DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 1 Contedo I. CONCEITOS BSICOS2 1. INTRODUO2 2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR3 3. ENZIMAS DE RESTRIO3 4. CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE7 5. DNA LIGASE8 5.1. Tipos de fragmentos de DNA que so ligados pela DNA ligase8 6. TRANSFORMAO BACTERIANA9 6.1.Conceito de transformao induzida9 6.2. Mecanismos de captao do DNA11 II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR13 1. PLASMDEO13 2. FAGOS14 2.1 Biologia do fago 14 2.2 Genoma do fago 15 2.3 Controle de expresso dos genes do fago 16 2.4 O uso do fago como vetor de clonagem molecular17 3. COSMDEO20 4. VRUS21 4.1. Clonagem no vrus SV4022 5. BACTERIFAGO M1324 5.1. Clonagem no bacterifago M1327 5.2. Estratgia de clonagem em vetores da srie M13mp28 6. FAGOMDEOS28 6.1. Clonagem no fagomdeo29 7. VETORES PARA TRANSFORMAO DE LEVEDURAS30 III. CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE33 1. BIBLIOTECA DE CDNA34 1.1. Sntese de cDNAs de fita dupla36 1.2. Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor37 2. BIBLIOTECA GENMICA39 2.1. Preparo do DNA do inserto42 2.2. Vetores utilizados na construo biblioteca genmica43 IV. DETECO E ANLISE DO CLONE RECOMBINANTE46 1. QUANDO O GENE DE INTERESSE EXPRESSO NO HOSPEDEIRO47 2. O USO DE SONDAS MOLECULARES DE CIDOS NUCLICOS PARA IDENTIFICAR O GENE DE INTERESSE49 3. ANLISE DO DNA E RNA POR ELETROFORESE EM GEL E BLOTTING55 4. COMO OS GENES CLONADOS SO UTILIZADOS?57 5. MAPA DE RESTRIO57 V. REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)58 VI. SEQUENCIAMENTO DE DNA61 VII. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS63 1. INTRODUO63 2. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS EM E.COLI65 2.1 Subclonagem em plasmdeos de expresso65 2.2 Anlise dos plasmdeos e seleo dos subclones corretos67 3. PRODUO DE PROTENAS HETERLOGAS EM E. COLI68 3.1. Produo de protenas hbridas68 3.2. Produo de protenas intactas72 4. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS EM ORGANISMOS EUCARIOTOS72 DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 2 4.1. Expresso em clulas de mamferos73 4.2 Expresso em fungos73 5. SISTEMA DE EXPRESSO EM CLULAS DE INSETO UTILIZANDO BACULOVRUS COMO VETOR74 6. EXPRESSO EM CLULAS DE DROSOPHILA75 7. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS: APLICAES E PERSPECTIVAS75 7.1- Bibliotecas de expresso e identificao de novas protenas atravs de anticorpos ou outros ligantes especficos75 7.2. A utilizao da tecnologia do DNA recombinante no conhecimento de receptores de membrana79 7.3. Expresso de protenas para interveno teraputica81 VIII. ANLISE DE EXPRESSO ATRAVS DE MICROARRANJOS DE DNA84 IX. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS88 I. CONCEITOS BSICOS 1. INTRODUO Atadcadade70,oDNAeraocomponentecelularmaisdifcildeseranalisado. Suasequnciadenucleotdeosdeenormetamanhoemonotoniaqumicaerageralmente analisadaatravsdemeiosindiretoscomoasequnciadeprotenaseanlisegentica.A partirdadcadade70novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a purificaodegenesespecficosnumprocessochamadodeclonagemgnica.Naverdade, muitasdestastcnicassoprovenientesdaMicrobiologia,Bioqumica,Imunologiae GenticaMicrobianaepermitiramqueaanlisedoDNAganhasseumnovoenfoque.O DNAtornou-seento,amolcula mais fcil de ser analisada, sendo possvel isolar regies especficas, obt-las em grande quantidade e determinar a sua seqncia numa velocidade de milhares de nucleotdeos por dia. ATecnologiadoDNArecombinante,comoseconvencionoudenominareste conjunto de tcnicas, tem uma ampla aplicao. Ela pode ser usada para estudar mecanismos dereplicaoeexpressognica,nadeterminaodaseqnciadeumgenee conseqentementedaprotenaqueelecodifica,ounodesenvolvimentodeculturas microbianascapazesdeproduzirsubstnciasteistaiscomoainsulinahumana,hormnio decrescimento,vacinaseenzimasindustriaisemgrandesquantidades.Suaaplicao comercial ou biotecnolgica parece ter um potencial inesgotvel. