Coleta, Classificação e

Maturação in vitro de Oócitos

Priscila Marques Moura de Leon Dr., Médica Veterinária

PNPD Biotecnologia/UFPel

Agosto, 2014

Universidade Federal de Pelotas

Graduação em Biotecnologias

Manipulação de Gametas e Embriões

Oócito

Conceito:

• Ovário tem como uma das funções produzir oócitos capacitados através da oogênese.

• Oogênese: processo de maturação das oogônias em oócitos. Este processo inicia-se na vida fetal e termina após a puberdade.

• Oócitos são células germinativas femininas resultantes do processo determinado Oogênese.

• Nomenclaturas: Oócito ou Ovócito

Estrutura do Oócito:

• Células do Cumulus

• Coroa Radiada

• Zona Pelúcida

• Membrana Plasmática

• Citoplasma

• Núcleo

• Nucléolo

Oócitos Equinos

Oogênese

• Oogênese inicia-se na vida fetal com a divisão mitótica das oogonias;

• Ao nascimento estas células entraram em meiose e encontram-se em

Diplóteno da Prófase I → Oócito I

• Na puberdade, no momento do pico pré-ovulatório de LH, o oócito

retoma a meiose até o estágio de Metáfase II → Oócito II

• A ovulação se dá no estágio de Metáfase II;

• Somente após a fecundação da meiose é finalizada → Óvulo

Oogênese:

Embrionária Nascimento A partir da Puberdade

Ovogonias Ovócito I Fecundação Ovócito II

Diplóteno da Prófase I

Metáfase II

Fases da Ovogênese

Óvulo

Nos humanos:

a maioria dos oócitos, aproximadamente 7 milhões, é perdida e sofre

atresia ao longo da vida da mulher, desde o período fetal até a

maturidade sexual;

99% dos folículos não atingem a maturação;

Somente 400 a 500 oócitos ovulam desde a puberdade até a menopausa;

Estágio Cromossomos Cromatide Processo Período

Oogonia Diplóide/46 2N Mitose Fetal

Oócito I Diplóide/46 2N Meiose I Foliculogênese

Oócito II Haplóide/23 1N Meiose II Ovulação

Óvulo Haplóide/23 1N Fertilização

• Diplóteno da Prófase I Estágio de Vesícula Germinativa

• VG: núcleo desenvolvido e imaturo;

• Complexo cumulus oophuros (CCO)

Oócito

Oócito humano em VG

• A foliculogênese se inicia na vida fetal e ocorre até após a

puberdade;

• Processo de transformação de folículos primários (formados na

vida fetal) em folículos pré-ovulatórios (pós-puberdade);

• Apresentam transformações celulares e moleculares, tanto do

oócito quanto de células foliculares (da teca e da granulosa);

• Controle: Hormonal, Fatores Intra-ovarianos e Fatores Intra-

foliculares;

Foliculogênese

• Folículo Primário: oócito envolto por camada simples de céls. pavimentosas;

Bovinos → Folículo = 35 µm; Oócito = 30 µm

• Folículo Secundário: duas ou + céls. Foliculares – Formação da zona pelúcida; – Oócito começa a crescer; – Formação de junções comunicantes (gap junctions); – Meiose permanece bloqueada (oócito em Vesícula Germinativa);

• Folículo Antral (Terciário e Pré-Ovulatório ou De Graaf): – Formação da cavidade antral do folículo (Fluído Folicular); – Crescimento folicular; – Crescimento e maturação do oócito;

Bovinos → Folículo = 1 mm; Oócito = 80 µm

→ Folículo = 15 mm; Oócito = 120 µm

Foliculogênese

• Quebra da Vesícula Germinativa → marca a retomada da meiose e início do processo de Maturação Oocitária;

– In vivo ocorre pela estimulação por LH (Hormônio Luteinizante)

