Depto. Tecnologia Agroindustrial e Scio-Economia Rural Centro de Cincias Agrrias Campus de Araras

Mtodos de anlises e monitoramento microbiolgico em laboratrio de

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Prof Sandra Regina Ceccato Antonini Doutora no Depto.Tecnologia Agroindustrial e Scio-economia Rural, CCA/UFSCar, com ps-doutorado em gentica molecular de leveduras na Universidade de Sheffield, Inglaterra.

Endereo: Depto. Tecnologia Agroindustrial e Scio-Economia Rural Centro de Cincias Agrrias Universidade Federal de So Carlos Via Anhanguera, km174 C.Postal 153 13600-970 Araras - SP Fone/fax: (19) 3543-2614 e-mail: antonini@cca.ufscar.br

A presente apostila se refere ao curso de treinamento ministrado nas unidades de Iguatemi-PR, no perodo de 19 a 21 de fevereiro de 2004, e de Ivat-PR, no

perodo de 16 a 18 de fevereiro de 2004, pertencentes Usina de Acar Santa Terezinha Ltda.

Fevereiro/2004

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INDICE

1. Introduo 03

2. Monitoramento microbiolgico........................................................... 05

3. Leveduras................................................................................ 08

4. Bactrias.......................................... 10

5. Mtodos microbiolgicos para controle em processos industriais de

produo de lcool............

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5.1. Leveduras..... 15

5.1.1. Contagem direta e determinao da viabilidade celular em

leveduras...........................

15

5.1.2. Plaqueamento e diluio em srie.... 19

5.1.3. Meios diferenciais/seletivos para deteco de leveduras

selvagens...............................................................................................

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5.2. Bactrias... 26

5.2.1. Plaqueamento e diluio em srie.... 26

5.2.2. Colorao de Gram................................................................... 27

6. Preparo de meios de cultivo e solues ........................................... 30

7. Bibliografia......................................................................................... 33

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1. INTRODUO

Fermentao alcolica um fenmeno atravs do qual os acares so transformados em lcool e gs carbnico, por ao das leveduras. A fermentao dos mostos realiza-se em trs fases distintas: pr-fermentao, fermentao principal e ps-fermentao. A pr-fermentao se inicia quando o fermento (leveduras) adicionado ao mosto devidamente preparado, e se caracteriza por ativa multiplicao das clulas e elevao lenta e gradual da temperatura do meio. Aps 5 a 6 horas, com pouca espuma, inicia-se a fermentao principal, que reconhecida pela elevao rpida da temperatura, queda da densidade do mosto por causa do desaparecimento dos acares e da formao equivalente do lcool. A acidez eleva-se abaixando o pH. Essa fase termina quando as espumas desaparecem, durando de 9 a 10 horas. A ps-fermentao caracterizada pela diminuio lenta e gradual da temperatura do mosto, diminuio do desprendimento do gs carbnico e no se formam mais espumas. Essa fase dura de 6 a 8 horas; e deve durar o mnimo possvel para evitar a infeco do vinho e do p-de-cuba, que ser utilizado em nova fermentao. O mosto totalmente fermentado denominado vinho. O processo de fermentao o seguinte:

C6H12O6 2 CH2OH + 2 CO2

A Figura 1 mostra um esquema do processo fermentativo para produo de etanol.

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Figura 1. Esquema representativo do processo fermentativo para produo de etanol

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2. MONITORAMENTO MICROBIOLGICO

Alm da escolha e da preparao do fermento, algumas condies timas devem ser mantidas durante o processo industrial no sentido de obter produtividade mxima de etanol a partir dos acares fermentescveis. Entre os parmetros a serem considerados, devem figurar, entre outros, o teor de fermento na dorna, a viabilidade celular, a ocorrncia de infeces, o pH, a temperatura e a concentrao de acar redutor total no mosto. H, dessa forma, necessidade de um rigoroso controle do processo de fermentao, envolvendo a avaliao dos rendimentos prticos e simultaneamente o monitoramento microbiolgico.

