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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

RECUPERAÇÃO DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS POR PRECIPITAÇÃO

Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial

Banca examinadora:

Dr. Adalberto Pessoa Junior Dra. Beatriz Vahan Kilikian Ora. Adriane Maria Ferreira Milagres

Estudante:

Ely Vieira Cortez

Lorena-SP-Brasil 1998

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIÀ INDUSTRIAL

, RECUPERAÇÃO DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS POR PRECIPITAÇÃO

Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora

' ,.,.

/

Lorena-SP-Brasil 1998

Dedico este trabalho à minha esposa Ednéa, aos meus filhos Bruno e Carolina, aos meus pais e irmãos, aos quais todas as palavras não seriam suficientes para expressar a minha gratidão.

AGRADECIMENTOS

Ao apoio financeiro da Capes e da FAPESP.

Aos professores, alunos e funcionários do Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia Química de Lorena, pela oportunidade e apoio. sem os quais este trabalho não poderia ter sido realizado.

CONTEÚDO Página

1 - INTRODUÇÃO 1

2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2

2. 1 - DOWNSTREAM PROCESSING 2

2.2 - FUNDAMENTO DA TÉCNICA DE PRECIPITAÇÃO: SOLUBILIDADE. 4

2.3 - "SAL TJNG our 6

2.4 - PRECIPITAÇÃO COM SAIS E ÉTERES DE CELULOSE 9

2.5- PRECIPITAÇÃO COM SOLVENTE ORGÂNICO 11

2.6- PRECIPITAÇÃO FRACIONADA 15

2. 7 -XILANASES 16

2.7.1 - Importância e características da xilanase 16

2. 7. 2 - Aplicações biotecnológicas 20

2. 7.3 - Extração e purificação de xilanases 22

3.0 - OBJETIVOS 24

4 - MATERIAIS E MÉTODOS 25

4.1 - MICRORGANISMO 25

4.2 - MEIO DE CULTURA FORMULADO A PARTIR DO HIDROLISADO

HEM/CELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE- AÇÚCAR 25

4.3 - PRODUÇÃO DAS ENZIMAS XILANOLÍTICAS 25

4.4 - ESTOCAGEM DO MEIO FERMENTADO 26

4.5 - PRECIPITAÇÃO DA XILANASE COM SULFATO DE AMÓNIO E

SULFA TO DE AMÓNIO COM METILCELULOSE. 26

4.6 - PRECIPITAÇÃO DA XILANASE COM SULFATO DE SÓDIO 27

4. 7 - PRECIPITAÇÃO DA XILANASE POR ADIÇÃO DE ETANOL 27

4.8 - PRECIPITAÇÃO DA /3-XILOSIDASE POR ADIÇÃO DE ETANOL 28

4.9 - PRECIPITAÇÃO FRACIONADA 29

4.10 - PRECIPITAÇÃO COM ÁCIDO TRICLOROACÉTICO (TCA) 30

4. 11 - INFLUÊNCIA DO PH DO MEIO DE CULTURA NA PRECIPITAÇÃO 30

4. 12 - MÉTODOS ANALÍTICOS 31

4.12.1 -Atividade enzimática da xilanase 31

4.12.2 -Atividade enzimática da ~-xilosidase 32

4.12.3 - Determinação do teor de proteínas totais 32

4.12.4 - Ensaios Eletroforéticos 33

4.13- PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL 34

4. 14 - DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS KM

(CONSTANTE DE MtCHAEL!slMENTEN) E VM {VELOCIDADE MAxlMA) DA /3-

X/LOSIDASE NO MEIO FERMENTADO INICIAL E APÓS A

RECUPERAÇÃO POR PRECIPITAÇÃO FRACIONADA 35

4.15 METODOLOGIA DE ANÁLISE DE RESULTADOS 36

5 - RESULTADOS E DISCUSSÕES 38

5.1 - ESTUDOS INICIAIS DE PRECIPITAÇÃO 38

5.1.1- Etanol 38

5.1.2 - Sulfato de Amônio 39

5.1.3 - Sulfato de Amônia na presença de Metilcelulose 40

5. 1.4 - Sulfato de Sódio 42

5.1.5 - Conclusão dos testes com agentes precipitantes 44

5.2 - SELEÇÃO DO MÉTODO DE DOSAGEM DE PROTEÍNA 44

5.3 - PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL 48

5.4 - PRECIPITAÇÃO DAS XILANASES E /3-XILOSIDASES 52

5.5 - PRECIPITAÇÃO FRACIONADA DAS ENZIMAS XILANOLÍTICAS 59

5. 6 - ELETROFORESE 61

5. 7 - CONSTANTES CINÉTICAS DA /3-XILOSIDASE INICIAL E DA

RECUPERADA POR PRECIPITAÇÃO 65

6 · CONCLUSÕES 68

.. 1,, -, ,-

1 -

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69

APÊNDICE

li

LISTA DE TABELAS Página

Tabela 2.1 - Processos de separação e tipos de separação (krijqsrnan,

1991) ', , 2

Tabela 2.2 - Enzimas precipitadas por sulfato de amônio 9

Tabela 2.3 - Enzimas precipitadas por solventes orgânicos 14

Tabela 2.4 - Purificação de enzimas xilanolíticas 23

Ta bela 4. 1 - Níveis das variáveis empregadas no~ experimental 34

Tabela 4.2 - Matriz para um planejamento fatorial 22 com ponto central 35

Tabela 5.1 - Efeito do etanol e tampões no método de Bradford e Lowry 46

Tabela 5.2 - Resultados do planejamento em Recuperação de Atividade

(RA) e em Aumento de Pureza (AP) 49

Tabela 5.3 -Análise de variância (ANOVA) para as variáveis a e b 50

Tabela 5.4 - Efeitos estimados para variáveis 1 e 2 50

Tabela 5.5 -Análise de variância do modelo 51

Tabela 5.6 - Variação do pH mediante a adição de etanol ao meio

fermentado 58

Tabela 5.7 - Aumento de pureza das enzimas xilanases totais e f3-

xilosidases em função da concentração de etanol aplicada na

precipitação do meio fermentado 59

Tabela 5.8 - Resultados obtidos pela precipitação fracionada 60

Tabela 5.9 - Balanço de atividades enzimáticas e proteínas totais da

precipitação fracionada 61

Tabela 5.1 O - kM e Vm da f3-xilosidase 66

Ili

LISTA DE FIGURAS Página

Figura 2.1 - Ordenação da água ao redor dos resíduos hidrofóbicos na

superfície da proteína (SCOPES, 1994) 7

Figura 2.2 - Concentração de acetona (0° e, ph 6,5) necessárias para

precipitar as seguintes proteínas encontradas em extratos de

tecido de músculo: fosforilase, piruvato quinase, aldolase,

lactato desidrogenase, enolase, creatina quinase,

fosfoglicerato quinase, mioquinase, mioglobina, parvalbumina

(em ordem decrescente de massa molar) (SCOPES, 1994) 13

Figura 2.3: (a) Enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da xilana.

ac: grupo acetil; a-4-o-me-glca: ácido a-4-o-metil glucurônico;

a-araf: a-arabinofuranose. (b) Hidrólise de

xilooligossacarídeos pela J3-xílosidase (SUNNA e

ANTRANIKIAN, 1997) 18

Figura 5.1 - Porcentagem de proteínas totais (•) e de atividade de

xilanase (D) solúveis após precipitação conduzida em meio

tamponado com tampão acetato 100 mM, pH 5,5, em função

da concentração de etanol, na temperatura de 4° e (os teores

de proteínas foram determinados pelo método de Bradford) ....... 39

Figura 5.2 - Recuperação por precipitação das xilanases totais em função

da concentração de sulfato de amônio 40

Figura 5.3 - Recuperação da atividade das xilanases totais em função

precipitação com sulfato de amônia na presença de O, 1 % de

metil celulose (•); recuperação das xilanases totais em

função da precipitação com sulfato de amônia (0) 42

Figura 5.4 - Recuperação das xilanases totais (•) e proteínas totais (D)

por precipitação em função da concentração de sulfato de

amônio 43

iv

Figura 5.5 - Interferência em mg/L na concentração de proteínas totais

causada pelo etanol na microanálise de Bradford 47

Figura 5.6 - Diagrama de interpretação dos efeitos de interação entre

concentração de etanol e pH no planejamento 22 50

Figura 5.7 -Recuperação(%) das enzimas xilanases totais, í3-xilosidases e

proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 4,6 53

Figura 5.8 - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, 13-xilosidases

e proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 5,9 53

Figura 5.9 - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, f3-xilosidases

e proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 6,3 54

Figura 5. 1 O - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, í3-xilosidases

e proteína totais em experimentos conduzidos no pH 7,0 54

Figura 5.11 - Recuperação por precipitação com etanol da atividade das

xilanases totais em diversos valores de pH 55

Figura 5. 12 - Recuperação por precipitação com etanol da atividade da 13-

xilosidase em diversos valores de pH 56

Figura 5.13 - Recuperação por precipitação com etanol das proteínas

totais em diversos valores de pH 57

Figura 5.14 - Eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) das

etapas da precipitação fracionada: linha 1 - marcador de

massa molar (66 kDa, 45 kDa, 36 kDa, 29 kDa, 24 kDa e

20, 1 kDa); linha 2 - fração inicial; linha 3 - precipitado obtido

após precipitação com 20% de etanol; linha 4 - precipitado

obtido após precipitação com 60% de etanol (massas molares

de 11 O e 104 kDa); linha 5 - precipitado obtido após

precipitação com 80% de etanol (31, 30 e 20 kDa) 64

V

Figura 5. 15 - Atividade da f3-xilosidase presente no meio inicial (D) e após

precipitação fracionada com etanol (•) em função da

variação da concentração de substrato (pNpX) 65

Figura 5.16 - Inverso dos valores da atividade da f3-xiiosidase presente no

meio inicial (D) e após precipitação fracionada com etanol(•)

em função do inverso das concentrações do substrato

(Lineweaver-Burk) 66

vi

RESUMO

Neste trabalho foi utilizada a precipitação como técnica de recuperação das enzimas xilanolíticas produzidas por Penícillium janthinellum em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Inicialmente a precipitação dessas enzimas foi realizada por processo de batelada, com os seguintes agentes precipitantes: etanol (concentrações de 1 O, 20, 30, 40, 50, 60, 70 e 80% v/v, pH 5,5 e a 4°C), sulfato de sódio (concentrações de 5, 15, 25, 40 e 60% p/p, pH 5,5 e a 25ºC), sulfato de amônio e sulfato de amônio com metilcelulose (concentrações de sulfato de amônio de 10, 20, 30, 40, 50 e 60 % da concentração de saturação; concentração de metilcelulose de 1 % p/v; pH 5,5 e a 25ºC). Foram precipitados aproximadamente 30% da proteína total com 40% de etanol, enquanto as xilanases permaneceram com 95% de atividade. Quase 100% da atividade xilanolítica foi recuperada com 80% de etanol. Com 50% de sulfato de amônio, precipitou-se toda a xilanase contida no meio, ao passo que com sulfato de amônio e metilcelulose foram necessários 40% de sulfato de amônio para obter o mesmo resultado. A máxima recuperação foi de 72% com 25% de sulfato de sódio. Em função dos resultados obtidos, realizou- se a precipitação com etanol em concentrações de 20, 40, 60 e 80% em diferentes valores de pH (4,6, 5,9, 6,3 e 7,0) e a 4°C, para comparar o comportamento da xilanase total com o da J3-xilosidase, ambas presentes no meio. Em seguida foi realizada uma precipitação fracionada dessas enzimas, em três etapas, com etanol em concentrações de 20, 60 e 80%, em pH 4,5 e a 4ºC. Aproximadamente 70% da proteína total do meio foi precipitada na primeira etapa (com 20% de etanol). A segunda etapa (com 60% de etanol) permitiu recuperar 75% da J3-xilosidase e aumentar a pureza 6 vezes. A massa molar da J3-xilosidase recuperada foi estimada entre 104 e 11 O kDa. Na terceira etapa da precipitação fracionada (com 80% de etanol), ocorreu a recuperação de 82% da xilanase total e a pureza aumentou 4,4 vezes. As massas molares das xilanases precipitadas na terceira etapa foram 20 e 30 kDa. As constantes cinéticas da J3-xilosidase antes da recuperação (Km=1,07 mM e Vm=0,35 U/ml) e após a recuperação (Km=1,03 mM e Vm=0,38 U/ml) foram similares, indicando que a precipitação praticamente não causou alteração nesses parâmetros.

ABSTRACT

Precipitation was used as a technique to recover xylanolytic enzymes produced by Penicillium janthinellum in sugar cane bagasse hemicellulosic hydrolysate. lnitially, the enzymes were precipitated batchwise with the following precipitants: ethanol (at concentrations of 1 o, 20, 30, 40, 50, 60, 70, and 80% v/v, pH 5.5, 4ºC), sodium sulfate (at concentrations of 5, 15, 25, 40 and 60%, pH 5.5, 25°C), ammonium sulfate and ammonium sulfate plus methylcellulose (concentrations of ammonium sulfate with 10, 20, 30, 40, 50 and 60% of saturation concentration; concentration of methylcellulose of 1 % w/v; pH 5.5, 25ºC). About 30% of total protein was precipitated with 40% ethanol, whereas xylanase remained with 95% activity. Almost 100% of the xylanase activity was recovered with 80% ethanol. With 50% ammonium sulfate, aü the xylanase present in the medium precipitated, whereas with ammoníum sulfate plus methylcellulose the sarne resu!t was attained with 40% ammonium sulfate. The maximum recovery value (72%) was achieved with 25% sodium sulfate. As a function of the results obtained, precipitation was performed with ethanol at concentrations of 20, 40, 60 and 80% at different pH values (4.6, 5.9, 6.3 and 7.0) and 4°C, in order to compare the behaviors of total xylanase and 13- xylosidase present in the medium. Additionally, a fractional precipitation of these enzymes was performed in three stages, at pH 4.5, 4°C, and 20, 60 and 80% ethanol concentrations. ln the first stage (20% ethanol) approximately 70% of total protein precipitated. ln the second stage (60% ethanol) 75% of 13- xylosidase was recovered and a 6-fold increase in purity was observed. The estimated molecular weight of recovered !3-xylosidase was inthe range of 104 to 11 O kDa. ln the third stage (80% ethanol), 82% of the total xylanase was recovered and purity increased 4.4-fold. The molecular weights of the xylanases that precipitated in this stage were 20 and30 kDa. The kinetic constants of 13- xylosidase bafore recovery (l<M=1.07 mM and Vrn=0.35 U/ml) and after recovery (i<M=1.03 mM and Vrn=0.38 U/ml) were similar, indicating that the precipitation practically did not affect these parameters.

1 - INTRODUÇÃO

Enzimas são proteínas que catalisam com grande eficiência as reações

biológicas. O uso crescente desses catalisadores em processos industriais

deve-se à alta sensibilidade e especificidade de suas reações químicas, bem

como ao avanço das pesquisas em genética e da tecnologia de processos

fermentativos para a produção de enzimas. No entanto, enzima obtida por

processo fermentativo geralmente encontra-se bastante diluída no meio de

cultivo, sendo portanto, a sua separação e purificação um fator crítico em

biotecnologia, principalmente pelos altos custos operacionais. O estudo de

técnicas visando a redução desses custos torna-se necessário à medida que se

deseja obter produtos competitivos e viáveis comercialmente (ASENJO, 1990).

Neste sentido, existe uma concentração de pesquisas para o desenvolvimento

de técnicas de separação e purificação que atendam à demanda desses

produtos tanto em qualidade como em quantidade (ROGALSKI e

LOBARZEWSKI, 1995; EL-HELOW e EL-GAZAERLY, 1996; PESSOA JR. e

VITOLO, 1996, 1997).

As enzimas xilanolíticas apresentam bom potencial de utilização

industrial e vêm sendo amplamente estudadas no meio acadêmico (KUMAR e

RAMóN, 1996; WONG et ai., 1994; ISHIHARA et ai., 1997, MILAGRES e

PRADE, 1994). A técnica escolhida para recuperar essas enzimas foi a

precipitação com etanol, tendo em vista sua simplicidade de execução, a

relativa abundância deste solvente orgânico em nosso país e a ampla aplicação

deste método no fracionamento de proteínas. em especial o plasma sangüíneo.

Esta técnica, em geral, proporciona baixo fator de purificação, mas, utilizando-

se da diferença de solubilidade entre as enzimas de interesse e as proteínas

contaminantes com relação à presença de diferentes concentrações do

solvente orgânico na solução, pode-se alcançar um significativo aumento de

pureza do produto final.