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 3 Comoconseqnciadodesenvolvimentodestatecnologiaatualmentepossvel realizarinvestigaodepaternidadeeodiagnsticodedoenasgenticaseinfecciosas atravs da anlise de DNA. 2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR A origem do termo clonagem vem da Gentica Bacteriana que considera uma colnia debactriascomoumcloneporquetodososindivduossogeneticamenteidnticos bactria inicial. AtcnicacentraldametodologiadoDNArecombinanteaclonagemmolecular,a qualconsistenoisolamentoepropagaodemolculasdeDNAidnticas.Aclonagem molecularcompreendepelomenosdoisestgiosimportantes.Primeiro,ofragmentodo DNA de interesse chamado deinserto ligado a uma outra molcula de DNA chamada de vetorparaformaroquesechamadeDNArecombinante.Segundo,amolculadoDNA recombinanteintroduzidanumaclulahospedeiracompatvel,numprocesso chamado de transformao. A clula hospedeira que adquiriu a molcula do DNA recombinante agora chamada de transformante ou clula transformada. Um nico transformante, em condies ideais, sofre muitos ciclos de diviso celular, produzindo uma colnia que contm milhares de cpias do DNA recombinante. 3. ENZIMAS DE RESTRIO Em 1953 foi descrito um estranho fenmeno no qual a eficincia da replicao de um bacterifago(vrusdebactrias)dependia da clula hospedeira na qual ele estava inserido. Algumtempodepoispercebeu-sequeainabilidadedecertosfagoscresceremem determinadas linhagens bacterianas era devido a presena de nucleases altamente especficas que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa bacteriano que degradaDNAquelheestranho(restrio).AbactriaprotegeseuprprioDNAdesta degradaocamuflando-oatravsdametilaodealgumasbasesespecficas (modificao). Como conseqncia, este sistema frequentemente descrito como fenmeno da restrio/modificao e existe em um grande nmero de bactrias. Asenzimasderestrioouendonucleasesderestriosodivididasemvrias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos stios de reconhecimento e clivagem. As DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 4 enzimasdoTipoII,asmaisimportantesnaTecnologiadoDNARecombinante,so proteinasmonomricasoudimricaseclivamoDNAnomesmostiodoseureconhecimento.Ostiodereconhecimentodestetipodeenzimanormalmenteuma seqncia palindrmica, isto , ela tem um eixo de simetria e a seqncia de bases de uma fita a mesma da fita complementar, quando lida na direo oposta (Figura 1). Figura1.Osdoistiposdeclivagemfeitosporenzimasde restrio. As setas indicam os stios de clivagem e as linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequncia. Estasenzimasreconhecemseqnciasespecficasde4a8paresdebase(pb)na molcula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. H 2 tipos distintos de clivagens: a) osdoiscortesocorremnoeixodesimetriadaseqnciaespecfica,gerandoextremidades abruptas, ou b) os cortes so feitos simetricamente, porm, fora do eixo de simetria, gerando extremidadescoesivas.Estesdoistiposdeclivagensesuasconseqnciasestomostrados na Figura 1.Atualmente,maisde1000enzimasderestriojforamidentificadas.A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviao do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gnero e as outras duas a espcie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrio denominada deEcoRI purificada deumaEscherichiacoliquecarregaumfatordetransfernciaderesistnciaRI,enquanto que a Hind III isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III. a) Clivagem no eixo de simetriaMolculas com extremidades abruptas Molculas com extremidades coesivasb) Clivagem simtricamente situada aoredor do eixo de simetria...TC GA......AG CT...3 5 3 5 +...GAA TTC......CTT AAG...