O caldo de cana, principalmente na fase de extrao, permite o desenvolvimento de uma srie de microrganismos, pois tem concentrao de acares, pH e temperatura favorveis. Os produtos de metabolismo destes microrganismos so incorporados ao caldo, encontrando-se substncias como lcoois, cidos orgnicos e polissacardeos que alteram a sua composio qumica, podendo causar srios transtornos nos processos de fabricao. Tanto a reproduo dos microrganismos como a formao dos metablitos se fazem s custas do acar inicialmente presente na cana, representando perdas no desprezveis, na forma de degradao de acar e de lcool no produzido. Entre os contaminantes que mais aparecem nos processos fermentativos, ocorrendo inclusive na etapa da fermentao alcolica, predominam as bactrias gram-positivas dos gneros Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc. A sacarose consumida por esses microrganismos deixar de ser transformada em lcool ou cristais de sacarose, provocando assim perdas do acar recupervel, o qual ser transformado em cidos orgnicos e dextrana, por exemplo. A determinao do nmero e tipos de bactrias presentes no processo so parmetros importantes para o controle da infeco. Tcnicas tm sido propostas para estimar a populao bacteriana de amostras coletadas nas diferentes fases do processo: contagem direta ao microscpio e semeadura em placas (plaqueamento). O emprego de um ou outro mtodo vai depender das

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condies e instalaes do laboratrio da indstria, alm de um treinamento especfico aos laboratoristas.

Estudos j realizados revelaram que uma concentrao bacteriana da ordem de 109 UFC/mL leva a uma queda no rendimento alcolico, chegando a atingir 100% com Lactobacillus e 60% com Leuconostoc, e reduo na viabilidade das clulas de leveduras a cerca de 10%. Existem tambm bactrias que induzem a floculao de Saccharomyces cerevisiae, tendo sido observados aumento no tempo de fermentao e reduo de aproximadamente 15% no rendimento fermentativo como conseqncia desta floculao. Essa acontece provavelmente devido presena de uma capa protica de natureza gelatinosa sobre as bactrias, acarretando assim a fixao mecnica nas clulas de leveduras ou atravs de uma ponte entre ons de clcio e polmeros aninicos da superfcie da levedura. Essas bactrias indutoras de floculao do fermento esto restritas a linhagens de Lactobacillus, mais particularmente L. fermentum. A utilizao de agentes antimicrobianos reduzem os danos causados pelos contaminantes, alm de medidas como limpeza das moendas, tubulaes, instalaes da fermentao e vrios outros procedimentos, tais como descarte de fundo de dorna, returbinao do fermento e tratamento cido. Porm, o eficiente controle s conseguido com o uso de antimicrobianos adequados e na dosagem correta, pois a aplicao racional desses produtos deve visar apenas a populao de bactrias e no a de leveduras. O uso contnuo de antibiticos pode levar ao desenvolvimento de linhagens resistentes, as quais se tornam cada vez menos sensveis sua ao, alm do alto custo. importante que cada laboratrio industrial utilize tcnicas para deteco de sensibilidade das bactrias aos agentes antimicrobianos que sejam adequadas s suas condies operacionais, permitindo desta forma, verificar quais so exatamente os antibiticos ou biocidas mais eficientes para a aplicao industrial.

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Se para o controle da contaminao bacteriana possvel a utilizao de agentes antimicrobianos, o mesmo no pode ser dito em relao s leveduras selvagens ou invasoras. Algumas unidades industriais tm se deparado com problemas atribudos presena de leveduras contaminantes que, altamente competitivas dentro das condies existentes, passam a predominar na populao de clulas presentes. Essas podem vir de fontes como melao, caldo, gua de lavagem de cana e o prprio solo. A ocorrncia dessas leveduras tem sido freqentemente associada a ocasies em que se verificam redues significativas da eficincia industrial, com queda no rendimento fermentativo, maior tempo de fermentao e maior formao de espumas pelo aumento da viscosidade. A instalao dessas leveduras na fermentao pode acarretar tambm srios problemas operacionais. Nos processos de batelada e batelada-alimentada, os inconvenientes eram mais facilmente contornados, ao passo que para os processos contnuos, passaram a constituir um srio problema. A eliminao dessas linhagens invasoras, quando se detecta prejuzo considervel ao processo, consiste na substituio do fermento por fermento adaptado, aliado a uma melhoria na assepsia das tubulaes, na qualidade da gua utilizada na diluio do mosto, na eficincia do tratamento trmico/qumico do caldo e controle da temperatura de fermentao.

