limpeza,montagem e esterilização de material utilizado em microbiologia
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Normas e protocolos
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Conteúdo
APRESENTAÇÃO _________________________________________________________________________________ 3
NÃO É PERMITIDO AO USUÁRIO: ___________________________________________________________________ 3
OBJETIVOS _____________________________________________________________________________________ 4
NORMAS DE UTILIZAÇÃO DO LABORATÓRIO _________________________________________________________ 5
MANUAL DE USO E MANUTENÇÃO PARCIAL DE MICROSCÓPIO __________________________________________ 5
INTRODUÇÃO ___________________________________________________________________________________ 5
USO DO MICROSCÓPIO ___________________________________________________________________________ 5
MICROSCÓPIO ÓPTICO (MO) - PARTES ______________________________________________________________ 7
MECÂNICA _____________________________________________________________________________________ 7
OPERAÇÃO _____________________________________________________________________________________ 8
SISTEMA DE AUMENTO: ____________________________________________________________________________ 8
SISTEMA DE ILUMINAÇÃO: __________________________________________________________________________ 9
CAUSAS DE INSUCESSO NA PRÁTICA DA MICROSCOPIA: ________________________________________________ 9
REGULAGEM DA ILUMINAÇÃO ___________________________________________________________________ 9
LIMPEZA E LUBRIFICAÇÃO ______________________________________________________________________ 10
Parte Óptica _______________________________________________________________________________ 10
Oculares __________________________________________________________________________________ 10
Objetivas _________________________________________________________________________________ 10
Condensador ______________________________________________________________________________ 10
Parte mecânica ____________________________________________________________________________ 10
Parte elétrica ______________________________________________________________________________ 11
Lâmpadas _________________________________________________________________________________ 11
CUIDADOS IMPORTANTES PARA COM O MICROSCÓPIO _______________________________________________ 11
NORMAS ADOTADAS NO LABORATÓRIO DE HISTOLOGIA ______________________________________________ 12
INTRODUÇÃO A HISTOLOGIA _____________________________________________________________________ 12
OBJETIVO _____________________________________________________________________________________ 12
LAMINAS ______________________________________________________________________________________ 13
NORMAS ADOTADAS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA __________________________________________ 14
1. LIMPEZA, MONTAGEM E ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAL USADO EM MICROBIOLOGIA __________________ 15
LIMPEZA E MONTAGEM ___________________________________________________________________________ 15
Objetivos _________________________________________________________________________________ 15
Introdução ________________________________________________________________________________ 15
ESTERILIZAÇÃO _________________________________________________________________________________ 15
Objetivos _________________________________________________________________________________ 15
Introdução ________________________________________________________________________________ 15
2. TÉCNICAS ASSÉPTICAS E SEMEADURA DE MICRORGANISMOS ______________________________________ 15
Objetivos _________________________________________________________________________________ 15
Introdução ________________________________________________________________________________ 15
Normas e protocolos
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3. PREPARAÇÃO, ACONDICIONAMENTO E CONTROLE DE QUALIDADE DE MEIOS DE CULTURA. 16
Objetivos _________________________________________________________________________________ 16
Introdução ________________________________________________________________________________ 16
4. ESTUDO MORFOLÓGICO DE COLÔNIAS BACTERIANAS ____________________________________________ 16
Introdução ________________________________________________________________________________ 16
Objetivo __________________________________________________________________________________ 17
5. TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM ___________________________________________________________ 17
Introdução ________________________________________________________________________________ 17
Objetivo __________________________________________________________________________________ 18
6. MEIO DIFERENCIAL E SELETIVO _______________________________________________________________ 18
Introdução: ________________________________________________________________________________ 18
Objetivo __________________________________________________________________________________ 18
MODELO DE RELATORIOS DE MICROBIOLOGIA _______________________________________________________ 19
1 – Resumo ________________________________________________________________________________ 19
2 – Introdução _____________________________________________________________________________ 19
3 – Materiais e Métodos _____________________________________________________________________ 19
4 – Resultados _____________________________________________________________________________ 19
5 – Discussão ______________________________________________________________________________ 19
6 – Bibliografia _____________________________________________________________________________ 19
7 – MATERIAIS NECESSÁRIOS (LEMBRETE) _______________________________________________________________ 19
ANEXO 01 _____________________________________________________________________________________ 20
ANEXO 02 _____________________________________________________________________________________ 21
Normas e protocolos
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APRESENTAÇÃO
Define-se como usuário, todo e qualquer indivíduo que fará uso das instalações dos Laboratórios, com a
finalidade de desenvolver atividades de Ensino Pesquisa e Extensão.