+3 5 3 5 DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 5 ATabela1mostraaseqnciapalindrmicaeolocaldeclivagemdealgumas enzimas de restrio. Note que algumas enzimas deixam terminaes coesivas enquanto que outras fazem cortes abruptos ou no coesivos. Tabela 1. Algumas endonucleases de restrio: origem e stios de clivagem. A seta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina. O interesse por estas enzimas de restrio aumentou em 1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitiam a ligao dos fragmentos. Isto significava que a recombinao poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Alm disto, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA Microrganismo EnzimaSequncia AlvoEcoRI EscherichiacoliBacillus amyloliquefaciens HHaemophilus aegyptiusHaemophilus aegyptiusHaemophilus aegyptiusProvidencia stuartiiStreptococcus albus GThermus aquaticusSerratia marcescensBrevibacterium albidiumBacillus globigiiBamHIBglIIPstIBalISmaIHaeIIITaqISalIHindIIIHaeIIG A A T T CC T T A A GG G A T C CC C T A G GA G A T C TT C T A G AP G C G C P iP i C G C G Puy uA A G C T TT T C G A AC T G C A GG A C G T CG T C G A CC A G C T GT G G C C AA C C G G TA G G C C TT C C G G AC C C G G GG G G C C CT C G AA G C TDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 6 humano ou de qualquer outra espcie, abrindo a possibilidade de clonar genes humanos ou isolar protenas de culturas bacterianas. Umaimportanteconseqnciada especificidade destas enzimas de restrio que o nmero de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo definido e permiteoisolamentodefragmentosdesteDNA.Portanto,cadaenzimaderestriogera umafamlianicadefragmentosquandoclivaumamolcula de DNA especfica. Enzimas que reconhecem stios de restrio compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em mdia acada256nucleotdeos(44=256).Aquelasquereconhecemstioscom6e8pbclivamo DNAemmdiaacada4096e65536pb,respectivamente.Noentanto,estamdiapode sofrer variaes significativas, dependendo principalmente da composio de bases do DNA analisado.Porexemplo,aenzimaNotIreconheceumstioderestriocontendo8pb, incluindo nucleotdeos CpG, que raramente ocorre no DNA de mamferos. A famlia de fragmentos gerados por digesto com enzima de restrio geralmente detectadapelaseparaodestesfragmentosporeletroforeseemgeldeagarose.Os fragmentosmigramemfunodeseuspesosmolecularessendoqueosmenoresmigram mais rapidamente (Figura 2). Figura2.MolculasdeDNAdetamanhosdiferentespodemserseparadasporeletroforese. Molculasmenoresmovem-semaisrapidamentequemolculasmaiores,tornando-seportanto separadas em bandas. O DNA corado com brometo de etdio, uma molcula que fluoresce quando iluminada com luz Ultra Violeta. Sentido da migraoPares debaseDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 7 4. CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE Uma enzima de restrio particular reconhece somente uma seqncia nica de bases. DNAs de origens diferentes sob a ao da mesma enzima de restrio produzem fragmentos comomesmoconjuntodeextremidadesfitassimples.Portanto,fragmentosdedois diferentesorganismos(por exemplo, bactria e homem) podem ser ligados por renaturao das regies de fita simples. Alm disto, se a ligao for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos sero ligados permanentemente. AtcnicadeDNArecombinantetemuminteresseespecialseumadasfontesde DNA clivado for um plasmdeo. Figura3.ConstruodeumamolculadeDNAhbridaapartirdefragmentosdediferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrio. A figura 3 mostra uma molcula de DNA de plasmdeo que tem somente um stio de clivagemparaumadeterminadaenzimaderestrio.Amesmaenzimausadaparaclivar DNAhumano.SeosfragmentosdeDNAhumanosomisturadoscomoDNAplasmidial linearizado,permitindoaligaoentreeles,umamolculadeDNAplasmidialcontendo DNAhumanopodesergerada.Esteplasmdeohbridopodeserinseridonumabactria atravsdetransformaoeentooinsertoserreplicadocomopartedoplasmdeo. Plasmdeo deE.coliDNA humanoDNA ligasePlasmdeo hbridoEnzima EnzimaGCATTACGTGCATGCAACGTACGTTGCAACGTTGCA TGCAACGTACGTDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 8 Geralmente,antibiticossoacrescentadosaomeiodaculturaparaselecionarsomenteas linhagens que portam os plasmdeos (o plasmdeo usado para esta finalidade porta resistncia a pelo menos um antibitico). 