O presente trabalho insere-se na linha de pesquisa do Departamento de

Biotecnologia da FAENQUIL, sobre recuperação por precipitação das enzimas

xilanolíticas produzidas pelo fungo Penicillíum janthinellum cultivado em

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar.

1

2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 - DOWNSTREAM PROCESSING

O objetivo do "Downstream Processing" (DSP) é recuperar o produto de

um biorreator para o nível desejado de pureza e com a formulação correta. Para

isto, diferentes tipos de operações são envolvidas. Com exceção do

rompimento celular, secagem e formulação (o qual inclui imobilização),

processos de bioseparação formam o centro do "Downstream Processing"

(KRIJGSMAN, 1991, PESSOA JUNIOR, 1995).

A Tabela 2.1 apresenta um levantamento de processos de separação e

tipos de separação.

Tabela 2.1 - Processos de separação e tipos de separação (KRIJGSMAN,

1991)

Parâmetro de separação Dispositivo Tipo de separação

tamanho de partícula filtro/centrífuga/ separação de fases

sedimentador

densidade centrífuga/sedimentador separação de fases

difusão osmose reversa molecular

iônico troca iônica/eletrodiálise molecular

solubilidade extração molecular

pressão de vapor destilação molecular

atividade superficial adsorção molecular

DSP é particularmente importante em biotecnologia onde as formas

finais dos produtos são, usualmente, muito diferentes do estado em que são

obtidos no biorreator. Como exemplo, pode ser citado um típico processo de

fermentação que fornece uma mistura de massa celular com outros

componentes do meio nutriente. O produto desejado pode estar dentro da

2

célula, como constituinte de uma mistura muito complexa, no meio aquoso

diluído ou ainda distribuído entre os dois. Em qualquer caso, sua recuperação,

concentração e purificação necessita de várias operações, às quais são

também limitadas por aspectos econômicos. Muitas operações padrões nos

laboratórios tornam-se impraticáveis, ou dispendiosas, em processos

industriais. Além disso, bioprodutos são freqüentemente compostos sensíveis,

cujas estruturas ativas só podem ser preservadas sob condições limitadas de

pH, temperatura e força iônica. Em função destas restrições conclui-se que não

existem técnicas gerais, ou mesmo, uma seqüência de operações que possam

ser recomendadas para recuperação e purificação de produtos biotecnológicos.

Cada caso requer o estudo aprofundado para definição das operações

unitárias ideais (GLATZ, 1990, SCOPES, 1994, SCAWEN etal., 1985 ).

Entretanto, mesmo sendo onerosas as operações necessárias para

purificar diversos produtos biotecnológicos, há uma tendência de crescente

demanda desses produtos na próxima década. Pesquisas recentes apontam

um aumento médio anual de 12% nas vendas de produtos biotecnológicos nos

Estados Unidos, partindo de US$1 O, 1 bilhões no ano de 1996, para uma

previsão de US$32,4 bilhões no ano de 2006. As enzimas fazem parte de um

segmento de expressiva participação no contexto geral de produtos

biotecnológicos, o qual deve saltar de US$275 milhões em 1996 para US$1,6

bilhões no ano de 2006, perfazendo uma alta nas vendas de 19% ao ano

durante este período (SHAMEL e KEOUGH, 1995).

Para satisfazer a demanda destes produtos, várias são as técnicas de

"downstream processing" empregadas, dentre as quais podem ser citadas a

precipitação por sais, precipitação por polietilenoglicol, ultrafiltração, extração

em sistemas de duas fases aquosas e por micelas reversas, cromatografia,

precipitação por solvente orgânico e outras. A separação de proteínas de meios

aquosos por precipitação é um dos métodos industriais mais importantes de

recuperação e pré-purificação dessas biomoléculas (VIRKAR et ai., 1982). É um

processo de separação que consiste da conversão do soluto a sólido, o que

poderá, subseqüentemente, ser removido por uma etapa de separação sólido-

líquido. Idealmente, precipitação resulta em concentração e purificação

(GLA TZ, 1990). Na precipitação as proteínas são desconformadas, isto é, têm

3

sua estrutura tridimensional modificada, tratando-se portanto de um método

agressivo, pois a função bioquímica das proteínas depende de tal estrutura.

Este método somente se aplica quando a redissolução do precipitado é possível

(SCOPES, 1994).

Esta técnica é freqüentemente utilizada em etapas primárias na

seqüência de operações de "downstream", reduzindo o volume para estágios

posteriores (STRATILOVA et ai., 1996; MANSOUR et ai., 1996; KOYAMA et ai.,

1990). Para misturas menos complexas do que os extratos celulares é,

também, uma etapa efetiva de purificação. As principais vantagens do uso de

precipitação para concentração e purificação são: operações unitárias

facilmente adaptáveis em larga escala, possibilidade de execução de modo

contínuo e o uso de equipamentos simples. Além disso, existe uma vasta

quantidade de agentes precipitantes de custo reduzido ou que podem ser

utilizados em baixas concentrações (GLA TZ, 1990).

2.2 • FUNDAMENTO DA TÉCNICA DE PRECIPITAÇÃO: SOLUBILIDADE

Uma típica proteína globular possui em sua superfície zonas

hidrofóbicas, zonas hidrofílicas, incluindo grupos ionizáveis, e variam de uma

proteína para outra. Essas moléculas possuem, em geral, massa molar entre

1 O. 000 a 500. 000 Daltons. São porém compactas em comparação com outros

componentes que apresentam massas molares similares, como ácidos

nucléicos e polissacarídeos. As complexas interações entre a superfície da

proteína e o solvente ao seu redor determinam a sua solubilidade. Sendo

assim, uma proteína torna-se insolúvel pela alteração de suas características

superficiais ou pela mudança do solvente (GLA TZ, 1990; RICHARDSON et ai.,

1990; ROTHSTEIN, 1994).

A solubilidade é, portanto, o resultado de interações polares com o

solvente aquoso, interações iônicas com os sais presentes no meio, ou

repulsão eletrostática entre moléculas ou pequenos agregados solúveis de

moléculas. Os sais aumentam a solubilidade das proteínas por interações dos

íons com as suas cargas superficiais reduzindo as atrações eletrostátícas e as

cargas disponíveis. Na ausência de força iônica na solução. as cargas

4

superficiais ficam disponíveis, e assim, pode ocorrer agregação por atração

entre cargas opostas. As moléculas com elevada proporção de zona hidrofóbica

na superfície pouco interagem com o solvente orgânico sendo, portanto, pouco

solúveis. Uma carga total líquida próxima de zero (ponto isoeiétrico) minimiza as

repulsões eletrostáticas entre as moléculas de proteína, resultando em

interações entre as zonas hidrofóbicas (SCOPES, 1994).

A curva de solubilidade de proteína em função da concentração de sal

pode ser dividida em duas regiões. A primeira é uma região de baixa força

iônica, "salting-in", onde a solubilidade da proteína é maior do que sua

solubilidade em água pura. A segunda é uma região de alta força iônica, onde a

solubilidade da proteína cai e esse fenômeno é chamado de "saltinq-out"

(RICHARDSON et ai., 1990).

A primeira descrição quantitativa do "salting-out" foi feita por COHN

(1925) que propôs uma equação semi-empírica para descrever a precipitação

de proteínas puras com sais, como descrito na Equação 2.1

logS = J3 - Ksl (2.1)

onde S representa a solubilidade da proteína e I representa a força iônica da

solução. O parâmetro J3 é uma constante que representa a solubilidade da

proteína em sistema com força iônica zero e é função do tipo de proteína, pH e

temperatura. O parâmetro Ks é a constante de "salting-out" e é função do tipo

de precipitante, sendo independente do pH e da temperatura.

Posteriormente aos trabalhos de Cohn, diversas tentativas foram

efetuadas para predizer teoricamente a solubilidade da proteína, com relativo

sucesso, empregando teorias de interações eletrostáticas e modelando a

molécula da proteína como um íon dipolar. A hidrofobicidade foi também

considerada, além das interações eletrostáticas, como um fator preponderante

na solublidade de proteínas. MELANDER e HORVATH (1979) aplicaram a

teoria da cavidade de SINANOGLU e ABDULNAR (1965) para descrever o

efeito do sal neutro na solubilidade de proteínas. A baixa solubilidade de

proteínas em elevadas concentrações de sal foi postulada como sendo o

resultado do alto valor de energia livre necessária para abrir uma cavidade no

5

solvente para acomodar uma macromolécula solúvel. Uma descrição teórica da

solubilidade de proteína deve enfocar os parâmetros das interações

termodinâmicas entre protelna-sotvente e proteína-precipitante. Porém, a alta

precisão necessária para medir estes parâmetros tem implicado em limitada

aplicação deste enfoque. A equação de Cohn é, ainda, largamente utilizada em

situações práticas para fracionamento de plasma sangüíneo e isolamento de

enzimas (VAN OSS 1989; RICHARDSON et ai., 1990).

2.3 • "SAL TING OUT"

O "salting out" de proteínas trata-se de uma das técnicas mais

largamente usada na purificação de enzimas, a qual utiliza altas concentrações

de sais (ODA et ai., 1997; SCHAFER et ai. , 1997; OKAMOTO et ai. 1997).

Embora haja uma tendência para proteínas tipo globulina (proteínas que

possuem baixa solubilidade a baixa força iônica próxima de seu ponto

isoelétrico) também apresentar baixa solubilidade em altas concentrações de

sal, há muitas exceções. Assim, as soro y-globulinas, típicas proteínas que são

insolúveis a baixa concentração de sal, mas solúveis na força iônica fisiológica,

precipita com sulfato de amônio numa concentração relativamente baixa

(aproximadamente 1,5 M). Por outro lado, algumas outras soro globulinas (a e

í3), necessitam de concentrações mais altas de sais para precipitação (entre 2,5

e 3,0 M). O "salting out" é largamente dependente da hidrofobicidade da

proteína, ao contrário do "salting in" que depende da distribuição de cargas

superficiais e das interações polares com o solvente (SCOPES, 1994)

Uma molécula de proteína típica possui resíduos hidrofóbicos em sua

superfície (Phe, Tyr, Trp, Leu, lle, Met, Vai). O contato forçado desses resíduos

hidrofóbicos com o solvente aquoso causa uma ordenação nas moléculas de

água ao redor dos mesmos conforme mostrado na Figura 2.1.

6

Resíduos hi drofóbi cos na proteína

Figura 2.1 - Ordenação da água ao redor dos resíduos hidrofóbicos na

superfície da proteína (SCOPES, 1994)

Esta ordenação da água ao redor dos resíduos hidrofóbicos é

termodinamicamente instável, pois representa um grande decréscimo na

entropia comparada com a proteína não solvatada mais a molécula de água

livre.

Deste modo, uma maneira de descrever a agregação de resíduos

hidrofóbicos da superfície das proteínas, quando aplicado uma alta

concentração de sal, é que os sais adicionados são solvatados, tornando

escasso as moléculas de águas livres no meio. Portanto, desfaz-se a camada

de hidratação (facilitado pela instabilidade dessas hidratações) das regiões

hidrofóbicas (Figura 2.1 ), as quais ficam livres para interagirem-se formando os

agregados. Com isso, proteínas com maiores proporções de regiões

hidrofóbicas tendem a insolubilizarem-se mais facilmente frente ao contato com

sais em solução, ou seja, em menores concentrações salinas. Os sais, para

serem utilizados em precipitação, devem possuir algumas características, tais

como: não interagir diretamente com a proteína, pois pode causar sua

7

desestabilização; ser bastante solúvel, tendo em vista que são necessárias

altas concentrações para se efetuar a precipitação; aumentar a tensão

superficial do solvente, pois isso favorece as interações entre solutos como as

proteínas (ânions multivalentes como sulfato e fosfato com cátions tais como

potássio, sódio e amônia são preferidos). Assim, dos sais comuns que são

efetivos em causar precipitação, sulfato de sódio, potássio e amônio, fosfatos, e

citratos são os mais atrativos.

Embora o "salting out" dependa fortemente das interações hidrofóbicas,

outras características afetam a solubilidade das proteínas, tais como o pH e a

temperatura.

Proteínas existentes em fluidos celulares são muitos solúveis em

condições fisiológicas, ou seja, à força iônica gerada por sais na concentração

ao redor de O, 15 a 0,20 M. E como mencionado anteriormente, a agregação

pode ocorrer facilmente próximo do pH do ponto isoelétrico da proteína. Um

exemplo clássico é a precipitação em uma única etapa da gliceraldeído fosfato

desidrogenase extraída de músculo de coelho. A pH 6,0 , esta enzima é solúvel

em sulfato de amônia a 3,2 M, mas se o pH é ajustado para 7,5 ou mais, ocorre

a precipitação ou até mesmo a cristalização do extrato bruto. Seu ponto

isoelétrico medido a baixa concentração de sal é ao redor de 8,5 (SCOPES,

1994).

·- r

Na região do "salting out", a solubilidade de proteínas geralmente

decresce com o aumento de temperatura (SCOPES, 1994)

Na literatura é possível encontrar uma grande quantidade de autores

que se utilizam da precipitação com sulfato de amônia, e exemplos de alguns

destes trabalhos são mostrados na Tabela 2.2.

8

Tabela 2.2 - Enzimas precipitadas por sulfato de amônio

Microrganismo Enzima S.A.1 Rec2 AP3 Referência

(% satur.) (%) (vezes)

fungo termofílico xilanase 20-80 66,4 1,6 ISHIHARA et

HG-1 ai. (1997)

Cephalosporium xilanase 30-80 72,2 1,9 KANG etal.

sp (1996)

Cellulomonas sp xilanase 55 88,9 2,0 CHAUDHARY

e

DEOBAGKAR

(1997)

Aspergillus xilanase 0-40 71,7 2,5 ROGALSKI et

terreus ai. (1983)

Penicillium ~- 0-40 81,7 2,8 ROGALSKI e

nota tum gala:iosdase LOBARZEWS

Kl(1995) 1 Sulfato de Arrâ1o 2 Reo..Jp:ra;fu de~ 3 Aumento de Pureza

2.4-PRECIPITAÇÃO COM SAIS E ÉTERES DE CELULOSE

Partição por um sistema de duas fases aquosas é um método de

separação baseado na diferença de afinidade de células e macromoléculas

para duas fases aquosas imiscíveis (ALBERTSSON, 1986). Duas fases líquidas

imiscíveis são formadas pela mistura de soluções aquosas de dois polímeros ou

um polímero e um sal. Entretanto, um sistema composto de um líquido e um gel

deve ser formado ao invés de duas fases líquidas, sob condições definidas (tipo

de polímero, presença de sais, e concentração de sal e polímero)

(ALBERTSSON, 1986). O termo gel foi usado para descrever uma fase

polímero que é substancialmente menos fluida que a solução inicial, e pode até

conter algum sólido. Polietilenoglicol, dextrana e éteres de celulose

(hidroxipropil metilcelulose e metilcelulose) são exemplos de tais polímeros os

9

quais produzem gel sob a adição de sal (MIRANDA e BERGLUND, 1990,

1995).

Este é um processo de partição que utiliza um polissacarídeo não iônico

e alta concentração de sal, podendo ser, portanto, controlado por interações

hidrofóbicas. Tais interações são conhecidas ser o mecanismo responsável

pela ligação de proteínas a algumas colunas de polissacarídeos, tal como a

Sepharose 48 e celulose, a altas concentrações de sal (ARAKAWA, 1986).

Entretanto, MIRANDA e BERGLUND (1990) contradizem essa afirmativa

quando utilizaram hidroxipropil metilcelulose (HPMC) para particionar albumina

bovina, uma proteína com características hidrofóbicas bem conhecidas, e

obtiveram baixa recuperação na fase gel.

A vantagem de se usar este sistema seria a adição de características

desejáveis de precipitação para o processo de partição, já que o gel assemelha-

se a um precipitado (ALBERTSSON, 1986). A adição de metilcelulose (MC) em

um processo de precipitação por sulfato de amônio pode reduzir a quantidade

de sal necessária para realizar o "salting out" de enzimas, auxiliar na

preservação de sua atividade, além de possibilitar a utilização de flotação como

etapa posterior, devido às características hidrofóbicas do gel (MIRANDA e

BERGLUND, 1990, 1993)

MIRANDA e BEGLUND (1990) utilizaram HPMC e MC para recuperar a

enzima !3-amilase. Os autores afirmam não ter encontrado na literatura

trabaihos anteriores que se utilizam desse sistema para a recuperação de

biomoléculas. A recuperação da a-amilase utilizando combinação de partição

para uma fase sal-HPMC com subseqüente separação sólido-líquido em uma

coluna de flotação, mostrou-se uma técnica viável (MIRANDA e BERGLUND,

1993). CHEN e JANG (1995) purificaram a tripsina utilizando precipitação por

afinidade combinada com extração em duas fases aquosas. Neste sistema, o

inibidor de tripsina foi ligado ao hidroxipropil metilcelulose acetato succinato e

foi purificado em 4,98 vezes do extrato bruto e proporcionou um rendimento de

65%.

