esterilização industrial

42
CAPÍTULO VIII – ESTERILIZAÇÃO Diogo B. Andreis José A. M. de Campos 1. INTRODUÇÃO Em processos fermentativos é necessário trabalhar com culturas puras, ou seja, sem contaminantes para se ter uma operação eficaz, do ponto de vista econômico e bioquímico. Os problemas causados pela contaminação serão discutidos posteriormente. O fermentador, meio de cultura e os equipamentos utilizados no processo, devem ser esterilizados para a destruição dos microrganismos pelos métodos apresentados neste capítulo. 2. CONCEITOS A palavra esterilização em sua concepção maior é o processo que promove a eliminação de todas as formas de microrganismos presentes para um nível aceitável de segurança. Antes de discutirmos a esterilização dos equipamentos e soluções é necessário conceituarmos e explicarmos. 2.1. Esterilização: processo que consiste na destruição completa dos microrganismos. Pode ser definida como a 1

Upload: diogo-andreis

Post on 13-Jan-2017

1.609 views

Category:

Technology


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Esterilização Industrial

CAPÍTULO VIII – ESTERILIZAÇÃODiogo B. Andreis

José A. M. de Campos

1. INTRODUÇÃO

Em processos fermentativos é necessário trabalhar com culturas puras,

ou seja, sem contaminantes para se ter uma operação eficaz, do ponto de vista

econômico e bioquímico. Os problemas causados pela contaminação serão

discutidos posteriormente. O fermentador, meio de cultura e os equipamentos

utilizados no processo, devem ser esterilizados para a destruição dos

microrganismos pelos métodos apresentados neste capítulo.

2. CONCEITOS

A palavra esterilização em sua concepção maior é o processo que

promove a eliminação de todas as formas de microrganismos presentes para

um nível aceitável de segurança. Antes de discutirmos a esterilização dos

equipamentos e soluções é necessário conceituarmos e explicarmos.

2.1. Esterilização: processo que consiste na destruição completa dos

microrganismos. Pode ser definida como a inativação e/ou destruição total dos

microrganismos quanto a sua capacidade reprodutiva. Mas não significa,

necessariamente, a destruição de todas suas enzimas, seus produtos

metabólicos e toxinas.

2.2. Desinfecção: o termo denota um processo que reduz o número de

microrganismos a um nível razoável de segurança. Geralmente aplicado ao uso

de agentes químicos. Não implica, necessariamente, na eliminação de todos os

microrganismos viáveis. Há uma grande variação no resultado da desinfecção,

desde a esterilização até a redução mínima do número de microrganismos

viáveis. Os diversos fatores que atuam são: natureza e número dos 1

Page 2: Esterilização Industrial

microrganismos presentes, presença de esporos bacterianos, concentração

dos desinfetantes, duração de aplicação, quantidade de matéria orgânica

presente, tipo de material e temperatura de aplicação.

2.3. Pasteurização: termo comumente utilizado na produção de alimentos.

Processo de destruição de microrganismos patogênicos, não possui ação

sobre os esporos. Consiste em submeter as substâncias a temperaturas

próximas à 100ºC por um tempo adequado. O aquecimento pode ser feito por

meio de vapor, água quente, calor seco ou resistência elétrica. E por final,

resfria-se o produto rapidamente após o tratamento térmico.

2.3.1. Existem três tipos de pasteurização

Pasteurização Lenta: na qual se utiliza temperaturas menores durante maior

intervalo de tempo. Este tipo é melhor para pequenas quantidades de produto,

por exemplo, o leite de cabra. A temperatura utilizada é de 65˚C durante trinta

minutos.

Pasteurização Rápida: na qual se utiliza altas temperaturas durante curtos

intervalos de tempo. É mais utilizada, por exemplo, para leite de saquinho, do

tipo A, B e C. A temperatura utilizada é de 75˚C durantes 15 a 20 segundos, na

literatura, frequentemente encontramos este tipo de pasteurização com a

denominação HTST (High Temperature and Short Time), alta temperatura e

curto tempo.

Pasteurização Muito Rápida: na qual as temperaturas utilizadas vão de 130˚C

a 150˚C, durante três a cinco segundos, este tipo é mais conhecido, por

exemplo, com o leite UHT (Ultra High Temperature) ou longa vida (Potter &

Hotchkiss, 1995).

2.4. Sanitização: é a diminuição do número de microrganismos sobre

superfícies, equipamentos e utensílios até níveis consideráveis de acordo com

as exigências de saúde pública.2

Page 3: Esterilização Industrial

2.5. Assepsia: é a destruição de microrganismos patogênicos ou inibição de

seu crescimento ou atividade por ação de substâncias químicas, sobre tecidos

vivos.

2.6. Tindalização: processo que visa a esterilização realizado pela exposição

do material ao vapor fluente por 30 minutos para destruição das células

vegetativas e posterior incubação para germinação de esporos. Este processo

é repetido por três ou quatro vezes, até que todos os esporos tenham

germinado e as células vegetativas resultantes estejam destruídas pelo calor.

Possui uma série de limitações como tipo de material que pode ser submetido

ao tratamento e baixo índice de segurança de esterilização.

3. MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO

Métodos Físicos:

Calor (seco e úmido);

Filtração;

Radiação (ionizante e não ionizante);

Métodos Químicos (líquidos e gasosos):

Álcoois;

Compostos fenólicos;

Halogênios;

Óxido de etileno;

Ozônio;

Peróxido de hidrogênio;

ETO (Óxido de Etileno).

Métodos Físico-químicos: 3

Page 4: Esterilização Industrial

Vapor a baixa temperatura com formaldeído (VBTF);

Plasma de peróxido de hidrogênio;

A escolha do método de esterilização a ser utilizado dependerá das

características dos produtos a serem esterilizados. Sempre que usarmos

radiação ou agentes químicos o tempo de contato é fundamental para termos

uma esterilização adequada. Quando for empregado o método de calor, o

tempo e a temperatura devem ser controlados para assegurar a esterilização. A

ação da temperatura de aquecimento sobre o tempo necessário para destruir

esporos de bactérias, submetidos ao calor úmido, é demonstrado na TABELA

10.