5. DNA LIGASE Conformemencionadoanteriormente,estaenzimapromovealigaodosfragmentosde DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrio.ADNAligaserequerum grupoOHlivrenaextremidade3'deumadascadeiasdeDNAeumgrupofosfatona extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactriasrequerNAD+,enquantoqueaisoladadobacterifagoT4requerATPcomo cofator. Figura 4. DNA ligase cataliza a juno de duas fitas de DNA que so partes da molcula da dupla-hlice. 5.1. Tipos de fragmentos de DNA que so ligados pela DNA ligase a) Fragmentos com extremidades coesivas Asextremidadescoesivasproduzidasporvriasenzimasderestriopermitemque doisfragmentosdeDNAsejammaisfacilmenteligados.Istoporqueocorreinicialmenteo pareamentodasfitassimplesdasextremidadescoesivasdasduasdiferentesmolculas, atravsdaformaodepontesdehidrogniopelacomplementariedadedasbases. DNA DNA 3 OH-O O 5 PO-ODNA DNA 3 O O 5OP-O+DNA-LigaseATP ou NADDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 9 Finalmente,aligaocovalente(fosfodister)dosfragmentosrealizadapelaDNAligase (ver figura 4). b) Fragmentos com extremidade no coesivas DNAsportandoextremidadesnocoesivassoligadoscommuitomenoseficincia que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma concentrao muito maior de DNA ligase emesmodosDNAsenvolvidosnecessriaparaqueasmolculascomextremidadesno coesivas sofram reao de ligao. Noentanto,aligaodeste tipo de fragmento facilitada pela transformao prvia dasextremidadesnocoesivasemcoesivas.Esteprocedimentopodeserfeitoatravsde dois processos: a)Adiodepolidesoxiadeninanaextremidade3'deumfragmentodeDNAe polidesoxitiminanaextremidade3'deumoutrofragmentodeDNA,atravsdaenzima desoxinucleotidil-transferase-terminal ou simplesmente transferase. Esta enzima, uma DNA polimerase incomum, adiciona nucleotdeos extremidade 3-OH de fragmentos fita simples proeminentesdeumacadeiadeDNA.Paragerarestetipodeextremidadeproeminentea molculatratadapreviamentecomumaexonuclease5-especficapararemoveralguns nucleotdeosterminais.Apsamisturadosdoistiposdefragmentoscomplementarese anelamento dos mesmos, as molculas so unidas preenchendo-se os espaos existentes com o auxlio da DNA pol I e selando-os com DNA ligase (Figura 5) b)Adiodeadaptadoressextremidadesnocoesivas.Osadaptadoresso oligonucleotdeossintticosquecontmstiosdeclivagemparaumaoumaisenzimasde restrio. Eles so unidos ao DNA com o auxlio da DNA ligase (Figura 6). Alternativamente, no lugar de modificar a extremidade no coesiva, pode-se optar pela utilizao de T4 ligase em grande concentrao, o que permitir a ligao entre molculas de DNA sem proeminncias. 6. TRANSFORMAO BACTERIANA 6.1.Conceito de transformao induzida DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 10 Oprocessodetransformaoconstituiumeventodealtaimportncianatcnicade manipulao gnica. A transformao natural descrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradores,em1944,umeventoraro.Noentanto,em1970,MandeleHiga encontraramqueaE.colitornou-semarcadamentecompetenteparatransformaocom DNA exgeno, quando a bactria foi suspensa em cloreto de clcio gelado e submetida a um curtochoquetrmico42oC.Estesmesmosautorestambmverificaramqueasbactrias crescidas at a fase log eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros estgios do crescimento. Figura 5. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adio de poli (A) e poli (T). 