O permanente monitoramento microbiolgico e o aperfeioamento de seus mtodos permite o acompanhamento da qualidade do fermento e a deteco das leveduras selvagens, ou seja, a diferenciao entre a levedura do processo e a levedura contaminante (selvagem), que nem sempre muito fcil. Os meios de cultura diferenciais ou seletivos para isolamento e quantificao de populaes de leveduras contaminantes baseiam-se em caractersticas fisiolgicas comuns s leveduras selvagens, mas ausentes em linhagens do processo, iniciadoras da fermentao. Dentre essas, destacam-se as nutricionais (variaes nas fontes de carbono, nitrognio e nos fatores de crescimento) e resistncia a certos compostos como antibiticos e corantes. Entretanto, um nico meio no totalmente satisfatrio para a avaliao de todas

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as leveduras presentes, sendo portanto necessrio o emprego de vrios tipos de meios quando se pretende detectar a maioria das leveduras presentes.

Somente com um certo nvel de conhecimento da flora e identificados os tipos predominantes, possvel propor mtodos de controle eficientes e econmicos, ou ainda modificar os processos para impedir a reinfeco.

3. LEVEDURAS

Leveduras so microrganismos cujo crescimento dominante na forma unicelular. A reproduo assexuada por brotamento multilateral e polar ou por fisso, e sexuada por meio de ascsporos. As caractersticas morfolgicas das leveduras determinadas por microscopia mostram formas esfrica e ovide, pera, cilndrica e mesmo alongadas em pseudomiclio (Figura 2).

Em geral, as clulas de leveduras so maiores do que as bactrias, mas as menores leveduras no so to grandes como as maiores bactrias. Esses microrganismos variam consideravelmente, no que se refere s suas dimenses, com limites desde 1 a 5 de largura e 5 a 30 de comprimento. Cada espcie tem uma forma caracterstica, mas, mesmo em culturas puras, h considerveis variaes de tamanho e de forma das clulas individuais, dependendo da idade e do ambiente. As leveduras no possuem flagelos ou outros rgos de locomoo.

Apresenta partes visveis como parede celular, citoplasma, vacolos, glbulos de gordura, grnulos e ncleo (Figura 3).

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Figura 2. Morfologia das clulas de leveduras (Saccharomyces cerevisiae). A, clulas brotantes; B, clulas dispostas em cachos; C, asco e ascsporos (esporos) caractersticos; D, pseudomiclio. Todas as fotos foram tiradas ao microscpio em aumento de 400X (As fotos C e D foram fornecidas por C.D.Tosta).

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Figura 3. Esquema de uma clula de levedura.

4. BACTRIAS

Embora existam milhares de espcies bacterianas diferentes, os organismos isolados apresentam uma das trs formas gerais: elipsoidal ou esfrica, cilndrica ou em bastonete e espiralada ou helicoidal (Figura 4). As bactrias medem aproximadamente 0,5 a 1,0 por 2,0 a 5,0 .

O exame da clula bacteriana revela certas estruturas definidas por dentro e por fora da parede celular, esquematizadas na Figura 5. As estruturas externas parede celular compreendem os flagelos, os pelos (fmbrias) e a cpsula. A parede celular uma formao rgida que d forma clula. A rigidez pronunciada da parede celular pode ser facilmente demonstrada, submetendo-se bactrias de formas diferentes a condies fsicas extremas, tais como presses osmticas muito elevadas ou muito baixas ou

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Figura 4. A diversidade de bactrias. A, Pseudomonas aeruginosa, um bastonete flagelado; B, Streptococcus, clulas esfricas dispostas em cadeias; C, Spirillum volutans, clula espiralada; D, Chondromyces crocatus, as clulas em forma de bastonete movem-se juntas, formando uma estrutura que carrega os esporos; E, Chroococcus, uma cianobactria na qual os indivduos ficam aderidos numa cpsula gelatinosa (Retirado de Raven & Johnson, 1990).

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Figura 5. Representao esquemtica da organizao estrutural de uma clula bacteriana (Retirado de Pelczar et al., 1980).

temperatura abaixo de zero seguidas de aquecimento; as clulas mantero sua forma original. As paredes celulares bacterianas parecem ser indispensveis ao crescimento das bactrias e sua diviso. Clulas cujas paredes foram removidas especificamente, isto , protoplastos, so incapazes de efetuar divises ou crescimento normais. Substncias qumicas interessantes so encontradas na parede celular das bactrias, como por exemplo, o cido diaminopimlico (DPA), o cido murmico e o cido teicico. Essas substncias so tpicas das bactrias e de microrganismos que com ela se relacionam estreitamente. O componente da parede celular que determina a forma da bactria , em grande parte, o

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peptoglicano, polmero insolvel que um constituinte de todas as paredes celulares bacterianas.