Os laboratórios de I (Zoologia, Histologia e de Paleontologia) II (Microbiologia e Parasitologia e III de
Botânica. Esses laboratórios multidisciplinares ajudam na complementação teórica, constam-se:
As normas e regulamento para a utilização de todos os equipamentos, dos três laboratórios seguem-
se adiante, porém, é necessário saber, antes de tudo, que qualquer atividade desenvolvida nos
laboratórios, devem ser acompanhada na presença de um professor responsável, que supervisionará
todas as atividades dos alunos.
o Orientar o destino final para os resíduos produzidos durante a realização da aula prática, não
permitindo a liberação de substâncias agressivas ao meio ambiente para locais inadequados,
devendo encaminhá-los para catalogação e acondicionamento, de acordo com normas
técnicas;
Utilizar e exigir dos alunos o uso de Equipamentos de Proteção Individual - EPls e dos Equipamentos
de Proteção Coletiva – EPCs;
Os alunos deverão estar devidamente paramentados para a prática laboratorial e deverão ajudar o
professor no final da aula, deixando o laboratório mais limpo e organizado possível.
Os laboratórios são utilizados para as aulas práticas, isto é, como área de integração entre teoria e prática,
permitindo a vivência aos alunos dos conhecimentos teóricos bem como o
Não é permitido ao usuário:
o Alterar configuração e/ou calibração de equipamentos sem a prévia consulta ao Servidor Técnico
Especializado responsável pelo Laboratório;
o Retirar equipamentos e material de consumo das dependências do laboratório sem a autorização do
Servidor Técnico Especializado responsável.
o Remover equipamentos do local de utilização, dentro do próprio laboratório sem prévia autorização
do Servidor Técnico Especializado responsável.
o Manusear de forma inadequada os equipamentos, sob o risco de penalidades, desde que
comprovada sua responsabilidade.
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OBJETIVOS
Proporcionar as condições necessárias para os estudos práticos, com materiais e equipamentos
adequados.
Criar competência, habilidade e responsabilidade na utilização dos equipamentos dos laboratórios.
Estudos práticos necessários para a formação do Biólogo e Educador
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NORMAS DE UTILIZAÇÃO DOS LABORATÓRIOS
Para que um laboratório atenda os seus objetivos, é importante que todos colaborem, buscando seguir
As instruções abaixo:
1. A entrada de alunos somente é permitida na presença de um professor ou responsável.
2. Os utilitários dos laboratórios devem utilizar vestimenta adequada e demais utensílios de proteção
para a atividade a ser realizada
3. Não é permitida a entrada de alimentos e material escolar não relacionado com a atividade.
4. Materiais descartáveis devem ser colocados no lixo, as vidrarias lavadas e as bancadas limpas.
MANUAL DE USO E MANUTENÇÃO PARCIAL DE MICROSCÓPIO
Introdução
As regras mais elementares de utilização são freqüentemente ignoradas, até mesmo por usuários
experientes, comprometendo assim não só a durabilidade do equipamento, mas também a não utilização de
possíveis recursos.
Muitas vezes os microscópios que são enviados para conserto estão apenas com as lentes sujas e podem ser
restaurados rapidamente. No entanto é recomendável uma manutenção preventiva por ano.
O presente visa, portanto, mostrar o uso apropriado, técnicas de regulagem da iluminação e de manutenção
parcial.
USO DO MICROSCÓPIO
1. Em primeiro lugar é essencial que você conheça as partes ópticas e mecânicas dos microscópios,
2. Mantenha o microscópio livre de poeira, vapores ácidos e do contato com reagentes.
3. Para mantê-lo seco, cubra com capa de flanela,
4. Não manusear o equipamento com as mãos sujas ou molhadas.
a. Motivo: Evita o pó e a proliferação de fungos
5. Jamais comer ou beber próximo ao equipamento.
a. Motivo: Evita a proliferação de fungos
6. Na remoção do equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e outra na base
7. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfície plana, evitando qualquer
movimentação brusca.
8. Nunca desloque o aparelho com a lâmpada acesa ou logo após ter sido apagada.
a. Motivo: Evite o arrastamento do equipamento, arrastar o MO as lentes saem de sua
conformação original e com isso perde a qualidade de foco.
9. Não permitir que os alunos deixem o microscópio com a objetiva de maior aumento encaixada e a
mesa levantada.
a. Motivo - os próximos alunos podem mexer na mesa (levantar) e quebrar a lâmina e objetiva.
10. Não permitir que os alunos deixem o microscópio com o Diafragma fechado e condensador
abaixado.
a. Motivo – os próximos alunos poderão ter dificuldades de descobrir o motivo da falta de luz.
11. Atenção quando se observa uma preparação em meio líquido, pois há sempre o risco de molhar a
lente frontal da objetiva; portanto o conselho é retirar o excesso de líquido com papel de filtro, antes
de colocar a lâmina sobre a platina;
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12. Em de acidente, enxugar imediatamente com papel absorvente macio.