10

2.5- PRECIPITAÇÃO COM SOLVENTE ORGÂNICO

Álcool, acetona e outros solventes orgânicos, miscíveis em água, têm

sido usados para precipitar proteínas desde o início deste século (GLA TZ,

1990; ROYER et ai., 1992; BOWER, 1993; PLESZCZYNSKA et ai., 1994;

STRATILOVA et ai., 1996). Esses solventes têm sido especialmente

importantes quando aplicados em escala industrial, em particular no

fracionamento de p!asma sangüíneo (VAN OSS, 1989). Entretanto, seu uso em

escala de laboratório é menos extensivo, embora possua algumas vantagens

quando comparado à precipitação com sulfato de amônio. Como os princípios

causadores da precipitação por esses dois agentes são diferentes, a

precipitação com solvente orgânico não é necessariamente uma alternativa à precipitação com auxílio de sais como sulfato de amônia e de sódio, podendo

ser usado, inciusive, como uma etapa complementar. A adição de um solvente

miscível em água, tal como etanol ou acetona, em um extrato aquoso contendo

proteína, possui uma variedade de efeitos que, combinados, conduzem à

precipitação dessas proteínas. O principal efeito é a redução da atividade da

água. O poder de solvatação da água para uma molécula de proteína carregada

e hidrofílica é reduzido com o aumento da concentração do solvente orgânico.

Isto pode ser descrito em termos de redução da constante dielétrica do

solvente, ou simplesmente pelo deslocamento da massa de água, somado à imobilização das moléculas de água por hidratação do solvente (orgânico). A

estrutura ordenada da água ao redor das áreas hidrofóbicas na superfície da

proteína pode também ser deslocada pela molécula do solvente orgânico,

resultando numa maior solubilidade dessas áreas. Entretanto, o efeito global do

solvente orgânico, em proteínas solúveis em água, é o decréscimo na

solubilidade até o ponto de agregação e precipitação destas biomoléculas. As

principais causas da agregação são, provavelmente. forças eletrostáticas e

dipolares. Atrações hidrofóbicas são menos importantes por causa da influência

solubilizante do solvente orgânico nessas áreas. A precipitação ocorre em

baixas concentrações de solventes e em valores de pH próximos do ponto

isoelétrico das proteínas, o que sugere que a agregação é similar à que ocorre

na precipitação isoelétrica (GLATZ, 1990; DEY-D et ai., 1992; SCOPES, 1994).

11

A influência das forças eletrostáticas na precipitação de proteínas

explica a redução observada na concentração de solvente orgânico necessária

para realizar a precipitação no ponto isoelétrico e com baixa concentração de

sal (estas condições reduzem as forças repulsivas) (GLATZ, 1990).

O solvente orgânico deve ser completamente miscível em água, não

reagir com proteínas e ter um bom efeito precipitante. Os dois solventes mais

largamente utilizados são etanol e acetona. Outros solventes que podem ser

usados incluem o metanol, n-propanol, i-propanol, dioxano, 2-metoxietanol, e

vários outros álcoois, éteres e cetonas. Cuidados com segurança devem ser

tomados por causa da flamabilidade e vapores nocivos derivados de solventes

orgânicos. Por esta razão, dioxano, 2-metoxietanol e outros éteres não são

recomendados (SCOPES, 1994).

A precipitação com solvente orgânico também é afetada pelo tamanho

da molécula precipitada. Geralmente é necessário menores quantidades de

solventes orgânicos para precipitar moléculas de massas molares maiores. Ou

seja, se fosse comparada uma série de proteínas de diferentes dimensões

moleculares, mas com hidrofobicidade e pontos isoeléticos semelhantes, a

ordem de precipitação seria da maior para a menor proteína, à medida que se

fosse aumentando o teor de solvente orgânico no meio. Isto é explicado pelo

fato que as moléculas maiores agregam-se primeiramente por terem maior

chance de possuírem uma área superficial carregada que interaja com outra

proteína. Na prática, as diferentes composições das proteínas (zonas

hidrofóbicas, zonas hidrofílicas e grupos ionizáveis) de um dado meio, torna

esta regra apenas uma aproximação da real condição. A Figura 2.2 mostra

resultados experimentais relacionados ao tamanho das moléculas e também ao

efeito do ponto isoelétrico na precipitação com acetona em extratos de músculo

de coelho. Os pontos isoelétricos dos maiores componentes do extrato estão na

faixa de 6,0 a 7,5. Observa-se uma tendência de aumento da quantidade de

solvente orgânico necessário para precipitar as proteínas à medida que se

observa a redução de suas massas molares.

12

6

.. 5.5 (O

õ e 5 ftS ,,, ,,, co 4.5 e e, o ..J 4

3.5 o 20 40 60 80

Concentração de acetona (% v/v)

Figura 2.2 - Concentração de acetona (OºC, pH 6,5) necessárias para precipitar

as seguintes proteínas encontradas em extratos de tecido de músculo:

fosforilase, piruvato quinase, aldolase, lactato desidrogenase, enolase, creatina

quinase, fosfoglicerato quínase, mioquinase, mioglobina, parvalbumina (em

ordem decrescente de massa molar) (SCOPES, 1994).

A Tabela 2.3 mostra alguns dados coletados da literatura com relação à precipitação de enzimas utilizando diferentes solventes orgânicos. É possível

encontrar trabalhos que aplicam esta precipitação como etapa preparatória (ou

pré-purificação) para outras de purificação bem como patentes objetivando a

produção industrial. Etanol geralmente é o solvente orgânico mais empregado.

As interações do solvente com as zonas hidrofóbicas causam por vezes

uma desconformação irreversível da proteína. Esta desconformação resulta na

desnaturação e está relacionada com as interações hidrofóbicas

intramoleculares que ajudam a manter a estrutura protéica. Isto pode ser

minimizado pela redução da temperatura de precipitação até valores próximos a

OºC.

13

Tabela 2.3 - Enzimas precipitadas por solventes orgânicos

Microrganismo Solvente Rec1 AP2 Referência

(%) (vezes)

a- Aspergillus etanol 75 NE3 ANNUNZIATO E

galactosidase oryzae MAHONEY

(1987)

xílanase Tríchoderma etanol NE NE ROYER etal.

longibrachiatum (1992)

a-amilase Bacillus subtilis acetona 90 5.4 EL-HELOWe

etanol 83 5,2 EL-GAZAERLY

isopropanol 65 2,8 (1996)

metanol 62 5,4

n-propanol 66 5,7

xilanase Tríchoderma acetona 55 NE TAN et ai.

harzianum E-58 (1987b)

xilanase Aspergillus acetona 17 3,7 ROGALSKY et

terreus F-413 ai. (1983)

í3- Penícillium etanol+ 85,6 NE ROGALSKY e

galactosidase nota tum acetona a LOBARZEWSKY

3% (1995)

celulase e Tríchoderma etanol NE NE BOWER (1993)

xilanase reesei (patente)

a-amilase Bacillus subtilis acetona 98,5 NE SAFWAT et ai.

metanol 100 NE (1983)

etanol 93,8 NE

isopropanol 92,8 NE 1 Re:u~ de ativdade 2 A.umento de Pureza 3 NãJ Erroitracb

Em temperaturas baixas a flexibilidade da molécula é menor, reduzindo com

isto a capacidade de penetração do solvente. Entretanto, em temperaturas mais

elevadas, pequenas moléculas orgânicas penetram nas "frestas" da superfície

molecular, o que ocorre espontaneamente devido à flexibilidade natural da

estrutura, interagindo com os resíduos hidrofóbicos internos (resíduos de

aminoácidos como Leu, lle, Tyr, Phe, Vai). A temperaturas mais elevadas estas

14

interações hidrofóbicas internas são mais acentuadas e, portanto, mais

importantes na manutenção da integridade da molécula. A perda dessas

interações resulta rapidamente em desnaturação. Somado a isto está a

vantagem de se obter misturas com baixos pontos de congelamento entre água

e solvente orgânico (SCOPES, 1994).

2. 6 - PRECIPITAÇÃO FRACIONADA

Precipitação fracionada é uma importante operação tanto para escala

de laboratório quanto para escala industrial na recuperação e purificação de

proteínas. Esta técnica objetiva fracionar seletivamente uma proteína de

interesse de uma mistura de proteínas bem como de contaminantes não

protéicos como lipídeos e ácido nucléicos (CLARKSON et ai., 1996).

Precipitação fracionada é geralmente utilizada em dois cortes. No

primeiro corte, proteínas contaminantes de baixa solubilidade são removidas

pela fase precipitada e, geralmente, somente uma pequena parcela da enzima

de interesse também se precipita. No segundo corte, a proteína de interesse é

recuperada na fase precipitada, juntamente com algumas proteínas

contaminantes. Proteínas contaminantes de alta solubilidade podem

permanecer em solução. É necessário otimizar os pontos nos quais os cortes

são realizados para a obtenção de um nível aceitável de purificação e um alto

rendimento do processo. Na literatura encontra-se publicações focalizando este

problema que têm sugerido técnicas para melhorar a precipitação fracionada.

Estas técnicas incluem um método empírico para determinar a posição dos

cortes (SCOPES, 1994), o teste da propriedade específica de solubilidade

(FALCONER e TAYLOR, 1946), o método da linha derivativa (DIXON e WEB,

1961) e o diagrama de fracionamento (RICHARDSON et ai., 1990). Os dois

primeiros métodos foram desenvolvidos para sistemas com solubilidade bem

definida, enquanto que os métodos desenvolvidos por SCOPES (1994) e

RICHARDSON et ai. (1990) podem ser usados em extratos brutos, os quais são

mais representativos de processos industriais (CLARKSON et ai., 1996).

RICHARDSON et ai. (1990) removeram 44% de proteínas

contaminantes menos solúveis aplicando o primeiro corte a 40% da

15

concentração de saturação de sulfato de amônio na precipitação da enzima

álcool desidrogenase. No segundo corte, a 60% da concntração de saturação,

20% das proteínas totais permaneceram em solução enquanto que a enzima de

interesse foi recuperada na fase precipitada. Isto proporcionou um fator de

enriquecimento da álcool desidrogenase de até 3, 1 vezes. KANG et ai. (1996)

utilizaram sulfato de amônia na concentração de 30% da concentração de

saturação no primeiro corte da precipitação da xilanase do Cephalosporíum sp

(RYM-202). No segundo corte, elevou-se a concentração de sulfato de amônio

para 80% da concentração de saturação obtendo um rendimento de 72,2% para

um aumento de pureza de 1,9. OKADA e SHINMYO (1988) precipitaram a

xilanase do Bacillus pumílus com 20-60% da concentração de saturação de

sulfato de amônio obtendo 63% de recuperação com aumento de pureza de 3

vezes.

A precipitação fracionada causa uma pequena perda de recuperação

em função da precipitação de parte da proteína de interesse juntamente com as

contaminantes, entretanto, o aumento de pureza pode compensar esta perda.

Esta técnica é, portanto, um artifício que pode trazer vantagens à precipitação

de proteínas.

2. 7 - XILANASES

2.7.1 - Importância e características da xilanase

Matérias primas lignocelulósicas são a maior fonte renovável de

biomassa do mundo, são composta principalmente de lignina, celulose e

hemicelulose. Muitas das pesquisas atuais são no sentido de utilizar a fração de

celulose para a produção de combustível líquido. No entanto, se produtos com

valores agregados significativos forem obtidos a partir da lignina e da

hemicelulose, torna economicamente mais viável o processamento desses

materiais (TAN et ai., 1988).

0-xilanas são os mais abundantes polissacarídeos hemicelulósicos em

madeiras duras (madeira de folhosas) e plantas anuais, equivalendo a 20-35%

do total de peso seco. Em madeiras moles (madeira de coníferas) são

encontradas em menor quantidade, compreendendo aproximadamente 8% do

16

peso seco. A estrutura básica da xilana é uma cadeia principal de resíduos í3-D-

xilopiranosídeo (ligações 1 ~4). Ligadas a esta cadeia linear estão as variadas

cadeias laterais curtas. A composição química dos grupos laterais substituintes

e a frequência de sua ocorrência depende da origem da xilana, bem como do

procedimento usado na sua extração (HALTRICH et ai., 1996; BASTAWDE,

1992; COUGHLAN e HAZLEWOOD, 1993).

Tradicionalmente, xilanases em conjunto com enzimas celulolíticas têm

sido utilizadas na bioconversão de materiais lignocelulósicos, especialmente

resíduos produzidos por agricultura e silvicultura, para obtenção de produtos

importantes, tais como os combustíveis (BIEL Y et ai., 1985).

Entretanto, como xilanas podem ser facilmente hidrolisadas por ácidos,

a degradação enzimática torna-se uma alternativa menos atrativa para a

produção de açúcares fermentecíveis. Xilanases podem ser usadas para

propósitos mais específicos, tal como a produção de xilooligossacarídeos de

xilana isolada o qual é feito no Japão em escala comercial (PELLERIN et ai.,

1991). Os xilooligossacarídeos assim produzidos (principalmente xilobiose e

xilotriose) são usados como adoçantes alternativos.

Devido à heterogeneidade estrutural, sistemas enzimáticos de

degradação de xilana incluem diversas enzimas. As mais conhecidas são a

endo-~-D-xilanase, que ataca a cadeia principal das xilanas, e a ~-xilosidase,

que hidrolisa xílooligossacarídeos a D-xilose (SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).

Somado a essas duas enzimas, diversas enzimas de atividades acessórias são

necessárias para a desramificação de xilanas substituídas (HAL TRICH et ai.,

1986), tais como a-glucuronidase. acetil (xilana) esterase e a-

arabinofuranosidase.

A Figura 2.3 mostra o conjunto de enzimas extracelulares requeridas

para a hidrólise da hemicelulose.

1 -. -- . ~_.,..,

17

Figura 2.3: (A) Enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da xilana. Ac:

grupo acetil; a-4-o-Me-GlcA: Ácido a-4-o-metil glucurônico; a-Araf: a-

arabinofuranose. (8) Hidrólise de xilooligossacarídeos pela 13-xilosidase

(SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).

18

Dentre as enzimas que participam na quebra das cadeias laterais

destacam-se a a-D-glicuronidase e as esterases que participam na liberação

dos substituintes acetil, cumaril e feruloil. Estas enzimas atuam em sinergismo

com as endo-xilanases e as f3-xilosidases (ERICKSSON, 1990; COUGHLAN e

HAZLEWOOD, 1993).

Endoxilanases

13-1,4-Endoxilanase (1,4-j3-xilana xilohidrolase; EC 3.2.1.8) cliva as

ligações internas da cadeia principal heteroxilana resultando num decréscimo

do grau de polimerização do substrato. O ataque não é randômico, e as

ligações a serem hidrolisadas dependem da natureza do substrato (por

exemplo, tamanho e grau de ramificação do substrato ou a presença de

substituintes). Durante o início da hidrólise da xilana, os principais produtos

formados são os xilooligossacarídeos. Com o prosseguimento da hidrólise,

esses xilooligossacarídeos são hidrolisados a xilotriose, xi!obiose e xi!ose

(SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).

13-xilosidase

13-D-xilosidases (13-D-xilosídeo xilohidrolase EC 3.2.1.37) são

exoglicosidases que hidrolisam xilooligossacarídeos e xilobiose, da extremidade

não redutora, para liberar xilose. São enzimas capazes de clivar substratos

artificiais como p-nitrofenil f3-D-xilosídeo (COUGHLAN e HAZLEWOOD, 1993).

Bactérias e fungos têm sido reportados como fontes produtoras de 13- xilosidases. São enzimas com massas molares maiores que as endoxilanases,

situando na faixa de 60 e 360 kDa, são mono ou diméricas, podendo ser intra

ou extracelular (SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997). Geralmente, j3-xilosidases

purificadas não hidrolisam xilana, entretanto, há alguns trabalhos onde registra-

se a ação neste substrato para a produção de xilose. Entre os xilooligômeros,

xilobiose geralmente é o melhor substrato para a ação enzimática da 13- xilosidase. A afinidade da enzima com relação a xilooligossacarídeo decresce

com o aumento do grau de polimerização (DP). Muitas f3-xilosidases têm

19

característica transferase, resultando em produtos de massa molar maior que o

substrato utilizado (SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997)

2.7.2 - Aplicações biotecnológicas

Um dos fatores determinantes do uso de xilanases em larga escala

certamente é o custo dos preparados enzimáticos. Consideráveis progressos

têm ocorrido nos últimos anos na identificação de parâmetros de processos que

são importantes para obter altas concentrações de xilanases e produtividade,

influenciando economicamente a utilização desta enzima. O custo das fontes de

carbono, bem como os componentes adicionais do meio, são os principais

fatores de uma produção econômica de xilanases. Substratos purificados, tais

como xilana ou celulose, os quais são vendidos como produtos de química fina,

são freqüentemente utilizados em laboratórios porque geralmente induzem alta

atividade xilanolítica. Já para a produção das enzimas em alta escala, estes

substratos tornam-se muito caros. Alternativamente, a biomassa lignocelulósica

constitue uma fonte de carbono menos dispendiosa, que é disponível em larga

quantidade, como produtos residuais da indústria de processamento de

lignocelulósicos (HAL TRICH et ai., 1996).