A parede celular das clulas gram-negativas quimicamente mais complexa. As paredes dos organismos gram-positivos possuem menor quantidade de aminocidos, mas os cidos teicicos so caractersticos dessas clulas. O contedo lipdico das bactrias gram-negativas consideravelmente maior do que o dos organismos gram-positivos (Figura 6).

Imediatamente abaixo da parede celular existe uma fina membrana, ou cobertura, chamada membrana citoplasmtica, s vezes tambm conhecida como membrana protoplasmtica ou, simplesmente, membrana plasmtica. As formaes da membrana como as intruses e extruses, desempenham papel variado nos processos de metabolismo e de reproduo, envolvendo-se, por exemplo, na formao do septo durante o processo de diviso celular das bactrias.

O material celular, contido dentro da membrana citoplasmtica, constitui o citoplasma, onde podem ser identificados depsitos concentrados de certas substncias, como volutina, cido, entre outros.

As clulas bacterianas no contm o ncleo tpico das clulas de animais e vegetais superiores. Possuem, contudo, dentro do citoplasma corpsculos que so encarados como estrutura nuclear, confinando o DNA da clula bacteriana a esta rea. No h evidncia de uma membrana nuclear separando o ncleo do citoplasma, o que caracterstico das clulas eucariticas.

Algumas bactrias tm a capacidade de produzir um corpo oval de parede espessa (um por clula), que uma clula altamente resistente. Essas formas resistentes so chamadas de endosporos, ou, mais comumente, esporos. So extremamente resistentes aos agentes fsicos e qumicos adversos.

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Figura 6. As paredes celulares bacterianas e a colorao de Gram. A camada de peptoglicano mais grossa nas bactrias gram-positivas, permitindo a reteno do corante cristal-violeta e corando-se assim de prpura. As bactrias gram-negativas no retm esse corante e assim exibem a colorao vermelha do contracorante (safranina). Alm disso, a concentrao de lipdeos nas bactrias gram-negativas maior que nas gram-positivas. (Retirado e adaptado de Raven & Johnson, 1990).

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5. MTODOS MICROBIOLGICOS PARA CONTROLE EM PROCESSOS INDUSTRIAIS DE PRODUO DE LCOOL

5.1. Leveduras

5.1.1. Contagem direta e determinao da viabilidade celular em leveduras

No existe um mtodo absoluto para determinao da viabilidade celular de uma populao de clulas de levedura. Para estimar a proporo de clulas viveis em uma cultura ou processo fermentativo, mtodos baseados no plaqueamento ou observao microscpica tm sido utilizados. Os mtodos de contagem direta so rpidos e simples, exigem um mnimo de equipamento, permitindo que seja observada, simultaneamente, a morfologia celular.

Este aspecto extremamente importante porque a tolerncia da levedura ao seu produto de fermentao, o etanol, bastante significante em relao eficincia de produo de lcool em fermentaes em escala industrial. Tem sido verificado tambm que a presena de lcoois superiores (n-butanol, isoamlico), cidos graxos e seus steres mesmo em baixas concentraes, juntamente com o etanol, agem de maneira sinergstica intoxicando a clula da levedura, levando-a morte e consequentemente diminuindo a viabilidade celular.

No controle da viabilidade celular nos processos de produo de levedura (fermento prensado) e fermentao alcolica (lcool), a colorao das clulas da levedura com azul de metileno ou eritrosina e o cultivo por plaqueamento so os mais empregados.

A tcnica de colorao com azul de metileno consiste em se misturar partes iguais da suspenso de levedura (amostra), adequadamente diluda, e da soluo corante (azul de metileno). As clulas com alta atividade fisiolgica no se colorem, enquanto as clulas inativas (mortas) apresentar-se-o coloridas de azul (Figura 7). A porcentagem ou o nmero de clulas viveis determinado transferindo-se com uma pipeta de Pasteur a amostra para a cmara

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de Neubauer. Trata-se de uma lmina especial, precisamente dividida em quadrados de 1 mm2 de rea (Figura 8); a lmina coberta com uma lamnula, que deixa um volume, sobre cada quadrado, de 10-4 cm3 ou 0,1 mm3 (equivalente a 1 mL).

Figura 7. Determinao da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno. As clulas coradas de azul so clulas mortas enquanto as incolores so clulas viveis (A foto foi cedida por C.D. Tosta).

