HEMOGLOBINA GLICADAINTRODUÇÃO E APLICAÇÃO, FUNDAMENTAÇÃO, CONSIDERAÇÕES PRÉ-ANALÍTICAS, ANALÍTICAS E PADRONIZAÇÃO, MÉTODO DE REFERÊNCIA,

INTERVALOS DE REFERÊNCIA, INTERPRETAÇÃO E METAS PARA TRATAMENTO EM DIABÉTICOS.

Recomendações: a hemoglobina glicada (HbG) deve ser a medição de rotina em todos os pacientes com diabetes mellitus para documentar o grau de controle glicêmico. As metas de tratamento devem estar baseadas em estudos aleatórios prospectivos tais como DCCT e UKPDS que demonstraram a relação entre o controle glicêmico, avaliado por determinações seriadas da HbG, e os riscos de desenvolvimento e progressão das complicações crônicas do diabetes (1).

A hemoglobina glicada (HbG) está sendo usada com freqüência cada vez maior para monitorizar o controle glicêmico de longo prazo no diabetes mellitus. Na maioria das vezes o teste proporciona uma indicação exata da concentração média da glicose plasmática nos 2 a 3 meses que antecedem o teste, complementando as medições mais tradicionais de controle glicêmico como medição da glicose em plasma ou urina.

O termo hemoglobina glicada se refere a uma série de componentes da hemoglobina em menor concentração que são compostos formados por hemoglobina A e vários carboidratos. A reação entre a glicose e hemoglobina é um exemplo da glicação não enzimática que é lenta, contínua e irreversível. Como a hemácia humana é livremente permeável à glicose, a hemoglobina glicada é formada a uma velocidade dependente e proporcional à concentração da glicose no plasma.

Os componentes em menor concentração da hemoglobina foram primeiramente reconhecidos por mostrarem diferenças na carga elétrica e foram denominados hemoglobinas rápidas, por migrarem em um campo elétrico, mais rapidamente que a hemoglobina A. A hemoglobina rápida mais importante, quando relacionada com o diabetes, é a A1c, formada por ligação da glicose ao nitrogênio terminal da valina em uma ou nas duas cadeias beta da hemoglobina. Dependendo do método de medição, a proporção de HbA1c em relação à hemoglobina total é 3-6%, em indivíduos normoglicêmicos, podendo chegar a valores muito elevados em indivíduos diabéticos não controlados adequadamente.

A hemoglobina pode ser glicada em outros aminoácidos não localizados nas cadeias beta. Entretanto, essas glicações não modificam a carga da molécula da hemoglobina e não são detectadas pelos métodos que se baseiam nas modificações da carga da hemoglobina.

A tabela 1 sumariza a nomenclatura corrente para as hemoglobinas, baseadas nas recomendações do National Institutes of Health, Diabetes Data Group.

As proteínas glicadas são formadas translacionalmente a partir da reação lenta e não enzimática entre a glicose e os grupamentos amina das proteínas. No caso da hemoglobina, a taxa de síntese da HbG é função da exposição das hemácias a concentrações elevadas da glicose. A HbG é um índice clinicamente útil da glicemia media nos 120 dias que precedem ao exame que correspondem à meia vida das hemácias. Ainda que estudos cuidadosamente controlados têm documentado a íntima correlação entre a HbG e a glicemia média, as medições de rotina da glicose sanguínea por pacientes (auto teste) e provedores de saúde não são consideradas tão adequadas quanto a HbG para estimar a glicemia média. A HbG é também utilizada como medida do risco de desenvolvimento das complicações crônicas do diabetes.

As concentrações de outras proteínas glicadas como a frutosamina, também refletem a glicemia média, mas em um menor período de tempo. Entretanto, a utilidade clínica das proteínas glicadas não está claramente estabelecida e não existem evidências convincentes que relacionam suas concentrações às complicações crônicas do diabetes (1).

