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ENZIMOLOGIA _______________________________________________

Pensa-se que não hajam enzimas solúveis, dado que os enzimas estão ligados ao citosqueleto, havendo múltiplas interacções. Também não se deve afirmar que existem enzimas isolados, pois as técnicas que existem não têm capacidade para detectar certas moléculas que se encontram perto do enzima. Hoje em dia, podem-se cristalizar enzimas sem estarem puros. Assim, como se fala em cristal não significa que o enzima esteja isolado. É a técnica de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) que permite estudar o enzima completamente isolado no seu meio ambiente. Por outro lado, é também importante usar enzimas o mais purificados possível para se poder detectar a verdadeira acção do enzima. Quando se efectua o processo de purificação, o enzima é solúvel. Um dos modos de fazer esta purificação é retirar o cofactor que activa o enzima. Por exemplo, uma situação em que é necessário estudar o enzima no seu ambiente, é quando se está a estudar como este se comporta numa via metabólica.

''Enzimas novos'': são enzimas que resultam após se removerem algumas moléculas e/ou se acrescentarem outras. Devido a estas modificações, verificam-se alterações na actividade do enzima.

A Genética Molecular é uma ferramenta importante em Enzimologia. A formação de enzimas novos permite que haja enzimas mais ''purificados'' e que não seja necessário utilizar uma grande quantidade de animais para um determinado estudo. Este procedimento pode ser, por exemplo, substituído através da utilização de leveduras, desde que se saiba a sequência de proteínas que se pretende obter. Deste modo, já não se fazem purificações através dos órgãos/ tecidos originais. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Nota: o problema do conceito de chave e fechadura é ser inflexível. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Através do estudo de cristais de urease por Sumner, soube-se que os enzimas são proteínas. Os enzimas são também catalisadores não biológicos. A enzimologia é reducionista pois o estado estacionário de fluxos metabólicos e de concentração de metabolitos na célula são propriedades do sistema. Por outro lado, o meio celular é heterogéneo e tem um elevado conteúdo em proteínas. Pensa-se que não há enzimas solúveis pois os enzimas estão ligados ao citoesqueleto e há múltiplas interacções.

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Novas moléculas com actividade catalítica?

Ribozimas; Anticorpos catalíticos; Enzimas artificiais.

Ribozimas

Os ribozimas são RNA que têm actividade catalítica. Correctamente, deve-se designar de RNA catalítico. 99,9 % das actividades que ocorrem na célula são catalisadas por enzimas. Os enzimas são proteínas e são catalisadores. Contudo, há catalisadores que não são enzimas, como os radicais. O RNA não é um enzima mas é um catalisador. Os ribozimas são moléculas que têm um potencial terapêutico e são utilizados como biossensores, para a evolução da função catalítica, genómica funcional e para a descoberta de novos genes. Os ribozimas são usados como aminotransferases, pois fazem a transferência de grupos amina. Anticorpos catalíticos

Os anticorpos catalíticos têm sido explorados in vitro e também são utilizados como

catalisadores. Os anticorpos catalíticos têm a capacidade de ligação (reconhecem moléculas) e são importantes para a construção do análogo do estado de transição que ocorre durante a catálise enzimática. Utilizam o anticorpo para formarem um composto muito parecido com o do estado de transição que é um estado muito reactivo.

E + A ⇔ EA* ⇔ EA, onde EA* é o estado de transição

Os anticorpos catalíticos são utilizados para destoxificação da cocaína. Com estes

anticorpos é possível tirar a cocaína de um organismo, pois transformam a cocaína por acção de anticorpos num composto muito parecido.

Anticorpos específicos são utilizados para se ligarem a determinadas substâncias e modificá-las para ficarem parecidos com a molécula do estado de transição.

Enzyme Mimics: “Enzimas artificiais”

Estas substâncias mimetizam a acção do enzima. São moléculas sintéticas de natureza

orgânica preparadas para recrear o centro activo do enzima. São preparadas para mimetizar as funções do enzima, mimetizar a reacção química (transformações químicas – ligações covalentes) e/ou reconhecimentos molecular.

Pretendem mimetizar a geometria. O centro activo está bem definido. Exemplo de dois sistemas catalíticos biomédicos:

Organocatálise com prolina;

Éteres de coroa de Koga.

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Estes enzimas artificiais servem para catalisar normalmente o passo inicial do processo. A dimensão também é importante para a ligação e para a libertação do produto.

Ciclodextrinas As ciclodextrinas servem de base para se construir o centro activo. Hoje em dia, são

muito utilizadas pois são baratas. Como são feitas a partir do amido são biodegradáveis. A ciclodextrina é um composto constituído por um anel com 6α, 7β ou 8γ resíduos de

glucose. Têm uma cavidade hidrófoba, estável e solúvel em água que pode ser modificada. Exemplo de aplicações:

A ligação de grupos imidazolo às ciclodextrinas funcionam como importantes catalisadores;

Transaminase artificial.

Criptandos

Os criptandos são ligandos multidentados que ligam catiões. Exemplo: hidrólise do ATP – mimetização do ATPase. Qualquer enzima tem um elevado poder catalítico (≈1017). Propriedades dos enzimas

Elevado poder catalítico;

Especificidade;

Capacidade de regulação.

Especificidade

Os enzimas têm especificidade variável.

Especificidade de ligação – baixa especificidade Exemplos de enzimas que pertencem a este tipo de especificidade: peptidases,

fosfatases, esterases. Ocorrem em vias degradativas.

Especificidade de grupo – especificidade intermédia Neste tipo de especificidade, o enzima já escolhe um tipo de molécula. Exemplo:

hexocinase.

Especificidade molecular – especificidade absoluta Exemplos de enzimas que pertencem a este tipo de especificidade: urease, o qual só é

específica para a ureia. Em substratos de maior massa molecular, há especificidade molecular por região.

Exemplo: endonucleases de restrição, que são específicas para uma determinada região.

Estereoespecificidade de grupo – especificidade elevada

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Este tipo de especificidade ocorre no ciclo do TCA. Consiste na especifidade do enzima em que apenas um dos isómeros da molécula é específico para com o enzima.

Nomenclatura e Classificação A partir de 1956 criaram-se regras para a nomenclatura de enzimas. E.C.: Enzyme Commission Os enzimas são classificados de acordo com o tipo de reacção que catalisam. Quando

se refere pela primeira vez o enzima, deve-se apresentar o nome sistemático, com o respectivo número EC e o nome trivial. A partir desse momento, já se pode tratar o enzima pelo nome trivial.

1º Algarismo: informa sobre a propriedade – o tipo de reacção Os enzimas são classificados com quatro algarismos. O primeiro algarismo indica o tipo

de reacção catalisada. Os restantes algarismos fornecem informações adicionais.

Liases: são sintases. Catalisam a reacção de substituição a outras substâncias através de duplas ligações;

Ligases: são sintetases. É necessário intervir ATP.

Exemplo: EC 1.1.1… Nome trivial: álcool desidrogenase Nome sistemático: álcool: NAD+ oxidoredutase No nome sistemático, primeiro escreve-se o dador : redutor ou aceitador na forma

oxidada. 2º Algarismo: informa sobre o tipo de dador que participa na reacção

Tendo-se um oxidoredutase, se se tiver 1.13, ou seja, se o segundo algarismo for um 13, significa que o oxigénio participa, ou seja, é um enzima que incorpora oxigénio. Se se tiver 1.13.11, tem-se um dioxigenase, pois o enzima incorpora dois átomos de oxigénio (2O). Se se tiver 1.13.12, tem-se um monoxigenase, pois o enzima incorpora um átomo de oxigénio (1O). 3º Algarismo: informa sobre o tipo de aceitador que participa na reacção No exemplo dado, significa que o NAD+ entra na reacção.