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Figura 8. A Cmara de Neubauer. A. O crculo indica a rea aproximada coberta pelo aumento de 100 vezes ao microscpio (10X ocular e 10X objetiva) de uma cmara de contagem padro. B. Aspecto de um quadrado integrante do quadrado mdio, mostrando que devem ser contadas as clulas que tocam as linhas do topo e da esquerda do quadrado, desprezando aquelas que tocam a linha de baixo e da direita do quadrado.

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Procedimento

1- Fazer a diluio conveniente em um tubo de ensaio. 2- Aps a diluio, transferir 0,3 mL para um tubo de ensaio e adicionar 0,3 mL da

soluo de azul de metileno-citrato de sdio. 3- Homogeneizar a mistura em agitador de tubos. 4- Colocar a lamnula na Cmara de Neubauer e com auxlio da pipeta Pasteur,

transferir um pequeno volume da amostra preparada. 5- Levar ao microscpio ptico e com a objetiva de 40X, fazer a contagem das

clulas nos campos : 5 campos na segunda coluna e 5 campos na quarta coluna (total de 10 campos), ou os 4 retculos centrais em cada um dos 25 campos (total de 100 retculos). Contar aproximadamente 40 clulas por campo ou 3 clulas por retculo. No primeiro caso, escolher 2 limites em cada quadrado nos quais sero desprezadas as clulas que forem encontradas em cima desses limites. Por exemplo, contar as clulas que esto nos limites superior e lateral esquerdo do quadrado e desprezar as do limite inferior e lateral direito.

6- Com o contador, marcar o nmero de clulas viveis (clulas que no se colorem com azul de metileno) e clulas inviveis (clulas coloridas de azul intenso).

Viabilidade (%)= (Nmero de clulas vivas / Nmero total de clulas) X 100

No. total de clulas/mL = no. clulas nos 10 campos X 2,5 X diluio X 104

ou

No. total de clulas/mL = no. clulas nos 100 retculos X 4 X diluio X 104

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5.1.2. Plaqueamento e diluio em srie

A semeadura em placas ou plaqueamento revela o nmero de clulas de leveduras capazes de se multiplicarem e formarem colnias em meios de cultivo apropriados e sob condies de incubao adequadas. Cada colnia desenvolvida suposta ter sido originada a partir de uma unidade vivel, a qual pode ser um organismo ou muitos. Como para uma maior preciso da anlise somente devero ser contadas as placas com nmero de colnias entre 30 e 300, uma diluio da amostra dever ser feita antes de se proceder a sua mistura com o meio de cultura (Figura 9).

Procedimento

1- Tomar 1 mL da amostra (suspenso de clulas) e transferir para um tubo de cultura com 9 mL de gua ou soluo salina esterilizada (diluio 1:10 ou 10-1).

2- Homogeneizar em agitador de tubos. 3- Pipetar 1 mL da diluio anterior para outro tubo com 9 mL de gua ou soluo

salina esterilizada e ter-se- uma diluio 1:100 ou 10-2. Diluies maiores podem ser obtidas tomando-se 1 mL de cada diluio sucessiva e colocando em tubos com 9 mL de gua ou soluo salina, at se atingir a diluio desejada.

4- Fazer a semeadura em placas de Petri, pipetando 1 mL e adicionando-se o meio de cultivo adequado liquefeito e resfriado a uma temperatura de 45-46oC. Agitar a placa com movimentos horizontais para distribuir as clulas com uniformidade (plaqueamento em profundidade). Semear no mnimo 2 placas de cada diluio e escolher 3 diluies.

5- Incubar a 32oC por 24-48 horas.

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Clculo: nmero de colnias na placa X ndice de diluio da amostra = nmero de bactrias/mL (Por exemplo, considerando-se que a placa que recebeu a diluio de 1/10.000 contm 32 colnias, pode-se estimar que existem 32 X 10.000 = 320.000 bactrias/mL da amostra ou 3,2 X 105

Figura 9. Contagem em placa e diluies seriadas. Na diluio seriada, o inculo diludo em uma srie de tubos de diluio. No exemplo apresentado, cada tubo de diluio subseqente conter um dcimo do nmero de bactrias presentes na anterior. Posteriormente, as amostras destes tubos sero transferidas para placas de Petri contendo meio de cultura onde ocorrer o crescimento das colnias e a contagem. O nmero de colnias ser utilizado na determinao da quantidade de bactrias presentes na amostra original (Retirado de Tortora et al., 2003).