INTRODUÇÃO E APLICAÇÃO RAZÕES FUNDAMENTAIS PARA MEDIÇÃO DA HEMOGLOBINA GLICADA

Tabela 1 - Nomenclatura das hemoglobinas (2)

CONSIDERAÇÕES PRÉ-ANALÍTICAS

CONSIDERAÇÕES ANALÍTICAS E PADRONIZAÇÃODenominação Descrição

HbA Forma mais importante da hemoglobina. É um tetrâmero nativo não modificado, composto de duas cadeias alfa e duas cadeias beta.

HbA0 Componente mais importante da HbA, identificado por suas propriedades eletroforéticas e cromatográficas. Podem ocorrer modificações pós translacionais nesta fração, incluindo glicação, que não alteram significativamente as propriedades de carga da proteína.

HbA1 Formas da HbA modificadas translacionalmente e carregadas negativamente, detectadas por eletroforese ou cromatografia.

HbA1a1, HbA1a2, HbA1b, HbA1C

Componentes cromatograficamente distintos que compõem a HbA1.

HbA1C Composto formado por ligação cetoamina irreversível da glicose ao nitrogênio terminal da valina na cadeia beta da hemoglobina. É a forma estável da hemoglobina glicada.

Pré-A1C Forma lábil da hemoglobina glicada, formado por ligação aldimina reversível da glicose ao nitrogênio terminal da valina na cadeia beta da hemoglobina.

Hemoglobinas rápidas Fração HbA1 total que, devido à sua carga negativa, migra mais rapidamente para o ânodo na eletroforese. É também eluída mais rapidamente que a HbA0 na cromatografia de troca iônica.

Hemoglobina glicada Denominação genérica para os compostos de hemoglobina com a glicose e outros carboidratos.

Não existem efeitos de idade, sexo, etnia e de estações do ano na hemoglobina glicada ou nos testes para HbG. Condições que reduzem a sobrevida das hemácias ou produzem diminuições em sua meia vida, produzem resultados falsamente diminuídos. As vitaminas C e E produzem resultados falsamente diminuídos por redução na glicação, mas a vitamina C aumenta os resultados em alguns métodos. A anemia por deficiência de ferro produz resultados falsamente elevados.

Hipertrigliceridemia, hiperbilirrubinemia, uremia, alcoolismo crônico, ingesta crônica de salicilatos e adição de opiáceos podem interferir com alguns métodos e aumentar falsamente os resultados.

As causas de interferências pré-analíticas mais importantes são as hemoglobinopatias que podem produzir resultados falsamente aumentados ou diminuídos (3). Em certas situações, a interferência pode ser mínima nos valores de referência e aumentar significativamente à medida que o valor da HbG aumenta. Os métodos utilizando cromatografia de afinidade e imunoensaios podem ser os menos sensíveis aos efeitos das hemoglobinopatias. Os métodos que não utilizam a medição da hemoglobina, como a frutosamina, podem ser utilizados como alternativa nos pacientes com hemoglobinopatias (3).

Recomendações: os laboratórios devem, preferencialmente, usar métodos certificados pelo National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) como rastreáveis ao método do DCCT (1,18).

Existem inúmeros diferentes métodos para medição da HbG em uso corrente, que variam de minicolunas com aplicação manual a sistemas automáticos de grande produção. A maioria dos métodos pode ser classificada em dois grandes grupos baseados no princípio analítico. O primeiro grupo inclui os métodos que medem a HbG com base nas diferenças de carga entre os componentes glicados e não glicados (cromatografia de troca iônica e eletroforese). O segundo grupo inclui métodos que separam os componentes da hemoglobina com base nas diferenças estruturais (cromatografia de afinidade, imunoensaios e enzimáticos).

Geralmente, os resultados dos métodos que utilizam diferentes princípios metodológicos demonstram excelente correlação entre si e não existem dados convincentes para demonstrar que um método ou analito é clinicamente superior ao outro. Entretanto, os resultados de HbG para a mesma amostra podem variar consideravelmente entre os métodos a menos que estejam padronizados a uma referência comum. Sem a padronização, a mesma amostra de sangue pode ter resultado de 7% no laboratório A e de 9% no laboratório B (2, 4-6). Entretanto, a monitorização do controle do paciente diabético pode ser realizada de modo eficaz se os testes forem realizados sempre no mesmo laboratório que mantenha a mesma tecnologia e controle adequado da qualidade.