ATENÇÃO: Portanto todos os alunos devem seguir os seguintes procedimentos ao final
da aula, ou seja, deixar o MO da seguinte forma:
1. Encaixar a menor objetiva.
2. Abaixar a mesa.
3. Deixar diafragma aberto.
4. Deixar condensador levantado.
5. Desligar o MO (na tomada também)
6. Cobrir o MO
Não permitir que o aluno afrouxe o parafuso do condensador. Explique para que serve e ensine a
usar.
o Motivo - Tem aluno deixando o parafuso solto e os seguintes, ao mexer, deixam o
condensador cair.
Não permitir que os alunos deixem o MO ligado sem estar usando ou quando se ausentar por muito
tempo.
o Motivo – as lâmpadas queimam com muita facilidade e o calor intenso estraga o MO
Não permitir que os alunos mudem de objetivas pegando nelas, sempre pelo revólver.
o Motivo – ao tocar nas objetivas pode afrouxar e, futuramente, elas podem cair.
Não permitir que os alunos, quando estiverem utilizando óleo de imersão, passem a objetiva de 40X
pelo material. Deve sair do aumento de 10X e ir para de 100X sem passar pela de 40X.
o Motivo – a objetiva de 40X pode encostar-se ao óleo e ela não pode ser limpa, portanto com
o tempo ela vai estragando.
Limpar adequadamente a objetiva de 100x quando utilizar, com solução e papel adequado. Jamais
papel higiênico.
o Motivo – se o óleo ficar por muito tempo estraga a objetiva e papel higiênico arranha.
Deixar televisão, vídeo e MO sempre com a capa e desligado.
o Motivo – a poeira estraga os equipamentos.
Não permitir entrada de bebidas e comidas.
o Motivo – permite a proliferação de fungo.
Não permitir movimentar o macrométrico com as objetivas de 40x e 100x.
o Motivo – pode quebrar a lâmina e arranhar a objetivo.
OBS.: Alguns MO estão com objetivas inadequadas e por isso nem sempre é possível
dar o foco sem mexer no macrométrico,
Ensinar que não é preciso abaixar a mesa para mudar de objetiva, basta fazer o ajuste no foco
utilizando o micrométrico.
o Motivo – muitos alunos têm medo de quebrar a objetiva e por isso abaixam a mesa.
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MICROSCÓPIO ÓPTICO (MO) - PARTES
Mecânica
1. Pé ou base – serve de apoio para os componentes do microscópio.
2. Braço ou coluna - fixo à base, serve de suporte a outros elementos.
3. Tubo, canhão ou cabeçote - suporta a ocular na extremidade superior
4. Revólver ou óptica - peça giratória portadora de objetivas de diferentes ampliações que podem ser
de 20x, 40x e 100x
5. Platina ou mesa - onde se fixa a preparação a observar; tem uma janela por onde passam os raios
luminosos e também parafusos dentados que permitem deslocar a preparação.
6. Charriot e pinças – As platinas fixas geralmente compensam sua Imobilidade por meio de peças
deslizantes, chamadas " charriot" que coloca a lamina no campo desejado
7. Parafuso macrométrico – a sua rotação é responsável por movimentos verticais da platina, rápidos e de grande amplitude.
8. Parafuso micrométrico – a sua rotação é responsável por movimentos verticais da platina, lentos e de pequena amplitude, permitem aperfeiçoar a focagem.
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Operação
A intensidade luminosa é regulável: aumenta-se a intensidade luminosa subindo-se o condensador e abre-se o diafragma ou diminui-se a intensidade luminosa descendo o condensador e baixa-se o diafragma.
A ampliação consiste no grau de aumento da imagem em relação ao objeto. A ampliação total obtida com o microscópio óptico consiste no produto da ampliação da objetiva pela ampliação da ocular. Esta, sem distorção, não ultrapassa as 1200x.
O fator mais significativo para a obtenção de uma boa imagem é, contudo, o poder de resolução, que corresponde à distância mínima que é necessário existir entre dois pontos para que possam ser distinguidos ao microscópio. Para o microscópio óptico essa distância é de 0,2 µm devido ao comprimento de onda das radiações visíveis. Com efeito, a propriedade da ampliação só tem interesse prático se for acompanhada de um aumento do poder de resolução.
No que diz respeito à microscopia óptica existem dois métodos fundamentais de observação, de acordo com o tipo de preparação que se quer observar:
Se a lâmina não está corada (exame a fresco): a observação é feita com objetivas
secas, do seguinte modo:
1. Desce-se o condensador e sobe-se o diafragma para que a iluminação não seja muito intensa, já que as lâminas não estão coradas.