TABELA 10. Efeito da temperatura sobre o tempo necessário para destruir

esporos bacterianos de fermentação simples em meio de concentração inicial

de 1,6 X 105 esporos/mL (Farmacopéia Brasileira, 2010).

TEMPERATURA (ºC)

TEMPO(min)

TEMPERATURA (ºC)

TEMPO(min)

100 1200 120 19

105 600 125 7

110 190 130 3

115 70 135 1

3.1. Métodos Físicos

Na esterilização por método físico se utiliza o calor como agente

esterilizante. Segundo a Farmacopeia Brasileira (2010), este processo é

considerado o mais simples, econômico e seguro de que se dispõe. O

documento destaca, no entanto, que a sensibilidade dos diferentes

microrganismos à ação do calor é variada, sendo a eficiência de inativação

4

Page 5: Esterilização Industrial

dependente da temperatura, tempo de exposição e presença de água

(ANVISA, 2010). O mecanismo de esterilização resulta da destruição da

estrutura das cadeias proteicas do microrganismo requer energia e a presença

de água possibilita o emprego de menores tempos de exposição e

temperaturas.

3.1.1. Calor Seco

O método da esterilização por calor seco ocorre devido a processos

oxidativos, e, portanto, necessitam de altas temperaturas e longo tempo de

exposição. É realizado em estufas com distribuição homogênea do calor. Sua

eficácia depende da difusão do calor, da quantidade de calor disponível e dos

níveis de perdas de calor. Existem dois tipos de estufas que operam com este

tipo de método: a estufa de convecção por gravidade e a estufa de convecção

mecânica (circulação de ar forçado). O método tem como desvantagens a

necessidade de altas temperaturas e longo tempo de exposição (TABELA 10a),

além da dificuldade de validação, que pode acelerar o processo de degradação

do instrumental. Deve-se utilizar o método por calor seco quando os materiais a

serem esterilizados não suportarem a ação do vapor dos esterilizadores a

vapor.

TABELA 10a - Relação de valores de temperatura e tempo de exposição necessário para esterilização por calor seco (ANVISA, 2010).

Temperatura (ºC) Tempo de exposição

170 1h

160 2h

150 2,5h

140 3h

121 12h

3.1.2. Calor Úmido

5

Page 6: Esterilização Industrial

É considerado o método mais econômico, rápido e sem efeitos

adversos, por não deixar resíduos do agente esterilizante. O processo

empregado vapor saturado é denominado autoclave. O princípio básico de

operação é a substituição do ar da câmara por vapor saturado. Tem a

vantagem de produzir uma elevação da temperatura em forma rápida em

curtos tempos de esterilização e de não deixar resíduos tóxicos no material.

Para a esterilização por calor úmido existe um número de combinações

aceitáveis de tempo e temperatura reconhecidas por algumas farmacopéias.

Exemplos de temperaturas e tempos mínimos estabelecidos para alcançar

níveis adequados de letalidade em processos de esterilização são

demonstrados na Tabela 11. Todas as combinações listadas estão baseadas o

conceito de sobre esterilização com um fator de segurança que se tem

estabelecido para vapor saturado ou água em contato com o microrganismo.

TABELA 11 - Relação de valores de temperatura e tempo de exposição necessário para esterilização por vapor saturado (ANVISA, 2010).

Temperatura (ºC) Tempo de exposição

121 15min

126 10min

134 3min

Se uma substância pura existe como vapor à temperatura de saturação,

ela é chamada vapor saturado. Quando o vapor está a uma temperatura

superior à temperatura de saturação, é chamado vapor superaquecido. A

pressão e temperatura do vapor superaquecido são propriedades, pois a

temperatura pode aumentar, enquanto a pressão permanece constante. As

especificações para temperatura e pressão do vapor saturado para uso na

esterilização por calor úmido são baseadas na normativa publicada em 1997 e

suas atualizações recentes pela IAPWS-IF97 (The International Association for

the Properties of Water and Steam). Substância pura é aquela que tem

composição química invariável e homogênea. Para uma substância pura há

uma relação definida entre a pressão de saturação e a temperatura de 6

Page 7: Esterilização Industrial

saturação. O termo temperatura de saturação designa a temperatura na qual

se dá a vaporização a uma dada pressão, e esta pressão é chamada

depressão de saturação para a dada temperatura.

Na Figura 41, apresenta uma representação esquemática da superfície

termodinâmica. Tradicionalmente são realizadas projeções nos planos pressão

volume especifico (p-v), temperatura volume específico (T-v) e pressão

temperatura (p-T) da curva de saturação.

FIGURA 41 - Representação esquemática da superfície termodinâmica e

projeções nos planos (ANGELO E. e SIMÕES M.J.R., 2011).

A Figura 42 apresenta o valor da pressão de saturação é função

exclusiva da temperatura.

7

Page 8: Esterilização Industrial

FIGURA 42 - Relação pressão x temperatura (ANGELO E. e SIMÕES M.J.R.,

2011).

As equações que descrevem as propriedades termodinâmicas da água e

vapor se baseiam na formulação de 1997. Esta formulação é recomendada

para uso industrial, e é chamado de Formulação industrial de 1997 para as

propriedades termodinâmicas da água e de vapor (IAPWS-IF97-International

Associationforthe PropertiesofWater and Steam). O modelo é dividido em cinco

regiões representadas em um gráfico que apresenta as faixas de aplicação

para diferentes estados. Para as cinco regiões do gráfico os autores da

IAPWS-IF97 desenvolveram equações fundamentais de alta precisão. Todas

as propriedades termodinâmicas podem ser calculadas a partir dessas

equações fundamentais utilizando as relações termodinâmicas apropriadas.