– In vitro ocorre na coleta do oócito

• Nesta fase ocorre a condensação da cromatina e quebra da membrana nuclear

• Metáfase I → duplicação dos centríolos e cromossomos em pares diplóides;

• 2º bloqueio meiótico: oócitos em Metáfase II

– Estágio em que o oócito é ovulado

– A meiose só prosseguirá se ocorrer a fertilização

Oócito

Folículo Primário

Folículo Secundário

Folículo Antral (Terciário)

Folículo Pré-Ovulatório

Oócito I

Oócito I

Oócito I

Oócito II

Fecundação Óvulo

VG

QVG

MII Ovulação Oócito II

MI

Foliculogênese: Oogênese: Meiose:

Foliculogênese Humana

A: Desenvolvimento de Folículos

B: Níveis Hormonais

1. FSH, Hormônio Folículo Estimulante: crescimento folicular, proliferação e diferenciação das células da granulosa, formação do antro 2. Estrogênio: produzido pelas céls foliculares, possui ação sinérgica ao FSH e LH 3. LH, Hormônio Luteinizante: ovulação, estimula luteinização das células da granulosa e da teca; 4. Progesterona: preparação e manutenção da gestação, ação imuno supressora;

Complexo Cumulus Oophorus

Coroa Radiada

Antro Folicular

Zona Pelúcida

Oócito

1. Crescimento Oocitário

2. Capacitação Oocitária

3. Maturação Oocitária

a. Maturação Citoplasmática

b. Maturação Nuclear

4. Ativação do Oócito

Maturação Oocitária Vesícula Germinativa

Metáfase II

• Crescimento Oocitário se inicia com o Crescimento

Folicular;

• Finalizado na formação do Folículo Antral;

• Aumento de tamanho do oócito (em até 3x);

• Aumento e organização de Organelas (6.000 para 193.000

mitocôndrias no oócito em humanos);

• Síntese de RNA e proteínas :

Maturação, Fecundação e Desenvolvimento Embrionário

1. Crescimento Oocitário

• Entre final do Crescimento e início da Maturação

• Ocorre no Folículo Antral

• Modificações Estruturais

• Finaliza a síntese de RNA

• Ainda se mantém no 1º bloqueio meiótico

2. Capacitação Oocitária

• Quando o oócito retoma a Meiose

• Após o pico de LH (causa queda de cAMP)

• Abrange 2 estágios:

Maturação Citoplasmática

Maturação Nuclear

3. Maturação Oocitária

• Reversão do 1º bloqueio meiótico (mantido pela alta de

cAMP produzido pelas céls. da granulosa)

• Vai até o segundo bloqueio meiótico → Metáfase II

• Condensação dos cromossomos e Quebra da Vesícula

Germinativa (QVG)

• Extrusão do 1º Corpúsculo Polar

Diacinese → Metáfase I → Anáfase I → Telófase I → Metáfase II

3.1. Maturação Nuclear

• Ocorrem Modificações Citoplasmáticas:

– Mitocôndrias e complexos de Golgi se redistribuem ocupando

posição central na célula;

– Grânulos Corticais (enzimas derivadas com complexo de Golgi)

migram para a periferia do oócito, próximo a membrana

celular;

– Microtúbulos e microfilamentos são reorganizados;

– Expansão das células do cumulus (modificação das junções

gap);

3.1. Maturação Citoplasmática

Junções Gap: Cumulus Expandido:

Oócito em MII:

• Extrusão do 1º Corpúsculo Polar;

• Expansão das Células do Cumulus;

Oócitos Caninos maturados in vitro

Vesícula Germinativa

Metáfase I

Quebra de Vesícula

Germinativa

Metáfase II

Tremoleda et al., 2006.

• MPF: Fator Promotor da Maturação

–Principal regulador das modificações morfológicas durante a maturação do oócito.

–MPF é uma cinase envolvida na divisão celular e regulação do ciclo celular (G2/M) de todas as células eucarióticas.