Enzimas degradadoras de xilana têm um potencial considerável em

diversas aplicações biotecnológicas. Em alguns processos. é requerido o uso

de enzimas purificadas, entretanto, em outras aplicações, a presença de

enzima adicional é desejada. Aplicações comerciais sugeridas para as

xilanases envolvem a conversão de xilana, que está presente em detritos da

indústria agrícola e de alimentos, em xilose (BIEL Y, 1985). Similarmente,

xilanases poderiam ser usadas para a clarificação de sucos, para a extração de

café, óleo de plantas e amido. Outra aplicação das xilanases é o uso da enzima

na dieta de aves domésticas. A utilização de xilanase na dieta de galinhas e

pintos melhorou o ganho de peso e a conversão de alimentos. A eficiência da

xilanase em melhorar a qualidade de pães tem sido demonstrada. A introdução

de xilanase e amilase na massa resultou em aumento do volume específico do

pão (SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).

20

Atualmente, o uso de xilanases no branqueamento de polpa de papel

tem sido considerado uma das mais importantes aplicações biotecnológicas

destas enzimas (VIIKARI et. ai., 1994). O impacto ambiental causado pelas

águas residuais da indústria de polpa e papel, especialmente a formação de

compostos orgânicos cloradas, é uma preocupação atual que vem merecendo a

atenção pública (VIIKARI et ai., 1991, 1994; COUGHLAN e HAZLEWOOD,

1993). O branqueamento enzimático de polpa tem resultado em uma redução

de 20 a 30% do uso de compostos cloradas neste processo (VIIKARI et ai.,

1991 , 1 994).

O reflexo da importância do branqueamento enzimático está no fato que

um significante número de indústrias de papel e polpa dos Estados Unidos e

Escandinávia estão usando xilanase em seus processos de branqueamento

(DANEAULT et ai., 1994; WONG et ai., 1994).

As xilanases do fungo P. jathínellum são capazes de reduzir a carga de

cloro no branqueamento da polpa de eucalipto com um simultâneo ganho de

alvura (DURAN et ai., 1995). Algumas xilanases produzidas por esse fungo

foram estudadas, e apresentaram as seguintes características: massa molar = 54.000 e 20.100 Da; ponto isoelétrico = 5,5; 6,0 e 6,5; estabilidade a variações

de pH de 4,0 a 8,0 e estabilidade à temperatura de até 50°C por 30 min

(MILAGRES e LACIS, 1991, MILAGRES et ai., 1993, RODRIGUES, 1997)

As xilanases já estão sendo produzidas e comercializadas para

diversos fins. HAL TRICH et a/.(1996), em uma pesquisas entre empresas

produtoras de enzimas obtiveram uma relação de quinze enzimas disponíveis

no mercado, dentre as quais três são citadas a seguir como exemplo:

1 - Alltech lnc. (3031 Catnip Hill Pike, Nicholas-ville, KY 40356, USA).

Pentosanase (xilanase) "Allzym PT", produzida por Aspergíllus niger em

fermentação submersa, pó com uma atividade xilanolítica de 600-700 IU/g

analisada pelo método de BAILEY et ai. (1992). temperatura ótima de 65°C (5

min), pH ótimo de 5,3, recomendada como auxiliar na alimentação animal.

2 - Amano Pharmaceutical Co., Ltd (1-2-3 Nishiki Naka-ku, Nagoia 460,

Japan). Hemicelulase "Amano"90, produzida por A. níger em fermentação em

estado sólido em farelo de trigo, pó com uma atividade de 90000 U/g, 100

unidades libera 1 mg de xilose por minuto de xilana (pH 4,5, 40°C) medido pelo

21

método SN, temperatura ótima de SOºC (30 min), pH ótimo de 4,5,

recomendada para uso em indústria de alimentos e farmacêutica.

3 - Genencor lnternational Europe Ltd (Kyllikin-portti 2, P.O. Box 105, 00241

Helsinki, Finland). "Multifect XL", produzido por T. longibrachiatum em

fermentação submersa, preparação líquida com uma atividade de 445 IU/ml,

medido usando xilana de aveia tingida com azul brilhante de remazol (pH 4,5,

40°C), temperatura ótima entre 55-60°C (20 min), pH ótimo entre 5,0-5,5,

recomendada para uso em indústria de alimento.

2.7.3 - Extração e purificação de xilanases

Fungos filamentosos são interessantes produtores de xilanases de um

ponto de vista industrial, devido ao fato que excretam enzimas degradadoras de

xilana para o meio, eliminando assim a etapa de rompimento celular.

Adicionalmente, o nível de atividade xilanolítica de culturas fúngicas são,

tipicamente, maiores que as culturas de leveduras e bactérias (HAL TRICH et

ai., 1996).

0-xilanases têm sido purificadas de várias fontes usando várias

combinações de técnicas, tais como cromatografia de troca iônica,

cromatografia de permeação em gel, focalização lsoelétrica. eletroforese e

cristalização. Na Tabela 2.4 são citados exemplos de diversas técnicas de

purificação utilizadas para purificar enzimas xilanolíticas. No entanto, esses

processos citados são lentos, caros e de difícil aumento de escala, portanto,

ineficientes para uma produção em maior escala (TAN et ai., 1988). Como

alternativa esses mesmos autores propõem a utilização de ultrafiltração para a

purificação da xilanase obtida do fungo Tríchoderma reeseí, com o qual obteve

uma recuperação de 77% e baixa atividade celulolítica (atividade

celulolítica:atividade xilanolítica = 1: 1000).

22

Tabela 2.4 - Purificação de enzimas xilanolíticas

Enzima Microrganismo M Etapa de R, AP2 Autor (kOa) purificação (%) (vezes)

xilanase Thermoascus 32 Cromatografia de 47 3, 1 TAN et ai.,

aurantiacus troca iônica (1987 a)

xilanase Robillarda sp. 18 Foca 1. isoelétrica 31,3 5,8 KOYAMA Y-20 (pH 3-10) et ai.

(1990)

Focal. isoelétrica 13,4 8,8

(pH 8-10,5)

Filtração em gel 8,6 9,0

í3- Neurospora 83 Focal. isoelétrica 87,5 24 DESHPANOE

xilosidase crassa Eletrof. em gel de 41,7 130 et ai.

poliacrilamida (1986)

í3- Aspergi/Jus 180 Q-Sepharose 50 6,3 KUMARe

xilosidase nidulans Cromatografia de 45,2 28,4 RAMÓN

troca iônica (1996)

Filtração em gel 27,2 89,2

Rendimento Aumento de Pureza

Estudos vêm sendo realizados pelo Departamento de Biotecnologia da

Faculdade de Engenharia Química de Lorena para a extração e purificação das

xilanases do P. janthinellum, os quais incluem este trabalho, utilizando-se de

técnicas com potencial para a aplicação industrial (extração líquido-líquido por

micelas reversas, extração líquido-líquido em sistemas de duas fases aquosas

e precipitação). RODRIGUES (1997) obteve uma recuperação de 73% da

atividade enzimática e um aumento de pureza de 7 vezes para uma

endoxilanase constituinte do complexo enzimático. Os estudos com duas fases

aquosas estão em andamento (COSTA et ai .. 1997), bem como estão iniciando

estudos de extração por micelas reversas da í3-xilosidase pré-purificada por

precipitação fracionada com etanol.

23

3 - OBJETIVOS

O objetivo principal deste trabalho foi realizar a recuperação das

enzimas xilanases totais e ~-xilosidase, obtida do cultivo de Penicillium

janthinellum em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar,

utilizando a técnica de precipitação.

Para alcançar este objetivo, foram desenvolvidas as seguintes atividades:

• Determinação da recuperação das xilanases totais pela precipitação com os

seguintes agentes precipitantes: etanol, sulfato de amônio, sulfato de amônio

em presença de metilcelulose e sulfato de sódio.

• Verificação da influência do pH e da porcentagem de etanol na precipitação

das xilanases totais utilizando um planejamento estatístico.

• Precipitação das enzimas xilanases totais e ~-xilosidase em diversos valores

de pH e verificação das condições para o fracionamento por precipitação

fracionada.

• Execução da precipitação fracionada das enzimas xilanases totais e ~-

xilosidase.

• Avaliação preliminar das constantes cinéticas da enzima í3-xilosidase.

24

4 - MATERIAIS E MÉTODOS

4. 1 • MICRORGANISMO

O microrganismo utilizado no presente trabalho foi o fungo Penicillium

janthinellum CRC 87M-115, isolado de madeira em decomposição em Lorena-

SP por MILAGRES (1988).

4.2 - MEIO DE CULTURA FORMULADO A PARTIR DO HIDROLISADO HEM/CELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE- AÇÚCAR

Para a produção do hidrolisado foi utilizado bagaço de cana-de-açúcar

proveniente da Usina Nova América S/A, Tarumã/SP.

O procedimento de hidrólise foi realizado conforme descrito por

MILAGRES, LACIS (1991). Foi utilizado 46 mg de H2S04 p.a. por grama de

matéria seca em uma relação de matéria seca:solução ácida de 1: 1 O. O bagaço

foi seco a 80ºC até ser atingida a umidade de 10%, passando em seguida por

um moinho com peneira de 20 "mesh". Posteriormente, foi tratado com ácido

(20 ml de ácido sulfúrico p.a. e 8 L de água para 800 g de bagaço) e

autoclavado a 121 ºC por 45 minutos. A fração líquida, constituída

principalmente por hemiceluloses, foi recuperada por filtração em papel de filtro

e levada a pH 5,5 com NaOH 1 N.

A partir do hidrolisado hemicelulósico foi preparado um meio para

cultivo de P. janthinellum com adição de solução mineral de Vogel (2% v/v) e

extrato de levedura (O, 1 % p/v). O meio foi autoclavado por 15 minutos a 112ºC.

4.3 - PRODUÇÃO DAS ENZIMAS XILANOLÍT/CAS

O meio de cultura usado para obtenção de esporos de P. Janthinellum

.foi composto por 2% de glicose, 0,25% de extrato de levedura, 2% (v/v) de

solução mineral (VOGEL, 1956), e 2% de ágar-ágar, autoclavado por 15

minutos a 112ºC. Cada mililitro de solução mineral continha citrato de sódio

25

dihidratado (O, 125 g), fosfato monobásico de potássio (0,25 g), nitrato de

amônio (O, 1 O g), sulfato de magnésio heptahidratado (O, 1 O g), cloreto de cálcio

dihidratado (0,05 g), ácido cítrico (0,25 mg), sulfato de zinco heptahidratado

(0,25 g), sulfato ferroso amoniacal pentahidratado (0,05 mg), sulfato de cobre

pentahidratado (0,015 mg) e sulfato de manganês dihidratado (0,002 mg)

(MILAGRES, 1988).

Em 100 mL de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar

adicionou-se 1 g de extrato de levedura. Transferiu-se o hidrolisado para uma

proveta, adicionou-se 20 ml de solução de Vogel e completou-se o volume

para 1000 ml. Distribuiu-se o meio em 40 frascos de Erlenmeyer de 125 mL (25

ml medido com pipeta). A produção das xilanases foi realizada com· a

inoculação de 105 esporos/ml nos frascos de Erlenmeyer, com agitação a 60

rpm, 30°C, por 5 dias. O meio fermentado foi filtrado em papel de filtro

(Millipore) utilizando vácuo. As atividades enzimáticas foram determinadas

como descrito no item 4.12.1 e 4.12.2 e foram de 40 a 50 U/mL para as

xilanases totais e de O, 13 a 0,20 U/ml para a !3-xilosidase.

4.4 - ESTOCAGEM DO MEIO FERMENTADO

Após a produção da enzima em frasco de Erlenmeyer, o meio

fermentado foi separado das células por filtração em papel, distribuído em

frascos de vidro no volume de 30 ml e mantido congelado a -18°C.

4.5- PRECIPITAÇÃO DA XILANASE COM SULFATO DE AMÔNIO E SULFA TO DE AMÔN/0 COM MET/LCELULOSE

Os experimentos foram conduzidos em tubos "Eppendorf' de 1,5 mL

usando 500 µL de meio contendo xilanases. Em seguida adicionou-se solução

de metil celulose (O, 1 % p/v para todas as amostras) e sulfato de amônio (1 O,

20, 30, 40 , 50 e 60 % da concentração de saturação) ou somente sulfato de

amônio num total de 1,0 ml. A mistura foi homogeneizada em vórtice (marca

PHOENIX, modelo AP 56) e após 1 O minutos de repouso, para se efetuar a

26

nucleação, foi centrifugada a 10000 xg (Centrífuga marca Jouan, Modelo 1812).

Os ensaios foram realizados à temperatura de 25ºC. O precipitado foi

redissolvido a 1,0 ml com tampão acetato de sódio pH 5,5, 50 mM e a

atividade enzimática das xilanases totais foi determinada. Os resultados foram

expressos em porcentagem de atividade enzimática recuperada no precipitado

em relação a atividade presente no meio fermentado inicial.

4.6- PRECIPITAÇÃO DA XILANASE COM SULFATO DE SÓDIO

Os experimentos foram conduzidos em tubos de centrífuga de 15 ml,

onde adicionou-se o sal na forma sólida sobre o meio fermentado tamponado

no pH 5,5, de modo a atingir as concentações de 5, 15, 25, 40 e 60% (p/p).

Depois da adição do sal os tubos continham 5,0 g da mistura, que foi agitada

por 15 segundos em vórtice à temperatura de 25 ºC. O precipitado foi coletado

por centrifugação (6000xg, 20 min) e então redissolvido em tampão acetato de

sódio pH 5,5, 50 mM para a mesma massa inicial. A atividade enzimática e o

teor de proteínas totais foram determinados no precipitado redissolvido e na

amostra inicial.

4. 7 - PRECIPITAÇÃO DA XILANASE POR ADIÇÃO DE ETANOL

O meio fermentado foi previamente tamponado no pH desejado (4,0,

5,5 ou 7,0, pela adição de nove partes do meio para uma parte do tampão a

1 M), transferido para um frasco de Erlenmeyer (50ml) e resfriado a uma

temperatura de 4°C (em banho de gelo e dentro de uma câmara fria a 6ºC). O etanol também foi previamente resfriado (OºC) e adicionado ao meio sob

agitação (agitador magnético). Foi efetuado o monitoramento da temperatura

durante o desenvolvimento desta etapa para que esta não ultrapassasse 4ºC. O

cálculo do volume de etanol adicionado foi efetuado de acordo com a Equação

4.1.

27

v; x100 %etanol= (4.1)

Vt:a + Vam + Vet

Sendo:

% etanol= concentração de etanol 0/N) Vet= volume de etanol adicionado ao meio fermentado (mL);

ve= volume de tampão adicionado ao meio fermentado (mL);

Vam= volume do meio fermentado (mL).

A adição de etanol foi efetuada através de bureta manual por

gotejamento para· evitar elevação da temperatura do meio causada pela

liberação de calor.

Após a adição do etanol, a mistura foi mantida refrigerada e em repouso

para possibilitar nucleação do precipitado que foi, em seguida, separado por

centrifugação a 2000xg por 30 min numa temperatura próxima de OºC. O precipitado obtido foi redissolvido em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5 à temperatura ambiente.

Para confecção da curva de solubilidade, os ensaios foram realizados

diretamente em tubo de ensaio, sob refrigeração em banho de gelo

(temperatura de <4ºC), com adição de etanol do tipo batelada e agitação em

vórtices.

Para o cálculo da recuperação e do aumento de pureza das xilanases

foram analisadas a atividades enzimáticas e os teores de proteínas totais do

meio inicial e do precipitado obtido. Devido à grande quantidade de etanol

presente no meio não foi possível a quantificação da atividade enzimática no

sobrenadante, obtido após a precipitação.

4.8- PRECIPITAÇÃO DA /3-XILOSIDASE POR ADIÇÃO DE ETANOL

Na tentativa de melhorar a recuperação das atividades enzimáticas foi

alterada a metodologia utilizada na precipitação descrita pelo item 4.7. Todos os

28

ensaios realizados a partir da análise das enzimas xilanolíticas, incluindo a 13- xilosidase, foram executados conforme está descrito abaixo.