Oxidase: trata-se de oxidoreductase, pois o oxigénio é o aceitador;

Oxigenase: trata-se de um oxidorectase que trabalha com a incorporação de oxigénio, sendo o oxigénio um aceitador.

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Nome Sistemático: por regra, o nome correcto é: Dador (com H2):aceitador no estado oxidado.

Quando os cofactores participam na reacção, na nomenclatura sistemática, são aceitadores. No nome colocam-se na forma oxidada.

Nome trivial: é o nome recomendado. Há nomes triviais que não são recomendados pois são confusos e errados.

O 1ª algarismo:

EC1 oxidoredutases

Ex: desidrogenases, reductases, …

EC2 transferases

Ex: transferases, transaminases. Os transaminases são enzimas que fazem a transferência de um grupo amina para o

oxoácido.

EC3 hidrolases

Fazem a ruptura de uma ligação através da introdução de água. Se a reacção ocorrer sem necessitar de ATP não é um sintetase, é um sintase.

→

O nome sistemático do enzima hexocinase que catalisa a reacção apresentada é: ATP:

D-glucose 6-fosfato transferase. O 6 é a localização para onde vai. N-metil – a ligação faz-se a partir do átomo de azoto. Se não se indicar significa que é

através do átomo de carbono. Só os hidrolases é que podem ser substratases. Por exemplo, o protease é um enzima

que participa na hidrólise de proteínas. Os hidrolases pertencem ao grupo 3 e os hidroliases pertencem ao grupo 4.

EC4 liases Os liases catalisam reacção de adição à dupla ligação.

Os hidroliases são enzimas em que há a adição de água a uma dupla ligação. O sintase é, na maior parte dos casos, um liase. Dependendo da quantidade de Glutamina/Glutamato, o organismo sabe se deve ou

não produzir mais aminoácidos.

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O sintase também pode aparecer noutros grupos, como no grupo dos transferases. Os sintases porque fazem a adição de uma dupla ligação.

EC5 isomerases

EC6 ligases

Quando se nomeia um enzima pelo seu nome sistemático deve-se indicar a espécie ou tecido pois pode haver enzimas com o nome sistemático mas intervém em mecanismos diferentes.

Actividade enzimática: corresponde ao máximo que a amostra pode dar em relação ao enzima. Corresponde ao máximo da actividade molecular. O substrato tem de estar em excesso. O substrato tem de estar em excesso mas não pode estar em demasia porque pode haver inibição do enzima por excesso de substrato.

≠ Actividade molecular: depende da quantidade de substrato.

Nota: exercício de exame – é dada um reacção química e tem de se saber o nome sistemático do enzima ou vice-versa. Alguns estão nos slides.

ESTRUTURA DOS ENZIMAS Os enzimas são proteínas globulares mas com propriedades próprias.

A finalidade da obtenção das estruturas de enzimas é:

Fornecer informação acerca das propriedades catalíticas;

Proceder ao desenho racional de drogas;

Utilizar enzimas para fins estruturais.

Tendo-se um enzima na forma purificada pode-se:

Determinar a sua massa molecular relativa; Esta determinação pode ser feita através de ultracentrifugação, havendo a precipitação da proteína de acordo com o seu peso.

Determinação do nível de estrutura primário; Permite saber a sequência de aminoácidos na cadeia. Pode-se fazer por sequenciação directa ou sequenciação indirecta (através do DNA).

Estudos dos níveis de estrutura secundário, terciário e quaternário.

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Enzimas em solução Os enzimas, sendo proteínas globulares, estão em solução. No entanto, não estão

isolados. CD: Dicroísmo Circular (DC) em português. Através desta técnica podemos saber qual é

a estrutura secundária de uma proteína, se tem hélices α, estruturas β, entre outras. Os enzimas são moléculas com alterações conformacionais permanentes, não são

estáveis, devendo-se falar em conformação média no tempo. Os domínios do fosfoglierase são dois, que rodam 32º, excluindo a água. Isto é muito

importante para que o ATP se possa ligar a este enzima. Caso contrário, o enzima não é activo. Se não houver alterações conformacionais no enzima lactato desidrogenase, o NADH

não sai. A alteração conformacional/ estrutural, é o passo mais lento. Sem alteração conformacional, não ocorrem os passos seguintes.

Características estruturais dos enzimas

Os enzimas são proteínas globulares “empacotadas”, sem espaços livres. Praticamente, não se encontram moléculas de água dentro dos enzimas. A quantidade de moléculas de água dentro dos enzimas é muito menor do que nas proteínas globulares. As hélices-α são as estruturas mais estáveis. A mais comum é designada por 3.813, ou seja, há treze aminoácidos em cada duas voltas e isto repete-se 3,8 vezes. De um modo geral, a massa molecular é maior para enzimas mais complexos. Quando se tem uma estrutura com uma massa molecular relativa de 30 000, pode-se tratar de um enzima pequeno ou de uma subunidade de um enzima grande. Classificação de Clothia e Levitt:

Enzimas α: são apenas constituídos por hélices do tipo α;

Enzimas β: são apenas constituídos por hélices do tipo β;

Enzimas α/β: combinam estruturas α e estruturas β, as quais podem estar alternadas ou misturadas;

Enzimas α+β: estruturas β e hélices α separadas. Há blocos de hélices α e blocos de estruturas β. Não há alternância entre as estruturas.

Dependendo da função, as proteínas terão determinados arranjos e folds.

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FOLDING E UNFOLDING Folding é sinónimo de enrolamento e unfolding é sinónimo de desenrolamento. No

entanto, estas palavras não deve ser traduzidas.

Nos estudos de folding e de unfolding pretende-se saber:

Como perturbar a conformação;

Como readquirir essa conformação.

Um enzima enrolado estável é termodinamicamente semelhante a um enzima desenrolado.

As variações de energia entre o folding e o unfolding são de ordem de grandezas

mínimas. As diferenças de energia entre o centro activo de um enzima desnaturado e o centro de um enzima não desnaturado são muito pequenas.

Quando se desenrola um enzima, se os enzimas forem comstituídos por subunidades,

é necessário dissocia-las.

Modelo: Estado fold/ Estado unfold O fold é importante e existe nas proteínas. Um enzima no estado unfold, ou seja, desenrolado, mesmo que mantenha a sua estrutura perde a especificidade para ligandos. Uma proteína em fold tem todas as suas características funcionais. Do ponto de vista do enzima, muito se perde. O centro activo perde a sua função, quando o enzima fica num estado unfold. As chaperonas são proteínas que se ligam à proteína quando esta está a adquirir o fold e evitam que se formam estruturas não desejáveis. Corpos de inclusão: os corpos de inclusão são produzidos quando há a sobrexpressão de proteínas que não eram produzidas por um determinado organismo. Dois enzimas com a mesma função e com centro activo muito semelhante têm o mesmo folding? Não! Não se pode prever estruturas a partir da sequência de aminoácidos. Pode-se ter o mesmo folding e ter funções diferentes. A análise genética permite prever padrões geométricos de resíduos do centro activo. Estrutura a nível quaternário A maior pate dos enzimas têm um nível quaternário de estruturas, com interacções fracas entre eles. O nível quaternário de estrutura consiste numa associação de subunidades ou protómeros. Os oligómeros podem ser considerados como diferentes domínios numa cadeia polipeptídica.