Utilizando a relação P x T a temperatura teórica (TP) é calculada a partir

da pressão medida (Pm) no interior da câmara (figura 2). Se (TP) é comparada

com as temperaturas dentro da câmara do esterilizador (Tm), três situações

podem ocorrer:

Tm = TP: vapor saturado 100 % está presente na câmara esterilizadora

Tm< TP: O vapor é supersaturado

Tm> TP: O vapor é superaquecido

8

Page 9: Esterilização Industrial

O vapor superaquecido se comporta como um gás seco e tem uma

eficácia microbicida baixa comparado com o vapor saturado. O vapor

superaquecido pode se formar como consequência de uma redução de

pressão e/ou uma compressão termodinâmica de vapor saturado.

A temperatura teórica é calculada a partir da pressão medida segundo

as tabelas padrão ou ele pode ser calculado a partir da equação a seguir:

TP = 42, 677 6 + [−3 892,7 / (lnP- 9,486 54)] - 273,27

Onde:

TP: é a temperatura teórica de vapor de água em graus Celsius;

P: é a pressão medida em megapascais.

1P = 0,0000099 atm

3.1.3. Destruição térmica de microrganismos

Tomando-se por base o fato de que a temperatura ideal para o

desenvolvimento e crescimento de organismos vivos vai de -5 ºC a 80 ºC,

podemos concluir que a exposição a temperaturas além desta faixa resultará,

provavelmente, na morte destes organismos, com exceção dos esporos

resistentes ao calor. Acredita-se que o limite superior desta faixa de

temperatura seja determinado pela instabilidade dos constituintes químicos da

matéria viva, mais precisamente as proteínas e os ácidos nucléicos, sendo

estas substâncias rapidamente destruídas, ou desnaturadas, a temperaturas na

faixa de 50 ºC a 90 ºC.

O mecanismo responsável pela morte dos microrganismos quando

sujeitos ao calor ainda não é claramente entendido. A teoria tradicional prega

que a morte de bactérias a temperaturas elevadas esteja intimamente

relacionada a alterações em proteínas, gerando alterações protoplasmáticas

irreversíveis no interior da célula da bactéria. Alguns pesquisadores afirmam

que a morte está associada à inativação por calor de algumas enzimas ou

9

Page 10: Esterilização Industrial

sistemas enzima-proteína na célula. Os outros mecanismos que atuam quando

a bactéria é destruída a altas temperaturas tiveram avanço graças aos

trabalhos de Chick (1906). As medições quantitativas originais de Chick

contribuíram enormemente para a evolução de uma ferramenta muito útil

conhecida como ordem logarítmica da morte de bactérias

Estudos mais recentes nos levam a crer que o modo de ação do calor

sobre a bactéria é bastante semelhante à coagulação de proteínas pelo calor.

Suportando este ponto de vista, Amaha e Sakagushi concluíram que a causa

da morte dos esporos bacterianos submetidos ao calor úmido possa ser

atribuída à desnaturação de uma molécula proteica essencial à célula do

esporo. Deste modo, é bastante razoável concluirmos que o efeito da umidade

sobre a temperatura de coagulação da proteína precisa guardar alguma

relação com a temperatura na qual a bactéria é destruída. Este ponto de vista

foi investigado por Lewith, que detectou o fato das proteínas serem coaguladas

pelo calor a temperaturas mais baixas quando estas contêm uma quantidade

maior de água . Além disso, quando o vapor encontra-se presente, as bactérias

são destruídas sob temperaturas bem menos elevadas e em períodos bem

mais curtos, diferentemente de quando há ausência de vapor. Este fenômeno

pode ser explicado se levarmos em conta que todas as reações químicas,

incluindo aqui a coagulação de proteínas, são catalisadas pela presença de

água.

Se a frequência de citações na literatura for um critério, é justo dizermos

que hoje é amplamente aceito o conceito de que a morte bacteriana por calor

úmido é causada pela desnaturação e coagulação de uma área proteica crítica

no interior da estrutura genética da célula conforme a figura 43.

10

Page 11: Esterilização Industrial

FIGURA 43: a) Bacillus colon típico, em líquido para cultura após 1 hora,

ampliado 28.000X. Verifica-se a uniformidade aparente do protoplasma celular.

b) Bacillus colon após aquecimento em cultura salina por 10 min a 50 ºC,

ampliado 16.000 X. Verifica-se a granulação do protoplasma de forma

irreversível (Perkins, John J., Principles and Methods of sterilization in Health

Sciences, p. 64).

3.1.4. Desnaturação

As proteínas das células bacterianas, muitas das quais enzimáticas,

existem em um estado coloidal perfeitamente disperso. Quando submetidas a

agentes antimicrobianos tais como: calor úmido, álcoois ou fenóis, a proteína

coagula, se precipita, tornando-se antifuncional, como no caso do enrijecimento

da clara de ovo. Esta transformação envolve uma importante reação

característica de proteínas, conhecida como desnaturação e implica em

mudanças nas propriedades físicas ou químicas da proteína, como a

solubilidade, incluindo ainda algumas alterações na estrutura molecular da

mesma. Se a exposição ao calor não for prolongada, a desnaturação pode ser

revertida, retornando-se às condições nas quais a proteína estava estável.

Desta forma, isto significa que é preciso distinguir-se entre a desnaturação

reversível ou irreversível de proteínas.

11

Page 12: Esterilização Industrial

Além do calor, outros agentes capazes de promover a desnaturação das

proteínas são: radiação, ultrassom, congelamento, pressão e uma variedade de

agentes químicos (ácidos, alcaloides, álcoois, ureia e detergentes). As reações

envolvidas no processo de desnaturação são complexas e ainda pouco

entendidas.

A importância da desnaturação de proteínas para a esterilização é a

ação letal do calor sobre os esporos bacterianos a qual foi primeiramente

registrada por Chick e Martin, que caracterizaram a desnaturação protéica

como uma reação mononuclear com água.