2. Com o parafuso macrométrico foca-se com a objetiva menor. 3. Passe para objetiva de 10x escolhe-se o campo que se quer observar.
a. A partir dessa objetiva não se foca mais com mais com o macrométrico b. USA-SE SOMENTE O MICROMETRICO
4. Seguidamente foca-se com a objetiva de 40x, fazendo aproximação da objetiva à lâmina, também, SOMENTE COM O MICROMETRICO.
Se a lâmina está corada: a observação é feita com objetivas de imersão, procedendo
do seguinte modo.
1. Sobe-se o condensador, abre-se o diafragma e regula-se a iluminação da fonte luminosa no máximo, de modo a conseguir-se uma iluminação intensa, apropriada à observação de lâminas coradas.
2. Coloca-se na lâmina uma gota de óleo de imersão e procede-se à focagem. Primeiro aproximando a objetiva à lâmina com controlo visual externa, seguidamente a focagem propriamente dita com o parafuso macrométrico e finalmente o aperfeiçoamento da focagem com o parafuso micrométrico.
Sistema de aumento:
1. Oculares- sistemas de lentes que permitem ampliar a imagem real fornecida pela objetiva, formando
uma imagem virtual que se situa a aproximadamente 25 cm dos olhos do observador
2. Objetivas - permitem ampliar a imagem do objecto 10x, 40x, 50x, 90x ou 100x. o As objetivas de 10x, 40x e 50x são designadas objetivas secas pois entre a preparação e a
objetiva existe somente ar. o As objetivas de imersão, uma vez que, para as utilizar, é necessário colocar uma gota de óleo
de imersão entre elas e a preparação, o qual, por ter um índice de refracção semelhante ao do vidro, evita o desvio do feixe luminoso para fora da objetiva.
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Sistema de iluminação:
1. Condensador - conjunto de duas ou mais lentes convergentes que orientam e espalham
regularmente a luz emitida pela fonte luminosa sobre o campo de visão do microscópio.
2. Diafragma - é constituído por palhetas que podem ser aproximadas ou afastadas do centro
através de uma alavanca ou parafuso, permitindo regular a intensidade da luz que incide no
campo de visão do microscópio.
3. Filtro
4. Seletor de intensidade luminosa - Fonte luminosa – a mais utilizada actualmente é a luz artificial, fornecida por uma lâmpada de tungsténio ou de halogéneo, incluída no aparelho juntamente com um interruptor com reóstato, que permite regular a intensidade da luz emitida.
CAUSAS DE INSUCESSO NA PRÁTICA DA MICROSCOPIA:
Campo escuro: é resultante de má centralização de iluminação; veja as instruções no item
"regulagem da iluminação";
Falta de nitidez da imagem: se persistir após a regulagem da iluminação e de uma focalização
cuidadosa, a causa deve ser buscada metodicamente:
1. Preparação pode estar suja em uma das faces e isto pode ser reconhecido
pela movimentação de estrias e sombras,
2. Deve-se limpá-la com um lenço de papel extra macio, embebido em álcool
ou éter;
Ocular está suja: ao girá-la veremos corpos estranhos movimentando ao mesmo tempo;
1. Seguir a instrução de limpeza descrita no item "limpeza e lubrificação";
(abaixo)
A objetiva pode estar com algum líquido na lente frontal ou com
poeira na lente posterior;
Ao usar a lente de imersão servir-se de óleo de imersão suficientemente fluído e nunca deixá-lo secar
sobre a objetiva ou sobre as preparações.
REGULAGEM DA ILUMINAÇÃO
Verificar a centralização feche completamente o diafragma e examine a imagem com a objetiva de
menor aumento focalizada numa preparação; em microscópios que possuem condensador de
campo (por onde passam os feixes de luz),
Este também deve ser fechado, reduzindo assim o cone de luz.
A centralização é feita girando os parafusos laterais do condensador Abbe até que a íris do
diafragma esteja exatamente no centro, ou seja, coincidindo com o eixo óptico do sistema de lentes.
A imagem da íris do diafragma, uma vez centralizada, deve ser regulada movimentando o
condensador, para cima ou para baixo, até que sua borda azulada esteja nítida;
Abre-se então o condensador de campo ou o diafragma para preencher todo o campo, obtendo-se
assim um feixe luminoso exatamente centrado.
Esta iluminação crítica ou de Köhler é, portanto, obtida quando o condensador focaliza a luz no
objeto e a luz transmitida do objeto para a objetiva quase que preenche completamente as lentes.
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LIMPEZA E LUBRIFICAÇÃO
Parte Óptica
Vimos que a falta de nitidez das imagens depende diretamente do estado de limpeza das lentes. Isto pode
ser evitado pelo hábito de limpeza periódica.