5 55 5 33AAAA TTTT333AAAA TTTT3335 - Exonuclease especficaDeoxinucleotdio transferase terminalEspaos preenchidos com DNA Pol I. DNA ligasepara completar a ligao+dATP +dTTPDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 11 Figura 6. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformados em coesivas pela adio de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrio que reconhece o adaptador. Oprocedimentodocloretodeclcioqueusadoathojeproduz uma eficincia de transformao da ordem de 105 a 107 transformantes por micrograma de DNA (a eficincia de transformao geralmente expressa como o nmero de clulas transformadas, obtido a partir de um micrograma de DNA plasmidial intacto). OtamanhoeaconformaodamolculadoDNA,afetamoprocessode transformao.Plasmdeospequenossomaisfacilmenteincorporadospelaclula bacterianacompetente;DNAlinearpobrementeincorporado,talvezpelofatodesofrer degradao pelas enxonucleases presentes no espao periplasmtico. 6.2. Mecanismos de captao do DNAOmecanismodecaptaodamolculadoDNApelabactriacompetenteainda desconhecido. Uma hiptese que as molculas do DNA passam atravs de canais situados nas chamadas zonas de adeso, que so locais onde a membrana interna e externa da clula bacterianaunem-seformandoporos.Estesporossestopresentesduranteocrescimento bacteriano (fase de crescimento exponencial). DNA a ser inserido+GAATTCCTTAAGAdaptadorSintticoT4 DNA ligaseGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIAATTCGGCTTAAGAATTCCTTAAGVetorEcoRIG AATTCCTTAA GDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 12 Emcondiesnaturais,acaptaodoDNAtorna-sedifcildevidoarepulso eletrostticaexistenteentreascargasnegativasdacamadadefosfolipdeosdamembrana bacteriana e dos grupo fosfato da molcula do DNA.Opapeldoclcioexplicadopelahiptesedequea0oCafluidezdamembrana celularcristalizada,estabilizandoadistribuiodosfosfatoscarregados.OsonsCa+2 formamumcomplexocomestegrupamento,cobrindoascargasnegativaseassim facilitandoaatraoeletrostticacomasmolculasdoDNA na zona de adeso. O choque trmico,complementaesteprocessodecaptao,provavelmentecriandoumdesbalano trmicoentreointerioreoexteriordaclulabacteriana,auxiliandoobombeamentodo DNA atravs da zona de adeso. A figura 7 ilustra este processo. Figura7.MecanismomolecularpropostoparaexplicaratransformaodeE.colicomuma molcula de DNA exgeno. - ------------------------------------------------- --- --Zona de adesoPlasmdeoBicamadalipdica(interna)Bicamada lipdica(externa)Fosfolipdeoson de clcioCamada peptidoglucanDNA genmico ClulaBacterianaDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 13 II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR Aps o isolamento de uma informao gentica, por exemplo um fragmento de DNA obtidopelaclivagemcomenzimasderestrio,estefragmentodeverserinseridonuma outramolculadeDNAdiferente,capazdeamplificaraquelainformaogenticaem centenas de cpias. Este processo de amplificao obtido atravs do uso de molculas de DNA que so os chamados vetores de clonagem molecular. Atualmente,ostiposbsicosdevetoresusadosnametodologiadoDNA recombinanteapresentamcaractersticasespeciaisqueostornamexcelentesveculosde clonagem em diferentes situaes. Aseguir,vamosapresentarosprincipaistiposdevetoresatualmenteemusona biologia molecular. 1. PLASMDEO PlasmdeossopequenasmolculasdeDNAduplafita,contendooselementos necessriosparaasuareplicaoepelomenosumgenequeconfereresistnciaa antibitico.Esteselementosgenticosextracromossomaisvariamde5a400kilobasese comumenteestopresentesemduasoumaiscpiasporclula.Osplasmdeospresentes num grande nmero de cpias so usados como veculos de clonagem desde que capacitem a amplificao do segmento do DNA neles clonado. Umplasmdeoparaserumbomvetordeclonagemdeveconterasseguintes propriedades: a) possuir uma origem de replicao (O), ou seja, uma seqncia de DNA que permita que o vetor seja replicado na clula