TECINFO

O MÉTODO DE REFERÊNCIA

INTERVALOS DE REFERÊNCIA, INTERPRETAÇÃO E METAS DE TRATAMENTO

CONCEITOS CHAVE PARA ESTABELECER AS METAS DE GLICEMIA E HBA1C EM CRIANÇAS E ADOLESCENTES

Tabela 2 - Correlação entre a HbA1c e a glicemia média de múltiplos testes nos 2-3 meses precedentes (17)

Tabela 4 - Metas para glicemia e HbA1c, por grupo etário, no diabetes tipo I em crianças e adolescentes (17)

Tabela 3 - Metas recomendadas para o tratamento de adultos diabéticos (17)

HbA1c Descrição

% mg/dL mmol/L

6,0 126 7,0

7,0 154 8,6

8,0 183 10,2

9,0 212 11,8

10,0 240 13,4

11,0 269 15,0

12,0 298 16,6

Idade (anos)

Glicemia (mg/dL)

HbA1c (%) Embasamento lógicodas metas

P r é –p r a n d i a l

Ao dormir,durante à noite

Infantes e pré-escolares (0 - 6) 100 - 180 110 - 200 >7,5, <8,5Alto risco e

vulnerabilidade para hipoglicemia grave.

Idade escolar(6 - 12)

90 - 180 100 - 180 <8,0Risco de hipoglicemia

e risco de complicações antes

da puberdade.

Adolescentes e adultos jovens (13 - 19)

90 - 130 90 - 150 <7,5

Risco de hipoglicemia grave. Ocorrência de

problemas psicológicos e de desenvolvimento.

A meta de HbA1c <7,0% é aceitável

quando conseguida sem hipoglicemias

freqüentes.

HbA1c < 7,0% *

Glicemia de jejum 70 - 130 mg/dL

Pico pós-prandial < 180 mg/dL

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Análise dos produtos Labtest;- Publicações Técnicas- Notícias sobre o mercado.

Referências1. Sacks DB, Bruns DE, Goldstein DE, Maclaren NK, McDonald JM, Parrott M. Guidelines and Recommendations for Laboratory Analysis in the Diagnosis and Management of Diabetes Mellitus. Clin Chem 2002;48:436-472.2. Goldstein DE, Little RR, Wiedmeyer HM, England JD, McKenzie EM. Glycated hemoglobin: methodologies and clinical applications. Clin Chem 1986;32:B64-B70. 3. Bry L, Chen PC, Sacks DB. Effects of hemoglobin variants and chemically modified derivatives on assays for glycohemoglobin. Clin Chem 2001;47:153-163.4. Little RR, Wiedmeyer HM, England JD, Wilke AL, Rohlfing CL, Wians FH, Jr, et al. Interlaboratory standardization of measurements of glycohemoglobins. Clin Chem 1992;38:2472-2478.5. Bodor GS, Little RR, Garrett N, Brown W, Goldstein DE, Nahm MH. Standardization of glycohemoglobin determinations in the clinical laboratory: three years of experience. Clin Chem 1992;38:2414-2418.6. Weykamp CW, Penders TJ, Muskiet FA, van der Slik W. Effect of calibration on dispersion of glycohemoglobin values determined by 111 laboratories using 21 methods. Clin Chem 1994;40:138-144.7. Little RR, Goldstein DE. Standardization of glycohemoglobin measurements. AACC Endo 1995;13:109-124.8. Goldstein DE, Little RR. Bringing order to chaos: the National Glycohemoglobin Standardization Program. Contemp Int Med 1997;9:27-32.9. NGSP Steering Committee.. Implementation of the national glycohemoglobin standardization program (NGSP). Diabetes 1997;46:151A.10. DCCT Research Group. Feasibility of centralized measurements of glycated hemoglobin in the diabetes control and complications trial: a multicenter study. Clin Chem 1987;33:2267-2271.11. Myers GL, et al. Standardization of lipid and lipoproteins measurement. Em Rifai N, Warnick GR, editors, Laboratory Measurements of Lipids, Lipoproteinsm and Apolipoproteins. Washington DC: AACC Press, 1994:177-205.12. Hoelzel W, Miedema K. Development of a reference system for the international standardization of HbA1c/glycohemoglobin determinations. J Int Fed Clin Chem 1996;9:62-64,667.13. Kobold U, Jeppsson JO, Dulffer T, Finke A, Hoelzel W, Miedema K. Candidate reference methods for hemoglobin A1c based on peptide mapping. Clin Chem 1997;43:1944-1951.14. Eckfeldt JH, Bruns DE. Another step toward standardization of methods for measurement of hemoglobin A1c [Editorial]. Clin Chem 1997;43:1811-1813.15. Miedema K. Electrospray mass spectrometry for measurement of glycohemoglobin. Clin Chem 1997;43:705-707.16. IFCC Standardization of HbA1c. <http://www.ngsp.org>, acesso em 20/08/2010.17. Nathan, D.M.; Kuenen, J.; Borg, R.;Zheng, H.; Schoenfeld, D.; Heine, R.J. Translationg the A1C assay into estimated average glucose values. Diabetes Care 2008; 31: 1473-1478. 18. Grupo Interdisciplinar de Padronização da Hemoglobina Glicada - A1c. Posicionamento Oficial 2009. <http://www.sbpc.org.br>, acesso em 20/08/2010.