Oculares
Com a objetiva de menor aumento focalizada em uma preparação,
Gire as oculares e verifique se existem partículas que acompanham o movimento;
o Caso existam elas, podem estar nas duas superfícies e neste caso
Ambas devem ser limpas com um bulbo de borracha e cotonete.
Para retirar eventuais manchas de óleo, dedos; umedecer um cotonete com solvente apropriado
(álcool a 70%GL ou éter), tomando cuidado para não inundar as lentes,
Secar imediatamente com um lenço de papel.
o Freqüentemente basta projetar o hálito na superfície das lentes e limpá-las.
Limpe freqüentemente as oculares com lenço de papel fino; pois o contato com os cílios e mesmo
poeira podem sujá-las.
Nunca toque as lentes com os dedos, pois gordura atrai poeira.
o Uma precaução especial é requerida no uso de solventes hidrocarbonetos, como o xilol,
pois podem
Penetrar na área de fixação das lentes dissolvendo a cola, bem como produzir
película sobre as lentes.
Objetivas
Cada objetiva deve ser desatarraxada cuidadosamente do revolver e após a limpeza recolocada na
posição original, para tanto, usar o mesmo método descrito para as oculares.
No entanto, como as superfícies das lentes são menores que as das oculares, recomendamos
inspecioná-las com uma pequena lupa manual.
Para retirar poeira da face posterior da objetiva, usa-se um pincel de pêlo muito macio.
Após o uso da objetiva de imersão, retirar o excesso de óleo com um papel de filtro e terminar a
limpeza com um cotonete levemente embebido de éter.
o JAMAIS USAR ÁLCOOL NA LIMPEZA DO ÓLEO DE IMERSÃO, POIS ESTE NÃO É DISSOLVIDO PELO ÁLCOOL,
MAS FORMA COM ELE UM PRECIPITADO BRANCO.
Nunca tente desmontar as objetivas ou oculares, pois poderá desalinhar as lentes ou colocá-las na
ordem ou posição erradas.
o SE HOUVER NECESSIDADE DE LIMPÁ-LAS INTERNAMENTE, DEVE-SE ENVIÁ-LAS AO SERVIÇO ESPECIALIZADO.
Condensador
Tanto o condensador de campo como o que contém o diafragma devem ser limpos com álcool ou
éter.
Cuidadosamente limpe as lentes, primeiro retirando a poeira, em seguida aplicando o líquido de
limpeza e enxugando com papel macio.
Parte mecânica
A lubrificação também deve ser regular, especialmente do macrométrico, que é a parte mecânica
mais vulnerável, evitando assim o acúmulo de poeira e areia.
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Antes de proceder à lubrificação, as sujeiras das partes metálicas devem ser eliminadas
com álcool, enxugadas com tecido de algodão macio e relubrificadas,
Nunca force um macro ou micrométrico que esteja emperrado ou duro.
Evite deixar o equipamento em locais que recebam luz solar ou calor por muito tempo, pois estes
podem derreter as graxas, danificando o mecanismo, ou descolar as lentes.
É útil reservar uma pinça para limpar detritos ou fragmentos acumulados em reentrâncias, bem
como dispor de alicates e chaves de fenda (fendas, estrela, Philips), para apertar ou folgar alguma
peça deslocada.
Para as partes expostas, é suficiente limpá-las com tecido umedecido com água e sabão neutro, mas,
pode-se aplicar à platina uma diminuta quantidade de vaselina neutra.
Parte elétrica
Se o equipamento apresenta problemas na hora de acender a lâmpada pode-se verificar a tomada, o
fusível e a lâmpada do mesmo.
o Tomadas: devem estar inteiras, com os fios bem firmes a ela, caso contrário, aconselha-se a
sua substituição.
o Fusíveis: Desligue e retire o equipamento da tomada e procure o fusível geralmente
localizado na parte inferior ou posterior do equipamento. São constituídos por um tubo de
vidro com duas extremidades de metal (uma de cada lado) com um diminuto fio no meio.
Este fio deve estar inteiro.
Caso contrário, o fusível deverá ser trocado por outro do mesmo tipo.
A sua identificação fica em uma das partes de metal (caso não tenha identificação,
consulte o manual do equipamento).
Lâmpadas
Verifique se ela está bem atarraxada no bocal e se seus "filamentos" encontram-se inteiros.
Evite pegar na lâmpada com os dedos, faça-o com um lenço de papel, pois existem lâmpadas
alógenas, que ao serem tocadas com os dedos, queimam.