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Se houver vários domínios numa cadeia polipeptídica, os domínios interactuam entre si por ligações fortes. Subunidade: nas subunidades há interacções fracas a nível quaternário, essencialmente. Domínio: consiste num conjunto estrutural de uma molécula de enzima ou proteína que pode envolver diferentes subunidades. Região que tem características particulares. Protómero: Por exemplo: Tetrâmero – tem 4 subunidades (azul) e pode só ter um domínio (amarelo)

Quanto maior for a evolução de um ser vivo, maior será a sua complexidade. O fosfofrutocinase é um tetrâmero, tem quatro subunidades. No entanto, em cada subunidade há dois domínios bem caracterizados. Este enzima catalisa a reacção cujos substratos são: 6-fosfato de frutose a reagir com ATP. Para que o fosfato de frutose actue é necessária a existência de duas subunidades para se ligar. Para o ATP é necessário a presença de uma subunidade de cada vez. Este enzima tem um centro catalítico, o qual regula a estrutura que implica as duas subunidades. O ADP funciona como efector positivo e o PEP funciona como efector negativo. Estes efectores ligam-se praticamente no mesmo local. No entanto, aos autores do artigo pareceu que a ligação do PEP implica as duas subunidades. Os autores descobriram que estas subunidades interactuam uma com a outra. Deste modo, concluíram que:

Há enzimas cujos centros catalíticos envolvem várias zonas do centro catalítico;

O centro catalítico pode abranger aminoácidos de duas subunidades distintas.

Por exemplo, o enzima aldolase tem duas subunidades que quando se dissociam fazem

provocam a inactividade do enzima.

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Quantas subunidades? Que tipo?

Estudos da Massa Molecular

O Cloreto de Guanidina actua nas ligações fracas que são as que mantém a estrutura quaternária.

Estudos cross-linking

O dimetilsuberimidato é um reagente que, quando em contacto com uma cadeia polipeptídica, une duas lisinas próximas. Esta ligação mantém-se após a desnaturação.

Ex.: Aplica-se o reagente dimetilsuberimidato a uma proteína nativa. Após a separação

com SDS, através da técnica de electroforese de SDS-PAGE, no gel que se obtém formam-se quatro bandas de intensidade crescente no gel de poliacrilamida. Neste exemplo, como as subunidades são todas iguais, significa que o enzima é um tetrâmero. A intensidade das bandas é proporcional ao número de ligações que cruzadas de lisinas.

No caso da proteína ser constituída por quatro subunidades, iguais duas a duas, pelo estudo da massa molecular obter-se-iam duas bandas e por cross-linking, obter-se-iam muitas bandas.

Desta forma, devem-se fazer vários estudos em paralelo para se proceder ao estudo correcto das estruturas das proteínas.

Na ligação de ligandos, deve-se utilizar o ligando em concentrações diferentes e, se

possível, testar vários ligandos. Como estão organizadas as subunidades? Para se saber como estão organizadas as subunidades, normalmente fazem-se estudos

de simetria por difracção de raios-X. O facto de o enzima se organizar num tetrâmero, por exemplo, é para haver um

maior contacto entre as subunidades, implicando uma maior estabilidade. Por outro lado, tem de haver também uma maior área superficial disponível, para que possa haver um maior contacto com o exterior.

O enzima aspartato transcarbamilase, ATCase, é um dos poucos enzimas descritos até

hoje cuja dissociação das subunidades, faz com que a subunidade catalítica exiba um gráfico hiperbólico.

Este enzima pode ser descrito da seguinte forma: (α3)2(β2)3.

(α3)2: significa que tem duas subunidades catalíticas; (β2)3: significa que tem três subunidades reguladoras.

Que forças existem para ligar as subunidades?

Cerca de 70% das interacções são não polares, como as interacções hidrófobas. Este tipo de interacções é fundamental a nível quaternário.

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Porque existe uma pequena margem que não são interacções hidrófobas? Porque há interacções iónicas e ligações de hidrogénios que são úteis para que a proteína consiga adquirir a simetria pretendida.

Qual o significado de múltiplas subunidades para o enzima? (pode sair em exame)

O facto de um enzima ter várias subunidades tem as seguintes vantagens:

Grande aumento da área superficial;

Aumento da variação da actividade catalítica;

Aumento da capacidade de regulação;

Aumento da estabilidade (no entanto, ainda não existem provas seguras que permitam afirmar que o facto de um enzima ter mais subunidades aumenta a estabilidade do mesmo).

As associação de subunidades geram grandes estruturas com determinada simetria, fazendo com que haja funções biológicas específicas, como a “economia específica”, e a probabilidade de erro é menor.

A célula tem menor probabilidade de errar na estrutura do enzima. Deste modo, é

muito importante o rigor genético da célula. Para a célula, fazer estruturas mais pequenas é mais seguro pois é menor a

probabilidade de erro. Porque são os enzimas tão grandes? A uma estrutura secundária estável correspondem cerca de 20 a 40 resíduos de

aminoácidos. As massas moleculares dos enzimas podem variar de 10000 a 1 milhão, o que significa

que podem variar entre 100 a 250 resíduos. Os enzimas também têm de ser grandes para terem capacidade para orientar os

substratos. Hipóteses:

A energia de activação baixa durante a catálise enzimática devido a flutuações da parte da proteína que é diferente do centro activo;

A catálise enzimática é tanto melhor quanto mais dificilmente o substrato entrar

dentro do enzima. O enzima garante a orientação do substrato em direcção ao centro activo.

As ligações ao acaso do substrato são úteis para levar o substrato em direcção ao centro catalítico;

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A velocidade de difusão é maior para estabilizar a molécula.

As interacções electrostáticas são úteis para estabilizar a molécula;

Quanto maior a actividade, maior a especificidade;

Localização dos enzimas na célula;

Os enzimas devem interactuar com outros enzimas.

A dimensão do enzima é importante para este ter uma área de superfície adequada para se ligar a múltiplos locais da célula.

Quanto maior for a especificidade de um enzima, maior o número de resíduos de

aminoácidos e, consequentemente, maior a dimensão do enzima. No entanto, não é de uma forma linear, é através do aumento do número de subunidades.

Os enzimas interactuam entre si e entre as estruturas. A área superficial depende do volume e é inversamente proporcional ao raio. Um enzima maior significa que tem uma maior área superficial. No entanto, não é com

o aumento do raio que se consegue um aumento da área de superfície. Por exemplo, O citrato cinase tem unteracções entre subunidades de área de 1670 Å2 num total de

área de enzima de 5800 Å2. Em 1983, Mathew et al. concluíram que para ver haver interacções adicionais era

necessário haver massas moleculares elevadas. Enzimas em sequência: os enzimas em sequência são importantes para a regulação pois estes enzimas interactuam entre si.

Os enzimas são associações supramoleculares.

ENZIMAS MULTIFUNCIONAIS ≠ MÚLTIPLOS ENZIMAS

Enzimas Multifuncionais: tratam-se de estruturas macromoleculares com diferentes centros catalíticos.