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6- Alternativamente, pode-se inicialmente colocar o meio de cultura (WLN) nas placas de Petri, esperar a solididificao e a seguir, pipetar 0,1 mL espalhando o inculo com ala de Drigalsky (plaqueamento em superfcie). A Figura 10 mostra a metodologia utilizada para contagem em placas, comparando as tcnicas de plaqueamento em superfcie e em profundidade (pour-plate). Fazer a contagem de cada placa e para estimar o nmero de colnias, escolher as placas que apresentem de 30 a 300 colnias. Calcular a mdia das colnias das duas placas e multiplicar pelo fator de diluio para se obter o nmero de colnias. Se for utilizado o plaqueamento em superfcie, multiplicar por 10. A Tabela 1 traz as regras para interpretar e reportar a contagem em placas.

5.1.3. Meios diferenciais / seletivos para deteco de leveduras selvagens

Embora a diferenciao entre a levedura alcolica (processo) e a levedura contaminante (selvagem) no seja muito fcil, a presena desta pode ser detectada utilizando-se meios diferenciais/seletivos, isto , o meio empregado deve permitir somente o desenvolvimento da levedura contaminante. Entretanto, um nico meio no totalmente satisfatrio para a avaliao de todas as leveduras presentes, sendo portanto necessrio o emprego de vrios tipos de teste quando se pretende detectar, seno todas, mas a maioria das leveduras contaminantes presentes. De um modo geral, os meios seletivos ou diferenciais podem ser classificados em:

a- meios para deteco de leveduras contaminantes no Saccharomyces b- meios para deteco de leveduras contaminantes (selvagens)

Saccharomyces

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Figura 10. Metodologia utilizada para a contagem de colnias em placa (Retirado de Tortora et al., 2003).

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Os meios diferenciais (seletivos) para isolamento e quantificao de populaes de leveduras contaminantes baseiam-se em caractersticas fisiolgicas comuns s leveduras selvagens, mas ausentes em linhagens utilizadas em processos fermentativos para a produo de lcool. Dentre essas caractersticas, destacam-se as nutricionais (variaes nas fontes de carbono, nitrognio e nos fatores essenciais de crescimento) e resistncia a certos compostos como antibiticos, corantes, etc.

Vrios so os meios propostos para a deteco de leveduras contaminantes, Saccharomyces ou no Saccharomyces, entretanto, todos apresentam variaes, o que demonstra que para se conhecer melhor a presena de leveduras contaminantes durante o decorrer de uma safra, o uso de um s meio diferencial no ser suficiente, principalmente quando se trata de leveduras contaminantes pertencentes ao gnero Saccharomyces.

Como exemplo de meios seletivos (Figura 11), pode-se citar:

Meios Saccharomyces cerevisiae

Outras Saccharomyces

No Saccharomyces

WLN + actidione (WLD) (-) (-) (+) LWYN (-) (+) (+) Meio de Lisina (-) (-) (+)

Em trabalho realizado por Ceccato-Antonini & Silva (2000), concluiu-se que os meios acima citados foram eficientes no isolamento de leveduras selvagens, embora o meio de Lisina tenha propiciado o isolamento de Saccharomyces e o meio LWYN, de outros gneros, como no era esperado. A contagem de colnias nesse ltimo meio mostrou-se difcil, devido ao grande nmero de microcolnias desenvolvidas, possivelmente resistentes concentrao de cristal-violeta utilizada.

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Figura 11. Meios seletivos/diferenciais para isolamento de leveduras selvagens. Aspecto das placas inoculadas com fermento em meio WLD, diluio 10-1 (A); WLN, diluio 10-7 (B); Lisina, diluio 10-1 (C) e LWYN, diluio 10-1 (D).

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Procedimento

1- Coletar as amostras em frascos estreis e mant-las sob refrigerao at o processamento.

2- Os frascos das amostras sero homogeneizados por agitao cuidadosa, sendo transferidos 10 mL das amostras para tubos de centrfuga estreis, assepticamente.

3- Centrifugar-se- a 3000 rpm por 5 minutos, sendo os sobrenadantes descartados, adicionando-se em seguida soluo salina estril para ressuspenso das clulas.

4- As amostras sero novamente centrifugadas, desprezando-se os sobrenadantes e ressuspendendo-se as clulas a um volume final de 10 mL com soluo salina estril. A partir da recomposio do volume inicial, as amostras sero submetidas a diluio em srie.