CUIDADOS IMPORTANTES PARA COM O MICROSCÓPIO
1. NÃO coma ou beba no laboratório;
2. NÃO deixe material sobre a bancada onde estão os microscópios;
3. NÃO arraste o microscópio;
4. NÃO movimente o macrométrico com as objetivas de 40x e 100x;
5. NÃO limpe as oculares e objetivas com papel higiênico;
6. NÃO toque nas objetivas;
7. NÃO utilize a objetiva de 40x quando estiver utilizando óleo de imersão;
8. NÃO abaixe a mesa para mudança de objetiva.
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NORMAS ADOTADAS NO LABORATÓRIO DE HISTOLOGIA
1- Não permitir que os alunos deixem bolsas sobre a mesa. No máximo um caderno e lápis.
o Motivo – o material pode ‘esbarrar’ no MO e movê-lo de lugar, além de tumultuar a
bancada.
2- Jamais deixar lâminas soltas sobre a bancada.
o Motivo – Outro aluno ou ele próprio pode derrubar a lâmina e quebrá-la.
3- Jamais deixar lâminas soltas no armário.
o Motivo: Outro professor ou monitor pode derrubá-la ao pegar as caixas.
4- Na troca de laminas, guarde a anterior na respectiva caixa e pegue outra
o Motivo – lâmina na bancada ou na base do microscópio pode quebrar
Introdução a Histologia
O aprendizado da Histologia depende da análise e compreensão de lâminas histológicas, o que ocorre em
aulas práticas, ministradas nos laboratórios de microscopia.
Objetivo
o O aluno deverá entender e esquematizar o tecido em questão.
o Fazer desenho esquemático em pranchas (PRANCHA_ANEXO 02)
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Laminas
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NORMAS ADOTADAS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
As aulas práticas de microbiologia têm como objetivo ensinar ao estudante os princípios e os
métodos utilizados em um laboratório de microbiologia.
Nessas aulas trabalharemos com uma variedade de bactérias, algumas patogênicas para o homem. Portanto,
é essencial seguir as normas de segurança estabelecidas para um laboratório de microbiologia, a fim de se
evitar contaminação dos estudantes, professores e funcionários.
1 - Desinfetar a bancada de trabalho no início e término de cada aula prática.
Para essa finalidade, utiliza-se álcool comercial. Com este procedimento, os microrganismos que poderiam
contaminar as culturas na área de trabalho são removidos.
2 - Não comer ou fumar no laboratório.
Se a bancada, equipamentos ou instrumentos tiverem sido contaminados acidentalmente com qualquer
microrganismo, comer ou fumar é meio eficiente para uma auto contaminação.
3 - Usar sempre avental.
Não utilizá-lo fora do laboratório, caso tenha sido contaminado acidentalmente.
4 - Lavar as mãos ao sair do laboratório e sempre que suspeitar de contaminação.
5 - Avisar ao professor em caso de contaminação acidental.
6 - Não colocar materiais contaminados (pipetas, lâminas etc.) sobre a bancada.
Estes materiais devem ser colocados em recipientes apropriados que serão dispostos em cada bancada.
7 - Cada aluno é responsável pelo material que receber.
8 - Seguir as normas de uso dos aparelhos. O microscópio é um instrumento de trabalho valioso e
deve ser manipulado cuidadosamente. São tidos como pré-requisitos conhecimentos sobre
microscópios ópticos comuns.
9 - Cuidado ao acender o bico de gás (bico de Bunsen). Verificar se não existem substâncias
inflamáveis por perto.
10 - Flambar alças, agulhas e pinças antes e após o uso.
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1. LIMPEZA, MONTAGEM E ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAL USADO EM MICROBIOLOGIA
Após ter estudado esta unidade e ter preparado o experimento prático, você estará apto a:
Limpeza e Montagem
Objetivos
Caracterizar a estrutura e o funcionamento de um laboratório de Microbiologia
Executar técnicas de preparo e montagem de matéria para esterilização.
Introdução
um laboratório de Microbiologia destina-se ao estudo de microrganismos, compreendendo entre
outras atividades, seu isolamento, identificação, caracterização, quantificação e conservação. A este estudo
aplicam-se "técnicas microbiológicas", que envolvem uma série de operações e normas padronizadas,
instalações e instrumental próprios.
No estudo de microrganismos são imprescindíveis as seguintes operações: execução de preparações
microscópicas, esterilização de vidrarias, preparo de meios de cultura e materiais diversos, técnicas de
cultivo, isolamento e outros ensaios microbiológicos.
Esterilização
Objetivos
Caracterizar os diversos métodos de esterilização.
Executar O preocesso de esterilização em calor umido e conhecer outros metodos.
Introdução
Vários procedimentos de esterilização são usados para destruir microganismos. A escolha do método
depende principalmente de natureza do material a ser esterilizado.