O meio fermentado contendo as xilanases, previamente tamponado

com o pH desejado, foi adicionado em um becker de 25 ml, o qual, juntamente

com um tubo de ensaio contendo etanol, foi levado a um banho termostatizado

(Marca Heto, modelo CB 15-25) à temperatura de -3° C, e deixado em repouso

por 15 minutos para a estabilização. Este procedimento evita que a temperatura

ultrapasse 4°C quando se adiciona o etanol ao meio fermentado. Com o auxílio

de bomba peristáltica o etanol foi transferido lentamente ao becker contendo o

meio fermentado. A temperatura foi monitorada constantemente e a agitação

executada manualmente com bastão de vidro. Após a adição completa do

etanol, a mistura foi mantida em repouso sob refrigeração (-3ºC) por 15

minutos, e então, levada à centrifugação (2400xg por 15 min, 4°C). Após a

centrifugação o precipitado foi separado do sobrenadante e redissolvido em

tampão acetato de sódio pH 5,5, 50 mM.

4.9 - PRECIPITAÇÃO FRACIONADA

O meio fermentado foi previamente tamponado em pH 4,6 na proporção

de 9 partes de meio fermentado para 1 parte de tampão acetato de sódio 1 M,

pH 4,0, e adicionado em um becker de 200 ml, que foi levado ao banho

termostatizado na temperatura de -3ºC e deixado em repouso por 15 min para

estabilização. Em um tubo de ensaio adicionou-se o etanol em volume

suficiente para atingir a concentração de 20% v/v (20 partes de etanol para 80

partes de meio fermentado) quando adicionado ao meio e em seguida foi levado

ao banho e mantido em repouso por 15 min. Através de bomba peristáltica o

etanol foi transferido ao becker contendo o meio fermentado em uma

velocidade suficiente para que a temperatura no interior do recipiente não

ultrapassasse 4°C. A agitação foi executada manualmente com auxílio de um

bastão de vidro. Após a adição completa do etanol, o meio foi mantido em

repouso e refrigerado (-3°C) por 15 min. Em seguida foi centrifugado a 2400 x g

por 15 min. O precipitado foi separado e em seguida redissolvido em tampão

29

acetato de sódio pH 5,5, 50 mM. Foram analisados o teor de proteínas pelo

método de Bradford, as atividades enzimáticas das xilanases totais e da 13- xilosidase e foi feita a eletroforese em gel de poliacrilamida da amostra obtida.

O sobrenadante foi imediatamente levado ao banho termostatizado

onde todo o procedimento foi repetido para as duas etapas seguintes:

precipitação com etanol na concentração de 60 e de 80%.

4.10 - PRECIPITAÇÃO COM ÁCIDO TRICLOROACÉTICO (TCA)

Cada uma das frações (inicial, 20, 60 e 80% de etanol) foi precipitada

por TCA para que pudessem ser analisadas por eletroforese. À uma alíquota de

1 O ml de cada uma das frações adicionou-se 1 g de TCA. O material foi

mantido em banho de gelo por uma hora e centrifugado a 6700xg por 15

minutos a 4°C. Os sobrenadantes foram desprezados, o sedimento lavado em

acetona a -20ºC e centrifugado a 6700xg por 15 minutos a 4°C. O sedimento foi

redissolvido em 0,4 ml de NaOH 0, 1 M.

4.11 - INFLUÊNCIA DO pH DO MEIO DE CULTURA NA PRECIPITAÇÃO

Para verificação da influência do pH do meio de cultura na precipitação

das xilanases totais, [3-xilosidase e das proteínas totais, foram realizados

experimentos em meios com diversos valores de pH, utilizando soluções

tampão adequadas (1 M). Uma parte desse tampão (1 M) foi misturada a nove

partes de meio contendo a enzima de tal forma que a molaridade final resultante

da mistura fosse de 0, 1 M.

As atividades enzimáticas e os teores de proteínas totais foram

analisados após a correção do pH.

30

4.12 - MÉTODOS ANALÍTICOS

4.12.1 -Atividade enzimática da xilanase

A atividade da xilanase foi determinada através da quantidade de

açúcares redutores liberados a partir da xilana, de acordo com o método de

BAILEY et ai. (1992). Os açúcares redutores foram dosados pelo método do

ácido 3,5-dinitrosalicflico (DNS) (MILLER, 1959).

A solução de xilana 1 % foi preparada a partir de 1 g de xilana

("birchwood"- Sigma) adicionada em 80 ml de tampão acetato de sódio 0,05 M,

pH 5,5. A mistura foi fervida sob agitação até completa dissoiução e o volume

completado para 100 ml, com o mesmo tampão.

Um volume de 0,9 ml de xi!ana 1 % foi colocado em tubos de ensaio, os

quais foram mantidos em banho termostatizado à temperatura de 50° C. Em

seguida, acrescentaram-se 100 µL das amostras contendo enzima. Após 5

minutos, adicionaram-se 1,5 ml de DNS para dosagem dos açúcares redutores

liberados, e em seguida a reação foi paralisada com o aquecimento da mistura

em banho de água fervente por 5 minutos. Após o resfriamento dos tubos, em

banho de água à temperatura ambiente, foram efetuadas as leituras de

absorbância a 540 nm em espectrofotômetro (Shimadzu modelo UV-150-02),

previamente calibrado com DNS adicionado de solução tampão (tampão

acetato de sódio 50 mM, pH 5,5).

Para detectar as unidades redutoras não provenientes da hidrólise

enzimática da xilana, foram utilizados dois controles. O primeiro, constituído de

xilana, tampão acetato e o DNS, para detectar a presença de açúcares

redutores contidos na solução de xilana utilizada como substrato sem a ação da

enzima. O segundo, constituído de tampão acetato, meio fermentado contendo

a enzima e o DNS (sem a presença da xilana), para detectar a presença de

açúcares redutores no próprio meio fermentado. Das leituras obtidas com as

amostras são descontadas as absorbâncias verificadas para os controles do

31

substrato e enzima. A curva padrão foi estabelecida a partir de xilose (Merck),

nas concentrações de 2 a 10 µmol/ml

Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de

enzima necessária para liberar 1 µmol de açúcar redutor expresso como xilose

por minuto, a 50°C.

4.12.2 - Atividade enzimática da 13-xilosidase

A atividade da 13-xilosidase foi determinada através da quantidade de p-

nitrofenol liberada após a ação da enzima numa solução de p-nitrofenil-13-0-

xilopiranosídeo (pNpX) em água (KUMAR e RAMÓN, 1995).

Um meio de reação contendo 250 µL de 2 mM de p-nitrofenil-13-0-

xilopiranosídeo (pNpX) em água e 250 µL do meio fermentado devidamente

diluído em tampão acetato de sódio (50 mM, pH 5,5) foi incubado a 50° C por

30 min. A reação foi interrompida pela adição de 1 ml de solução de carbonato

de sódio 2M. A absorbância do p-nitrofenol liberado após a ação da 13-xilosidase

foi medida em espectrofotômetro a 400 nm e comparada com uma curva

padrão.

Uma unidade de atividade de 13-xilosidase foi definida como a

quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de p-nitrofenol/min/ml nas

condições descritas acima.

4.12.3 - Determinação do teor de proteínas totais

A determinação de proteínas totais foi baseada nos métodos de

BRADFORD (1976) e de LOWRY (1951).

O método de Bradford emprega o reagente "Comassie Brilliant Blue" G-

250 e padrões de BSA ("bovine serum albumin") nas concentrações entre 200 a

1000 mg/L para a construção da curva de calibração. Inicialmente, o "Comassie

Brilliant Blue" (100 mg) foi dissolvido em 50 ml de etanol a 95% sob agitação

vigorosa, sendo depois misturado com 100 ml de ácido fosfórico a 85%. Diluiu-

32

se a mistura com água deionizada para o volume de 1000 ml, e a solução

obtida foi filtrada para remoção de insolúveis formados. As leituras foram feitas

em espectrofotômetro a 595 nm em soluções contendo 5 ml deste reagente e

O, 1 ml da amostra analisada.

A microanálise de Bradford emprega o mesmo reagente contendo

"Coomassie Brilliant Blue" utilizado na análise padrão. Mas, foram utilizados

padrões de BSA nas concentrações de 20 a 200 mg/L. As leituras foram feitas

em espectrofotômetro a 595 nm em soluções contendo 1 ml deste reagente e

O, 1 ml da amostra analisada.

O método de Lowry utiliza o reagente "Folin-Ciocalteau phenol" 1 N, e

como padrão para a curva de calibração, soluções de BSA nas concentrações

de 50 a 1 OOOmg/l. Para essa análise, foi empregado o método de Lowry

modificado onde foram preparadas três soluções estoque, sendo: 1) sulfato de

cobre pentahidratado a 1 %; 2) tartarato de sódio e potássio tetra hidratado a

2% e; 3) carbonato de sódio a 2% em solução O, 1 N de hidróxido de sódio.

Pipetou-se uma alíquota determinada de cada solução estoque (1 ml da

solução 1; 1 ml da solução 2; 88 mi da solução 3), adicionou-se 1 O ml de uma

solução de SOS-Na a 1 %, e essa nova solução foi misturada e agitada com a

amostra a ser analisada (4 ml da solução; 0.4 ml da amostra). Adicionou-se

0.4 ml do reagente de "Folin" sob agitação. Após 30 min a absorbância foi lida

em espectrofotômetro a 578 nm.

4.12.4 - Ensaios eletroforéticos

As massas molares das enzimas foram determinadas através da

mobilidade eletroforética em condições desnaturantes em gel de poliacrilamida

12,5%, contendo SOS de acordo com o método descrito por WEBER et ai.

(1972). A corrida eletroforética foi realizada à temperatura ambiente, utilizando

tampão Tris-glicina pH 8,9 contendo SOS (O, 1%). A coloração dos géis foi

realizada durante 12 horas a 37 ºC com uma solução contendo 100 mg de azul

brilhante de "Comassie Blue" em uma mistura de 45 ml de metanol, 10 ml de

ácido acético glacial e 45 ml de água destilada. A descoloração foi feita com

33

lavagens sucessivas em uma solução contendo 100 mL de ácido acético, 450

mL de metanol e 450 mL de água destilada.

Foram utilizados como padrões as seguintes proteínas: ~-galactosidase

(116 kDa); Fosforilase (97,4 kDa); Albumina de soro bovino (66 kDa);

Ovalbumina (45 kDa); Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (36 kDa); Anidrase

carbônica (29 kDa); Tripsogênio de pâncreas bovino (24 kDa) e Inibidor de

tripsina (20, 1 kDa).

4.13 - PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

A determinação das variáveis ótimas para a precipitação da xilanase foi

realizada através de um planejamento experimental. Foram testadas duas

variáveis (pH e concentração de etanol) adotando um planejamento fatorial com

2 níveis (valor mínimo e valor máximo) e 1 experimento no ponto central. Para

este tipo de planejamento e para investigar todas as combinações possíveis

foram realizados um número de experimentos igual a 2" (BARROS NETO et ai.,

1995), onde n representa o número de variáveis testadas somadas a duas

repetições no ponto central. Nas Tabelas 4.1 e 4.2 são mostrados os valores

atribuídos para cada variável e o quadro representativo dos ensaios realizados,

respectivamente.

Tabela 4.1 - Níveis das variáveis empregadas no planejamento experimental

ITEM VARIÁVEL NÍVEL MÍNIMO PONTO CENTRAL NÍVEL MÁXIMO o +

A pH 4,0 5,5 7,0

B % ETANOL 40 60 80

Os valores da Tabela 4.1 foram baseados em resultados observados

na literatura. Os valores de pH situam-se dentro da faixa de atuação e de

estabilidade das enzimas xilanolíticas, conforme determinado por MILAGRES

(1994).

34

Tabela 4.2 - Matriz para um planejamento fatorial 22

com ponto central

EXPERIMENTO VARIÁVEL

A B

1 4,0 40

2 7,0 40

3 4,0 80

4 7,0 80

5 5,5 60

6 5,5 60

7 5,5 60

4.14 - DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS KM (Constante de

Michaelis/Menten) e Vm (Velocidade máxima) DA /3-XILOS/DASE NO MEIO

FERMENTADO INICIAL E APÓS A RECUPERAÇÃO POR PRECIPITAÇÃO

FRACIONADA

Foi medida a atividade enzimática (conforme descrito no ítem 4.12 2) da

(3-xilosidase no meio fermentado inicial e após a purificação parcial dessa

enzima através da precipitação fracionada com etanol (ítem 4.9), utilizando as

seguintes concentrações de substrato (pNpX): 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3;0;

4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 15,0 e 20,0 mM. Os valores de~ e Vm foram determinados

pelo método de Lineweaver-Burk (LEHNINGER, 1976).

35

4.15- METODOLOGIA DE ANÁLISE DE RESULTADOS

Para a avaliação dos processos de recuperação das enzimas foram

analisados os seguintes parâmetros: aumento de atividade específica ou fator

de enriquecimento; recuperação em proteína total e recuperação em atividade

enzimática.

• Definiu-se atividade específica (AE) como:

AE = atividade da enzima (U/mL) I proteínas totais (mg/mL)

Ambas relativas a mesma fase analisada.

• Definiu-se então aumento de pureza (AP) como:

AP = AE2/AE1

Sendo:

AE2 = atividade específica na fase precipitada (U/mg);

AE1 = atividade específica da amostra antes da purificação (U/mg).

• Definiu-se como recuperação em proteína total (RP) como:

RP = P2/P1 X 100

Sendo:

P2 = proteína total na fase precipitada (mg);

P1 = proteína total antes da purificação (mg).

As massas de P1 e P2 correspondem à concentração de proteína multiplicada

pelo volume da fase considerada.

• Definiu-se como recuperação em atividade enzimática (RA) como:

RA = A2 I A1 X 100

Sendo:

36

A2 = atividade na fase precipitada (U);

A1 = atividade antes da purificação (U).

As atividades A1 e A2 correspondem à atividade enzimática multiplicada pelo

volume da fase considerada.

• Planejamento experimental e análise estatística

Os fatores respostas (fator de enriquecimento e recuperação de

atividade) foram medidos em função do pH e da concentração de etanol para

cada um dos dois fatores: nível mínimo (valor codificado: -) e nível máximo

(valor codificado: +). Precipitações representando todas as quatro (22)

combinações foram feitas, assim como, três precipitações representando o

ponto central (valor codificado: O). Todos os fatores foram medidos duas

vezes, assim como o ponto central.

A análise estatística dos resultados foi feita com auxílio do programa

estatístico STATGRAPH 6.0.

37

5 - RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 - ESTUDOS INICIAIS DE PRECIPITAÇÃO

Alguns agentes precipitantes foram inicialmente testados para verificar

as suas influências na precipitação das xilanases presentes no meio

fermentado. Foram testados os seguintes precipitantes: etanol, sulfato de sódio,

sulfato de amônio e sulfato de amônio mais metilcelulose.

5. 1.1- Etanol

A solubilidade da xilanase em meios contendo de 1 O a 80 % em volume

de etanol foi determinada adotando como critério de avaliação as medidas de

atividades enzimáticas e dos teores de proteínas remanescentes na solução

após a precipitação com etanol. O meio de cultura foi tamponado com tampão

acetato pH 5, 5, de tal forma que a concentração final do tampão no meio de

precipitação resultasse em O, 1 M. Os ensaios foram realizados em triplicata,

num volume total de 5 ml. Os resultados obtidos são mostrados na Figura 5. 1.

Pela curva de solubilidade, pode-se observar que aproximadamente

100% da atividade da xilanase foi precipitada com adição de 80% de etanol.

Com 40% de etanol no meio observa-se, ainda, que aproximadamente 30% da

proteína total é precipitada enquanto que mais de 95% da atividade enzimática

permanece em solução. Isto sugere que a realização de uma precipitação

fracionada nesta concentração de etanol poderá proporcionar um aumento da

atividade específica da enzima.