3.1.5. Ordem de Mortalidade

Quando uma população de microrganismos é exposta a determinada

influência esterilizante, a taxa ou velocidade na qual os organismos individuais

morrem é diretamente proporcional à concentração ou ao número por unidade

de volume em um dado tempo. Geralmente, a ordem de mortalidade, como

pode ser determinada experimentalmente, segue um curso uniforme e

consistente e é descrita comumente como sendo logarítmica. Isto significa que

quando uma população microbiana está em contato com um meio esterilizante,

o número de células vivas decresce gradualmente, de maneira tal que o

logaritmo do número de células sobreviventes em um dado momento, quando

plotado em relação ao tempo, decresce em uma linha reta como pode ser

verificado na Figura 44. Apesar de haver evidências que suportem ordens de

mortalidade não logarítmicas, os dados coletados desde as medições iniciais

de Chick, até a presente data, mostram que a morte de células vegetativas,

bem como de esporos é essencialmente logarítmica.

12

Page 13: Esterilização Industrial

FIGURA 44: Curva de sobrevivência. O número de sobreviventes é plotado em

relação ao tempo de exposição à temperatura constante. O valor D = 0,666 min

(PERKINS, 2008).

O conhecimento da ordem logarítmica é importantíssimo, pois permite

ao microbiologista computar a taxa de mortalidade constante, designada por K.

Este termo expressa, através de um simples número, a Taxa de Mortalidade,

que apresenta uma relação direta com a eficiência do processo de

esterilização. A constância da taxa de mortalidade significa que o número de

bactérias que são mortas a cada minuto ou unidade de tempo é um percentual

constante do número de bactérias vivas no início de cada novo minuto. É

comum expressarmos K através da equação 1:

K=1tlog No

Nt (1)

Onde, t = tempo em minutos ou tempo de exposição, N0 = Número inicial de

organismos no início do intervalo de tempo e N t = Número de organismos

sobreviventes no final do intervalo de tempo.

13

Page 14: Esterilização Industrial

A determinação da taxa de mortalidade possibilita a comparação da

resistência ao calor de diferentes organismos à mesma temperatura, ou a

resistência de um organismo em particular a diferentes temperaturas. Além

disso, possibilita descrever o efeito quantitativo de fatores, como o pH, sobre a

esterilização. É importante perceber que a característica logarítmica da ordem

de mortalidade implica na morte do mesmo percentual de bactérias vivas a

cada minuto. Teoricamente isto significa que a esterilização completa nunca é

obtida. A tabela 13 ilustra o caso teórico baseado na premissa de que quando

uma suspensão de 1 milhão de bactérias por mililitro é submetida a uma

influência esterilizante, 90% dos organismos são mortos a cada minuto de

exposição.

Minuto Bactérias vivas no início do primeiro minuto

Bactérias Mortas em 1 minuto

Bactérias sobreviventes ao final de 1 minuto

Logaritmo de sobreviventes

1º 1.000.000 90%= 900.000 100.000 5

2º 100.000 = 90.000 10.000 4

3º 10.000 = 900 1.000 3

4º 1.000 = 90 100 2

5º 100 = 9 10 1

6º 10 = 0,9 1 0

7º 1 = 0,09 0.1 -1

8º 0,1 = 0,009 0.01 -2

9º 0,01 = 0,0009 0.001 -3

10º 0,001 = 0,00009 0.0001 -4

11º 0,0001 = 0,000009 0.00001 -5

12º 0,0001 = 0,0000009 0.000001 -6

TABELA 13: Exemplo teórico da ordem de mortalidade de uma população

bacteriana (PERKINS, 2008).

Na coluna de sobreviventes, nos casos de 0,1 ou 0,01 bactéria/ ml, nos

dá a informação de que apenas 1 bactéria permanece viva em 10 ml ou em 14

Page 15: Esterilização Industrial

100 ml da suspensão. Ao final de 12 minutos de exposição, teoricamente,

apenas 1 bactéria ainda permaneceria viva em 1.000.000 de ml, equivalente a

1000 L da suspensão.

Como uma medida prática, o exemplo acima mostra a necessidade de

um período proporcionalmente maior de tempo de exposição para a

esterilização de um líquido contendo uma alta concentração de bactérias, do

que um líquido contendo alguns poucos organismos. Esta condição é

verdadeira para a esterilização por calor, desinfecção química ou

pasteurização. A aplicação deste princípio é muitas vezes ultrapassada no

estabelecimento do período de exposição mínimo para a esterilização de

materiais e produtos.

Por exemplo, da figura anterior, N0 = 1milhão, ou 106 organismos, t = 2 minutos

e Nt = 1.000 ou 103 organismos. Desta forma na equação 2 temos:

K=12

(106−103 )=6−32

=1,50 (2)

Várias tentativas de explicação da característica logarítmica da ordem de

mortalidade têm sido feitas. Uma das mais plausíveis é a proposta por Rahn,

onde o processo de morte remonta uma reação unimolecular ou bimolecular de

primeira ordem. Com isso em mente, a característica logarítmica da ordem de

mortalidade é matematicamente possível apenas quando a morte é devida a

destruição (desnaturação) de uma simples molécula da célula. A ordem

logarítmica é inteiramente impossível se mais do que uma molécula precisar

ser inativada para gerar a morte da célula.

A taxa de mortalidade também pode ser expressa através do valor D ou

Tempo de Redução Decimal. Este princípio, introduzido por Katzin é baseado

na aplicação da reação unimolecular constante à morte microbiana sob

condições uniformes. Por definição, o valor D é o tempo necessário, a uma

dada temperatura, para destruir 90% dos microrganismos. Da figura anterior,

podemos perceber também que o valor D representa o tempo necessário para

que a curva de sobrevivência atravesse um ciclo de log.

15

Page 16: Esterilização Industrial

Quando a taxa de mortalidade é exponencial, o valor D torna-se o

recíproco da taxa de mortalidade constante, K, e ambos D e K representam a

inclinação da curva de sobreviventes. É importante expressarmos a relação

entre estes termos como:

D= 2.303K (3)

Uma vez que o valor D pode ser determinado para qualquer

temperatura, um subescrito é normalmente utilizado para designar a

temperatura empregada, como D250 ou D150.