hospedeira; b)apresentardoisoumaisstiosnicosdeclivagemparaendonucleasesderestrio.O conjunto destes stios, denominado de Mltiplos Stios de Clonagem (MSC), o local onde o inserto incorporado ao vetor de clonagem; c)possuirumgenequecodificaumprodutoquedistingueaclulatransformadadaclula notransformada.Porexemplo,muitosvetoresdeclonagemcarregamogenequeconfere resistnciaampicilina(AmpR).Asclulastransformadascomtaisvetoressocapazesde crescer num meio contendo o antibitico, enquanto que as clulas no tranformadas acabam morrendo.DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 14 A figura a seguir ilustra as principais caractersticas estruturais de um plasmdeo. Figura8.Estruturamoleculardeumplasmdeotpicousadoemclonagemmolecular.Esto representadosogenederesistncia(AmpR),aregiodemltiplosstiosdeclonagem(MSC)ea origem de replicao (O). Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular o uso de enzima de restrio que produz extremidades compatveis durante a clivagem do DNA a ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor). UmavezqueoDNAfoiligadoaovetor,estamolculahbridadeverser introduzidanumaclulahospedeirageralmentebactrias,porumprocessochamadode transformao,paraqueovetorpossasofrerreplicaeseconsequentementeamplificaro nmerodecpiasdoinserto.Abactriatransformadaserfacilmentereconhecidapela aquisiodeumnovofentipodadopeloplasmdeo,ouseja,capacidadedecrescerem meios contendo antibitico. 2. FAGOS Umdosvetoresmaisutilizadosnosprocessosdeclonagemmolecularo denominadobacterifago,oqualcomporta-secomoumvrusdaE.coli.Antesde analisarmosousodesteelementocomoveculodeclonagemmolecular,vamosmostrar resumidamente as suas propriedades biolgicas e estruturais. 2.1 Biologia do fago AmpROMSCDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 15 O fago um parasita obrigatrio da E.coli, o qual necessariamente deve injetar o seuDNAnabactriahospedeiraparaasuamultiplicao.ApsainfecodaE.colio genoma do fago pode seguir duas vias: a) No primeiro caso denominado estado ltico, o DNA do fago permanece na bactria como uma molcula independente, havendo a ativao de alguns genes do fago e a concomitante inativaodeoutros,dentrodeumprogramaestritamentedefinido.Comoresultadoo cromossomodofagoreplicadoativamente,ocorreasntesedasprotenasdacapaeda caudaeformam-senovaspartculasvirais.Emaproximadamente45minutosapsa infeco a clula hospedeira lisada havendo a liberao de cerca de 100 novos fagos. b)Aoutraviaqueocromossomodofagopodeseguirodenominadoestadolisognico. Neste caso, o DNA do fago integrado no cromossomo da bactria passando a ser chamado profago.Noestadolisognico,todososgenesdoprofagoestoinativoscomexcessodo genequeproduzaprotenarepressora.Abactriahospedeiracarregandooprofago multiplica-se e este replicado passivamente e distribudo para as bactrias descendentes. Em condies naturais a opo entre seguir o estado ltico ou lisognico depende das condiesdomeio.Assim,viaderegra,emmeioricoemnutrientesoestadoltico preferencial,porexemploofagonabactriaE.coliintestinal.Poroutrolado,emmeio pobre de nutrientes como o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado lisognico. Em condies experimentais, o estado a ser seguido depende de um balano entre os fatores do meio intra e extra celular e de fatores genticos da bactria hospedeira e do bacterifago. 2.2 Genoma do fago Obacterifagoumapartculaviralconstitudadeaproximadamente50%de protenas e 50% de DNA. O DNA do fago , na forma como ele isolado da partcula viral, umamolculalinearcomduplafitadeaproximadamente48.500paresdebases.As extremidadesdamolculacontmumafraodeDNAfitasimplescomcercade12 nucleotdeos,osquaissocomplementaresnasequnciadebaseseatravsdelasqueo DNAassumeaformacircularquandoeleinjetadonaclulahospedeira.Estas extremidadessodenominadasdestioscos.Ogenomadofagocodificapara aproximadamente 50 protenas, cujos genes tem um cronograma de expresso bem definido, o que determina a instalao do estado ltico ou lisognico. