imunodiagnóstico - infecções virais - valdirene leão carneiro - unime

10/10/2009

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Imunodiagnóstico: Infecções Virais

Valdirene Leão Carneiro

Diagnóstico Laboratorial das Infecções ViraisInfecções Virais

Isolamento Viral por cultura;

Detecção de Antígenos virais;Microscopia eletrônica e IFD;

Amplificação do Ácido Nucléico;

Técnicas de Imunoensaios:Detecção de Antígenos;Detecção de Anticorpos.

Aspectos Gerais e Diagnósticos das Infecções Virais

Importantes em nosso meioImportantes em nosso meio

VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA

HUMANA - HIV

Origem do HIV

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HIV

Família: Retroviridae

Gênero: Lentivirus

Tipos: HIV-1 e HIV-2Subtipos: A a J (Grupo M)

(Grupo N e O)

HIV

Cronologia:1983: Foi descoberto1984: Testes de ELISA1986: Entrada através do CD41986: Outro tipo de HIV1986: Outro tipo de HIV1987: Zidovudina (transcriptase reversa)1994: AZT diminui transmissão vertical1995: Inibidores de proteases1996: Entrada também com quimiocinas1997: Macrófagos e Linfócitos em latência1998: Diminui mortalidade => doenças metabólicas1999: Cepas resistentes as novas drogas2005: Começa a aparecer em países pobres

AIDS ????

• Conceito:

“ Corresponde ao estágio final da infecção pelo HIV-1 e/ou HIV-2, quando as manifestações clínicas de uma severa imunodeficiência são observadas pela incapacidade do paciente em controlar infecções oportunistas e processos neoplásicos.”

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Figure 11-20 Figure 11-21

Ligação a Receptores Figure 11-30

HIV - Infecção

Fase Aguda:Manifestações clínicas de um resfriado comum.

Fase de Latência:Fase de Latência:Teste anti-HIV positivo.

AIDSDestruição das células imunes leva a falência imunológica.

HIV

Vias de transmissão:

Contato sexual;

Sangue e derivados;

Da mãe infectada para a criança (intraparto, congênita, amamentação etc)

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Risco médio de transmissão do HIV

Tipo de Exposição Risco Médio

Relação sexual (1 vez) 0,01-1,0%

Uso droga injetável (1vez) 0 5-1 0%Uso droga injetável (1vez) 0,5 1,0%

Aleitamento materno 12%

Sangue contaminado 90%

Transmissão ocupacional < 0,03%

Diagnóstico Laboratorial - HIV

Determinação sorológica de Acs circulantes (Anti-ç g (env, gag e pol);

Detecção e quantificação de Ags virais (p24).

• Pesquisa de Anticorpos (HIV I e II):

– ELISA (indireto, competição)– Detecção de Acs anti-HIV e Agp24


Detecção de Acs anti-HIV e Agp24– Quimioluminescência, Eletroquimiolumin.– Micropartículas de Gelatina– Testes rápidos – IFI– Western-Blotting (Immunoblotting).

Antígenos dos ensaios:

P24 41 / 120 (A bi t


P24, gp41 e/ou gp120 (Ags recombinantes ou peptídeos sintéticos);Apenas HIV-1 ?????HIV-1 (grupo O e M) e HIV-2.

Western-Blotting ou Immunoblot- HIV

Western-Blotting - HIV

PROTEÍNAS DO VÍRUS HIV 1:

ENV: GP160, GP110/120 e GP41

POL: P68, P52 e P34

GAG: P55, P40, P24/25 e P18

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PADRÃO DE INTERPRETAÇÃO

NEGATIVO:Ausência de bandas específicas do vírus ou presença de P 18 apenas


apenasPOSITIVO:

2 ENV +/- GAG +/- POLINDETERMINADO:

1 ENV +/- GAG +/- POL ouGAG + POL ouGAG (exceto P18) ou POL


WesternWestern--Blotting Blotting -- HIVHIV

Ferreira et al, 2001 Imunoensaios, Vaz et al, 2007

Imunoensaios, Vaz et al, 2007

Acompanhamento do paciente com AIDScom AIDS

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Detecção qualitativa e quantitativa do vírus no sangue:

Carga viral: Técnicas de amplificação do RNA viral

Exames de Seguimento

Níveis de células CD4+ e CD8+:Concentração de células CD4+ inversamente proporcional a carga viral.

