Enzimologia Aula 2

Leitura sugerida

Biochemistry Voet & Voet 3ª edição

Capítulo 10 – parte 1Bb (página 323), parte 4A, 4B e 4C (páginas 346-350)

Structure and Mechanism in Protein Science Alan Fersht

1999 Capítulo 10 – páginas 289-304

No caso das “enzimas alostéricas” a v0 varia muito mais mesmo com menores variações de [S]. A formação de [ES] parece depender de uma afinidade entre E e S que é crescente. Daí a hipótese de “cooperatividade” entre os sítios ativos.

Modelo de Hill Cooperatividade infinita

E + nS ESn E + nP

S S

S S + S

Proporcional a v0/Vmax

Esta passagem está detalhada na próxima página.

Linearização (ver slide 8)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 2 4 6 8 10 12

4 2 1

Simulação para diferentes valores de n (4, 2 e 1)

y = 3x - 0.699 R² = 1 -4

-3

-2

-1

0

1

2

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1

Log

(v0/

1-v0

)

Log [S]

Demonstração da linearização

Parâmetro de Hill (h)

A constante de Hill (n) aumenta proporcionalmente com o grau de cooperatividade da ligação de S, porém nunca atinge o valor real de número de sítios. N = 1 à ligação não-cooperativa N > 1 à ligação com cooperatividade positiva N < 1 à ligação com cooperatividade negativa

Modelo Simetria Concatenada

Enzima é um oligômero com subunidades idênticas Estados T e R estão em equilíbrio. Ambos podem ligar S, porém afinidade por R é maior (KR < KT) Todas as subunidades da enzima alteram de conformação concatenadamente. Qualquer complexo ES pode gerar produto do mesmo modo

T0 R0

T1

T2

T3

T4

R1

R2

R3

R4

L

+ S + S

+ S + S

+ S + S

+ S + S

KT

KT

KT

KT KR

KR

KR

KR

Ver simulação no próximo slide

0

0.5

1

0 5 10 15 20a

YS

L = 10.000

L = 1

L = 100 L = 1000

c 0 n = 4

Pro

porc

ion

al

à v

0/V

ma

x

y = 1.4403x - 1.0753R = 0.99

y = 2.5988x - 1.9496R = 0.99

-3

-2

-1

0

1

2

3

0 0.5 1 1.5

L = 1000

L = 10.000

Log [S]

Log

(Ys /

1 –

Ys)

L cooperatividade Coeficiente de Hill Para c = 0

Quanto maior [T], maior a cooperatividade

c 0 n = 4 L = 1.000

A formação dos complexos R1, R2, etc... desloca o equilíbrio no sentido do estado de maior afinidade (R) pelo ligante

T0 R0

R1

R2

R3

R4

L

+ S

+ S

+ S

+ S KR

KR

KR

KR

Visão simplificada do esquema inicial assumindo os valores simulados nos slides anteriores (14 e 15)

O equílibrio T – R, com [T0] > [R0], é essencial para existência da cooperatividade. O deslocamento do equílibrio aumenta a concentração dos sítios de maior afinidade por S.

0

0.5

1

0 5 10 15 20a

YSc à 0 ; S liga somente em R

c = 0,1 ; Afinidade por R é 10x maior

c = 0,04 Afinidade por R é 25x maior

L = 1.000 n = 4

p/ L > 1 e cte. c cooperatividade coeficiente de Hill

y = 1.4403x - 1.0753R = 0.99

y = 2.5988x - 1.9496R = 0.99

-3

-2

-1

0

1

2

3

0 0.5 1 1.5Log [S]

Quanto maior a afinidade entre S e R em comparação à S e T, maior a cooperatividade

Log

(Ys /

1 –

Ys)

c = 0,1 ; Afinidade por R é 10x maior

c à 0 ; S liga somente em R

T0 R0

L

R0 + ativador (efetuador

alostérico +)

T0 + inibidor (efetuador

alostérico -)

+

+ +

-

Efetuador alostérico positivo desloca equilíbrio no sentido de R, aumenta o Ys para uma mesma [S] e reduz a cooperatividade. Efetuador alostérico negativo desloca o equilíbrio no sentido de T, reduz o Ys para uma mesma [S] e aumenta a cooperatividade.