O Tempo de Redução Decimal (D) é muito importante para a indústria

de processamento de alimentos, especialmente na avaliação dos métodos para

a preservação de alimentos pelo processamento térmico e em estudos de

pesquisa sobre a microbiologia de alimentos enlatados.

3.1.6. Ponto de Destruição Térmica e Tempo de Destruição Térmica

Há alguns anos, dentre os bacteriologistas, surgiu o conceito de que se

uma suspensão com bactérias fosse gradualmente aquecida, seria alcançado

um ponto na escala crescente de temperatura no qual todas as células na

suspensão seriam mortas instantaneamente. Este conceito deu origem ao

termo Ponto de Destruição Térmica, sendo este definido como a menor

temperatura na qual uma solução aquosa de bactérias é morta em 10 min. Este

foi o primeiro padrão de comparação de tolerância ao calor entre organismos

de diferentes espécies. O uso deste termo tem sido bastante criticado, tendo

em vista o fato de implicar em uma falta de entendimento, pois nos leva a

acreditar na existência de uma determinada temperatura que, uma vez

alcançada, causaria a morte instantânea de todas as bactérias, sem levar-se

em conta o período de exposição, o número de organismos, o ambiente a redor

dos organismos e seu estado fisiológico.

16

Page 17: Esterilização Industrial

Em vista da evidência de que a morte de microrganismos sob a

influência de o calor ser um processo ordenado, uma vez que a coagulação da

proteína celular é um processo irreversível, precisamos admitir que não existe

uma temperatura na qual todas as células em suspensão seriam mortas

instantaneamente.

O processo ocorre como uma função do tempo dentro de uma

determinada faixa de temperatura. Se a temperatura é aumentada, o tempo

pode ser reduzido, ou se a temperatura for reduzida, o tempo precisa ser

prolongado. Em outras palavras, a morte de microrganismos pelo calor é uma

função dependente da relação tempo-temperatura empregada. Por estas

razões, a expressão Ponto de mortalidade térmica tem dado caminho a uma

medição de cunho mais prática conhecida como Tempo de Morte Térmica.

Este tempo se refere à determinação do menor período de tempo necessário

para matar toda uma população conhecida de microrganismos em uma

suspensão a uma dada temperatura.

A natureza do meio nos quais os organismos estão suspensos tem uma

importante ligação com o Tempo de Destruição Térmica. Substâncias tóxicas,

se presentes, tornam-se crescentemente germicidas com leves aumentos de

temperatura. Além disso, os produtos do metabolismo mostram toxidade

aumentada em altas temperaturas. Um pH ácido ou alcalino diminui o Tempo

de Mortalidade Térmica, bem como a presença de óleos e gorduras retardam a

penetração de calor aumentando o tempo.

3.1.7. Curva do Tempo de Destruição Térmica

Em última análise, a curva do Tempo de Morte Térmica mostra a resistência

relativa dos organismos a diferentes temperaturas letais. Esta curva pode ser

construída através da plotagem dos Tempos de Destruição Térmica,

determinados experimentalmente, sobre uma escala logarítmica e as

temperaturas correspondentes em uma escala linear. Tal curva é mostrada na

figura 45.

17

Page 18: Esterilização Industrial

FIGURA 45: Curva de TMT com tempos de destruição e sobrevivência

plotados em relação à temperatura do calor úmido. Z = 20ºF (11,2ºC) (Perkins,

John J., Principles and Methods of sterilization in Health Sciences, p.72).

É importante percebermos que qualquer valor de Tempo de Morte

Térmica não apresenta sentido, a menos que o número de organismos

originais seja conhecido, tendo em vista o fato de diferentes populações

resultarem em diferentes curvas.

A inclinação da curva na figura 45, simbolizada por Z, é definida como o

número de graus necessários para a curva atravessar um ciclo de log. Este

número é equivalente ao número de graus de temperatura que precisam ser

aumentados ou diminuídos a uma dada temperatura de referência para gerar

um decréscimo ou aumento no tempo de destruição. Com uma inspeção mais

detalhada na curva podemos perceber que o valor de Z é a medida de como o

Tempo de Morte Térmica varia com a temperatura, seguindo daí que, se Z for

um valor elevado, a temperatura influirá menos sobre o TMT do que nos casos

onde Z é um número pequeno. A maioria dos esporos bacterianos resistentes

exibe um valor de Z dentro da faixa de 10 a 15 ºC. Na confecção da curva de

Tempo de Morte Térmica certas condições precisam ser observadas. Estas

condições, como estipuladas por Townsend e Col são:

18

Page 19: Esterilização Industrial

a) Um Ponto de Sobrevivência é considerado um dado positivo e a curva

precisa estar acima (temperatura mais elevado ou tempo mais prolongado) de

cada um dos pontos de sobrevivência;

b) Pontos de Destruição são indicativos, mas não positivos devido ao

fenômeno de “saltos” (sobrevivência de organismos após decorrido um tempo

além do prescrito para a obtenção de esterilidade). Em geral, uma curva de

Morte Térmica deve estar abaixo de tantos pontos de destruição quanto

possíveis e acima de todos os pontos de sobrevivência;

c) A inclinação da curva de morte térmica deve ser paralela à tendência geral

dos pontos de sobrevivência e de destruição.

Estudos do Tempo de Morte Térmica são de suma importância para os

estudos no campo da bacteriologia aplicada, como por exemplo, na indústria de

enlatados. Deve-se lembrar que os Tempos de Morte Térmica são valores

falsamente considerados constantes e imprecisos.

Todas as informações a respeito dos Tempos de Morte Térmica

apresentam certo erro associado, cuja magnitude depende dos intervalos de

tempo considerados. O número de sobreviventes nunca é zero, podendo

tornar-se muito pequeno, da ordem de 1 em 100 ou 1 em 1000 l.