CITOMETRIA DE FLUXO

PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CITOMETRIA DE FLUXO

CITO METRIA FLUXO

Célula Medida Movimento

HEPATITES VIRAIS

Hepatites virais

• Diagnóstico Laboratorial:• Testes sorológicos = “Marcadores Imunológicos”;

• Técnicas de Biologia Molecular = Confirmação da infecção viral em casos duvidosos;

• Métodos Bioquímicos = Avaliar o tipo e o grau do comprometimento hepático, cura, cronicidade e eficácia terapêutica

Características e Diagnóstico Laboratorial

das Hepatites (A-E)

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Principais características das hepatites virais

Hepatite A Hepatite B Hepatite C Hepatite D Hepatite E

Agente etilógico

HAV HBV HCV HDV HEV

Período de incubação ( )

2 - 7 6 - 16 6 - 12 2 - 16 2 - 8(semanas)

EnvelopeNão Sim Sim Do HBV Não

Genoma (no. Nucleotídeos)

RNA (7900)

DNA (3200) RNA (9400) RNA (1700)

RNA (7600)

FamíliaPicornavi-

ridaeHepadna-

viridaeFlaviviridae ? Calciviridae

Ferreira et al, 2001

Principais características das hepatites virais

Vias de transmissão

Hepatite A Hepatite B Hepatite C Hepatite D Hepatite E

Fecal-oralSim Não Não Não Sim

Não Sim Sim Sim NãoParenteral

Sexual e Vertical

Não Sim Pouco freqüente

? Não

Formas crônica

Não Sim (5%) Sim (70%) - Não

Triagem sorológica doadores

Não AgHBs Anti-HCV Não Não

Vírus da Hepatite A

• Marcadores Sorológicos: Anti-HAV G e M;

• Anti-HAV IgM patognomônico;


• Anti-HAV IgG Estudos soroepidemiológicos;

• Recuperação da doença, sem reinfecção;

• Metodologias utilizadas ELISA, QL, EQL…

• Biologia Molecular Fezes.




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Vírus da Hepatite B

Resposta dos LTCs elimina o vírus

• Período de incubação: 6 a 8 semanas;

• Presente no sangue Fase aguda, convalescença e forma crônica;


• Transmissão pelo sangue e agulhas muito eficaz;

• Recuperação sorológica, bioquímica e clínica: 93%;

• Formas crônicas 5%;

• Hepatite fulminante 1%.

• Marcadores Imunológicos:

• a) AgHBs;• b) Anti-HBS;


• c) Anti-HBc G e M;• d) AgHBe;• e) Anti-HBe.

Outros marcadores a nível de investigação



• Cronologia dos marcadores imunológicos:• Primeiro....

S d


• Segundo ....• Terceiro .....• Quarto ..........• Quinto ............• Sexto ...............

• AgHBs > 6 meses forma crônica;

• AgHBs e AgHBe > 6 meses prognóstico


AgHBs e AgHBe 6 meses prognóstico de maior gravidade com alta replicação viral.

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• Biologia Molecular:

C fi d id


• Confirmar casos duvidosos;• Várias metodologias.

• Gênero Hepacivirus ; Família: Flaviviridae

• Fita única de RNA e 9500 nucleotídeos

Vírus da Hepatite C

9500 nucleotídeos (Weine et al, 1991)

• Genótipos e Subtipos: 1a, 1b, 2a, 3a... (Simmonds et al, 1994)

• Quasiespécies : Extensa variabilidade

Recuperação

Estável

HepatiteCrônica

InfecçãoAguda

Estável


Cirrose

Mortalidade (Cirrose, CHC)

20–30 anos

• Hepatite não-A e não-B ( 90%);

• Transmissão pós-transfusional, agulhas contami-nadas, transplante de órgãos etc;


nadas, transplante de órgãos etc;

• Transmissão sexual e vertical rara;

• Ocorre de forma esporádica sem que se possa determinar a forma de infecção.