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Exemplo 1: Triptofano sintase Este enzima apresenta efeito de channeling: o produto da primeira subunidade não é libertado mas é aceite pela segunda subunidade como substrato, o que permite uma maior eficiência do processo. Certos investigadores modificaram uma estirpe de levedura para que este enzima não apresentasse efeito de channeling. Para isso, foi necessário induzir uma mutação de modo a que as subunidades não estivessem ligadas, não havendo interacções. Do estudo realizado, o gráfico experimental foi semelhante ao apresentado em baixo:

O enzima wild-type, apresentou uma curva do tipo da representada pois há efeito de channeling. A reacção que ocorre quando se verifica este efeito é a seguinte:

Com as subunidades ligadas não se detecta a formação de indolo porque este é logo utilizado pela segunda subunidade.

O enzima mutado, apresentou a curva do tipo da representada pois não se verifica o

efeito de channeling, dado que houve a dissociação das subunidades. Sendo assim, não havendo este efeito, não há a formação de Trp numa primeira fase pois o substrato (produto do primeiro centro catalítico), o indolo, tem de acumular para que a segunda subunidade o possa utilizar como substrato. Assim, só depois de isto ocorrer é que há o aumento da actividade enzimática. Sem efeito, ocorrem as seguintes reacções:

Reacção 1:

Reacção 2: Sem efeito de channeling, estas reacções ocorrem de um modo independente. Para a

reacção 2 ocorrer, é necessário que o produto da reacção 1, que é o substrato da reacção 2, o indolo, esteja em quantidades significativas.

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Exemplo 2: Lactose sintase αβ Este enzima tem duas subunidades, a subunidade α e a subunidade β. A subunidade α ajuda o enzima a ser específico. No entanto, não tem propriedades

catlíticas. Quando o enzima tem esta subunidade, a α-lactalbumina, há uma alteração da sua especificidade e o enzima fica activo para formar lactose com esta subunidade.

A subunidade β, β-galactosiltransferase faz a biossíntese de glicoproteínas e sem estar

associada ao enzima catalisa a seguinte reacção:

No entanto, para haver a produção de lactose, o enzima precisa de ambas as subunidades para que ocorra a seguinte reacção:

A glucose é agarrada pela subunidade α. Deste modo, apesar do enzima poder

funcionar sem a subunidade α, a subunidade β não consegue captar sozinha a glucose. Assim, é a subunidade α que funciona como subunidade reguladora na medida em que activa a subunidade β.

COFACTORES Os cofactores podem ser:

Coenzimas: os quais sofrem modificações durante o processo catalítico;

Vitaminas;

Iões metálicos, como Cu, Mn, Mg, ...;

Moléculas orgânicas, como os fosfatos, flavina, heme,...

COENZIMA ≠ GRUPO PROSTÉTICO

Grupo prostético: tem-se um grupo prostético quando a entidade cofactor está ligada covalentemente à estrutura do enzima. Estes cofactores têm a particularidade de seres regenerados após um ciclo catalítico. Coenzimas: são aquele que sofrem modificações durante o processo catalítico. Podem ser moléculas que fazem a transferência de grupos ou que participam em reacções de oxidação-redução. Estas entidades entram e saem durante a catálise. Como exemplos tem-se: NAD, FAD,... As vitaminas podem ser lipossolúveis ou hidrossolúveis. Há ainda um terceiro grupo que não se insere nem em proteínas lipossolúveis nem em hidrossolúveis. Resposta a pergunta para exame: o metal tem como função actuar durante o mecanismo de catálise. O facto de ter diferentes estados de oxidação faz com que a versatilidade do mecanismo seja maior.

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Relação do metal com o enzima: Existem enzimas que têm metais na sua estrutura. É importante para a estrutura da proteína. O metal é introduzido durante o processo de síntese. Há uma diferença entre metaloenzima e enzima activado por um metal em termos de constantes de activação. Um metaloenzima é um ião metálico que faz parte do centro catalítico do enzima. Mecanismos de catálise enzimática Em geral, a catálise enzimática representa um mecanismo complexo. Quando se junta um enzima com um substrato, há complexos de transição que se formam e têm diferentes velocidades de transição. O que comanda esta velocidade é a transição que ocorre mais lentamente. Em termos de estratégia de catálise, é necessário ter em conta o efeito de proximidade e o efeito de orientação. A catálise ácido-base é muito mais rápida que as outras e permite a introdução de protões durante a catálise. Na maior parte dos enzimas, o centro catalítico envolve praticamente toda a estrutura, como, por exemplo, no citrato cinase. Os enzimas misturam, a diferentes tempos, diferentes mecanismos de catálise, como é o caso de um enzima muito estudado, o lisozima.

PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS - ASPECTOS GERAIS Ao longo do processo de purificação é necessário fazer-se um quadro de purificação. É necessário que haja uma grande quantidade de enzima na fonte permitindo obter

rendimentos altos. Quando se quer produzir cópias de um gene, coloca-se num vector em E.coli para que

as cópias sejam produzidas por este organismo. A presença de inibidores de proteases evita que haja a degradação de proteínas. Deve-se usar tampões adequados para manter as proteínas activas e em bom estado

de conservação. Como avaliar o sucesso de um processo de purificação?

SDS-PAGE;

Tabela de purificação.

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Escala analítica:

Electroforese: permite saber se há enzima puro ou se há contaminações;

Focagem isoeléctrica;

HPLC. A espectrometria de massa permite ver se a proteína tem ou não modificações pós-traducionais. Análise da actividade catalítica: Ao longo do tempo, a actividade específica aumenta à medida que o enzima vai sendo cada vez mais purificado. A quantidade de proteína total diminui, tal como o volume total. Se a actividade específica não aumentar, significa que durante o processo de purificação se perdeu o enzima de interesse. Podem-se adicionar detergentes ao tampão quando se quer saber se o enzima é hidrófobo ou se se localiza nas regiões membranares. Se o enzima tiver muitas modificações pós-traducionais devem-se utilizar estratégias para que se consiga obter o enzima purificado sem que essas modificações ocorram. A purificação deve ser mantida o mais simples possível.

PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS - EXEMPLOS Purificação do adenilato cinase do músculo de porco: (Anos 60/ 70) Na altura, pensava-se que ter um enzima em cristal significava que o

enzima estava puro. (Anos mais tarde) O marcador vai ser a resistência à canamicina. A indução foi feita a

partir de 1 L de cultura. Só as proteínas que têm uma cauda de His é que vão agarrar à coluna. Num processo de purificação quanto menos etapas se fizer melhor, pois permite

aumentar o rendimento do processo, conseguindo-se diminuir as perdas de enzima. O sulfato de amónio permite a precipitação de proteínas de um modo gradual. Assim,

com o aumento da quantidade de sulfato de amónio, as proteínas vão precipitando gradualmente.

E se o enzima for secretado para o meio extracelular? As bactérias Lactobacillus produzem α-amilases que enviam para o meio extracelular.

Assim, pode-se purificar o enzima de interesse a partir do meio extracelular.

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Experiências com Leishmania infantum

Glioxilase I e II: Houve uma grade expressão de proteínas insolúveis a 37 ºC, durante 3 h. A 15 ºC, durante 16 h, verificou-se que a maior parte das proteínas estava na fracção solúvel. No entanto, a quantidade nesta fracção era menor do que a 37 ºC, t = 3 h, na fracção solúvel. Assim, os autores escolheram fazer os ensaios a 37 ºC, t = 3 h, pois tinham uma maior quantidade de proteínas na fracção solúvel, apesar de haver uma grande quantidade de proteínas na fracção insolúvel.