38

100 90 80 70

(1) 60 > ,::, 50 o

(f) 40 ~ o

30 20 10

o o 1 O 20 30 40 50 60 70 80 90

% etanol

Figura 5. 1 - Porcentagem de proteínas totais (•) e de atividade de xilanase (O)

solúveis após precipitação conduzida em meio tamponado com tampão acetato

100 mM, pH 5,5, em função da concentração de etanol, na temperatura de 4° C

(Os teores de proteínas foram determinados pelo método de Bradford). - ·-

5.1.2 - Sulfato de Amônio

Na precipitação das enzimas xilanolíticas do P. janthinellum com até

20% da concentração de saturação de sulfato de amônio a recuperação da

atividade enzimática foi inferior a 5%. A 30% da concentração de saturação o

resultado é próximo de 10% de recuperação, e a 40% da concentração de

saturação de sulfato de amônio pode-se obter uma recuperação da xilanase de

aproximadamente 30%. Toda xilanase contida no meio fermentado foi

recuperada na precipitação a 50% da concentração de saturação de sulfato de

amônio (Figura 5.2). Em geral é necessário utilizar este sal em concentrações

de 40 a 80% da concentração de saturação para se obter uma boa recuperação

da atividade enzimática. ISHIHARA et ai. (1997) utilizaram 80% da

concentração de saturação de sulfato de amônia para precipitar 66,4% da

atividade da xilanase do fungo termofílico HG-1. CHAUDHARI e DEOBAGl<AR

(1997) utilizaram 55% da concentração de saturação de sulfato de amônia para

39

precipitar 88,9% da atividade da xilanase do Cellulomonas sp. Sendo assim, os

resultados obtidos para a xilanase do P. Janthinellum são satisfatórios, e em

primeira análise, até superiores a muitos outros encontrados na literatura.

100

- ~ 80 o - o 1(0 o- 60 ~ Q) a. ::l 40 (J Q)

o:::

O 1 O 20 30 40 50 60 70

Sulfato de Amônio (% de saturação)

Figura 5.2 - Recuperação por precipitação das xilanases totais em função da

concentração de sulfato de amônio.

Os resultados mostrados na Figura 5.2 sugerem que esta técnica pode

ser aplicada na precipitação da xilanase do P. janthinellum quando se deseja

extraí-la do meio fermentado, pois proporciona boa recuperação da atividade.

Nestes experimentos iniciais não foram analisados os teores de proteínas totais

e portanto, não foi determinado o aumento de pureza proporcionado por esta

precipitação.

5.1.3 - Sulfato de Amônio na presença de Metilcelulose

A adição de metil celulose na concentração de O, 1 %, juntamente com o

agente precipitante (sulfato de amônio), no meio fermentado contendo xilanase,

permitiu obter recuperação mais elevada da enzima no precipitado quando

comparado com a precipitação utilizando somente sulfato de amônio. Na

40

Figura 5.3 observa-se que foi necessário 40% da concentração de saturação de

sulfato de amônio para uma recuperação total da atividade enzimática contra os

50% necessários quando aplicado somente sulfato de amônio ao mesmo meio

fermentado. Resultado semelhante foi encontrado por MIRANDA e BERGLUND

(1990) quando reduziu de 40 para 30% da concentração de saturação de

sulfato de amônio necessário para precipitar 98% da atividade da J3-amilase

quando em presença de 0,2% de metilcelulose. Na precipitação da xilanase do

fungo Termoascus aurantiacus foi necessário utilizar 50% da concentração de

saturação de sulfato de amônio para obter 79% de recuperação da atividade

enzimática na fase precipitada. Os mesmos 79% de recuperação foi obtido com

40% da concentração de saturação de sulfato de amônio quando ao meio

fermentado foi adicionado metilcelulose a O, 1 % (CORTEZ et ai., 1996).

MIRANDA e BERGLUND (1990) propuseram duas possíveis

explicações para a redução de sulfato de amônio necessário para precipitar a J3-

amilase. Primeiramente supõe-se que a J3-amilase e o polímero (metilcelulose)

interajam entre si, formando um complexo que possua solubilidade menor

perante a adição de sal. A segunda explicação é baseada no "salting-out" do

polímero, o qual necessita de no máximo 20% da concentração de saturação de

sulfato de amônia para ocorrer quase 100% de formação da fase gel. A partir

daí, supõe-se que a enzima particione para a fase gel depois da sua formação.

É somado então. o efeito da partição da enzima para a fase gel ao "salting-out",

o que reduz a quantidade de sal necessária à precipitação.

Esta constatação torna-se relevante à medida que pode-se reduzir a

quantidade de sulfato de amônio necessária para obter um mesmo valor de

recuperação. O metilcelulose é de grau alimentício e ainda parece auxiliar na

manutenção da atividade enzimática quando aplicado na precipitação com

sulfato de amônio de uma a-amilase (MIRANDA e BERGLUND, 1993). Este

mesmo autor utilizou o precipitado da a-amilase com sulfato de amônio na

presença de metilcelulose para posteriores etapas de flotação, utilizando-se da

característica hidrofóbica do metilcelulose. Outro fator importante é que o

polímero é utilizado em pequena quantidade (O, 1 % p/v) e pode ser reciclado por

reprecipitação.

41

20

100

~ !?.... 80 o

1g' 60 .....

<D a. :::i 40 o <D a::

o -->-~----~----~---~---------~~~__. O 1 O 20 30 40 50 60 70

Sulfato de Amônio (% de saturação)

Figura 5.3 - Recuperação da atividade das xilanases totais em função

precipitação com sulfato de amônio na presença de O, 1 % de metil celulose (•);

recuperação das xilanases totais em função da precipitação com sulfato de

amônio (D).

5.1.4 - Sulfato de Sódio

O sulfato de sódio pode ser facilmente separado quando em solução

pois cristaliza-se a baixas temperaturas com relativa facilidade, o que possibilita

a sua reciclagem. Sendo assim, torna-se uma alternativa ao sulfato de amônio,

cuja principal desvantagem é justamente o resíduo de sua utilização como

agente precipitante, os quais não são facilmente recicláveis e possuem

propriedades corrosivas.

Verifica-se na literatura que poucos trabalhos utilizam este sal como

agente precipitante de enzimas, quando comparado ao sulfato de amônio (VAN-

ERP-R et ai./, 1991). Talvez isso se deve a sua baixa solubilidade em

42

temperatura ambiente, o que limita a sua aplicação em enzimas estáveis à temperaturas abaixo de 35°C. Outra desvantagem é seu custo mais elevado.

Os resultados apresentados na Figura 5.4 indi~m que a recuperação

máxima da atividade das xilanases totais é de 72% a 25% (p/p) de sulfato de

sódio. Em concentrações mais elevadas deste sal observa-se uma queda na

recuperação da atividade enzimática (64% de recuperação a 40% de sulfato de

sódio; 50% de recuperação a 60% de sulfato de sódio) o que pode ter ocorrido

por desnaturação da enzima.

O máximo de recuperação das proteínas totais foi de 68% em 40%

(p/p) de sulfato de sódio. Analisando o perfil das duas curvas (recuperação de

proteínas totais e recuperação de atividade da xilanase, Figura 5.4) não foi

observado a possibildade de se executar precipitação fracionada com obtenção

de aumento de pureza, pois a solubilidade das proteínas totais é aproximadamente semelhante à solubilidade das xilanases totais, quando

submetidas ao contato com sulfato de sódio. O único benefício desta

precipitação seria, portanto, um fator de concentração.

80

70 - 60 :::R. o - o 50 t(O (.),, co 40 .._ a., a. 30 ::J (.) a., 20 cr.:

10

o o 10 20 30 40 50 60 70

Sulfato de Sódio (% p/p)

Figura 5.4 - Recuperação das xilanases totais (•) e proteínas totais (D) por

precipitação em função da concentração de sulfato de sódio.

43

5.1.5 - Conclusão dos testes com agentes precipitantes

Seguindo a proposta inicial, a precipitação com etanol foi a técnica

escolhida para dar sequência aos trabalhos, visto as seguintes vantagens

observadas: alta recuperação da atividade enzimática na fase precipitada;

solubilidade diferenciada entre as enzimas de interesse e proteínas totais e

facilidade de execução.

A precipitação com sulfato de amônio também mostrou-se atrativa, pois

proporcionou alta recuperação da atividade enzimática no precipitado. Mesclar

precipitação com sulfato de amônio e partição em duas fases aquosas com

metilcelulose também apresentou resultados satisfatórios. Portanto, sugere-se

que as duas técnicas sejam estudadas em trabalhos futuros.

5.2 - SELEÇÃO DO MÉTODO DE DOSAGEM DE PROTEÍNA

O método de Lowry para determinação da concentração de proteínas

totais é um dos mais utilizados devido à sua simplicidade, sensibilidade e

precisão. Porém, suas principais desvantagens são: pouca especificidade e

interferência de diversos compostos (PETERSON, 1979; LOWRY et et., 1951).

O método de Bradford é rápido, mais específico para proteínas, e não

apresenta tantas interferências como o método de Lowry (BRADFORD, 1976).

Para selecionar qual desses métodos de dosagem de proteínas seria

adotado nos experimentos de precipitação com etanol, foram estudadas as

influências nos métodos de Bradford e Lowry ocasionadas pelos reagentes

empregados nas precipitações (tampões e etanol).

Foi testado etanol porque no sobrenadante resultante da precipitação,

este reagente pode ser encontrado em concentração de até 80% (v/v). Foi

observado valores baixos de absorvância (item 1 da Tabela 5.1) quando este

reagente foi submetido às duas técnicas (análise padrão) o que correspondeu a

baixos valores de massa de BSA. Isto está de acordo com a literatura, na qual

44

verifica-se que etanol não registra absorvância quando sumetidos a essas

análises (BRADFORD, 1976; LOWRY, 1951).

Os tampões acetato de sódio pH 4,0 e pH 5,5, fosfato pH 7,0, também

foram testados. Neste trabalho estes tampões foram utilizados no preparo e

tamponamento do meio fermentado nos diversos valores de pH. Para o método

de Lowry foi testado somente o tampão acetato de sódio pH 4, o em função da

escolha do método de Bradford para continuação dos trabalhos.

Com os baixos valores de absorvância obtidos (itens 2, 3 e 4 da Tabela

5. 1) pode-se afirmar que estes tampões não interferem nos métodos de

Bradford e de Lowry.

Verificou-se também a influência dos tampões e etanol quando os

mesmos são misturados em igual volume com uma concentração conhecida de

BSA (itens 5, 6, 7 e 8 da Tabela 5.1). Os valores de massa de BSA

determinados por essas análises aproximam-se do valor real. Podemos afirmar,

portanto, que não ocorreu interferência nos métodos testados. A pequena

variação ocorrida pode ser interpretada como erro experimental

Os valores apresentados na Tabela 5.1 foram obtidos quando O, 1 ml

de cada substância potencialmente interferente foi analisada pelo método de

Bradford, análise padrão, ou 0,2 ml de cada substância foi analisada pelo

método de Lowry.

Após a realização de testes para verificar a influência de vários

prováveis interferentes (principalmente dos componentes presentes nos

tampões utilizados nas precipitações) nos métodos de análise de proteína, foi

escolhida a técnica de Bradford para dar continuidade aos trabalhos devido à sua maior simplificidade e rapidez de execução.

Porém, em função do baixo teor de proteína presente no meio

fermentado contendo as enzimas xilanolíticas, ficou definida que as

determinações seriam feitas utilizando a microanálise de BRADFORD (1976),

pois esta detecta proteínas com concentrações na faixa de 20 a 200 mg/L.

45

Tabela 5.1 - Efeito do etanol e tampões no método de Bradford e Lowry

Absorvância Massa de BSA

Teste Substância Bradford Lowry Bradford Lowry Real

595 nm 578 nm µg

1 Etanol 0,042 0,027 4,2 -1 o 2 Tampão acetato de sódio 50 mM, 0,012 -0,012 1,4 -44 o

pH4,0

3 Tampão fosfato 50 mM, pH 7,0 0,008 NR 1,1 NR o 4 Tampão acetato de sódio 50mM, 0,017 NR 1,9 NR o

pH5,5

5 Sol. BSA 1000 mg/L + etanol (1: 1) 0,455 0,546 48 57 50

6 Sol. BSA 1000 mg/L + tampão 0,514 0,490 55 51 50

acet. de sódio 100 mM pH 4,0

(1: 1)

7 Sol. BSA 1000 mg/L + tampão 0,519 NR 56 NR 50

fosfato 50 mM pH 7,0 (1:1)

8 Sol. BSA 1000 mg/L + tampão 0,495 NR 51 NR 50

acetato de sódio 50 mM, pH 5, 5

(1:1)

NR - não realizado

Para se fazer um balanço de massa que melhor representasse o

comportamento das proteínas totais durante as precipitações resolveu-se

determinar as concentrações dessas proteínas tanto na fase precipitada como

na fase sobrenadante. Primeiramente alguns testes foram realizados para

verificar a influência da concentração de etanol na microanálise de Bradford. A

Figura 5.5 apresenta esses resultados com etanol nas concentrações de 20, 40,

60 e 80% v/v.

46

50

-. 40 ...J - O>

-S 30 ro -~ ~ 20 e o.

10

o 20 40 60 80 100

% etanol (v/v)

Figura 5.5 - Interferência (em mg/L) na concentração de proteínas totais

causada pelo etanol na microanálise de Bradford.

Como se pode verificar, em concentrações mais elevadas de etanol a

sua interferência sobre o método torna-se mais significativa (ao contrário da

análise padrão) atingindo quase 50 mg/L de proteína quando a concentração de

etanol é de 80%. Portanto, no sobrenadante obtido após uma precipitação,

onde há altos teores de etanol (até 80%) e também baixas concentrações de

proteínas, torna-se difícil quantificá-las utilizando a microanálise de Bradford.

Sendo assim, nos experimentos conduzidos neste trabalho, a

quantidade de proteínas existentes, a exemplo do que ocorreu com as

determinações das atividades enzimáticas, foi determinada somente no

precipitado, onde não se observou interferência do etanol residual nos métodos

analíticos.

47

5.3 - PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

Segundo a literatura, vários são os fatores que influenciam a

precipitação de proteínas por etanol, como concentração do solvente, pH,

velocidade de adição de etanol, temperatura e concentração de sais (força

iônica) (SCOPES, 1994). Mas, de acordo com resultados apresentados por

LUCARINI (1996) os dois fatores que mais influenciaram a precipitação com

etanol de amiloglicosidade foram o pH e a concentração de etanol. Em função

disso esses dois parâmetros foram aqui estudados para verificar as suas

influências na recuperação das xilanases através da precipitação por etanol

com auxílio de um planejamento experimental 22 + ponto central (Tabela 5.2).

As condições das precipitações do planejamento experimental 22 +

ponto central foram as seguintes:

• concentração de etanol: 40, 60 e 80% 0/N) • pH: 4,0, 5,5 e 7,0

Os valores de pH foram selecionados em função da estabilidade e do

ponto isoelétrico (pi = 5,5) de uma isoenzima (endoxilanase) produzida pelo P. Janthinel/um nas mesmas condições deste trabalho e isolada por MILAGRES

(1994). As concentrações de etanol foram definidas de acordo com a literatura

(ROGALSKI et ai., 1995, LUCARINI, 1996).

Após a análise estatística (Tabelas 5.3 e 5.4) os resultados indicaram

que, para esta série de experimentos o fator "pH" não interferiu na variável

resposta testada (% recuperação de enzimas). Nem mesmo a sua interação

com o outro fator "concentração de etanol" foi significativa. Uma análise

estatística para a variável resposta "Aumento de Pureza" (Tabela 5.2) também

foi realizada e apresentou resultados semelhantes aos das Tabelas 5.3 e 5.4.

48

Tabela 5.2 - Resultados do planejamento experimental expresso em

recuperação de atividade (RA) e em aumento de pureza (AP).

Fator

Experimento pH %Etanol RA(%) 1 AP2

1 3, 1 0, 1

2 + 2,7 0, 1

3 + 70,4 1,2

4 + + 64,6 1,2

ponto central

5 o o 37, 1 0,8

6 o o 33,0 0,7

7 o o 22.6 0,6

1 RA = Recuperação em atividade 2AP = Aumento de Pureza

Os efeitos individuais dos fatores experimentais e suas interações

sobre as variáveis respostas estão mostrados na Tabela 5.4. Como pode ser

observado pelo teste t, o pH e suas interações com a concentração de etanol

não apresentaram influência significativa ao nível de 5% de probabilidade.

Somente a porcentagem de etanol (fator 8) mostrou-se significativa (p<O, 05) na

variação da resposta. Isto contradiz a literatura, a qual menciona o pH como

fator significativo na precipitação. Segundo SCOPES (1994), o pH do ponto

isoelétrico deve ser o mais favorável na precipitação de enzimas. Isso pode ter

ocorrido pelo fato que o meio fermentado contém um complexo enzimático com

diferentes isoenzimas de diferentes valores de pontos isoelétricos.

A Figura 5.6 mostra como os níveis dos fatores estudados interferem

na precipitação da xilanase. Variando-se o fator A (de -1 para +1), observa-se

na Figura 5.6 que não ocorre uma variação significativa da variável resposta

(de 1,25 para 0,88 ou de 68,55 para 62,75). Esta variação é muito pequena em

relação às encontradas quando se varia o fator B (de 1,25 para 68,55 ou 0,88

para 62,75). Portanto, os níveis mais altos de porcentagem de etanol produzem

melhores resultados, independente do pH utilizado.