O objetivo da esterilização é destruir ou remover todos os organisr patogênicos ou não, incluindo os
esporos bacterianos. Não existe a expressão meio termo como "quase estéril", o termo estéril ou
esterilização não deve ser usado com sentido relativo.
As bactérias nas suas formas vegetativas, são destruídas com certa facilidade pelos métodos comuns
de esterilização. O mesmo comportamen observado para as células vegetativas e esporos de leveduras e
bolores esporos bacterianos, no entanto, constituem um grupo de organismos apresentam a maior
resistência a ação dos agentes físicos, especialmente a temperatura. A maioria dos esporos bacterianos
exige, para a sua eliminação temperaturas superiores a 100°C por período de tempo prolongado. A relação
temperatura e tempo de exposição que deve ser usada para tornar material estéril é baseada no grau de
resistência ao calor dos esporos bacterianos.
2. TÉCNICAS ASSÉPTICAS E SEMEADURA DE MICRORGANISMOS
Objetivos
Treinar o aluno na manipulação de meios e culturas em condições de assepsia;
Executar técnicas de semeadura de microrganismos em meios sólidos e líquidos.
Introdução
O isolamento, cultivo e identificação de microrganismos requerem técnicas adequadas de inoculação
destes microrganismos em meios de cultura que possibilitem o seu rápido crescimento, livre de
Normas e protocolos
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contaminações. Estas são as chamadas "técnicas assépticas". Para sua execução, certas
precauções especiais devem ser observadas pelo manipulador na ocasião da prática de técnicas de
semeadura, com o fim de preservar a pureza do cultivo e minimizar os riscos de infecção ou intoxicação no
laboratório. Assim, o estabelecimento de uma zona de esterilidade é garantida pela regulação do bico de gás
(Bunsen). É somente nesta zona, estéril, que os tubos ou recipientes com meios de cultura, estéreis ou com
material a ser inoculado, deverão ser abertos ou manipulados. Qualquer outro material deverá ser mantido
nesta área, para ser preservada a sua esterilidade. As manipulações deve ser feitas, preferencialmente, por
trás da chama do bico de gás. As alças ou agulhas, de platina ou níquel-cromo, devem ser flambadas
imediatamente antes e depois de qualquer transferência. Elas devem ser flambadas em todo seu
comprimento, a partir de alguns centímetros do cabo de Kolle, até ao rubro, mantendo-as em posição
vertical à chama do bico de Bunsen. Nunca iniciar a flambagem pela extremidade livre da alça ou agulha.
Deixar esfriar nas proximidades da chama.
3. PREPARAÇÃO, ACONDICIONAMENTO E CONTROLE DE QUALIDADE DE MEIOS DE CULTURA.
Objetivos
Realizar a preparação de meios de cultura.
Realizar a armazenagem correta dos meios de cultura.
Descrever os fatores que podem interferir na preparação dos meios que influenciam um resultado
satisfatório de crescimento bacteriano.
Efetuar as normas que regem o controle de qualidade dos meios de cultura.
Introdução
Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos microrganismos. Estes meios fornecem os
princípios nutritivos indispensáveis ao seu crescimento. As exigências nutritivas estão relacionadas a uma
fonte de carbono, de nitrogênio, de energia e de sais minerais. Alguns microrganismos também necessitam
de fatores de crescimento que são substâncias que eles não podem sintetizar, tais como vitaminas,
aminoácidos etc.
Outras condições inerentes ao meio de cultura necessário ao desenvolvimento são as condições de pH,
pressão osmótica e grau de umidade.
4. ESTUDO MORFOLÓGICO DE COLÔNIAS BACTERIANAS
Introdução
Os microrganismos são encontrados em praticamente todos os ambientes naturais, tais como solo, ar, água,
plantas, animais, corpo humano, alimentos e esgoto. Apresentam-se sob a forma de comunidades (conjunto
de população de espécies), e para que possamos estudá-los no laboratório, necessitamos separá-los
individualmente, para que, em cultura formem populações clonadas (iguais, puras), conhecidas como
culturas puras (colônias).
As bactérias são extremamente variáveis quanto ao tamanho e formas que apresentam. Em relação às
formas, a maioria das bactérias estudadas segue um padrão menos variável, embora existam vários tipos
morfológicos distintos. De maneira geral, as bactérias podem ser agrupadas em quatro tipos morfológicos
gerais: cocos, bacilos, espiralados e vibriões.
Normas e protocolos
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Objetivo
Treinar o aluno a pratica de semeadura e isolamento de colônias bactérias
Diferenciar as diferentes formas, tamanho, cores, etc. das colônias bacterianas
Aprender a classificar as diferentes colônias bacterianas
Avaliação das formas morfológicas das colônias cultivadas em placa de Petri.
