Fertilização in vitro e Cultivo de Embriões

Novembro, 2013

Universidade Federal de Pelotas

Graduação em Biotecnologias

Manipulação de Gametas e Embriões

Priscila Marques Moura de Leon Dra., Médica Veterinária

PNPD Biotecnologia/UFPel

Fertilização in vitro - FIV

• Parte do processo de Produção in vitro de Embriões (PIV)

MIV FIV CIV

Objetivos da FIV:

Acelerar a produção de animais geneticamente superiores;

Tratamento de infertilidade; Científico Respaldo para técnicas como: Clonagem,

Transgênese, Sexagem, Criopreservação

Histórico FIV

• Século XIX: foi observada pela primeira vez, a fecundação de um óvulo de estrela-do-mar com a posterior formação da primeira célula do futuro embrião (Heman Fol, 1980)

• Século XIX: estudo da manipulação de embriões. Os primeiros

trabalhos experimentais em embriologia de mamíferos foram realizados com coelhos

Invertebrados marinhos a fecundação ocorre externamente ao sistema reprodutor da fêmea.

Oócito grande Ovulação induzida pelo acasalamento

Histórico FIV

• Van Beneden, 1875: descrição dos estágios embrionários pré-implantacionais;

• Walter Heape, 1890: transferência de embriões para o oviduto;

• Lewis e Gregory, 1929: realização de um filme das sucessivas clivagens de uma mórula em cultivo;

Dificuldades relativas à compreensão das necessidades nutricionais e limitações das condições de cultivo.

''Whitten effect'' ou ''Whitten medium''

Histórico FIV

• Wesley Whitten, 1950: meios de cultivo suplementado com albumina sérica bovina (BSA), promovendo a clivagem de embriões de camundongo até blastocisto.

• Ralph Brinster, 1950: desenvolveu a técnica da cultura de embriões utilizada atualmente, em microgotas.

Histórico FIV

• Chang, 1959: relatou o nascimento do primeiro mamífero (coelho) gerado a partir da técnica de FIV.

• Whittingham, 1968: camundongos

• Steptoe & Edward, 1978: estabeleceram um novo marco na história da FIV no mundo, com o sucesso do nascimento do primeiro bebê humano.

Louise Brown e Robert Edward

Julho, 2008

Nobel de Medicina 2010

Robert Edward

• O pesquisador britânico Robert Edwards ganhou o Prêmio Nobel de Medicina 2010 por suas pesquisas sobre a fecundação in vitro;

• Professor emérito da Universidade de Cambridge;

• A pesquisa foi realizada com o cirurgião ginecológico Patrick Steptoe, que morreu em 1988;

• “As conquistas [de Edwards] tornaram possível tratar a infertilidade, uma condição médica que aflige uma grande proporção da humanidade, incluindo mais de 10% de todos os casais”;

• “Aproximadamente 4 milhões de pessoas nasceram graças à fertilização in vitro”.

Histórico FIV

• Década de 70 → animais de produção. Relatos de sucesso no nascimento de filhotes após maturação in vitro.

• Sreenan et al, 1970: produção de embriões bovinos;

• Crosby et al., 1971: filhotes saudáveis de ovelhas;

• Leman & Dziuk, 1971: suínos;

• Brackett et al., 1982: nascimento de um terneiro sadio produzido por FIV, ocorrido no dia 9 de Junho de 1981.

• Palmer et al. 1991: 2 potros nascidos de FIV;

22 doadoras e 7 receptoras, sêmen a fresco e congelado;

Coleta cirúrgica: foram recuperados 177 oócitos, 52% fertilizados;

1 doadora gestando um embrião no estágio de 4 células;

O terneiro nasceu pesando 45kg sem alterações no desenvolvimento.

1. Coleta de Oócitos (Aspiração Folicular)

2. Maturação in vitro de Oócitos

3. Capacitação Espermática

4. Fecundação In vitro

5. Seleção dos Zigotos

6. Cultivo Embrionário

7. Transferência dos Embriões

8. Diagnóstico de Gestação

9. Nascimento

Principais etapas da Produção in vitro de Embriões

Fertilização in vitro

Etapas prévias a FIV: • Coleta dos CCOs;

• Maturação in vitro dos CCOs → MII;

• Frequentemente uso de sêmen congelado

• Capacitação espermática:

Testículo: imaturo, infértil e imóvel;

Epidídimo: motilidade e maturação

(maturam por 10-15 dias);

Trato genital feminino: Capacitação.