Os autores salientam que somente pacientes diabéticos com glicemias relativamente estáveis (A1c mantendo dentro de 1% do valor basal) foram incluídos. Portanto, os atuais resultados somente são aplicados a essa população. O estudo não inclui crianças, grávidas, pacientes com disfunção renal ou com hemoglobinopatias.

As metas de tratamento para diabéticos idosos devem ser estabelecidas individualmente, tratando caso a caso.

O posicionamento oficial (18) estabelece que o valor da meta para HbG quando os resultados são obtidos em conjuntos diagnósticos comerciais não certificados pelo NGSP, deve ser o valor do limite superior do intervalo de referência mais uma unidade (Intervalo de referência: 6,3 a 8,0%, Meta para HbG <9,0%).

* Método certificado pelo NGSP

O método de referência para HbA1c foi definido pela IFCC, utiliza espectrometria de massa ou eletroforese capilar como métodos de medição e preparações purificadas de hemoglobina A0 e A1c como calibradores e não foi adotado como referência pelo NGSP.

O método empregado para gerar os dados de HbG do DCCT, passou a ser utilizado como referência básica por apresentar desempenho adequado para um método designado de comparação e está sendo aplicado para certificar laboratórios de referência do NGSP e sistemas analíticos disponibilizados pelos fabricantes para medição de HbG.

O uso continuado, como certificador, do método rastreável ao DCCT, gerou a crença de que se trata de um método de referência. Como o procedimento de medição utiliza a HPLC o equívoco se ampliou para considerar a HPLC como método de referência.

Em 1995 a IFCC criou um grupo de trabalho (Working Group on HbA1c Standardization), incluindo representantes do NGSP, que avaliou vários métodos e várias preparações purificadas de HbA1c, que potencialmente poderiam proporcionar uma associação firme entre o NGSP e os programas de padronização em HbG desenvolvidos em outros países (12). Esse esquema se mostrou particularmente atraente porque permitiria a comparação dos resultados obtidos mundialmente com os resultados do DCCT e UKPDS.

A IFCC estabeleceu também uma rede de laboratórios que utilizam dois métodos de referência, espectrometria de massa e eletroforese capilar, para a medição da HbA1c. Cada laboratório aplica misturas purificadas de HbA1c e HbA0 como calibradores (13-15).

Os resultados de HbA1c obtidos na rede do NGSP e na rede da IFCC foram comparados tendo sido gerada uma equação que descreve a relação do método NGSP em função do método IFCC (16). Os resultados IFCC são consistentemente mais baixos (1,5 - 2%) quando comparados com os resultados NGSP em todo o intervalo clinicamente encontrado.