49

Tabela 5.3 -Análise de Variância (ANOVA) para as variáveis A e B

Efeito Soma dos Grau de Média dos Fator F p

quadrados liberdade quadrados

Fator A 9,52 1 9,52 0,20 0,6902

Fator B 4171,22 1 4171,22 87, 17 0,0026

AB 7,37 1 7,37 O, 15 0,7248

Total (erro) 143,55 3 47,85

Total (corr.) 4331,66 6

R2= O 96 R2 (ajust. grau de liberdade) = 0,93 f

Tabela 5.4 - Efeitos Estimados para variáveis 1 e 2

Variáveis Estimativa dos efeitos Erro Padrão t

média 33,36 +/- 2,61 12,79

Fator A -3,08 +/- 6,91 0,45

Fator B 64,58 +/- 6,91 9,34*

AB -2,71 +/-6,91 0,40

*Significativo ao nível de 5% de probabilidade (t1ab=3, 182) Para t>t1ab mostra que a variável é significativa

1 68,55 62,75

Fator B

-1 1,25

-1 Fator A

0,88

1

Figura 5.6 - Diagrama de interpretação dos efeitos de interação entre

concentração de etanol e pH no planejamento 22.

50

O coeficiente de determinação (R2 = 0,96) obtido na análise de

variância (Tabela 5.3) permitiu a determinação de um modelo estatístico

polinomial de primeira ordem, representado pela Equação 5.1:

y = 33,4 + 32,3 8 (5.1)

onde: y corresponde à recuperação da xilanase prevista em percentagem (%) e B

corresponde ao valor codificado para a variável porcentagem de etanol.

O modelo estatístico para a recuperação das xilanases totais foi

determinado através de urna regressão linear pelo método dos Mínimos

Quadrados em função da variável B (% de etanol) a qual se mostrou

significativa ao processo. A validade deste modelo foi verificada através de uma

Análise de Variância (Tabela 5.5) onde pode ser observado que a regressão

obtida foi estatisticamente significativa (p< 0,05) com coeficiente de

determinação R2 = O, 96.

Tabela 5.5 -Análise de Variância do modelo

Fonte Somados Grau de

quadrados liberdade

Média dos

quadrados

Fator-F Valor de P

Modelo 4171,22 1

Erro 160,43 5

4171,22

32,08

129,99 0,0001

Total(corr.) 4331.66 6

R = 0,96 R2 (ajustado por grau de liberdade) = 0,95 Erro padrão= 5,66

A recuperação da xilanase foi da ordem de 65% para uma

concentração de 80% de etanol obtida nos experimentos 3 e 4 (Tabela 5.2), e

não confirmou os dados anteriormente mostrado na curva de solubilidade

(Figura 5. 1 ), onde foi constatado 100% de recuperação de xilanase para essa

mesma concentração de etanol. É bem provável que esta alteração seja

resultante da diferente forma de condução dos experimentos.

51

5.4 PRECIPITAÇÃO DAS XILANASES E fJ-XILOSIDASES

Apesar do pH ter sido verificado como uma variável não significativa na

precipitação com etanol das xilanases, novos experimentos foram realizados

onde se variou o valor do pH inicial das precipitações. Nesta série de

experimentos foi incluída a análise da recuperação da 13-xilosidase, uma

isoenzima que foi detectada no meio fermentado do P. janthinelfum em

trabalhos prévios realizados por MILAGRES (1994). As Figuras 5.7, 5.8, 5.9 e

5.1 O mostram o perfil da recuperação para xilanases totais, 13-xilosidase e

proteínas totais, quando se adicionou etanol ao meio fermentado nas

concentrações de 20, 40, 60 e 80% (v/v), para valores de pH de 4,6, 5,9, 6,3 e

7,0. O que pode ser verificado é uma acentuada diferença de solubilidade entre

as xilanases totais, 13-xilosidase e proteínas totais. Este resultado está de

acordo com a literatura, onde verificou-se que, as 13-xilosidases, são enzimas

com massas molares mais elevadas (60 a 360 kDa) (SUNNA e ANTRANIKIAN,

1997) que as endoxilanases, e que nesta técnica, precipita-se primeiramente as

enzimas de massas molares maiores, à medida que se aumenta o teor de

etanol (SCOPES, 1994).

Nas precipitações com etanol em concentrações na faixa de 20 a 60%

a xilanase total apresenta uma recuperação baixa na fase precipitada.

Resultado semelhante foi reportado por ROGALSKI et ai (1983) onde

constataram 11 % de recuperação da atividade na fase precipitada com 50% de

etanol em trabalhos realizados com a xilanase do Aspergillus terreus F-413. O

autor demonstra ainda que 55% da xilanase foi recuperada com 75% de etanol.

EL-HELOW e GAZAERL Y (1996) obtiveram 46% de recuperação com 66% de

etanol da xilanase produzida por Bacillus subtilis enquanto que TAN et ai. (1987

b) utilizaram 80% de etanol para recuperar 63% da atividade da xilanase do

fungo Trichoderma harzianum E58.

Como se pode observar nas Figuras 5.7, 5.8, 5.9 e 5.10, o máximo de

recuperação da atividade da !3-xilosidase foi com 60% de etanol.

52

pH 4,6

100

o 80 iro o, ro J-o- lCÍIEIUISe .... 60 (l) a. 1-beta-xilosidase ::i o 40 ; ......,._ proteínas totais (l)

o::: ~ o 20

o o 20 40 60 80 100

% etanol (v/v)

Figura 5. 7 - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, f3-xilosidases e

proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 4,6.

100

o 80 ,ro o, ~ 60 (l) a. ::i o 40 (l)

o::: ~ o 20

o o 20 40 60 80 100

% etanol (v/v)

pH 5,9

-O- xílanase

--- beta-xilosidese --à- proteínas totais

Figura 5.8 - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, f3-xilosidases e

proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 5,9

53

pH 6,3

100

o 80 iro o ro 1-0-xilatase I ..... 60 (!) -beta-xilosidase I Q.

::J o 40 -6-protefnas totais I

(!) o::: ~ o 20

o o 20 40 60 80 100

% etanol (v/v)

Figura 5.9 - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, í3-xilosidases e

proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 6,3.0

pH 7,0

100

o 80 1(0 o --·-------·---- ro --0-xilanase ..... 60 (!)

- beta-xilosidese Q. :::, -6- proteínas totais o (!) 40 o::: ~ o 20

o o 20 40 60 80 100

% etanol (v/v)

Figura 5.1 O - Recuperação (%) das enzimas xilanases totais, 13-xilosidases e

proteína totais em experimentos conduzidos no pH 7,0

54

Em resumo, p-xilosidase precipita quase totalmente a 60% de etanol,

enquanto que as xilanases totais precipitam a 80% de etanol. Portanto, é possível executar uma separação destas enzimas aplicando-se uma

precipitação fracionada com etanol nessas concentrações.

A Figura 5. 11 representa a recuperação das xilanases isoladamente

mediante a precipitação com etanol nos valores de pH indicados. Pode-se

verificar uma solubilidade semelhante, independente do pH, até 40% de etanol.

A 60% de etanol ocorre uma ligeira queda de solubilidade, ou seja, um pequeno

aumento de recuperação na fase precipitada. A 80% de etanol há uma queda

brusca de solubilidade das xilanases totais. Observa-se também uma

recuperação de aproximadamente 85% para os valores de pH de 4,6 e 7,0 e

uma recuperação de aproximadamente 95% para os valores de pH 5,9 e 6,3.

Esta diferença pode ser explicada em termos de desnaturação das enzimas, à medida que as recuperações mais baixas são obtidas com os valores de pH

mais extremos (4,6 e 7,0)

100

..- 80 :::,'i?. o - ------ o ---pH 4.6 ,ro 60 -0-pH 5.9 o, ro -+-pH6.3 ~ <D -0-pH 7,0 a. 40 ::, ------

o <D e:::

20

o o 20 40 60 80

% Etanol (v/v)

Figura 5.11 - Recuperação por precipitação com etanol da atividade das

xilanases totais em diversos valores de pH

55

Na Figura 5. 12 verifica-se a recuperação da J.3-xilosidase isoladamente

mediante a precipitação com etanol. Ao contrário das xilanases, a J.3-xilosidase

já apresenta uma expressiva recuperação (aproximadamente 80%) a 40% de

etanol. Entre 20 e 40% não é possível verificar uma tendência de maior

recuperação para um determinado pH. Já a 60 e 80% de etanol verifica-se uma

recuperação ligeiramente superior para os valores de pH centrais (5,9 e 6,3). A

exemplo das xilanases totais, supõe-se que haja uma maior desnaturação da J.3- xilosidase para os valores de pH extremos (pH 4,6 e pH 7,0).

100

.......... 80 ::R. o .._... o ·--pH4,6

1r3. 60 .-0-pHS,9 ~ -e-pH6,3 Q)

-&-pH 7,0 e.. 40 ::::, o Q)

o:: 20

o o 20 40 60 80

- --

% Etanol (v/v)

Figura 5. 12 - Recuperação por precipitação com etanol da atividade da (3-

xilosidase em diversos valores de pH

Com a Figura 5.13 pode-se observar como ocorre a recuperação das

proteínas totais mediante a variação do pH. Para os valores de pH 5,9, 6,3 e

7,0 o perfil das curvas são semelhantes, ou seja, a recuperação de proteínas

totais é praticamente a mesma na precipitação com etanol entre 20 e 80% (v/v).

No entanto, ao utilizar-se do pH inicial de 4,6, ocorre uma precipitação

significativa das proteínas totais aplicando-se somente 20% de etanol, o qual

56

corresponde a quase 80% do valor quantificado pelo método de Bradford. Este

fato resulta num efeito desejado, ou seja, a 20% de etanol não ocorre

precipitação sigificativa da í3-xilosidase e também das xilanases totais, o que

implica num aumento de pureza dessas enzimas pela precipitação de

contaminantes. Sendo assim, esse pH foi escolhido como o inicial para a

precipitação fracionada.

100

80 - ~ o - o 60 iro (..), ro '- Q) o. 40 :::i o Q)

o::: 20

o o 20 40 60 80

% Etanol (v/v)

-pH4,6 --<rpH 5,9 -+-pH6,3 -e-pH 7,0

Figura 5.13 - Recuperação por precipitação com etanol das proteínas totais em

diversos valores de pH

Com o intuito de se verificar qual o efeito da concentração de etanol no

pH do meio tamponado para a precipitação, alguns experimentos foram

realizados. A Tabela 5.6 mostra a variação do pH com a adição de etanol no

meio fermentado, tamponado com o devido tampão (tampão acetato de sódio

para pH 4,5 e 5,9 e tampão fosfato para pH 6,3 e 7,0) a 100 mM. Quando

adiciona-se 20% de etanol (v/v), observa-se uma pequena variação de 0,3 a 0,4

no valor de pH do meio, mas ao adicionar 60% esta variação alcança valores

de 1,0 a 1,2. A 80% de etanol as variações são de 1,3 a 1,9 do valor do pH.

Assim, uma precipitação iniciada no pH 4,6, pode, ao final da adição de 80% de

etanol, possuir um pH de 6,5. Torna-se, portanto, difícil de se executar uma

57

precipitação com etanol em pH fixo, utilizando estes tampões na concentração

de 100 mM. Sendo assim, não é possível otimizar a recuperação através do

ponto isoelétrico das enzimas xilanolíticas do P. janthine/lum, baseando-se nos

trabalhos de RODRIGUES (1997) e MILAGRES (1994), as quais isolaram e

caracterizaram 3 enzimas produzidas por este fungo nas mesmas condições

deste trabalho. Isto pode explicar a falta de influência do pH no planejamento

experimental (item 5.3).

Tabela 5.6 - Variação do pH mediante a adição de etanol ao meio fermentado

pH inicial % etanol pH após adição de

etanol

4,5 5,9 6,3 6,9

20

4,8

6,2

6,6

7,3

4,5 5,9 6,3 6,9

60

5,7

6,9 7,3

7,9

4,5 5,9 6,3 6,9

80

6,4

7,3

7,6

8,5

A Tabela 5. 7 apresenta os resultados da precipitação em uma única

etapa a pH 5, 9, onde foi calculado o aumento de pureza obtido para as enzimas

xilanases totais e para a í3-xilosidase. Como se pode verificar, a precipitação

em uma só etapa não proporciona aumento na pureza das enzimas analisadas,

pois os melhores resultados são de aumento de pureza próximo a 1. A

precipitação com etanol, desta forma aplicada, pode ser utilizada apenas como

técnica para concentrar as enzimas presentes no meio fermentado.

58

Tabela 5. 7 - Aumento de pureza das enzimas xilanases totais e 13-xilosidases

em função da concentração de etanol aplicada na precipitação do meio

fermentado.

Atividade específica (U/mg) Aumento de pureza (AP)

Fração xilanase 13-xi losidase xilanase 13-xilosidase

Inicial 280,66 1, 13 1,00 1,00

20% etanol 13,80 0,23 0,05 0,21

40% etanol 12,09 0,94 0,05 0,84

60% etanol 35,58 1,25 O, 13 1, 11

80% etanol 250,29 1,04 0,90 0,92

5.5 PRECIPITAÇÃO FRACIONADA DAS ENZIMAS XILANOLÍTICAS

Em função do perfil de recuperação, por precipitação com etanol, da 13-

xilosidase, xilanases totais e proteínas totais foram definidos os cortes para

realização de precipitação fracionada nas concentrações de 20, 60 e 80% de

etanol (v/v). Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 5.8.

Para o fracionamento inicial das enzimas foi escolhido o pH 4,6. Nesse

valor de pH, com a adição de 20% de etanol, obtém-se uma precipitação de

proteínas totais na ordem de 70% do total presente no meio fermentado antes

do fracionamento.

Juntamente com os contaminantes precipita-se 13-xilosidase e xilanases

totais em quantidades inferiores a 10% da atividade determinada inicialmente,

ou seja, há uma perda da ordem de 10% das enzimas presentes após

precipitação com etanol a 20%. Isto proporciona, portanto, a eliminação de

partes dos contaminantes presentes no meio fermentado por intermédio do

precipitado, com pequena perda de atividade das enzimas xilanolíticas.

59

Tabela 5.8 - Resultados obtidos pela precipitação fracionada

BETA XILOSIDASE

Amostra Proteína RP1 Ativ. RA2 AE3 p.p4

(mg) (%) (U) (%) (U/mg) (AE/IAI=.;~

Inicial 2,94 2,84 0,96 1,00

20% etanol 2,09 71 0,22 8 O, 11 O, 11

60% etanol 0,36 12 2,09 74 5,77 5,98 80% etanol 0,54 18 0,18 6 0,33 0,35

XILANASE

Amostra Proteína RP Ativ. RA AE AP

(mg) (%) (U) (%) (U/mg) (AEr/AEini)

Inicial 2,94 433,37 147, 17 1

20% etanol 2,09 71 25,70 6 12,32 0,08

60% etanol 0,36 12 29,40 7 80,99 0,55

80% etanol 0,54 18 351,55 81 646,04 4,39 1 R90.l~ de pcteína L R~ de Ativrl:de 3.Ativda:je Especffica 4Aurnento de p..ireza

5Ativdade Especffica final 6Ativdade Especffica incial .. ~_.,.,.

O segundo passo do fracionamento consiste em adicionar etanol ao

sobrenadante para que este atinja uma concentração de 60%. Nesta etapa

recupera-se aproximadamente 70% da 13-xilosidase presente no meio

fermentado e ocorre uma pequena precipitação das xilanases totais (perda

inferior a 10%), além da precipitação de aproximadamente 10% das proteínas

totais. A recuperação da !3-xilosidase é inferior às recuperações anteriormente

citadas (Figura 5.12), mas com um aumento de aproximadamente 6 vezes na

pureza em relação ao meio inicial. O precipitado desta etapa, enriquecido em 13-

xilosidase, ao ser dissolvido em tampão acetato de sódio (pH 5,5, 50 mM), em

igual volume ao anterior à precipitação (meio fermentado inicial), possui uma

condutância de aproximadamente 3 mS, bastante inferior à condutância da

amostra inicial (13 mS). Isto pode ser útil em etapas posteriores de purificação,

tal como extração líquido-líquido por micelas reversas, para a qual é necessário

uma condutância em torno de 7 mS para sua execução.

Na 3ª etapa, o sobrenadante recebe quantidade adicional de etanol

para atingir a concentração final de 80%. Desta forma, precipita-se

60

praticamente toda xilanase remanescente no meio fermentado, obtendo-se uma

recuperação de aproximadamente 80% e um aumento de pureza de 4,39 vezes

em relação ao meio inicial. Esta fração apresenta baixa atividade da enzima ~-

xilosidase (aproximadamente 6% da inicial) o que comprova o fracionamento

proporcionado pela precipitação com etanol das enzimas xilanolíticas

produzidas pelo fungo P. janthinellum.