3.1.8. Resistência de Microrganismos ao Calor

A resistência de microrganismos a agentes destrutivos externos, tais

como: calor, produtos químicos e radiações ionizantes formam a base para

todos os processos de esterilização e desinfecção. O que precisa ficar claro é

que, hoje em dia, nosso conhecimento do “porquê” e de “como” certas espécies

são mais resistentes do que outras é muito limitado. Esta situação nos leva ao

fato das células bacterianas serem compostas por um sistema altamente

complexo, responsável pela habilidade de sobreviver em um ambiente

desfavorável. De acordo com Wyss, “quando o estresse é levado ao sistema,

três possibilidades se revelam: 1) O sistema entra em colapso e o organismo

19

Page 20: Esterilização Industrial

morre ou deixa de ser viável para a continuação de sua linhagem; 2) O sistema

desenvolve mecanismos de resistência; 3) O sistema se altera, acomodando-

se temporária ou permanentemente à presença da influência indesejável.”

(Wyss, O.: Bacterial resistance and dynamics of antibacterial activity. In G. F.

Reddish (Ed): Antiseptics, Desinfectants, Fungicides and Sterilization, 2a ed.

Philadelphia, Lea & F, 1957, p. 210).

3.1.9. Filtração

Essencialmente é um método que não destrói, porém remove

microrganismos, quando outras metodologias não podem ser empregadas seja

pela característica dos produtos ou por sua termo estabilidade. A esterilização

por filtração ocorre por remoção física dos microrganismos presente na solução

testada, com retenção dos mesmos em membranas filtrantes.

As membranas filtrantes disponíveis no mercado podem ser de: acetato

de celulose, nitrato de celulose, fluorcarbonato, polímeros acrílicos, poliesteres,

policarbonato, cloreto de polivinila, vinil, nylon, com porosidade de diâmetro de

0,2 micras removem os microrganismos das soluções e do ar.

Contudo, a maior parte dos vírus é suficientemente pequena para

atravessarem os poros destas membranas filtrantes, pelo que esta técnica não

assegura a esterilidade total das soluções ou gases filtrados.

3.1.10. Radiação Ionizante

A ação antimicrobiana da radiação ionizante se dá através de alteração

da composição molecular das células, modificando seu DNA. As células sofrem

perda ou adição de cargas elétricas.

Existem fatores ambientais, físicos e alguns compostos que influenciam

na resposta celular à radiação, aumentando ou diminuindo sua sensibilidade a

20

Page 21: Esterilização Industrial

esta. Há também microrganismos que são mais resistentes à radiação, como

os esporos bacterianos; as leveduras e fungos têm resistência considerada

média e os Gram negativos têm baixa resistência à radiação.

A esterilização por radiação ionizante é realizada por emissões de alta

energia de ondas eletromagnéticas ou de partículas que se chocam com os

átomos do material irradiado, alterando sua carga elétrica por deslocamento de

elétrons transformando os átomos irradiados em íons positivos ou negativos

podendo gerar hidrogênio livre, radicais hidroxilas e alguns peróxidos,

causando lesões intracelulares. As principais fontes de radiação são raios: alfa,

beta, gama e raios X.

Particularmente na indústria farmacêutica a esterilização por radiação

ionizante apresenta vantagens que são consideradas prioritárias como, por

exemplo: os produtos esterilizados já na sua embalagem final, tornando o

processo um dos mais seguros quanto ao aspecto de recontaminação, o alto

poder de penetração da radiação assegura esterilização de todo o volume do

produto, seja líquido, sólido ou gel, principalmente para produtos que

apresentem cavidades de difícil acesso e uma série de materiais são

compatíveis com este tipo de radiação (termoplásticos, borrachas, metais,

papéis, vidros, etc.).

3.2. Métodos Químicos

Os métodos químicos utilizados para esterilização podem ser líquidos ou

gasosos e se caracterizam pelas interações entre compostos químicos.

3.2.1. Químicos líquidos

Os métodos químicos líquidos utilizam glutaraldeído, peróxido de

hidrogênio, formaldeído ou ácido peracético.

21

Page 22: Esterilização Industrial

Esterilização por glutaraldeído: O glutaraldeído é um biocida utilizado em

processos de desinfecção na concentração de 2 % (p/v), por um período de

tempo de 30 minutos. Seu mecanismo de ação é a alquilação de grupos

hidroxila, carboxila e amino dos microrganismos, alterando seu DNA, seu RNA

e sua síntese de proteínas. Esse método de esterilização é recomendado para

esterilizações de materiais sensíveis ao calor. É um produto extremamente

tóxico para o operador sendo o seu uso restrito. O glutaraldeído tem potente

ação biocida, sendo bactericida, virucida, fungicida e esporocida. O mecanismo

de ação do glutaraldeído sobre esporos é causar reação com a superfície do

esporo provocando endurecimento das camadas externas e morte.

Esterilização por formaldeído: Na esterilização pelo formaldeído o

mecanismo de ação ocorre na alquilaçãode radicais amino, carboxil, oxidril e

sulfidrilde proteínas e ácidos nucléicos microbianos, formando pontes

metilênicas ou etilênicas, o que impedem que esses compostos celulares

realizem suas funções no microrganismo. Existem vários fatores que impede o

seu uso: o efeito carcinogênico no homem, ação lenta sobre esporos podendo

levar 18 horas para destruição total das formas esporuladas, perda de atividade

quando os microrganismos estão envoltos com matéria orgânica, odor forte e

irritante para olhos e mucosas e presença de resíduo tóxico após o uso.

Esterilização por ácido peracético: O ácido peracético é uma mistura entre

água, ácido acético e peróxido de hidrogênio que atua oxidando a parede

celular dos microrganismos e oxidando elementos do interior dos mesmos,

danificando o sistema enzimático levando a morte. Possui como vantagem a

ação esporocida mesmo em temperaturas baixas e sua ação não é impedida

em presença de matéria orgânica.