5- Os plaqueamentos sero realizados em duplicata para duas diluies, de cada amostra, em cada um dos meios a serem analisados.

WLN diluies 10-7 e 10-8 WLD plaqueamento direto e 10-1 Lisina gar plaqueamento direto e 10-1 LWYN plaqueamento direto e 10-1 6- Utilizar-se- a tcnica de espalhamento de 0,1 mL da suspenso de clulas em

superfcie e a incubao das placas a 28C por 72 horas, quando sero feitas as contagens das colnias.

5.2. Bactrias

5.2.1. Plaqueamento e diluio em srie

Proceder como descrito no tem 5.1.2., utilizando-se o meio gar Nutriente.

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5.2.2. Colorao de Gram

A colorao de Gram um mtodo muito utilizado na identificao de bactrias. um mtodo de colorao diferencial que utiliza um corante primrio (cristal violeta) e um contracorante (safranina). Aps o uso do cristal violeta, segue-se a aplicao de uma soluo de lugol, o qual chamada de mordente, pois se combina com o corante para formar um composto colorido insolvel. Aps a descolorizao com lcool, aplica-se o contracorante safranina.

Os organismos que resistem descolorizao e retem o comlexo cristal-violeta apresentam cor prpura e so chamadas Gram-positivas. Aquelas clulas que descolorizam e perdem o complexo cristal violeta-iodo, aceitam o corante safranina e ficam vermelhas. So as Gram-negativas.

A maioria das clulas vivas, incluindo tecidos animais, so Gram-negativas. a caracterstica Gram-positiva que distintiva. Algumas bactrias, leveduras e alguns fungos fillamentosos so Gram-positivos.

Procedimento

1- Colocar uma gota de gua sobre uma lmina de vidro. 2- Com a ala de platina, retirar assepticamente uma pequena poro da cultura

e emulsion-la na gota, a fim de obter uma suspenso uniforme. Espalhar suficientemente para obter um esfregao fino. No esquecer de anotar na lmina a procedncia do esfregao.

3- Secar a preparao ao ar ou na chama do bico de gs. 4- Fixar o esfregao, passando a lmina trs vezes diretamente na chama. 5- Antes de corar, deixar que a lmina esfrie completamente. 6- Para a colorao, seguir o procedimento da Figura 12.

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Figura 12. Procedimento da colorao de Gram. 1- Um esfregao de cocos e bacilos fixado com calor primeiramente coberto com um corante prpura bsico (colorao primria) como a violeta-genciana ou cristal-violeta, e ento o corante lavado. 2- O esfregao coberto com iodo (um mordente) e lavado. Neste momento, ambas as bactrias gram-positivas e gram-negativas adquirem cor prpura. 3- A lmina lavada com etanol ou uma soluo de lcool-acetona (um descolorante) e ento lavada com gua. Agora, as clulas gram-positivas esto prpuras e as gram-negativas esto incolores. 4- Na etapa final, a safranina adicionada como contracorante, e a lmina lavada, seca e examinada microscopicamente. As bactrias gram-positivas retm o corante prpura, mesmo aps a lavagem com lcool. As bactrias gram-negativas aparecem de cor rosada, pois adquirem o contracorante safranina (Retirado de Tortora et al., 2003).

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7- Examinar ao microscpio com objetiva de imerso e determinar se as culturas so Gram-positivas (clulas coradas de roxo) ou Gram-negativas (clulas coradas de vermelho), Figura 13. Utilizar sempre um padro de bactria gram-negativa (por exemplo, Escherichia coli) e um padro gram-positivo (por exemplo, Bacillus thuringiensis) para comparao com a bactria-teste.

Figura 13. Microfotografia de bactrias coradas pelo Gram. O Staphylococcus aureus (prpura) gram-positivo, e a Escherichia coli (rosa) gram-negativa (Retirado de Tortora et al., 2003).