Aldolase redutase: O enzima foi todo expresso na fracção insolúvel, encontrando-se nos corpos de inclusão. Foi necessário mudar de sistema de expressão e de vector. A utilização de um promotor indutível permite que haja uma expressão controlada. Assim, foi utilizada a expressão com levedura para se verificar se existia de facto o gene que se queria expressar. Posteriormente, após se ter verificado que este enzima era expressado pela levedura, utilizou-se um plasmídeo que tem o gene de interesse que vai ser expresso pela bactéria. A proteína apareceu na fracção solúvel, pois já tinha chaperonas para promoverem o folding correcto.

E se o gene não estiver no genoma?

Heme oxigenase:

Este enzima degrada o hemo para haver a libertação de Fe. Como a L. infantum não sintetiza o hemo, quando infecta outros organismos, faz com que este processo se dê, obtendo Fe que é necessário para a sua sobrevivência. IEX - cromatografia de troca iónica; HIC - cromatografia de interacção hidrofóbica.

INTRODUÇÃO À CINÉTICA A hipótese do quase equilíbrio é um caso particular da hipótese do estado

estacionário. Pode-se ignorar k2. A temperatura influencia a velocidade da reacção. Nestes estudos, houve três teorias importantes:

Equação de Arrhenius;

Teoria da Colisão;

Teoria do Estado de Transição.

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Q10: consiste no aumento da actividade de um enzima quando a temperatura aumenta 10 ºC. Mecanismo de Catálise Enzimática A notação de Cleland é a mais fácil de ser usada. Nesta notação, o enzima representa-se por uma linha e todas as formas do enzima são representadas por baixo dessa linha. Na anotação de Ainsworth tem-se, por exemplo: (Y1),(GX1),(11),(1X),(1GY)=

Nesta notação, o enzima representa-se pelo número 1. (Y1),(GX1) - representa o enzima mais o ligando. (11) - isoenzimas do enzima. = - a reacção é reversível. No mecanismo de Theroell-Chance, não há detecção, em laboratório, do intermediário da reacção. Trata-se de um mecanismo de catálise específica dos álcoois desidrogenases de cadeia curta. Mecanismo de Theorell-Chance Bibi: a partir de dois substratos formam-se dois produtos. Não há intermediário detectável. Quando se quer estudar um enzima, deve-se colocá-lo sempre na presença de NAD, para enzimas, como é o caso dos desidrogenases, que são dependentes do NAD. Com o enzimas dependentes de FAD, ocorre o mesmo. CINÉTICA ENZIMÁTICA - PARTE 1 "Enzyme kinetics: partial and complete uncompetitive inhibition" - ler o paper para o exame Invertase é o nome trivial do hidrolase que catalisa a reacção:

→

"O invertase combina-se com o açúcar". - Primeira referência à associação de enzima

com substrato.

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Michaelis e Mente definiram a equação de quase equilíbrio ou de equilíbrio rápido.

Foram os primeiros a utilizar tampões e a estudar velocidades iniciais. Kd é a constante de dissociação do complexo EA. A0 = A + E No entanto, pode considerar-se que A0 ≈ A, quando a [E] << [A], para a determinação

de uma velocidade inicial, quando ainda não há a formação de produto ou a reacção está tão no início que esta formação pode ser desprezada.

O modelo de Van Slyke foi o primeiro modelo que utilizou a hipótese no estado

estacionáro para o estudo de um enzima. Quando se escreve uma equação de parâmetros enzimáticos igual a zero significa que

esta se encontrava no estado estacionário. [E]0 - quantidade de enzima livre. V: velocidade limite. limite para que tende a velocidade inicial com o aumento da

concentração de substrato. a = [A] [A] - concentração do 1º substrato [B] - concentração do 2º substrato kcat - é considerada uma medida de eficiência catalítica de um enzima. Uma das primeiras coisas a fazer num estudo cinético é: varia a quantidade de enzima

para concentrações de substrato constantes e ver se a velocidade é linear variando-se a concentração de enzima. Isto permite saber se o enzima tem ou não um comportamento michaeliano. (No teste pode sair uma pergunta do tipo: "elabore um protocolo experimental para caracterizar um enzima")

Para 99 % dos enzimas estudados, pode aplicar-se a hipótese do estado estacionário. CINÉTICA ENZIMÁTICA - PARTE 2 No estado pré-estacionário, a variação do complexo intermediário EA encontra-se

praticamente constante. Quanto maior for a distância entre a [E] e a [A], maior a probabilidade de se atingir o

estado estacionário (considera-se que se atingiu este estado quando a ordem é de 103). Para intervalos de tempo superiores a 5 ms, a expressão é aproximadamente zero,

podendo-se admitir que se está no estado estacionário.

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Eficiência "A proficiency enzyme science" - ler o paper para estudar para exame. Qual é o papel da enzima? A eficiência do enzima é a capacidade que o enzima tem de catalisar uma reacção para

além da velocidade não catalizada. O que é mais difícil? Acelerar um processo lento ou rápido? A importância do enzima é não catalisar todas as reacções mas apenas uma reacção

específica. A constante de especificidade é dada pela seguinte expressão:

A constante de especificidade é um parâmetro que se utiliza para se saber a

especificidade de um enzima. Quanto maior for o valor da constante de especificidade, maior será a especificidade

do enzima para a reacção. O que torna um enzima eficiente é a sua especificidade para uma determinada

reacção. Um enzima muito eficiente dificilmente reconhece o produto da reacção que catalisou,

não catalisando a reacção inversa. Knc - constante da reacção não catalisada. Km - constante de equilíbrio.

A ornitina descarboxilase, como tem um

é maior do que para o outro enzima,

este enzima é mais eficiente. Se o valor de Km for baixo, a concentração de enzima-substrato é elevada em relação à

concentração de enzima e em relação de substrato. Assim, a ligação enzima-substrato é forte e a catálise enzimática é também forte.

Deve-se evitar falar de afinidades quando se fala de valores de Km. Quando o valor de kcat é elevado, permite saber se as reacções são rápidas. Este

parâmetro indica o número de moléculas transformadas por quantidade de substrato consumido.

105 - a partir desta ordem de grandeza pode considerar-se que há catálise. Enzimas que tenham uma razão kcat/Km de, aproximadamente, 107 e 108, designam-se

por "enzimas maravilha", pois estas ordens de grandeza correspondem às ordens de grandeza da velocidade de difusão do substrato.

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A maior parte dos enzimas não possui estes valores tão elevados. A razão kcat/Km do fumarato é maior que a razão kcat/Km do fluorofumarato, pelo que é

o substrato mais específico. Qual o substrato mais específico? - pergunta que pode sair no teste Aqui, coloca-se o problema da inibição nesta questão, variando a resposta consoante a

concentração de substrato. Quando há dúvidas acerca do substrato, pode fazer-se o seguinte ensaio: um dos

composto funciona como substrato e o outro como inibidor e fazem-se concentrações crescentes de inibidor. Posteriormente, faz-se o inverso, o que funcionou como inibidor funciona agora como substrato e o outro composto funciona como inibidor. Isto permitirá saber qual é, de facto, o substrato preferencial.

Quando o valor de kcat é elevado, há competição por inibição nesta situação, pelo que

a reacção é mais rápida quando a concentração de substrato é mais elevada. Linearizações Método de Lineweaver-Burk: é considerado um mau método.

Os resultados aparecem mais condensados na

região apresentada e deve-se trabalhar numa zona mais acima.

Como por este método é feita a inversão dos

valores, os erros que eram pequenos passam a ser maiores.

Por outro lado, a variação das concentrações

de substrato que era regular, quando se inverte, torna-se irregular e daí obter-se um conjunto de pontos concentrados numa região que não era esperada.