Capacitação Espermática

Conceito:

Capacitação é o processo que torna os espermatozoides aptos a fecundar. Não há modificações morfológicas, e sim modificações bioquímicas e ultraestruturais.

Remoção de componentes decapacitantes oriundos do plasma seminal ;

Modificações bioquímicas que desestabilizam a membrana plasmática e fazem a hiperativação espermática;

Essencial para a reação de acrossomo e penetração espermática.

Duração média in vivo:

• Trato reprodutivo Bovino: 6 a 7 horas

• Trato Reprodutivo Suíno: 1 a 2 horas

Capacitação Espermática

• No oviduto: • Glicosaminoglicanas (presentes no muco uterino) induzem a capacitação;

• Espermatozoides ligam-se ao epitélio do oviduto através de proteínas da membrana;

• Existe a formação de um reservatório de espermatozoides, que são liberados gradualmente para atingir o local de fertilização em momentos diferentes, e assim uma maior probabilidade de fertilizar o oócito (no inicio do istmo).

• Reação Acrossômica: • Ocorre na presença de Cálcio extracelular;

• É a fusão da membrana plasmática do espermatozoide com a membrana externa do acrossomo. Ocorre após a ligação do espermatozóide com a zona pelúcida (ZP3). Com função de dissolução da camada glicoproteica do oócito e penetração na zona pelúcida;

• Realizada por enzimas hidrolizantes: Hialuronidase e Acrosina;

• Hialuronidase: desdobramento do ác. Hialurônico, componente da matriz celular das células da granulosa que envolvem o oócito;

• Acrosina: enzima proteolítica que digere a zona pelúcida do oócito;

Capacitação Espermática • Dura cerca de 7 horas; • Interação com fatores capacitantes

(Bicarbonato, Albumina, Íon Cálcio, Glicosaminoglicanos e ROS);

• Cobertura glicoproteica e proteínas seminais são removidas;

• Maior permeabilidade a Ca2+ e incremento do metabolismo celular;

• ↓ Colesterol: Fosfolipídeos; • O processo de capacitação ocorre no

útero e tubas uterinas; • Hipermotilidade (entrada no oócito); • .

Reação do Acrossomo: • Presença de Íon Cálcio extracelular; • Espermatozoide liga-se a zona

pelúcida e sofre a reação acrossomática;

• Formação de vesículas e exposição da membrana interna.

- ZP3

Acrosina, Esterase, Fosfolipase A2, Fosfatases àcidas, Aril amidase, Aril sulfatase,...

Capacitação Espermática In vitro

Métodos de Capacitação In vitro:

Método de “Swim Up”: baseado na mobilidade dos espermatozoides vivos e sem patologias.

Espermatozoides viáveis se desprendem de um pellet nadando para a superfície e tornando-se capacitados. Estes espermatozoides poderão ser utilizados em: IA, FIV e ICSI.

Gradiente Descontínuo (Gradiente de Percoll): o princípio da técnica é baseado na força centrífuga de passagem dos espermatozoides entre duas camadas de substância coloidal com diferentes concentrações.

Células sedimentam de acordo sua própria densidade. As camadas irão reter espermatozoides mortos e debris celulares. O pellet formado contém apenas espermatozoides viáveis.

Capacitação Espermática In vitro

Heparina: glicosaminoglicana utilizada como agentes capacitante in vitro;

Desencadeia reações bioquímicas na membrana plasmática do espermatozoide;

Concentração de 2 a 100 µg/mL de meio (depende do macho/método de separação espermática) (mais frequente em bovinos 10 µg/mL);

Objetivos dos Métodos de Capacitação In vitro:

separar os espermatozoides do líquido seminal e diluentes;

Obter espermatozoides com 70% de motilidade progressiva;

Gradiente de Percoll [↓ Heparina]

Swim Up [↑ Heparina]

Capacitação Espermática In vitro

Swim Up:

utilizada em espermatozoides com motilidade normal;

• 1mL de meio de capacitação é adicionado a 1 palheta de sêmen;

• Meio TALP suplementado com BSA e piruvato, 37-39°C (1h);

• Lavagens + Centrifugação;

• Eliminação do sobrenadante (900µL) + incubação 40 – 60 min;

• Seleção sptz com motilidade progressiva (sobrenadante);

• Concentração e motilidade dos sptz e ressuspende em meio de FIV;

Capacitação Espermática In vitro

Gradiente de Percoll: (solução sílica coloidal)

Mais utilizado atualmente;

Aumenta a recuperação de sptz móveis;

Filtração dos sptz através de gradientes com diferentes densidades;