Avaliações adicionais são necessárias para validar as estabilidades de rede IFCC e da relação NGSP/IFCC. Se ambas se mostrarem robustas, o NGSP irá adotar os métodos IFCC como âncora. O processo de certificação e, mais importante, os testes para sistemas analíticos certificados pelo NGSP não serão modificados e continuarão a ser rastreáveis diretamente ao método de referência do DCCT (16).

Para os métodos certificados pelo NGSP que têm o intervalo de referência entre 4,0 e 6,0%, o desvio padrão do intervalo é geralmente < 0,5 ponto percentual, produzindo o intervalo de confiança (95%) < 2,0 pontos percentual (Média de HbA1c + 2 desvios padrão = 5,0% + 1,0%). Para os mesmos métodos, os intervalos de referência não devem se desviar significativamente do intervalo de 4 a 6%. Observar que as metas de tratamento da American Diabetes Association (ADA) derivadas do DCCT e UKPDS, são usadas para estabelecer o estado desejável de controle metabólico.

As metas devem ser individualizadas e valores mais baixos podem ser aceitáveis quando estabelecidos por avaliação de risco/benefício.

As metas de glicemia devem ser mais elevadas em crianças com hipoglicemias freqüentes ou não percebidas.

Deve-se medir a glicemia pós-prandial quando houver discrepâncias entre valores da glicemia de jejum e valores da HbA1c.

Rev.:

Ago

sto,

201

0 Re

f.: 0

1091

0

O NGSP foi criado em 1996 (8-9) usando como modelo um programa bem sucedido denominado Cholesterol Reference Method Laboratory Network program (11). O NGSP iniciou a padronização dos métodos para HbG com o objetivo de tornar os resultados dos vários métodos disponíveis, equivalentes aos resultados do método utilizado no DCCT. Os valores do método utilizado no DCCT passaram a ser empregados como base para a padronização da HbG, porque o DCCT estabeleceu a relação entre valores específicos da HbG e o desfecho em longo prazo nos pacientes com diabetes mellitus (7-9).

A rede de laboratórios do NGSP utiliza uma diversidade de métodos de ensaio, todos eles rastreáveis ao método de referencia do DCCT, classificado como método designado de comparação segundo o CLSI e que utiliza a tecnologia HPLC (10). Essa rede interage com os fabricantes de produtos para HbG para auxiliá-los na calibração dos métodos e proporcionar comparação de dados para certificação da rastreabilidade aos valores do método utilizado no DCCT.

Os métodos certificados pelo NGSP utilizam diferentes princípios analíticos como: cromatografia de troca iônica (HPLC e LPLC), eletroforese, cromatografia de afinidade, imunoensaio e enzimático, assegurando que, apesar das diferenças metodológicas, os resultados fornecidos são substancialmente equivalentes. As informações detalhadas sobre o processo de certificação podem ser obtidas no sítio do NGSP: http://www.ngsp.org (acesso em 20/08/2010).

Reagente 1

Reagente 2A

Reagente 2B

Reagente Hemolisante

intervalo operacional de 2,0% a 16,0%.

Sistema para a determinação quantitativa de hemoglobina A1c (HbA1c) em amostras de sangue total.

Característica do Sistema:

Apresentação

Linearidade:

Todas as hemoglobinas presentes na amostra se ligam à superfície das partículas de látex (Reagente 1). A adição de anticorpo monoclonal de camundongo anti-HbA1c humana (Reagente 2) promove a formação do complexo látex-HbA1c-anticorpo anti-HbA1c. Um segundo anticorpo presente no Reagente 2 (anticorpo policlonal anti-IgG de camundongo) produz aglutinação deste complexo. A intensidade da aglutinação, medida em absorbância, é proporcional à quantidade de HbA1c presente na amostra. O valor de HbA1c é obtido através de curva de calibração.

A medição é realizada diretamente sem a necessidade da determinação da hemoglobina total.

Os resultados são obtidos através da curva de calibração, evitando a realização de cálculos adicionais.

A fração pré-HbA1c (fração lábil ou instável) não é detectada pelo método e, portanto, não interfere na determinação de HbA1c.

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