Para uma melhor aplicação deste método, em laboratório, o protocolo experimental

deve ser adaptado. Assim, devem fazer-se os cálculos para 1/[A] e não para [A] e realizar uma gama alargada de replicados na zona onde os resultados não vão ficar condensados, diminuindo-se assim os erros associados a este método.

CINÉTICA ENZIMÁTICA - PARTE 3 O valor do coeficiente angular máximo corresponde ao valor do ponto de inflexão. Gráfico de Hanes ou Woolf Representa a/V em função de a. a - concentração de substrato Entre os três métodos de linearização, este é o mais correcto.

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Método de Eadie-Hofstee Representa v em função de v/a. Este método tem alguns problemas. Comparação de Resultados O método de Hanes é o melhor método. Neste método, a variação da distribuição do

erro é menor e é homogéneo ao longo da linha. No método de Lineweaver-Burk, maiores valores de 1/a têm uma distribuição de erro

menor. No método de Eadie e Hofstee, se a distribuição de erro der linear, trata-se de um

modelo michaeliano. Se de curvo, o modelo não é michaeliano. Regressão não linear: Graficamente, a regressão linear coincide com a distribuição de erro, o que coincide

com os dados da distribuição de erro pelo método de Hanes. Regressão "hiperbólica": Equação experimental de Michaelis-Menten:

Esta equação não é linearizável. Critérios dos mínimos quadrados À partida, a distribuição tem de ser gaussiana ou normal. Sempre que se faz a média e se calcula o desvio padrão, admite-se que estes critérios

são válidos. No entanto, estes critérios são válidos se as concentrações de substrato forem mínimas.

Métodos não paramétricos: Estes métodos só exigem a condição número 5 dos critérios anteriores. Método directo (Eisenthal e Cornish-Bowden) Embora seja um método fácil de usar, considera variável o que é constante e o que é

constante como variável. Os valores mais prováveis correspondem à mediana dos valores de Km e de V. Qualquer outlier pode ser ignorado. No entanto, também se pode considerá-lo porque

o objectivo é fazer-se a mediana. Os outliers não vão influenciar o valor da mediana.

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Quando há intersecção no 2º quadrante, tem-se um valor facial. Este valor deve ser considerado como ele mesmo. Pode desaparecer se se alargar o intervalo de concentrações usadas.

A intersecção no 3º quadrante pode ser devida a um erro sistemático ou ao facto de o

enzima não seguir uma cinética michaeliana. Este resultado é necessário ser verificado. Se após a repetição do ensaio continuar a aparecer este resultado, considera-se como sendo um ponto no infinito ( ou ).

A mediana de intervalo de valores corresponde ao ponto intermédio. Melhoramento ao método directo por Eisenthal: Para melhorar o método directo, Eisenthal propôs uma representação de 1/V por

Km/V. Com uma representação deste tipo, os pontos que apareciam no 2º e 3º quadrantes deixam de aparecer.

Em relação ao método anterior não tem grandes vantagens pois é necessário fazerem-

se cálculos. MECANISMO REVERSÍVEL DE MICHAELIS-MENTEN Considera-se que a velocidade é da reacção no sentido directo.

Nota: No exame - saber deduzir todas as expressões deste mecanismo e de outros.

Relação de Haldane Relaciona as constantes de equilíbrio com as constantes de especificidade. kcat f - forward kcat r - reverse Km - indica apenas uma relação de V em relação a A. Enzimas "One-Way" São enzimas que catalisam reacções apenas em um sentido. Os enzimas reguladores

são, normalmente, deste tipo. Porque se podem designar por enzimas "one-way"? (São apenas propostas)

(ver slide)

Do ponto de vista prático, a célula não deixa que haja a acumulação de produto, evitando que a reacção inversa ocorra;

Do ponto de vista metabólico, o enzima não evoluiu no sentido de catalisar a reacção inversa;

Não há a possibilidade de desenhar estruturas que catalizem as reacções em ambos os sentidos.

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No caso dos mecanismos ping-pong, os enzimas catalisam as reacções em ambos os sentidos. Nota: ter em atenção às duas últimas frases que aparecem no final deste capítulo nos slides - comentar no teste.

INIBIDORES O melhor inibidor é o que tem como alvo o estado de transição. Com um inibidor reversível não se consegue eliminar completamente a actividade do enzima. Na inibição linear, os parâmetros de inibição variam linearmente com a concentração de inibidor. Se um inibidor for hiperbólico, variando-se as concentrações, pode-se conseguir um inibidor linear, por exemplo, quando se estudam drogas e se quer estudar a inibição, podem utilizar-se intervalos de concentrações muito curtos. Neste tipo de situações, o inibidor é linear. A inibição não competitiva pura é um caso particular da inibição mista. Na inibição mista varia V e Km e, consequentemente, V/Km. Na inibição não competitiva pura, não varia o Km e varia apenas o V, variando V/Km. Anti-competitiva (deve dizer-se assim e não incompetitivo) - uncompetitive Não competitiva - non-competitive Ki - constante de dissociação do complexo Kii - constante de dissociação do complexo ternário EAI. Estas duas constantes são iguais na inibição não competitiva pura. Na inibição competitiva, Kii = 00, porque se admite que não se forma o complexo EAI. Para deduzir uma equação empírica que explique o comportamento de um inibidor anti-competitivo, do ponto de vista do modelo tem de haver restrições, pelo que o enzima não se pode ligar ao inibidor na forma livre. Inicialmente, o enzima deve sofrer uma modificação. Não há a possibilidade de haver a formação de complexos EI e apenas se podem forma complexos EAI. Se o inibidor só se liga a EA para formar EAI, então pode ocorrer (em termos de reversibilidade):

No entanto, segundo o modelo, o produto EI não se pode formar. Assim, é como se houvesse uma maior afinidade do complexo A para o enzima na presença de inibidor e é como se o A estivesse impedido de sair. Isto permite verificar a artificialidade do modelo.

Um modelo deve explicar o comportamento cinético gráfico e antes de se idealizar um modelo, deve-se primeiro realizar a experiência em laboratório. A inibição anti-competitiva é rara.

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INIBIÇÃO DA ACTIVIDADE ENZIMÁTICA Inibidores Reversíveis ou Irreversíveis A actividade catalítica diminui na presença de um inibidor reversível. Inibição competitiva: a velocidade limite mantém-se constante e afecta a constante de especificidade (Km). Assim, pode-se também designá-la por inibição específica. Inibição anti-competitiva: a velocidade limite é afectada e a constante de especificidade mantém-se constante. Assim, pode-se também designá-la por inibição catalítica. Com um ligeiro aumento da concentração de substrato pode anular-se o efeito do inibidor. Modelo da inibição competitiva Segundo o modelo da inibição competitiva, o inibidor competitivo liga-se ao enzima. No entanto, se a concentração de substrato for muito maior que a concentração de inibidor, o efeito do inibidor pode acumular-se. Modelo da inibição anti-competitiva Segundo este modelo, o inibidor deve estar ligado à forma modificada do enzima, não se consegue ligar ao enzima livre. Esta forma modificada foi induzida e provocou uma alteração conformacional. Segundo Michaelis-Menten tem-se:

E+A EA E+P

Assim, é provável que o inibidor se ligue a EA para formar EAI. No entanto, na realidade, o inibidor vai ligar-se a um enzima modificado (E'). A inibição não competitiva e anti-competitiva são raras! Inibição mista Geralmente ocorre aqui a inibição por produto. Análise da inibição (e cálculo de Ki e Kii Gráficos do método directo: Linhas pretas: sem inibidor. Linhas coloridas: com inibidor.