30%, 45% e 90%

Sptz é depositado no topo da coluna;

Centrifugado 200g/20-30 min;

Ressuspende e centrifuga para eliminar Percoll;

Densidades inferiores: sptz imóveis e debris celulares (70%);

Densidade superiores: sptz móveis (90 -100%);

Concentração e ressuspende em meio de FIV;

Subfertilidade → menor gradiente (a partir de 40%) e volume menor

• Determinação da Concentração Espermática

• Avaliação da Motilidade Celular

Cálculo da Dose Inseminante

Preparo da Dose Inseminante

1 x 106 sptz/mL

Fecundação

• A ligação dos espermatozoides ao oócito é mediado por receptores espermáticos presentes na zona pelúcida;

– ZP1 (estrutural), ZP2 (ligação 2ª) e ZP3 (receptor1º - reação do acrossoma);

– Ação enzimática (Reação Acrossômica) e mecânica (Hipermotilidade).

• Oócito: ativado pelo sptz (segmento equatorial do sptz entra em contato com a membrana plasmática do oócito)

– despolarização da membrana plasmática;

– exocitose dos grânulos corticais (enzimas hidrolíticas, proteinases e peroxidases)→ Endurecimento da Zona Pelúcida;

– ZP1F, ZP2F e ZP3F (Hidrólise);

• Zona Pelúcida perde receptores espermáticos; • Resistente a digestão enzimática e penetração espermática;

Tremoleda et al., 2006.

Fecundação

Fecundação

1. Sptz penetra no cumulus;

2. Reconhecimento Zona

Pelúcida:

a) Ligação ZP3

b) Ligação ZP2

c) Penetração Zona Pelúcida

3. Fusão Oócito/Sptz;

4. Ativação do Oócito e Bloqueio

da Zona Pelúcida;

5 e 6. Formação dos Pró-Núcleos;

Fases da Fecundação

I. Passagem do espermatozoide pela Coroa Radiada: • Ação da Hialuronidase; • Movimentos espermáticos;

II. Penetração na Zona Pelúcida: • Enzimas proteolíticas: Acrosina, estearases e

neuraminidases; • Ocorre a Reação Zonal (Endurecimento da Zona Pelúcida)

→ impede polispermia;

III. Fusão das membranas do Oócito e Sptz: • Membranas se rompem • Cabeça e cauda do sptz penetram no citoplasma de oócito;

IV. Término da 2ª divisão meiótica do oócito V. Formação do Pró-núcleo masculino VI. Lise da membrana do pro-núcleo

Fases da Fecundação

I. Passagem do espermatozoide pela coroa radiada

II. Penetração na zona pelúcida

III. Fusão das membranas do oócito e sptz

IV. Término da 2ª divisão meiótica do oócito:

• Óvulo maturo, extrusão do 2º Corpúsculo Polar;

• Formação do Pró-Núcleo Feminino;

V. Formação do Pró-núcleo masculino:

• Núcleo do sptz aumenta;

• Formação do Pró-Núcleo Masculino;

• Cauda degenera;

VI. Lise da membrana do pro-núcleo:

• Agregação dos cromossomos para divisão celular mitótica;

• Primeira Clivagem embrionária;

Fecundação

Fecundação

Fecundação In Vitro

• Após maturação dos oócitos e separação dos sptz viáveis;

• Ambiente adequado para a capacitação espermática e

fecundação;

• Meio de FIV: vários meios comerciais;

• Co-cultivo: 18 a 22 horas, estufa 5% de CO2 a 37-39°C;

• Concentração espermática: 1x106 a 1x 107 sptz/mL;

• Sptz são adicionados a gota de fertilização com os oócitos em

MII;

Meio FIV: subsídio para a fertilização pelo sptz. • Heparina; • Hipotaurina; • Epinefrina; • Cálcio; • Ex: Fert-TALP, TALP-FIV;

http://www.youtube.com/watch?v=NjnFBGW3Fmg

Vídeo - Fecundação In Vitro

http://www.youtube.com/watch?v=gtPd4Yn_18c&feature=related

Tremoleda et al., 2006.

FIV Equinos:

Causas do Insucesso:

Resistência do Espermatozoide a Capacitação;

Endurecimento da zona pelúcida prévio;

↓ Tx de recuperação de Oócitos maturados in vivo;

↓ Tx de Maturação in vitro;

• Zigoto (1 cél.) sofre → Divisões Mitóticas repetidas;

• Inicia-se cerca de 24 a 30 h após a fecundação;

• Os Blastômeros tornam-se menores a cada divisão;

• Durante a clivagem o zigoto permanece dentro da zona pelúcida;

• Estágios Embrionários:

• Zigoto, 2 células, 4 células, 8 células;

• formação da Mórula (12 a 32 blastômeros);

• Compactação: polarização dos blastômeros e achatamento;

• Blastocisto: diferenciação celular e formação da blastocele;

Clivagem Embrionária

Tremoleda et al., 2006.