• Funções:

– Regulam a condensação dos cromossomos;

– Bloqueio da atividade transcricional;

– Estimulação do rompimento do envelope nuclear na QVG;

– Reorganização dos microtúbulos;

• Em baixa atividade em oócitos em VG / atividade máxima em MI e MII;

Ativado pela queda na concentração de AMPc causada pelo pico de LH;

Inativado pela fertilização, permitindo a finalização da meiose pelo seu desbloqueio.

Reguladores da Maturação do Oócito

• MAPK: Proteína Cinase Ativada por Mitógeno

• Estas proteínas são ativadas por sinais extracelulares,

• Ativação da MAPK em oócitos bovinos ocorre após 8h de cultivo in

vitro e apresenta um aumento gradual até 14h, mantendo-se estável

até o final da maturação;

• Funções:

– Atua na fosforilação de fatores de transcrição e proteínas do

citoesqueleto;

– Sua ativação ocorre na QVG e se mantém até o fim da

maturação (essencial nos eventos após QVG);

– Mantém a estabilidade dos microtúbulos e do fuso meiótico;

Reguladores da Maturação do Oócito

• Microtúbulos

• Microfilamentos

• Cromatina

VG Pró-M MI

MI AI TI

MII MII Deg

Microscopia

Confocal:

Tremoleda et al., 2001.

Vídeo – Estágios de Maturação do Oócito

• http://www.youtube.com/watch?v=3-uocDm4SNg

• Oócitos são ovulados em Metáfase II;

• A ativação é induzida pela fecundação de um

espermatozoide;

Metáfase II → Telófase II → extrusão do2º corpúsculo

polar → divisão embrionária

• Caso não ocorra fertilização o oócito se degenera;

4. Ativação do Oócito

4. Ativação do Oócito

Finalização da maturação do oócito:

Tremoleda et al., 2006.

Tremoleda et al., 2006.

Fertilização in vitro :

Oócito Fertilizado:

• Formação do Pró-núcleo Feminino e Masculino • Extrusão do Segundo Corpúsculo Polar

• In vivo: – Aspiração Guiada Por Ultra Som (OPU)

– Aspiração Folicular Cirúrgica

– Aspiração Transcutânea pelo flanco

• In vitro: – Aspiração Folicular

– Slicing (Técnica de Fatiamento)

– Scraping

Coleta de Oócitos

Aspiração Guiada por Ultra Som (OPU)

• OPU – Ovum Pick-Up

• Ultra som – sonda convexa de 5MHz a 6,5MHz;

• Bomba de vácuo;

• Tranquilização;

• Aspiração do Fluído Folicular;

• Lavagem Folicular com PBS e Heparina;

• Procura do CCO em lupa estéreo microscópica;

Coleta de Oócitos in vivo - OPU - Bovino

Coleta de Oócitos in vivo - OPU - Bovino

• Média de Oócitos /OPU:

– 8 CCO viáveis;

– 20 - 25 CCOs viáveis com estimulação hormonal (Protocolo de Superovulação);

– 10% dos CCO são degenerados;

• Manejo OPU doadora:

– OPU entre os dias 14 e 16 do ciclo estral devido maior n° de CCOs;

– OPU de 20 vacas / dia;

– Possível: OPU 2x em uma semana ( com decorrer a OPU ↓ nº de CCOs);

– Ideal: OPU 1 x a cada 2 semanas;

– Possível: OPU no 1º Trimestre da Gestação;

Estimativa: pode ser obtidas 18 gestações/3 meses com OPU + PIV

Coleta in vivo de Oócitos - Equinos

• Equinos: maior aderência das células do cumulus à parede folicular

resultando em dificuldade na coleta

• Aspiração Folicular Cirúrgica (McKinnon, 1986);

• Aspiração Transcutânea pelo flanco (Palmer, 1987);

• Aspiração Transvaginal guiada por ultra som (Cook, 1992);

• Carnevale & Ginther, 1993: 78% de oócitos recuperados;