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Tipo de inibição Gráfico de Dixon (determinar Ki) Gráfico de Cornish-Bowden

(determinar Kii)

Competitiva 1/v0 vs [I]

Intersecção no 2º quadrante Não há

distinção

[A]/v0 vs [I] Padrão de rectas paralelas

Mista Intersecção no 2º

quadrante Intersecção em um ponto no 2º

quadrante

Anti-competitiva Padrão de rectas paralelas Interesecção no 2º quadrante

Nota: é obrigatório fazer o gráfico de Dixon e de Cornish-Bownden para se poder concluir acerca do tipo de inibição. Quando a concentração de substrato, [A] aumenta muito:

Há dificuldade em dissolver os compostos;

Implica custos maiores;

Pode haver inibição pelo substrato. 3 Km máximo de substrato que se deve utilizar para que não se verifique inibição pelo substrato. A maior parte das drogas não são inibidores competitivos. Quando se pensa num composto e pretende-se torná-lo numa droga, tem de se verificar se naquele local específico há um transportador para a droga. Se não existir este transportador, não pode ser uma droga. DEDUÇÃO DA EQUAÇÃO DE VELOCIDADE DE ESTADO ESTACIONÁRIO Método de King e Altman E0 – Determinante global (resulta do somatório de todas as espécies); 1º Identificação das espécies enzimáticas; 2º Dividir pelo somatório de todas as espécies (E0) e desenhar a figura geométrica que corresponde às espécies envolvidas. Quando se tem três espécies enzimáticas, tem-se um triângulo. Põe-se em cima da seta o que leva a passar de uma espécie para a outra. Desenha-se o diagrama de acordo com os fluxos que originam E. Como é para a formação de E, não pode haver fluxos divergentes, apenas convergentes. K-3 retirou-se do modelo propositadamente. Do ponto de vista esquemático, quando falha um, elimina o padrão.

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A partir do passo 5, já não corresponde ao modelo. Aplicação: (Exercícios propostos – resolver para o exame) CINÉTICA DE REACÇÕES COM DOIS SUBSTRATOS OU MAIS… A concentração de substrato tem de ser elevada. No entanto, não demasiado elevada para não se tornar inibitória. Double displacement ou não sequencial: libertação de produtos antes da ligação de todos os substratos. Considera-se um sistema de dois substratos:

Sequencial ordenado: primeiro entra o A e depois entra o B;

Equilíbrio rápido random bibi: tanto faz entrar primeiro o A ou o B;

Theorell-Chance: embora se forme, a formação do complexo ternário é tão rápida que não se detecta, do ponto de vista cinético. Aplica-se a álcoois desidrogenases de cadeia curta.

Exemplo: o cofactor tem de ser sempre ligado/adicionado primeiro ao enzima antes do substrato, mesmo em laboratório é assim que se faz (importante!!). Mecanismo: Primeiro, liga-se o enzima. Após a ligação do enzima, pode primeiro entrar ATP e depois a creatina ou pode ocorrer ao contrário e o mesmo ocorre na saída dos produtos. Mecanismo ping-pong: não é um mecanismo uni-uni porque o enzima não se encontra como no início. As diferentes linhas têm ordenadas n origem.

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O coeficiente angular tem incluído nele a concentração de produto. A introdução do produto num sistema com inibição só altera o denominador pois é no denominador que se localiza o inibidor. O tipo de inibição por produto, para mecanismo em que a quantidade de produto se mantém constante, o tipo de mecanismo é de hibridação ordenada. Equilíbrio de Dolziel: equilíbrio formado por mecanismos de dois substratos. SIMULAÇÃO DE MEANISMOS ENZIMÁTICOS Quando há o aumento da concentração de enzima, deixa de se ter uma recta e passa-se a ter uma curva, sendo difícil determinar-se a velocidade.

Assim, temos de criar situações para termos rectas, recorrendo-se à simulação. A concentração de enzima deve ser suficientemente baixa em comparação à concentração de substrato. Inicialmente, não se considera a existência de um estado estacionário. Posteriormente, é que se verifica se é possível

existir ou não esse estado estacionário. No gráfico PLAS, implicitamente no eixo dos xx está o tempo. Simulação:

e = [E] Descrição das equações diferenciais subjacentes: (dependo do mecanismo enzimático a utilizar) A’ = -vf1 + vr1 vf1: velocidade dos reagentes (velocidade de formação do complexo) vr1: velocidade dos produtos para os reagentes A = …… (condições iniciais) O enzima, no início, deve estar em quantidades mínimas. tf: tempo final. Tem de se determinar um tempo para o final do ensaio, pois a constante de tempo não pode ser infinita. Npoints: número de pontos que obtemos ao longo do tempo. Temos de ter muitos pontos para se obter uma curva bem definida. O complexo nunca atinge uma concentração maior que o própria enzima.

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!!: filtro do interesse. Ex.: !!APEC = “Estou interessado em ver exclusivamente as curvas do APEC. Simulação 2: Varia apenas a escala do eixo dos yy. O complexo ES forma-se muito rapidamente. No final da reacção, o E livre é regenerado. Simulação 4: O complexo tem uma variação complementar ao do enzima livre. Simulação 5: Período pré-estacionário A – decresce rapidamente mas a variação é muito pouca e mantém-se constante. Simulação 6: Diminuição drástica da quantidade de substrato inicial. Nota-se uma zona bifásica. É mais fácil determinar a velocidade inicial pela formação de produto. Simulação 7: O que ocorre ao E nestas condições. O E livre nunca chega a zero. Desde o início, regenera-se como E livre. Por estes resultados, pode dizer-se que não há a formação do estado estacionário nestas condições. Não é necessário que a hipótese do estado estacionário para se estuda velocidades iniciais. A hipótese do estado estacionário é eliminada quando se diminui a quantidade de substrato inicial. Simulação 8: Aumento drástico da concentração de enzima. Assim, é mais barato diminuir a concentração de substrato (em termos práticos). Os resultados indicam que se se a aumentar a concentração de substrato (A), é possível afastarmo-nos da hipótese do estado estacionário. Simulação 9: Mecanismo a ser simulado: há a formação de dois complexos (observando as equações diferenciais). Não existe um único passo EA que origine o produto. Kf2 = Kr2 O mecanismo de catálise não define se a reacção é ou não irreversível. K2: define o passo irreversível. Simulação 10: Conclusão: Se [A] >> [E], então, verifica-se a hipótese do estado estacionário. [C1] >> [C2]

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ENZIMOLOGIA IN SITU [proteína]intracelular ≈ 100 mg/mL (na maior parte das células) In vitro: ↓[proteína] ↑[substrato] In vivo: ↑[proteína] ↓[substrato] Utilizando-se NMR consegue medir-se a concentração de quase tudo. É necessário preservar a concentração celular dos enzimas. Como permeabilizar a célula de um modo suave? É necessário ter em conta a concentração de proteína exposta ao meio reaccional. O azul de Comassi é constituído por três espécies principais e por nove espécies secundárias. A digitonina é insolúvel em água à temperatura ambiente. Também é um composto termoestável. Assim, na preparação da digitonina deve aquecer-se a água e adicionar-se a digitonina em água quente para que seja solúvel. Tem de se utilizar agitação. Caso contrário, há sedimentação da levedura na cuvette. METABOLISMO DO GLIOXALATO Estão presentes dois enzimas para os quais é necessário glutationo. O glutationo II é o substrato de uma reacção irreversível. Quando se faz um homogenato, há libertação de grande quantidade de protéases. BIOCATALISADORES E ENZIMAS AMBIENTAIS Há muitos enzimas que não são inibidos pela concentração de substrato. É necessário assegurar que os substratos entrem dentro das células. Uma das vantagens de se usarem enzimas como catalisadores é ter-se poucos ou nenhuns subprodutos. A estéreo-especificidade consiste nos isómeros reconhecerem isómeros de enzimas. O enzima fora da célula é instável. Os enzimas necessitam de cofactores e de ser regenerados. Como alternativa, pode fazer-se uma reacção acoplada.