Vírus da Hepatite CVírus da Hepatite C

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• BIOLOGIA MOLECULAR

• A PCR é o “ gold standard test” no diagnóstico da hep. C;

• Metodologias: Branched DNA e RFLP;


• Metodologias: Branched- DNA e RFLP;

• PCR (Qualitativo, Quantitativo e Genotipagem)

• Confirmação do resultado e acompanhamento do tratamento.

Vírus da Hepatite D

Vírus da Hepatite D

• Prevalência no Brasil? Bahia? Mato Grosso?

• Semelhante a HAV;

Vírus da Hepatite E

• Gestantes pode ser perigoso;

• Marcadores imunológicos: Anti-HEV G eM?

• IFD em hepatócitos infectados: Fase aguda.

• Hepatites não-A-E;

• Hepatites não-A e não-B (90% E e C);

Outras Hepatites

p ( )

• Hepatite F? Hepatite G? (os outros 10%).

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HTLV – Vírus linfotrópico humano para células T.

• Família => Retroviridae;Família Retroviridae;

• Infecta células do sistema imunológico humanodenominadas linfócitos T.

• Existem basicamente dois tipos de HTLV, oHTLV-1 e o HTLV-2.

HTLV

• HTLV-I que está implicado em doençaneurológica e leucemia.

• HTLV-II, o tipo 2, que está poucoevidenciado como causa de doença.

HTLV

HTLV - I HTLV - II

Como se pega o HTLV ?

– Recebendo transfusão de sanguecontaminado pelo vírus;

Compartilhando agulhas seringas ou objetos– Compartilhando agulhas, seringas, ou objetoscortantes;

– Aleitamento materno;

– Relação sexual, não protegida.

Prevalência do HTLV-I

• Endêmico no Japão, Caribe, África, América doSul e ilhas da Melanésia;

• Estima-se que 15 a 20 milhões de pessoastã i f t d l HTLV I destão infectadas pelo HTLV-I no mundo.

• HTLV-I => presente em todas as regiõesbrasileira;

• Prevalência elevada => Bahia, Pernambuco ePará;

• Brasil possui o maior número absoluto deindivíduos infectados no mundo.

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Prevalência do HTLV-I Doenças causadas pelo HTLV?

Maioria dos pacientes assintomáticos;Leucemia/linfoma de células T do adulto;Mielopatia associada ao HTLV-1 => doençacausada por uma inflamação na medula espinhalcausada por uma inflamação na medula espinhalprovocada pelas células infectadas pelo HTLV-1.

Mielopatia associada ao HTLV-I

Os sintomas mais comuns da mielopatiaassociada ao HTLV-1 são:Fraqueza nas pernas;

Rigidez, endurecimento dos músculos das pernas;

Problemas para controlar a urina;

Pele muito seca, boca e olhos secos;

Dormências, formigamentos, dores, sensação dequeimação nos pés ou nas pernas; dores nasarticulações.

Diagnóstico do HTLV-I e II

• Sorológico:Triagem => Aglutinação em látex, EIA (lisados viraise proteínas recombinantes);Confirmatórios => Western-Blotting e IFI.Confirmatórios Western Blotting e IFI.

• Molecular:Confirmar casos indeterminados;Discriminar entre HTLV-I ou II.

Interpretação do WB

• Soropositivos => Anticorpos contra antígenos do core (anti-p24) e anti-glicoproteínas do env (r21, gp46 ou gp61);gp46 ou gp61);

• Indeterminados => Padrão de reação diferente do citado acima;

• Negativo => Ausência de bandas.

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