• Gaetano et al. 2005: 46,4% Recuperação Oocitária;

• Manejo OPU éguas doadoras:

– OPU 12 - 24h após hCG;

– 5 CCOs/égua;

– 11 CCOs/ éguas com protocolo de Superovulação;

Coleta in vivo de Oócitos – Caprinos e Ovinos

• Aspiração Folicular por Laparoscopia (LAF);

• Uso frequente promove aderências no trato reprodutivo

dificultando novas coletas;

• OPU é dificultada pelo tamanho dos animais;

• Manejo LAF doadoras:

– Possível: Até 1 x /semana;

– 11º dia do ciclo ou do protocolo de Superovulação;

– Em média 6 CCO/coleta em cabras;

– 4 CCO/coleta em ovelhas;

Aspiração Folicular por Laparoscopia:

LAF - Cabras

Coleta de Oócitos - Mulheres

• Dellenbach (1985): inicio da aspiração folicular por via

transvaginal guiada por ultra-som.

• Procedimento é feito sob sedação;

• 6 CCOs ou mais coletados por OPU;

• Mulheres com infertilidade:

– 15% de taxa de gravidez com CCO próprios;

– 49% de taxa de gravidez com CCO doados;

Aspiração Folicular em Mulheres

Vídeo - Aspiração Folicular Guiada por Ultra Som

• http://www.youtube.com/watch?v=Wm4Khn6MVbc&feature=related

Coleta de Oócitos in vitro

Aspiração Folicular

Slicing (Técnica de Fatiamento)

Scraping

• Objetivos:

– Avanços científicos;

– Controle em clínicas de reprodução assistida;

Coleta de Oócitos in vitro - Scraping

• Individualização de cada folículo e abertura em placa de petri;

• Auxílio de bisturi ou cureta;

– Maior taxa de coleta (90%);

– CCO de boa qualidade;

– Muito demorado;

– Utilizado em Equinos;

Coleta de Oócitos in vitro - Slicing

• Fatiamento de toda a superfície ovariana;

– alta taxa de coleta;

– Muitos CCO inviáveis e desnudos;

– Líquido de procura bem “sujo”, maior probabilidade de contaminação;

– Utilizado em bovinos;

Coleta de Oócitos in vitro – Aspiração Folicular

• Aspiração do conteúdo folicular com seringa e agulha;

– Taxa de coleta em torno de 60%;

– Método mais prático e rápido;

– Líquido de procura é deixado para sedimentar ou filtrado;

– Utilizado em Bovinos, Equinos, Ovinos e Suínos;

• De acordo com aspectos Morfológicos:

– Quantidade de camadas de céls. do cumulus;

– Aspecto das Céls do cumulus;

– Grau de compactação das células do cumulus;

– Homogeneidade e coloração do citoplasmática;

– Presença de grânulos citoplasmáticos;

Influencia diretamente a qualidade embrionária e a

viabilidade após o descongelamento de oócitos

Classificação dos Complexos Cumulus Oócito

* Oócito pode ter seu potencial de maturação, fecundação e capacidade de desenvolvimento embrionário estimado pela aparência do complexo cumulus-oócito.

• Aspecto do Citoplasma:

Oócitos de camundongos apresentam ooplasma claro e quase ausente de granulações;

Oócitos equinos, suínos e caninos observa-se ooplasma escuro e com granulações;

* Variação devido a quantidade de lipídeo intracelular e sua distribuição.