Esterilização por peróxido de hidrogênio: O peróxido de hidrogênio possui

como registro de sua primeira comercialização no ano de 1800, desde essa

época, sua produção mundial aumenta a cada ano. Sendo utilizado na forma

isolada ou na forma combinada com outras substâncias, é um dos reagentes

mais empregados nos últimos tempos. Seu mecanismo de ação sobre os

microrganismos é causar desnaturação de proteínas e ruptura da

permeabilidade da membrana celular. A ação letal do peróxido de hidrogênio

22

Page 23: Esterilização Industrial

depende: do tempo de exposição, da temperatura e da concentração do

mesmo. Em comparação com glutaraldeído, o peróxido de hidrogênio é

superior. O glutaraldeído possui: dificuldade de validação é um agente que

produz carcinogenicidade ao homem, requer alta umidade na área de

descontaminação, têm baixo poder de ação e necessita de tempo de ciclo de

descontaminação maior que o peróxido de hidrogênio, além de possuir poder

de aderência o que dificulta a sua retirada da área de trabalho. O peróxido de

hidrogênio é um agente oxidante superior ao cloro, dióxido de cloro e

permanganato de potássio. Através da catálise, o peróxido de hidrogênio pode

ser convertido em radical hidroxila (OH), com reatividade inferior apenas ao

flúor. Quando a ação desinfetante do peróxido de hidrogênio é comparada com

a ação do glutaraldeído, o peróxido é o que fornece melhores resultados,

sendo capaz de eliminar maior número de esporos de Clostridium

sporogenesem dispositivos médicos reutilizáveis. Os príons são um desafio nos

processos de descontaminação, mas estudos recentes demonstram a eficácia

do vapor de peróxido de hidrogênio contra os mesmos.

3.2.2. Métodos Químicos gasosos

O agente ativo geralmente utilizado no método de esterilização por gás é

o óxido de etileno (ETO- Ethylene Oxide). A vantagem do ETO é ser uma

sustância com grande poder de difusão e penetração, o que permite uma

ampla versatilidade na esterilização de materiais sensíveis ao calor. A

desvantagem do método é seu elevado custo e toxicidade, podendo provocar

reações locais em pele e mucosas, além de efeitos sistêmicos com

manifestações clínicas como dispnéia, cianoses, transtornos gastrointestinais,

hemólises, necroses e fenômenos mutagênicos. Devido aos efeitos adversos é

considerada uma substância de grande periculosidade, estando restrita ao uso

de operador habilitado. É um processo lento, que requer controle ambiental e

controle residual dos materiais. Não há indicadores químicos que passam

monitorar a concentração do ETO durante o ciclo de esterilização.

23

Page 24: Esterilização Industrial

3.3. Métodos Físico-Químicos

O método físico-químico consiste na associação de dois métodos, que

de modo geral são realizados a baixa temperatura. Podem ser por vapora baixa

temperatura com formaldeído ou por plasma de peróxido de hidrogênio.

3.3.1. Vapor a baixa temperatura com formaldeído (VBTF) ou gás de vapor de formaldeído (FO)

É uma alternativa à esterilização por ETO para a esterilização de

equipamentos e materiais que não resistem a altas temperaturas. As vantagens

são sua rapidez, ausência de resíduos tóxicos e fácil instalação. As

desvantagens são a incompatibilidade com materiais sensíveis a umidade e

sua toxicidade, sendo considerado potencialmente cancerígeno e mutagênico.

3.3.2. Plasma de peróxido de hidrogênio

Esse método usa peróxido de hidrogênio como precursor de plasma. O

plasma, que é considerado como um quarto estado da matéria, diferente do

líquido, sólido e gasoso, é composto por íons reativos, elétrons e partículas

atômicas neutras. As vantagens do método são a ausência de resíduos tóxicos,

fácil instalação, rapidez do processo e compatibilidade com materiais sensíveis

a umidade. As desvantagens são o reduzido poder de penetração, a

impossibilidade de esterilizar materiais derivados da celulose, e a necessidade

de emprego de pacotes especiais sem celulose em sua composição.

4. ESTERILIZAÇÃO NA INDÚSTRIA FERMENTATIVA

24

Page 25: Esterilização Industrial

4.1. Esterilização do Meio de Cultura

De acordo com um conceito bem amplo, a esterilização de um meio é a

operação que tem por finalidade remover ou destruir todas as formas de vida,

animal ou vegetal, macro ou microscópicas, saprófita ou não, existentes no

meio considerado. O grau de esterilização dos meios de fermentação varia

conforme o processo a que se destina. Algumas vezes é totalmente

dispensável (fermentação láctica de hortaliças e polvilho; tratamento biológicos

de resíduos); realizada de forma incipiente (fermentação alcoólica; produção de

leveduras para panificação; fermentação acética do vinagre); realizada com

alto grau de exigência (produção de antibióticos, enzimas, vitaminas, acetona,

butanol). Em ensaios laboratoriais sempre é necessário (devido ao uso de

culturas puras).

Em plantas industriais o calor úmido é a principal forma de se efetuar a

esterilização. Pode ser feita nos próprios recipientes destinados a fermentação

(processo descontínuo) ou em separado (processo contínuo).

4.2. Esterilização em batelada:

Vários meios de cultura são esterilizados no fermentador a 121 ºC (para

destruir esporos), o tempo é calculado em função dos constituintes do mosto

(pH, material em suspensão, etc) e do tamanho do fermentador. Também é

necessário esterilizar ás válvulas e eletrodos e outros equipamentos que

entram em contato direto com o fermentador.

• Método indireto - injetar vapor no fermentador através de camisa ou da

serpentina;

• Método direto - injetar vapor direto na solução nutriente, assim o vapor deve

estar livre de aditivos químicos.

25

Page 26: Esterilização Industrial

OBS.: O vapor gerado pela indústria normalmente contém substâncias

potencialmente tóxicas aos microrganismos, derivadas de anticorrosivos

utilizados no processo de geração de vapor. Com injeção direta de vapor no

meio de cultura o volume deste aumentará, pois uma parte do vapor se

condensa aumentando o volume do líquido dentro do fermentados.