Tamanho
Colônia: pequena, media ou grande
Forma
Elevação
Bordos
Cromogênese
Pigmentada ou sem pigmento (cor: amarela, preta, vermelha, etc.)
Detalhe óptico
(transparente, translúcida, opaca ou brilhante)
Superfície
(lisa, rugosa, mucóide, seca, pulverulenta)
5. TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM
Introdução
O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas
de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto
que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.
A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de
microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras
de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são
prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou
de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura
estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de
espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como
documentação.
Normas e protocolos
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Objetivo
Conhecer os procedimentos empregados na metodologia coloração de bactéria pelo método de
Gram
Observar e identificar as bactérias pela morfologia e pela assimilação de corantes
6. MEIO DIFERENCIAL E SELETIVO
Introdução:
Meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial das bactérias. Esses meios fornecem os princípios nutritivos
indispensáveis, assim como outras condições necessárias ao crescimento bacteriano.
Os primeiros meios de cultura usados foram líquidos, até que em 1880, Kock introduziu os meios sólidos em
bacteriologia, adicionando ágar aos mesmos.
Os meios podem ser líquidos, sólidos e semi-sólidos, quanto à função pode ser: simples, seletivo e
diferencial.
Geralmente são meios sólidos, utilizados para isolamento e identificação presuntiva de bactérias. Permitem
o desenvolvimento de grupos de microrganismo com características relativamente diferentes. Estas
diferenças podem ser notadas através de uma analise visual nas formas e coloração das colônias ou
coloração do meio de cultura.
MEIO SELETIVO E DIFERENCIAL: Podem estar combinadas as duas características no mesmo meio, são
utilizados para a fácil identificação da colônia da bactéria de interesse.
Objetivo
Fornecer noções básicas sobre os meios de cultura
Aprender a classificação dos meios de cultura e qual sua finalidade
Aprender técnica de semeadura de bactérias
Observar diferenças entre as colônias de microrganismo
Normas e protocolos
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MODELO DE RELATORIOS DE MICROBIOLOGIA
Como fazer um relatório e apresentar os resultados (folha padrão _ Anexo 01)
1 – Resumo
É uma breve síntese que dará a um hipotético leitor do relatório uma idéia sumarizada do trabalho
neste descrito. Deve conter o que se fez como se fez e as conclusões e/ou resultados principais que foram
obtidos. Nunca se devem utilizar tabelas ou gráficos, nem abreviaturas, exceto aquelas já institucionalizadas
entre a comunidade científica (e.g. DNA, CBO, CQO). Não deverá ocupar mais do que ½ página.
2 – Introdução
A introdução, tal como o nome indica, introduz o leitor ao problema estudado, apresenta uma
descrição sucinta do estado atual dos conhecimentos sobre a matéria investigada e justifica o interesse do
trabalho realizado à luz da problemática em que se insere. Geralmente não são utilizadas figuras e deverá
ocupar 1-2 páginas.
3 – Materiais e Métodos
Neste item são descritos os principais materiais utilizados (e.g. microrganismos, reagentes), métodos
(e.g. espectrofotometria), condições experimentais (e.g. temperatura de incubação) e equipamento (e.g.
estufa de incubação). Normalmente não contém figuras nem tabelas.
4 – Resultados
Neste item são descritos os resultados observados (sem os analisar ou avaliar, sem tirar conclusões e
sem repetir o que consta no item dos Materiais e Métodos), recorrendo a tabelas e/ou gráficos para
complementar o texto apresentado, com vista à sua total compreensão. Note-se que nas tabelas a legenda é
colocada por cima, enquanto que, nas figuras e gráficos a legenda é colocada por baixo.
5 – Discussão
Na discussão analisam-se os resultados obtidos à luz dos conhecimentos atuais (do que deveria ser
esperado), discute-se a qualidade dos resultados em função das condições utilizadas (e.g. fraca precisão nas
determinações, número insuficiente de réplicas) e, com base na interpretação dos resultados obtidos,
apontam-se as conclusões possíveis.
6 – Bibliografia
Contém a lista das principais fontes de informação (e.g. livros, artigos científicos, comunicações,
páginas da Internet) utilizadas na elaboração dos pontos 2, 3, 5 e 6, devendo ser identificados por: autores,
ano de publicação, título do artigo ou capítulo e revista ou livro onde foram publicados incluindo o volume e
as páginas.
7 – Materiais Necessários (lembrete)
Cada aluno deverá trazer para as aulas práticas de Microbiologia o jaleco, caderno de laboratório
onde devem registrar a informação considerada importante relativamente a cada trabalho prático a realizar
(e.g. cuidados a ter no manuseamento de reagentes, detalhes da execução experimental, resultados
obtidos).
Normas e protocolos
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Anexo 01
Normas e protocolos
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Anexo 02