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6. Preparo de meios de cultivo e solues

WL Nutrient Medium (WLN) meio de cultivo para enumerao de leveduras totais

-extrato de levedura ............................. 0,4 g -casena hidrolisada ............................... 0,5 g -glicose.................................................... 5,0 g -fosfato monopotssico*.......................... 55,0 mg -cloreto de potssio*................................ 42,5 mg -cloreto de clcio*.................................... 12,5 mg -sulfato de magnsio*.............................. 12,5 mg -cloreto frrico*........................................ 0,25 g -sulfato de mangans*............................. 0,25 g -verde de bromocresol............................ 2,2 mg -cido nalidxico*..................................... 5,0 mg -gar ....................................................... 2,0 g -ampicilina*.............................................. 5,0 mg -gua destilada q.s.q. ............................. 100 mL

Os ingredientes assinalados com asterisco devem ser incorporados ao meio na forma de solues previamente preparadas.

Esse meio pode ser adquirido da Acumedia (referncia 7488 A).

WL Differential Agar (WLD) meio de cultivo para enumerao e isolamento de leveduras resistentes cicloheximida. O meio WLD obtido por adio do agente antifngico cicloheximida,

na forma de soluo, ao meio WLN, para uma concentrao final de 5 ppm.

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Meio de lisina meio de cultivo para isolamento de leveduras no pertencentes ao gnero Saccharomyces .

-bacto yeast carbon base...................... 1,17 mg -lisina...................................................... 0,10 g -gar ....................................................... 2,0 g -cido nalidxico....................................... 5,0 mg -ampicilina .............................................. 5,0 mg -gua destilada q.s.q. ............................. 100 mL

Os antibiticos sero incorporados ao meio na forma de solues.

Lin Wild Yeast Medium (LWYN) meio de cultivo para enumerao e isolamento de leveduras selvagens do gnero Saccharomyces.

-extrato de malte...................................... 0,20 g -extrato de levedura................................ 0,40 g -peptona.................................................. 0,20 g -glicose .................................................. 1,00 g -fosfato de potssio bibsico................... 0,10 g -cloreto de amnio .................................. 0,05 g -gar ....................................................... 2,00 g -violeta cristal * ....................................... 0,6 mg -mistura fucsina-sulfito ........................... 0,01 g -cido nalidxico * ................................... 5,0 mg -ampicilina * ........................................... 5,0 mg -gua destilada q.s.q. ............................ 100 mL

Os ingredientes assinalados com asterisco sero incorporados ao meio na forma de solues. A mistura fucsina-sulfito composta de 1 parte, em peso, de dextrina, 4 partes de fucsina bsica e 25 partes de sulfito de sdio anidro.

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gar Nutriente meio de cultivo para isolamento e enumerao de bactrias

-peptona........................ 5 g -extrato de carne..................................... 3 g -cloreto de sdio...................................... 1 g -gar........................................................ 20 g -gua destilada q.s.q. ............................. 1000 mL

Todos os meios de cultura sero esterilizados em autoclave a 120C por 20 minutos, a 1 atm.

Soluo de azul de metileno-citrato de sdio -azul de metileno...................................... 0,01 g -citrato de sdio........................................ 2 g -gua destilada q.s.q. ............................. 100 mL

Dissolver o corante numa pequena poro de gua, adicionar os outros ingredientes e completar o volume.

Soluo salina -cloreto de sdio....................................... 8,5 g -gua destilada q.s.p................................ 1000 mL

Cristal violeta (Gram) Soluo A -cristal violeta........................................... 2 g -lcool a 95%........................................... 20 mL Soluo B -oxalato de amnio..... ............................. 0,8g -gua destilada......................................... 80 mL

Misturar as solues A e B.

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Lugol (Gram) -iodo....... ........................ 1 g -iodeto de potssio................................... 2g -gua destilada q.s.q. ............................. 300 mL

Dissolver o iodeto numa pequena poro de gua, adicionar o iodo e completar o volume.

Safranina (Gram) -safranina em soluo alcolica a 2,5%. 10 mL -gua destilada q.s.q. ............................. 100 mL

7. Bibliografia

CECCATO-ANTONINI, S.R. Guia prtico de microbiologia. Araras: UFSCar, 1996. 58 p. (Apostila)

CECCATO-ANTONINI, S.R., SILVA, D.F. Eficincia de meios diferenciais no isolamento de cepas de leveduras de processos industriais de fermentao alcolica. STAB, Piracicaba, v.18, n.4, p.40-46, 2000.

PELCZAR, M., REID, R., CHAN, E.C.S. Microbiologia. So Paulo: McGraw-Hill, 1980. 566p. vol.1

RAVEN, P.H., JOHNSON, G.B. Biology. Dubuque: WCB, 1990. 1310p.

TORTORA, G.J. FUNKE, B.R., CASE, C.L. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2000. 827p.