Para L >>1 e c à 0

0

0.5

1

0 5 10 15 20a

YS

L = 1.000 n = 4 c = 0

Inibidor; efetuador negativo

Ativador; efetuador positivo

Modelo Sequencial

A afinidade depende do número de sítio disponíveis. Cooperatividade positiva K2 < K1 Cooperatividade negativa K2 > K1 Cooperatividade resulta da influência de uma subunidade (acoplamento estrutural) sobre a outra. Forte acoplamento= simetria

S

S

S

S

+ S

+ S + S

+ S

K1

K1

K2

K2

A equação de Adair pode representar o modelo sequencial

Solução K1 K2 K3 K4 Hemoglobina 8.8 6.1 0.85 0.25 Hb+NaCl+BPG 97 43 11.9 0.09

Aumento de 35 vezes na afinidade entre ligação 1 e 4 Aumento de ~1.000 vezes na afinidade entre ligação 1 e 4 (~20 kJ/mol)

a1-b1 interface tem 35 pontos de interação Inteface a1-b2 tem 19 pontos de interação Na passagem deoxi-oxi alteram-se principalmente os contatos entre a1-b2 e a2-b1

Bases estruturais do mecanismo de funcionamento da Hemoglobina

Bom exemplo para o modelo de simetria concatenada

Ao “arrastar” o Fe, a His proximal também é “puxada” em direção do grupo heme. A simples aproximação do resíduo de His não é possível devido a um impedimento estérico entre a cadeia lateral deste resíduo e o próprio grupo heme. Esta aproximação só é possível devido a um “giro” na cadeia lateral. Como o resíduo de His está “bem empacotado” na hélice F, esta movimentação somente é possível com um deslocamento da hélice como um todo (Fig. 9-15 e 9-16).

Bases estruturais do mecanismo de funcionamento da Hemoglobina

Bases estruturais do mecanismo de funcionamento da Hemoglobina

A movimentação da hélice F (a1) leva a uma alteração da interface de contato (interações) a1-b2 (principalmente hélice C(b2) e alça FG(a1). A forma deoxi (T) e oxi(R) são estabilizadas por dois conjuntos de ligações de hidrogênio (diferentes, mas equivalente) (Fig. 9-19). A movimentação da hélice F faz a estrutura quaternária alternar entre estes dois mínimos (formas estáveis) possíveis. Estruturas intermediárias são menos estáveis devido a perda das ligações de hidrogênio. A maior “rigidez” (maior nº de interações) das interfaces a1-b1 e a2-b2 faz com que a movimentação em uma das interfaces (p.ex a1-b2) seja propagada para a outra inferface.

Bases estruturais do mecanismo de funcionamento da Hemoglobina

A alteração da estrutura terciária em uma subunidade da hemoglobina se propaga por toda a molécula, ou seja, a passagem de uma subunidade para o estado R leva todas as demais subunidade também para o estado R. No estado R, o átomo de Fe já se encontra posicionado para ligar o O2 sem a existência de impedimento estérico e com o comprimento de ligação de maior energia. Assim, o sítio de ligação já está preparado para ligar o O2, ou seja, tem maior afinidade pelo ligante. Se a forma deoxi (T) e oxi(R) são estabilizadas por dois conjuntos de ligações de hidrogênio (diferentes, mas equivalente), a passagem T à R é “guiada” pela energia proveniente da formação da ligação Fe-O2. Já na ausência de ligante a forma T é mais estável que R devido a um conjunto de ligações iônica envolvendo resíduos do C-terminal (a e b)