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IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS Um enzima só cristaliza se todas as moléculas estiverem orientadas no mesmo sentido. O carrier não se deve degradar com o tempo, nem na presença, pelo menos, dos reagentes do ensaio, nem com as alterações de temperatura a que a experiência se vai desenvolver. É importante que o enzima esteja bem ligado ao suporte para que o substrato se ligue eficientemente ao enzima. O uso de glutaraldeído permite aumentar a quantidade de enzima disponível. A dimensão da malha da acrilamida determina o tamanho dos enzimas que ficarão presos aos poros do gel. ENGENHARIA DE PROTEÍNAS O futuro da engenharia de proteínas passa por juntar o desenho racional com a evolução dirigida, ainda que seja necessário ter equipamento para que esta junção se torne possível. ENGENAHRIA DAS VIAS METABÓLICAS O succinato entra no TCA (ciclo dos ácidos tricarboxílicos) estando constantemente a ser produzido e eliminado. A artemisina é uma droga anti-malárica. REGULAÇÃO DA ACTIVIDADE ENZIMÁTICA Na velocidade limite não há regulação. A célula distingue o tipo de fosforilação/desfosforilação, consoante o tipo de aminoácido que é atacado. Há aminoácidos envolvidos em modulação enzimática por fosforilação/desfosforilação. Pode ter-se cooperatividade numa única proteína como um protómero. Quando não há cooperatividade, tem-se uma hipérbole (Michaelis-Menten). Cooperatividade: alteração conformacional que induzem alterações de actividade. Cooperatividade negativa: a sigmoicidade quase desaparece. Presença de um efector positivo. Quando aumenta a concentração de efector positivo, o enzima está muito activo, estando pouco regulado. Se o enzima está activo, está pouco regulado. Cooperatividade positiva: a sigmoicidade aumenta. Este enzima está mais regulado e há uma menor quantidade activa. Há a presença de um efector negativo.

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A hemoglobina tem de ligar o oxigénio quando a pressão de oxigénio é maior e libertá-lo quando a pressão de oxigénio é menor. Normalmente, há duas ou três moléculas de oxigénio ligadas à hemoglobina, que é um número adequado para que haja maior cooperatividade e maior regulação. K0.5: constante de semi-saturação. H = 1: indica que não há cooperatividade. Equação de Hill = Equação de Michaelis-Menten. H > 1: cooperatividade positiva. H < 1: cooperatividade negativa. MODELOS EXPLICATIVOS

Modelo de Hill

Este modelo implica que ou estão todos os centros activos do enzimas livres ou estão todos com ligandos.

n – não é um número inteiro e não tem a ver com os centros de ligação. h – coeficiente de Hill. Indica se há ou não cooperatividade. Quando o h diminui, o Ra aumenta e tem-se cooperatividade negativa. Quando o h aumenta, o Ra diminui e tem-se cooperatividade positiva.

Modelo de Adair Supõe-se que existem dois centros de ligação no enzima. Este modelo soluciona o problema do modelo de Hill. São as constantes de cooperatividade intrínseca que ao variarem permitem explicar a cooperatividade. Se o valor de K aumentar, tem-se cooperatividade negativa. Se o valor de K diminuir, tem-se cooperatividade positiva. Exemplo:

Tetrâmero sem ligandos Tetrâmero com um ligando ligado há quatro possibilidades Tetrâmero com dois ligandos ligados há 6 possibilidades

Hill e Adair definiram cooperatividade de maneiras diferentes. A equação de Adair tem mais significado físico dado que é mais adequado pensar-se que os ligandos se ligam a tempos diferentes. Ambos definiram um índice de cooperatividade: se se observar cooperatividade

S

S S

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positiva pela equação de Hill também se observará em Adair. No entanto, o valor será diferente, consoante a equação que se aplique.

Induced-fit Por este modelo, aparece o conceito de flexibilidade e desaparece o modelo de proximidade. Há uma alteração na conformação do enzima e posteriormente há a ligação do ligando, segundo o modelo do induced-fit.

Modelos modernos de cooperatividade

o MWC: a proteína tem de ter diferentes conformações em equilíbrio. Trata-se do modelo concertado ou simétrico (é incorrecto dizer que é alostéreo). Verificou-se que quando o enzima se encontrava na presença de mercúrio, o mercúrio não afectava a ligação à His, não alterando a actividade do enzima. Este modelo considera que o enzima pode estar, pelo menos, nestas duas conformações, na ausência de ligando. (Bola) R – relaxado (activo) (Quadrado) T – tenso (inactivo) Por este modelo, não há híbridos.

L: constante alostérea. Indica se há ou não cooperatividade. Se L >> => T > R => sigmoicidade grande Se L << => R > T => sigmoicidade pequena Se o enzima tem sigmoicidade, tem várias conformações em equilíbiro independentemente dos ligandos estarem ou não presentes e ligados. Todos os enzimas na forma relaxada têm um carácter hiperbólico, indicando uma maior actividade. É possível aplicar o MWC à Hb-O2? Para isso, é necessário considerar que a hemoglobina tem dois estados: o estado T e o estado R.

L (Hb) = 9050 (valor muito elevado) A hemoglobina está na maioria das vezes no estado T e a ligação do oxigénio é muito favorável ao estado R.

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Por este modelo existem críticas relativamente à simetria que por vezes é difícil ter numa molécula.

Modelo KNF: a proteína só pode ter diferentes conformações na presença de ligandos.

Assim, as diferentes conformações não estão implícitas na proteína e só ocorrem se houver ligandos. A presença de ligandos induz uma alteração conformacional que é perpetuada às outras subunidades. Este modelo permite ultrapassar os problemas do modelo MWC, pois admite a existência de formas híbridas e permite explicar a cooperatividade negativa. Quando A se liga ao enzima na forma T, a forma T passa à forma R. Este modelo permite explicar diferentes tipos de fenómenos de cooperatividade das ciências da vida. Ambos os modelos existem porque admitem que as proteínas são oligómeros. No entanto, pode haver cooperatividade em proteínas só com uma subunidade.

Modelos de associação-dissociação Permitem explicar como proteínas com formas mais simples exibem maior sigmoicidade.

Modelo de Ferdinand (1966) e Rabin (1967) A cooperatividade pode surgir pode motivos cinéticos. Consequentemente, uma única cadeia pode ter cooperatividade sem ter uma estrutura quaternária.

Modelo de Rabin (ver artigo - importante) É o substrato que provoca alterações conformacionais no enzima (E’’A) e é só assim que vai ser possível dar o produto. ‘’O enzima tem memória’’ e ‘’lembra-se’’ da conformação que tinha quando o substrato estava em baixas concentrações. A este fenómeno designa-se por histerese. Histerese: é a tendência de um material ou sistema de conservar suas propriedades na ausência de um estímulo que as gerou.