 4 U

dH2O estéril até volume final de 10 µl

2. Incubar a reacção a 14 ºC durante 12 a 16 horas.

3. A reacção pode ser imediatamente utilizada ou armazenada a -20 ºC.

1. Descongelar em gelo uma alíquota (50-200 µl) de células competentes de E. coli.

2. Adicionar 2-10 µl da reacção de ligação às células competentes misturandosuavemente.

3. Manter em gelo por 30 minutos.

4. Submeter as células a um choque térmico durante 30 segundos a 42 ºC.

5. Colocar novamente em gelo durante 2 minutos.

6. Adicionar 250 µl de meio SOC.

7. Incubar durante 1 hora a 37 ºC e com agitação.

8. Semear 10-200 µl da transformação em placas de meio LA suplementado com oantibiótico adequado, e quando necessário X-Gal e IPTG.

9. Incubar as placas a 37 ºC durante 15 a 18 horas.

10. Com palitos estéreis, replicar clones positivos para uma nova placa.

11. Proceder a caracterização do DNA plasmídico dos transformantes.

Ligação de produtos de PCR a vector

Transformação


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X-Gal: solução stock preparada a 20 mg/ml em dimetil-formamida; usar a 40 µµg/ml

IPTG: solução stock preparada a 100 mM, em água; usar a 0.05 mM

1. Inocular uma colónia com um palito estéril em 1.5 ml de meio LB, suplementadocom o antibiótico adequado.

2. Incubar a 37 ºC durante 15 a 18 horas, com agitação.

3. Sedimentar as células por centrifugação, a 14 000 rpm, durante 5 minutos.

4. Ressuspender em 350 µl de STET.

5. Adicionar 10 µl de solução de lisozima.

Solução de lisozima preparada a 10 mg/ml

6. Deixar a lisozima actuar 1 minuto.

7. Colocar o microtubo em água a ferver durante 45 segundos.

8. Centrifugar 5 minutos a 14 000 rpm.

9. Retirar o sedimento com um palito estéril.

O sedimento é constituído por resíduos celulares e DNA cromossómico.

10. Adicionar 1 volume de isopropanol e 1/10 de volume de acetato de sódio 3 M, pH5.2.

11. Misturar e manter à temperatura ambiente durante 15 minutos para precipitar oDNA plasmídico.

12. Centrifugar a 14 000 rpm, 5 minutos.

13. Lavar o precipitado com etanol a 70 %.

14. Ressuspender em 30 µl de TE.

STET: 0.1 M NaCl; 5 % Triton X-100; 10 mM Tris-Hcl, pH 8.0; 1 mM EDTA

TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA

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Extracção de DNA plasmídico

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Para um gel a 0.7 % com um volume de 100 ml

1. Pesar 0.7 g de agarose (Fig. 9-A).

2. Com uma proveta (Fig. 9-B), medir 100 ml de tampão (TAE ou TBE).

3. Num Erlenmeyer misturar a agarose e o tampão (Fig. 9-C).

4. Ferver num forno de micro-ondas até clarear a solução (Fig. 10-A).

5. Entretanto, efectuar a montagem da plataforma do gel e do respectivo pente (Fig 10-B).

Preparação de um gel de agarose

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A B C

Figura 9: A - Pesagem da agarose. B - Medição do volume apropriado do tampão.C - A agarose não solubiliza no tampão, formando uma solução turva.

A B

Figura 10: A - Uso do micro-ondas para solubilizar a agarose; B- Preparaçãoda plataforma para o gel, com o respectivo pente.


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6. Esperar que a temperatura da agarose baixe até cerca de 50 º C.

7. Verter a agarose na plataforma (Fig. 11-A).

8. Deixar solidificar à temperatura ambiente.

9. Colocar o gel na tina, submergido em tampão.

10. Retirar o pente (Fig 11-B, C).

11. Adicionar tampão de carga às amostras (Fig. 12-A).

12. Carregar o gel, uma amostra em cada poço. (Fig 12-B).

13. Ligar a tina à fonte, tendo em atenção a polaridade correcta.

14. Ajustar a voltagem e iniciar a corrida.

A B C

Figura 11: A- Vertendo a agarose na plataforma; B - O pente é retirado com ogel já submerso em tampão, dentro da tina (C).

A B

Figura 12: A - Adição do tampão de carga, normalmentecontendo corantes azuis; B - Carregando uma amostra.


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15. Seguir a evolução da corrida através da migração dos corantes presentes no tampãode carga.

16. Terminada a electroforese, retirar o gel.

17. Corar com EtBr (5 ìg/ml) durante cerca de 15 minutos.

18. Observar num transiluminador de UV.

19. Registar os resultados, fotograficamente ou com um sistema de análise de imagem.

TAE: 40 mM Tris-HCl; 5 mM acetato de sódio; 2 mM EDTA; pH 8.0

TBE: 90 mM Tris-HCl; 90 mM ácido bórico; 2 mM EDTA; pH 8.3

Tampão de carga (6X): 0.02 % azul de bromofenol; 0.02 % xileno cianol; 60 % sacarose;0.025 M EDTA

EtBr: Brometo de etídeo. Solução stock a 500 ìg/ml, em água.

Gautom R.K. 1997. Rapid pulsed-field gel electrophoresis protocol for typing ofEscherichia coli O157:H7 and other gram-negative organisms in 1 day. Journal ofClinical Microbiology 35:2977–2980.

Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning - a laboratory manual.2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Versalovic J.,Schneider M.,de Bruijn F.J., Lupski J.R. 1994. Genomic fingerprinting ofbacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods inMolecular and Cellular Biology 5:25-40.

Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lupski J.R. 1991. 16S ribosomal DNAamplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology 173:697-703.

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Referências

manual metodos de tipagem

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