Fecundação e clivagem

Embrionária Equina:

Clivagem

Embrionária:

Cultivo embrionário por 7 dias.

Allen, 2005.

Estágios do

Desenvolvimento

Embrionário:

Zigoto 2 células 4 células 8 células

16 células/Mórula Mórula Compactação/ Blastocisto inicial

Blastocisto

http://www.youtube.com/watch?v=sIxBCxPW2Fc&feature=related

Vídeo – Desenvolvimento Embrionário

Formação do Blastocisto

• Formação da cavidade blastocística;

– 32 céls suíno; 64 céls no bovino; 128 céls coelho;

• Partes Embrionárias:

– Trafoblasto: fina camada externa que formará a placenta;

– Embrioblasto: grupo de blastômeros localizados que dará origem ao embrião

– Pólo Embrionário: local da implantação embrionária;

Desenvolvimento e Cultivo Embrionário In vitro

• Eventos do desenvolvimento:

– Clivagem, Ativação do genoma embrionário *ponto crítico

– Agregação e Compactação dos blastômeros

– Diferenciação do Trofoblasto e Embrioblasto;

– Formação e expansão da blastocele;

– Rompimento da zona pelúcida;

• Embriões produzidos in vitro são mais sensíveis ao cultivo que os produzidos in vivo;

• Fatores Intrínsecos (não controlamos);

• Fatores Extrínsecos: meio, pH e condições ambientais;

Desenvolvimento e Cultivo Embrionário In vitro

• Meio de cultivo: nutrição celular e suporte para o desenvolvimento embrionário;

• Potássio e cloro em concentração mais elevada, cálcio mais baixo que meio de fertilização (fluído oviduto);

• Piruvato é essencial na clivagem (a partir de mórula que o embrião consegue utilizar glicose como fonte de energia);

• Amilase e lactato dehidrogenase na conversão do piruvato em glicose;

• Aminoácidos (substrato energético, síntese proteica e reguladores do pH): glutamina, glicina, alanina, prolina;

• pH é crítico: 7,3 a 7,5 (influência nas reações bioquímicas) (HEPES: tampão orgânico)

• Vitaminas (HAM’s F10): incrementam o desenvolvimento;

• Soro Fetal Bovino (proteínas, Ac. Graxos, glicídios, hormônios, vitaminas e fatores de crescimento).

Protocolo PIV

• MIV: gotas de100 µl de TCM 199, 20-30 CCOs/gota;

• Capacitação: Gradiente de Percoll com SP-TALP;

• FIV: gotas de 100 µl de FERT-TALP, 20 CCOs + 1x 107 sptz/ml;

• CIV: Retirada das céls. do cumulus por pipetagem, cultivo gotas de 100 µl de KSOM (+10% SFB e 4mg/ml de BSA), renovação do meio de cultivo a cada 2 dias.

• Avaliações:

– Clivagem: 24 horas de cultivo (48 h após a FIV).

– Embriões de 2, 4 ou 8 células → retirada das estruturas não clivadas

– D7: estágio de blastocisto (transferência dos embriões)

Resultados esperados na FIV

• Bovinos: – Tx de Clivagem: 70% – 80%; – Tx de Blastocisto: 35% - 50% – Tx de prenhes: 60%

• Homem: – Tx de Clivagem: 60 – 80%; – Tx de desenvolvimento embrionário: 35 – 40%; – Tx de gravidez: 25%;

• Ovinos e Caprinos: – Tx de Clivagem: 50% - 80%; – Tx de Blastocisto: 30% - 45%; – Tx de prenhes: 60%

• Equinos: – ICSI

Fatores que afetam os resultados da FIV

• Sêmen (efeito macho): variações de 10 a 50% na Tx blastocisto;

• Oócitos: 0% a 75% (idade doadora);

• Seleção dos oócitos;

• Interações embrionária (retirada das estruturas não clivadas);

• Tamanho da gota de cultivo e nº de oócitos/gota;

• Fatores de crescimento (IGF, EGF, TGF, PDGF);

• Meios e condições de cultivo;

• Transferência dos embriões (regressão do Corpo Lúteo);

• Variabilidade da Superovulação;