Classificação dos Complexos Cumulus Oócito

CCO Equino CCO Suíno

CCO Bovino CCO Murino

• Grau I:

– Mais de 3 camadas de céls. do cumulus;

– Cumulus compacto;

– Ooplasma com granulações finas e homogêneas;

– Ooplasma preenchendo todo o interior da zona pelúcida;

• Grau II:

– 3, 2 ou 1 camada de células do cumulus;

– Cumulus compacto;

– Granulações heterogeneamente distribuídas (concentradas em uma lado ou na periferia);

– Ooplasma preenche todo o interior da zona pelúcida;

Classificação dos Complexos Cumulus Oócito

• Grau III:

– Cumulus parcialmente expandido;

– Ooplasma contraído (espaço entre a zona pelúcida e o ooplasma);

– Manchas escuras no ooplasma;

– Degeneração das céls. do cumulus em grau leve;

• Grau IV:

– Cumulus expandido;

– Oócitos Desnudos;

– Ooplasma muito escuro;

– Sinais de degeneração (vacúolos, inclusões citoplasmáticas, degeneração das céls. do cumulus);

Classificação dos Complexos Cumulus Oócito

Classificação quanto ao Estágio de Maturação

Classificação de oócitos

Grau I Grau II Grau IV

Grau II Grau III Grau IV

Classificação de oócitos

Cumulus Compacto

Cumulus Expandido

Oócito humano em Metáfase II apresentando:

Granulações Citoplasmáticas

Oócito humano em Metáfase II apresentando:

Fragmentação do Corpúsculo Polar

Oócito humano em Metáfase II apresentando: Vacúolo no Ooplasma

Oócito humano em Metáfase II apresentando: Inclusões Citoplasmáticas

• Bovinos: – Taxa de maturação entre 80 e 90%

– 20 a 24h de incubação a 38,5°C

• Caprinos e Ovinos: – Taxa de maturação caprinos é 50%

– Taxa de maturação ovinos 35 – 40%

– 27h de incubação a 38,5°C a 39°C

• Suínos: – Taxa de maturação 60-70%

– 48h de incubação a 38,5°C

• Equinos: – Taxa de maturação entre 40 e 60%;

– 36 a 40h de incubação a 38,7°C

Maturação In Vitro - MIV

• Maioria dos Protocolos:

– Meio de cultivo de tecidos 199 (TCM-199);

– Suplementação com Soro Fetal Bovino (SFB);

– Antibióticos (Gentamicina e Penicilina ou Sulfato de Amicacina);

– Adição de Hormônios :

• Estradiol

• FSH e LH

– Fatores de Crescimento e Estimulantes (GH, IGF-I, IL-1β);

– Fluído Folicular ou Soro de Vaca em Estro;

– Adição de Albumina Sérica Bovina (BSA);

– Compostos Antoxidantes (Cisteamina);

*Oócitos em cultivo são afetados por osmolaridade, composição iônica, temperatura, pH, CO2 e tensão de oxigênio

Maturação In Vitro - MIV

• Gotas de 60 a 120 µl; • Submersas em óleo mineral; • Placas de Petri tratadas;

• Em Estufa de CO2;

• 5% de CO2, temperatura e umidade controladas;

Maturação In Vitro - MIV

* Oócitos em cultivo são afetados por osmolaridade, composição iônica, temperatura, pH, CO2 e tensão de oxigênio

• Dell’Aquilla et al, 1996: adição de soro de égua e vaca em estro ao TCM

199 para maturação;

• Bruck et al., 2000: MIV em fluído de folículos pré-ovulatórios;

• Carneiro et al., 2002: IGF-I adicionado a meio de maturação;

• Pereira et al. 2006: 41,47% de MIV com eGH por 30h;

• Tremoleda et al., 2006: manutenção do Bloqueio da Meiose com o

objetivo de desenvolvimento da Competência Oocitária e

Reprogramação Celular;

Maturação In Vitro - MIV

Adição de Cisteamina ao meio de MIV;

Síntese de Glutationa (GSH);

Estresse Oxidativo;

Aumento da taxa de maturação in vitro;

Tratamento Imaturo Maturo Total

controle 88 (56.8%)a 67 (43.2%)a 155 (31.4%)

50μM Cisteamina 84 (57.5%)a 62 (42.5%)a 146 (29.6%)

100μM Cisteamina 89 (46.4%)b 103 (53.6%)b 192 (38.9%)

Total 261 232 493