Vantagem:

a) tem a vantagem de esterilizar o fermentador e o meio simultaneamente,

evitando perigos de contaminações.

Desvantagem:

a) Manutenção de temperaturas altas por períodos longos, favorecendo

possíveis alterações no meio;

b) Consumo elevado de vapor e água de resfriamento;

c) Problemas de corrosão pelo contato do equipamento com o meio aquecido.

d) Elevado tempo ocioso do equipamento;

e) interações químicas com nutrientes

4.3. Esterilização Contínua

As principais desvantagens apresentadas podem ser evitadas pela

esterilização contínua; melhor controle de temperatura; temperaturas mais

elevadas diminui o tempo da operação; Fornece meio esterilizados para

fermentadores de vários tamanhos. Uma etapa preliminar obrigatória nos

processos fermentativos contínuos, também tem valor nos processos em

batelada, pois diminui o tempo de esterilização e a área física necessária para

o processo, devido a relação exponencial entre taxa de morte e temperatura

tomando bem menor o tempo necessário para a destruição de todos os

microrganismos quando temperaturas maiores são utilizadas.

26

Page 27: Esterilização Industrial

Na esterilização em batelada são necessários 30 a 60 minutos a 121 ºC

e na esterilização contínua normalmente é realizada em 30 a 120 segundos a

140 ºC. O meio de cultura torna-se diluído pois a condensação do vapor

aumenta o volume do líquido, para resolver este problema o meio aquecido é

bombeado através de uma válvula de expansão e o condensado é removido

por uma bomba de vácuo até que o meio de cultura fique com a mesma

concentração de antes da esterilização. Pode se feita pela injeção direta de

vapor ou por meio de trocadores de calor.

Em certos casos a pasteurização já pé suficiente para eliminar grande

parte da comunidade microbiana. É uma operação rápida utilizando

temperaturas próximas de 100 ºC seguida de resfriamento. Para pequenas

quantidades de meio pode-se lançar mão da tindalização.

FIGURA 46: Esquema de esterilização contínua em trocadores de calor.

4.4. Destruição de Nutrientes

A esterilização do meio pelo calor pode acarretar alterações na sua

composição química. A experiência mostra que, quanto mais elevada for a

27

Page 28: Esterilização Industrial

temperatura necessária para esterilização de um dado meio, menor será a

destruição de nutrientes e, consequentemente, melhores serão os resultados

da fermentação posterior. Esta menor destruição de nutrientes é uma

consequência de fato – observada experimentalmente – de ser a energia de

ativação de destruição térmica dos microrganismos maior do que a de

destruição térmica dos nutrientes. Essa afirmativa é de importância prática,

tanto na esterilização de meios de fermentação como na esterilização de

alimentos.

4.5. Esterilização do Ar

As fermentações aeróbias, com o microrganismo em suspensão,

constituem os processos fermentativos de maior importância industrial

atualmente. Em tais fermentações a quantidade de ar introduzida no sistema é

grande e é perfeitamente aceitável, que haja grande preocupação quanto a

esterilização do ar a ser admitido nos fermentadores. Tais cuidados devem ser

tomados principalmente nas horas iniciais da fermentação.

A maior parte dos processos fermentativos é conduzida com agitação

vigorosa, e o ar fornecido ao fermentador deve ser estéril. O número de

partículas e microrganismos depende da localização da indústria, do

movimento do ar e do tratamento prévio que o ar foi submetido.

4.5.1. Métodos de Esterilização do Ar

Calor seco - normalmente antieconômica ou de difícil realização.

Radiações - Apenas as radiações UV poderiam ter aplicação prática, porém

pouco usada devido ao grande tempo de exposição. Pode ser usada em

pequenas instalações (laboratórios, pesquisa). Atua mais como desinfetante.

Filtração - É sem dúvida o processo mais importante por ser o de maior

aplicação na indústria. Filtros feitos de lã de vidro, acetato de celulose, etc.

28

Page 29: Esterilização Industrial

Os filtros podem ser de dois tipos principais:

Filtros que apresentam poros - retenção mecânica dos microrganismos

(cartuchos de membranas de ésteres de celulose, nylon);

Filtros de camadas de material fibroso (lã-de-vidro) - Atua na combinação de

vários efeitos físicos: inércia, bloqueio, difusão, separação por gravidade e

atração eletrostática.

REFERÊNCIAS:

ANGELO E. e SIMÕES M.J.R. Journal of thermophysics and heat transfer 16 (3), 2011, 415-424.

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução da Diretoria Colegiada – RDC 17/2010 : Seção VII - Tecnologia de isoladores.

CHICK, H., E MARTIN, C. J.: On the “Heat Coagulation of proteins. J. Phisiol, London, 40:404-430, 1910.

Farmacopéia Brasileira. Processo asséptico: Tecnologias alternativas para processo asséptico. Brasília: ANVISA; 2010, 5 ed.

PERKINS, JOHN J., Principles and Methods of sterilization in Health Sciences, 2008.

PINTO TJA, KANEKO TM, PINTO AF. Controle Biológico de Qualidade de Produtos Farmacêuticos, Correlatos e Cosméticos: Controle de produtos estéreis ênfase nos processos assépticos tecnologia de isoladores. 3 ed. São Paulo: Atheneu; 2010.

POTTER, N.N.; HOTCHIKISS, J.H. Food Science. 5.ed. New York: Chapman & Hall, 1995. 608 p

Rutala, WA – APIC Guideline for selection and use of disinfectants.Rev. Am. J.Infect. Control 1996; 24 (4): 313-342.

The International Association for the Properties of Water and Steam. 2015 Annual Meeting. Stockholm, Sweden, June 29 to July 3, 2015.

WYSS, O.: Bacterial resistance and dynamics of antibacterial activity. In G. F. Reddish (Ed): Antiseptics, Desinfectants, Fungicides and Sterilization, 2a ed. Philadelphia, Lea & F, 1957, p. 210

29

Page 30: Esterilização Industrial

30