Na Tabela 5.9 verifica-se o balanço de atividades enzimáticas das

xilanases totais e 13-xilosidase, e proteínas totais, da precipitação fracionada. O

balanço fecha em aproximadamente 100%, ou seja, a soma das proteínas

determinadas nas fases precipitadas é praticamente igual à proteína do meio

inicial. Portanto, as porcentagens de perdas de atividades enzimáticas de 6,2%

para as xilanases totais e 12,3% para a ~-xilosidase devem corresponder às

perdas de atividades causadas pelo etanol durante a precipitação.

Tabela 5.9 - Balanço de atividades enzimáticas e proteínas totais da

precipitação fracionada

Amostra Atividade (U) Proteínas - "

totais

xilanase ~-xilosidase (mg)

inicial 433,37 2,84 2,94

20% etanol 25,70 0,22 2,09

60% etanol 29,40 2,09 0,36

80% etanol 351,55 O, 18 0,54

Total 406,65 2,49 2,99

Perdas(%) 6,2 12,3 -1, 7

5. 6 - ELETROFORESE

Na eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) foram

analisados os precipitados de cada etapa da precipitação fracionada,

juntamente com a amostra inicial, e possibilitou a constatação do fracionamento

das enzimas, como pode ser observado na Figura 5. 14. O meio fermentado

61

inicial analisado, linha 2 da eletroforese, permite verificar a presença de

proteínas com massas molares na faixa de 20, 30 e 100 kDa.

Na linha 3 (precipitação conduzida com 20% de etanol) foi observado

apenas uma leve impressão de proteínas na faixa de 30 kDa e 100 kDa. Isto

confirma os resultados obtidos mediante as medidas das atividades enzimáticas

citadas na Tabela 5.8, ou seja, pouca atividade xilanolítica foi precipitada nesta

etapa. Embora não haja bandas nítidas nesta fração, a análise de Bradford

indicou que ocorreu por volta de 70% de recuperação de proteínas totais. Isso

pode ser explicado pelo forte arraste observado nesta linha, o qual deve

corresponder à proteína determinada pelo método de Bradford.

Na linha 4 verifica-se bandas fracas na faixa de 20 e 30 kOa,

contrastando com bandas nítidas na faixa de 100 e 11 O kDa. Analisando esses

dados e comparando-os com os dados observados na Tabela 5.8, conclui-se

que essas bandas nítidas correspondem à í3-xilosidase, pois é esta fração que

apresenta o melhor aumento de pureza e recuperação desta enzima. Estes

resultados são semelhantes aos observados por VAN-PEIJ-N-N-M-E et ai.

(1997) que purificou e identificou por SDS-PAGE uma í3-xilosidase (massa

molar 11 O kOa) proveniente do Aspergillus niger cultivado em arabinoxilana. A

literatura indica que as í3-xilosidase são enzimas de massas molares na faixa de

60 a 360 kDa, embora algumas de tamanhos inferiores são reportadas.

Na linha 5 praticamente não é observado bandas na faixa de 100 e 11 O

kDa, e sim bandas nítidas entre 20 e 30 kDa. Conforme a Tabela 5.8 isto

corresponde à fração onde ocorre o enriquecimento da atividade de xilanases

totais e uma fraca atividade de í3-xilosidase. RODRIGUES (1997) constatou em

trabalhos de purificação das enzimas xilanolíticas produzidas pelo P.

janthinellum através da técnica de extração líquido-líquido por micelas reversas

que há no meio fermentado uma enzima, provavelmente uma endoxilanase, de

massa molar 20, 1 kDa. Possivelmente trata-se da mesma enzima citada neste

trabalho. MILAGRES (1994) purificou e caracterizou uma í3-xilosidase do meio

fermentado produzido por este mesmo fungo. A autora utilizou filtração gélica

em Coluna Sephacryl 300 S e ultrafiltração para obter uma banda em SDS-

PAGE, e através da mobilidade eletroforética relativa calculou a massa molar

como sendo de 74,3 kDa. Sendo uma glicoproteína, a maior massa molar da í3-

62

xilosidase deste trabalho ( 104 e/ou 11 O kDa) em relação à purificada por

Milagres (74,3 kDa), pode ser explicada pela perda de unidades de glicose

ocorrida durantes as etapas de purificação da enzima. VAN-PEIJ-N-N-M-E et ai.

(1997) isolou e caracterizou uma ~-xilosidase de massa molar de 85 kDa, a

qual, quando glicosilada, possui massa molar de 11 O kDa (possui 15 sítios de

glicosilação).

Na literatura pode-se encontrar xilanases com diversos valores de

massas molares, porém, uma quantidade expressiva são apresentadas na faixa

de 20 a 40 kDa.

Os resultados aqui obtidos mostram que a técnica de precipitação

fracionada com etanol apresenta boa seletividade mediante a diferença de

solubilidade apresentada pelas enzimas encontradas no meio fermentado. Esta

diferença de solubilidade pode ser explicada parcialmente devido às diferenças

apresentadas pelas massas molares, pois como já citado, a precipitação ocorre

com menores teores de etanol com as enzimas de maiores massas molares,

isso considerando que há semelhança de hidrofobicidade e de ponto isoelétrico

entre as enzimas fracionadas. Estes dois útimos parâmetros não foram

determinados neste trabalho.

63

2 3 4 5

Figura 5.14 - Eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) das

etapas da precipitação fracionada: linha 1 - marcador de massa molar (66 kDa,

45 kDa, 36 kDa, 29 kDa, 24 kDa e 20, 1 kDa); linha 2 - fração inicial; linha 3 -

precipitado obtido após precipitação com 20% de etanol; linha 4 - precipitado

obtido após precipitação com 60% de etanol (massas molares de 11 O e 104

kDa); linha 5 - precipitado obtido após precipitação com 80% de etanol (31, 30 e

20 kDa)

64

5. 7 - CONSTANTES CINÉTICAS DA /3-XILOSIDASE INICIAL E DA

RECUPERADA POR PRECIPITAÇÃO

Na Figura 5.15 verifica-se a atividade enzimática da enzima í3- xilosidase em função da concentração do substrato (pNpX) para a enzima

presente no meio fermentado e a enzima pré-purificada com precipitação

fracionada (20-60% de etanol). Não há diferenças significativas entre os perfis

das curvas da Figura 5.15, o que indica não haver alterações na cinética da

enzima quando precipitada por etanol. A Figura 5. 16 corresponde ao inverso

dos valores das atividades em função do inverso das concentrações do

substrato (Lineweaver-Burk), e foi construída para a determinação dos valores

de KM e Vm (Constante de Michaelis-Menten e Velocidade máxima,

respectivamente). A regressão linear dos pontos da Figura 5.16 permite obter

as equações das quais extraem-se os valores de KM e V m , que são

apresentados na Tabela 5.10.

0.40 • 1 0.35 • o o

• o 0.30 - o - o _J •~o E 0.25 ,P - :::> -------

(1.) 0.20 o Inicial

"O ,f • Precipitada (O o -------- "O 0.15 ·5 ~ ! ~ 0.10

O.OS !

0.00 o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

pNpX (mM)

Figura 5. 15 - Atividade da í3-xilosidase presente no meio inicial (D) e após

precipitação fracionada com etanol(•) em função da variação da concentração

de substrato (pNpX) .

65

16.0

14.0

12.0 - ..J 10.0 E - :::> 8.0 - > y = 2,7409x + 2,6516

~ 6.0 R2 = 0,9955

..... 4.0

2.0

O.O-+---...----+--+--+--+--------- ........ -~ O.O 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

1/pNpX (mM)

Figura 5. 16 - Inverso dos valores da atividade da 13-xilosidase presente no meio

inicial (O) e após precipitação fracionada com etanol (•) em função do inverso

das concentrações do substrato (Lineweaver-Burk)

Tabela 5.10 - ~ e Vm da 13-xilosidase

Enzima ~(mM) Vm (U/ml)

meio fermentado

precipitada (20-60% etanol)

1,07 1.03

0,35

0,38

RISTROPH E HUMPHREY (1985) calcularam a velocidade de reação

da 13-xilosidase do caldo fermentado produzido por Thermomonospora e

obtiveram um~ de 0,82 mM e uma Vm de 0,0085 U/ml, utilizando pNpx como

substrato nas concentrações de 0,049 a 8,9 mM. O autor citou ainda ~

encontrados na literatura nos valores de 0,22, 1,43 e 3,01 respectivamente para

Arpergillus, Bacillus e Malbranchea. Isto implica que o l<M da ~-xilosidase, deste

trabalho (Tabela 5.1 O), é de um valor consistente com a literatura.

Outro valor semelhante para ~ da 13-xilosidase foi encontrado por

KUMAR e RAMÓN (1996) utilizando a mesma metodologia de medida de

atividade citada neste trabalho. O autor utilizou pNpX nas concentrações de 0,2 a 3,0 mM para uma 13-xilosidase purificada do Aspergillus nidulans, obtendo um

66

i<M de 1, 1 mM e uma Vm de 2,56 U/ml. A v,« citada neste trabalho (Tabela

5. 1 O) encontra-se num valor inferior a este, porém, bastante superior (44 vezes)

ao citado por RISTROPH E HUMPHREY (1984), e assim, como o KM ,

compatível com os dados da literatura.

Estes valores de KM e V m podem ser diferentes do que seria

encontrado se a enzima estivesse pura, pois trata-se de dados extraídos do

meio fermentado e da enzima parcialmente purificada. Entretanto, são valores

com uma boa aproximação das reais condições em aplicações industriais, pois

enzimas xilanolíticas normalmente não são aplicadas na forma pura.

67

6 - CONCLUSÕES

Os resultados obtidos no presente trabalho levaram às seguintes conclusões:

1. As técnicas de precipitação por adição de etanol e por adição de sulfato de

amônio mostraram-se satisfatórias na recuperação da atividade das xilanases

totais. A adição de metilcelulose no meio fermentado possibilitou diminuir a

quantidade de sulfato de amônio necessário para a precipitação. A precipitação

com sulfato de sódio apresentou resultados inferiores ao etanol e ao sulfato de

amônio.

2. O pH não interferiu na recuperação da atividade das enzimas xilanolíticas por

precipitação com etanol.

3. As xilanases totais, 13-xilosidase e proteínas totais apresentaram

solubilidades diferenciadas após a adição de etanol, o que possibilitou a

realização de precipitação fracionada com obtenção de aumento de pureza das

enzimas. A diferença de massa molar das !3-xilosidases, quando comparada

com às outras enzimas xilanolíticas, deve ter contribuído para esta diferença de

solubilidade.

4. As xilanases totais possuem massa molar entre 20 e 30 kOa, segundo a

eletroforese em gel de poliacrilamida da precipitação fracionada por etanol,

enquanto que a !3-xilosidase possui massa molar entre 104 e 11 O kDa.

5. Os parâmetros cinéticos da 13-xilosidase (KM e Vm) após precipitação

fracionada com etanol (20-60 % v/v) foram semelhantes à enzima antes da

recuperação.

68

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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78

APÊNDICE

Apêndice 1

Tabela 1- Referente à Figura 5.1. Porcentagem de proteínas totais e de

atividade de xilanases solúveis após a precipitação conduzida em meio

tamponado com tampão acetato 50 mM, pH 5,5, em função da concentração de

etanol, na temperatura de 4°C.

% de etanol atividade (%) proteínas totais(%)

o 100 100

10 96 76

20 96 73

30 95 69

40 96 69

50 93 66

60 73 60

70 31 52

80 1 32

Tabela 2 - Referente à Figura 5.2. Recuperação das xilanases totais em função

da precipitação com sulfato de amônio

% sulfato de amônio (saturação) recuperação da atividade (%)

o 10

20

30

40

50

60

4

4

5 8

27

105

101

Tabela 3 - Referente à Figura 5.3. Recuperação da atividade das xilanases

totais em função da precipitação com sulfato de amônio e com sulfato de

amônio na presença de 0, 1% de metilcelulose

% sulfato de amônio rec. da ativ. (%)

(saturação) (com metilcelulose)

rec. da ativ. (%)

(sem metilcelulose)

O 8 10 9

20 10

4

4

5 30

40

50 60

15

104

111

104

8

27 105 101

Tabela 4 - Referente à Figura 5.4. Recuperação das xilanases totais e

proteínas totais em função da precipitação com sulfato de sódio

% sulfato de sódio (p/p) recuperação da atividade recuperação das proteínas

(%) totais (%)

5 19 19

15

25 40 60

33

72 64 50

40 58

68

63

Tabela 5 - Referente à Figura 5.5. Interferência em mg/L na concentração de

proteínas totais causada pelo etanol na microanálise de Bradford

% etanol proteína (mg/L)

20 4

40 11

60 20 80 31

100 49

Tabela 6 - Referente à Figura 5.7. Recuperação (%) das enzimas xilanases

totais, f3-xilosidase proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 4,6

etanol(%) rec. xilanase (%) rec f3-xilosidase(%) rec. prot. tot. (%)

20 5 10 78

40 5 78 60

60 11 91 61

80 82 89 89

Tabela 7 - Referente à Figura 5.8. Recuperação (%) das enzimas xilanases

totais, 13-xilosidase proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 5, 9

etanol(%) rec. xilanase (%) rec 13-xilosidase(o/o) rec. prot. tot. (%)

20 2 8 24

40 --

3 55 38 - - 60 11 95 44

80 97 99 91

Tabela 8 - Referente à Figura 5.9. Recuperação (%) das enzimas xilanases

totais, !3-xilosidase proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 6,3

etanol(%) rec. xilanase (%) rec f3-xilosidase(%) rec.prot. tot.(%)

20

40

60

80

2 1 24

6 83 38

10 99 44

95 99 91

Tabela 9 - Referente à Figura 5.10. Recuperação (%) das enzimas xilanases

totais, í3-xilosidase proteínas totais em experimentos conduzidos no pH 7,0

etanol(%) rec. xilanase (%) rec ~-xilosidase(%) rec. prot. tot. (%)

20 3 5 24

40 4 75 38

60 17 89 51

80 83 94 97

Tabela 1 O - Referente à Figura 5.11. Recuperação por precipitação com etanol

das xilanases totais em diversos valores de pH.

etanol(%) rec. xilanase (%)

pH 4,6 pH 5,9 pH 6,3 pH 7,0

5 2 2 3

5 3 6 4

11 11 10 17

82 97 95 83

20

40

60

80

Tabela 11 - Referente à Figura 5.12. Recuperação por precipitação com etanol

da ~-xilosidase em diversos valores de pH.

etanol(%) rec. í3-xilosidase (%)

pH 4,6 pH 5,9 pH 6,3 pH 7,0

10 8 1 5

78 55 83 75

91 95 99 89

89 99 99 94

20

40

60

80

Tabela 12 - Referente à Figura 5.13. Recuperação por precipitação com etanol

das proteínas totais em diversos valores de pH.

etanol(%) rec. proteínas totais(%)

pH 4,6 pH 5,9 pH 6,3 pH 7,0

20 10 8 1 5

40 78 55 83 75

60 91 95 99 89

80 89 99 99 94

Tabela 13 - Referente à Figura 5.15. Atividade da J3-xilosidase presente no meio

inicial e após a precipitação fracionada com etanol (20-60% v/v) em função da

variação da concentração de substrato (pNpX)

concentraçaõ de atividade meio inicial

pNpX (mM) (U/ml)

0,25 0,07

0,50 O, 11

1,00 0, 17

1,50 0,20

2,00 0,23

2,50 0,24

3,00 0,25

4,00 0,27

5,00 0,28

6,00 0,29

8,00 0,31

10,00 0,33

12,50 0,35

15,00 0,36

20,00 0,38

atividade precipitado

(U/ml)

0.07

0.12

0.18

0.23

0.25

0.26

0.28

0.28

0.33

0.35

0.38

0.38

Tabela 14 - Referente à Figura 5.16 - Inverso dos valores da atividade da f3- xilosidase presente no meio inicial e após a precipitação fracionada com etanol

em função da variação da concentração de substrato (pNpX)

1 1

cone. pNpX (mM) ativ. Meio inicial (U/mL)

4,00 14,72

2,00 9,17

1,00 5,91

0,67 5,06

0,50 4,33

0,40 4,10

0,33 4,01

0,25 3,69

0,20 3,63

0, 17 3,39

0, 13 3,19

0, 10 3,05

0,08 2,85

0,07 2,79

0,05 2,64

1

ativ. precipitado (U/mL)

13,34

8,66

5,41

4,41

4,08

3,83

3,60

3,52

2,99

2,87

2,63

2,61