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 16 As figuras 9 e 10 ilustramo ciclo biolgico do fago em uma clula hospedeira e o genoma do fago com alguns dos seus principais genes, respectivamente. 2.3 Controle de expresso dos genes do fago Sejaqualforaviaaserseguidapelofago,ousejavialticaoulisognica,a expresso dos genes envolvidos nestes circuitos comea pelos produtos dos genes N e Cro, reguladospelospromotorespLepRrespectivamentesituadosesquerda(pL)edireita (pR) do gene cI. Duranteotranscursodavialtica,oprodutodogenecroestdiretamente relacionadocomareplicaodogenomadofago,atravsdainduodaexpressodos genesOP.Poroutrolado,oprodutodogeneNestdiretamenterelacionadocoma expressodosgenesdaregiodeempacotamento,ousejagenesAeJ,responsveispela sntese das protenas da cabea e da cauda do fago , como tambm da expresso dos genes S e R, diretamente envolvidos com a lise da clula hospedeira. Figura 9. Replicao do fago no interior da clula hospedeira. Aps adsoro (1) e injeo (2) do genoma do fago na bactria, a via ltica indicada pelos nmeros 3, 4 e 5 leva a formao de novas partculasvirais.Alternativamente,avialisognica(6)podeserativadalevandointegraodo 126345Empacotamento Recombinao Regulao Replicao Lisecos A JNCropLpr.cIII cI cII O P S RintDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 17 material gentico viral ao genoma da bactria hospedeira. Figura 10. Representao esquemtica do genoma do fago . Duranteavialisognica,atranscriotambminicia-sepelospromotorespLepR coordenandoaexpressodosgenescIIecIII.Oprodutodestesdoisgenescoordenaa expressodogenecIqueproduzumaprotenarepressorainibindoaexpressodosgenes responsveis pelo empacotamento e a lise. Por outro lado, um outro gene importante o int, cujoprodutorelaciona-secomaintegraodofagonogenoma bacteriano estabelecendoo estado lisognico. 2.4 O uso do fago como vetor de clonagem molecular Duranteocicloltico,osgenesenvolvidosnoprocessodelisogniaso dispensveiseconsequentementearegiodeintegraodogenomadofagopodeser totalmentesubstitudaporumoutrofragmentodeDNA,semquehajaqualqueralterao nos processos envolvidos na via ltica. Uma das maiores vantagens de usar o fago como vetor de clonagem que o DNA inserido no fago empacotado in vitro. Embora a eficincia de empacotamento seja cerca de 10%,umavezqueosfagossoempacotadosteremos100%deeficincianainfecoda E.colihospedeira.Esteprocessoaltamenteeficientequandocomparadocomoda transformao bacterianacom plasmdeos. Neste caso, os melhores resultados situam-se ao redorde108transformantesporgdeDNAoquesignificaquemenosde1em1000 plasmdeos so incorporados na E.coli hospedeira. Atualmente,existemvriosderivadosdofagonosquaisumoumaisstiosde restrioflanqueiamaregioderecombinao,facilitando a sua substituio por um outro DNA. Estes so os chamados vetores de substituio. Um exemplo tpico destes vetores o EMBL3, no qual a regio de recombinao flanqueada pelas enzimas de restrio EcoRI, BamHI e SalI. Esse vetor quando quando clivado pode receber fragmentos de DNA variando de 10,4 a 20 kb, como mostra a figura abaixo. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 18 Outrosderivadosdofagosooschamadosvetoresdeinsero.Nestetipode vetor,osfragmentosdeDNAquepodemserinseridosdevemternomximoat7kbde tamanho para no alterar os processos de empacotamento do genoma do fago. Osvetoresdeinseroderivadosdofagomaisbemutilizadosespecialmentena clonagemdecDNA,soosvetoresgt10eogt11.Vamosaseguirfazeralgumas consideraes sobre estes dois tipos de vetores. No fago gt10, o inserto geralmente cDNA, inserido no stio da EcoRI situado no gene repressor cI. O fago recombinante ter agora o gene cI obstrudo e consequentemente duranteaculturaprovocaralisedascolniasdebactriastransformadas.Essascolnias lisadas so visualizadas como crculos com o centro claro (placas de lise), bastante distintos dascolniasnorecombinantes,queporpossuremogenecIntegronosolisadase permanecem como colnias turvas. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 19 Figura 11. Representao esquemtica da clonagem de um fragmento de DNA genmico no fago . AsregiesindicadasporacontmtodasasinformaesnecessriasparareplicaoemE.colie empacotamentoinvitro.OsdiferentesfragmentosobtidosdadigestodoDNAdeinteressecom enzima apropriada esto indicados pelas letras b e c, onde somente c possui tamanho adequado para o empacotamento. Poroutrolado,ofagogt11contmumstioderestrioEcoRIlocalizadonum gene chamado LacZ, a 53 nucleotdeos do cdon de trmino da enzima codificada por esse gene (|-galactosidase). Essa enzima, cuja expresso pode ser induzida por IPTG (isopropil-|-D-galactosdeo),degradaosubstratoX-galproduzindoumprecipitadodecorazul. Portanto,colniasdebactriascarregandooDNAdofagocomogeneLacZintacto(sem inserto),napresenadoindutorIPTGedosubstratoX-gal,ficaroazuis.Enquantoque, EcoRIEcoRIligaseempacotamentoin vitroaabbbbcDNA bacterifagoDNA camundongobacterifagocontendogenesdocamundongoinformaesdesnecessriasreplicaocDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 20 aquelas portanto o DNA o fago que incorporou o inserto no stio de EcoRI, no expressam a |-galactosidadeepermanecemdecorbranca,oquefacilitaaidentificaodosclones recombinantes. 3. COSMDEO AclonagemdefragmentosdeDNAnofagoapresentaumalimitao,poiso fragmento a ser clonado no podeser maior do que cercade 15kb (Figura 12). Na maioria das vezes, esta dimenso suficiente para conter um gene completo, incluindo as sequncias flanqueadoras.Entretanto,muitosgenesapresentamdimensesdaordemde35a40kbe nestescasos,atcnicausadaparaaclonagemdestetipodefragmentoachamada clonagem em cosmdeos. Oscosmdeos,soplasmdeosquecontmumfragmentodeDNAdofagoque inclui o stio cos. Estes cosmdeos podem ser usados como veculos de clonagem molecular empregando o sistema de empacotamento in vitro que reconstitui a estrutura do fago (cabea e cauda) e assim usado para infectar a clula hospedeira. As enzimas do sistema de empacotamento do fago reconhecem os dois stios cos situadosde35a49kbdedistnciaenestecaso,somentefragmentosdestaordemde tamanho sero convenientemente empacotados. ODNAgenmicodeinteresseclivadocomumaenzimaderestrioque produz grandesfragmentosdeDNA,osquaisseroligadosaocosmdeo,tambmclivadocoma mesma enzima. A situao ideal que cada fragmento do DNA genmico apresente um stio cos nas suasextremidades.Duranteoempacotamento,asenzimasdosistemareconhecemosstios cossituadosaumadistnciadentrode49Kb,clivamestesstioseempacotamestas molculas. O DNA do cosmdeo injetado no interior da clula hospedeira, circulariza igual ao DNAdofagoereplicacomoumplasmdeonormal,semexpressodequalquerfunodo fago.Asclulasinfectadasseroselecionadascombasenaresistnciaadquiridaaum determinado antibitico. A figura 12 ilustra um tpico processo de clonagem em cosmdeo. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 21 Figura 12. Esquema de clonagem em cosmdeo. 4. VRUS A biologia molecular dos vrus de DNA e RNA foi extensivamente estudada antes do advento da metodologia do DNA recombinante. O vrus SV40, isolado de clulas tumorais de macacos, foi um dos primeiros sistemas virais utilizados para introduzir genes em clulas de mamferos. O DNA do SV40 apresenta 5.200 pares de bases e pode ser dividido em duas regiesquantoaexpressognicaviral.Estasregiessochamadasderegioprecocee regio tardia. fragmentosde restriode 35 a 40 kbAmpR Stio alvo de restriocosDNA circularizaaps infecoseleo de clones resistentes a ampicilinaDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 22 Aregioprecoceexpressaatravsdocicloltico,enquantoqueaexpressodos genes da regio tardia ocorre somente aps o incio da replicao do DNA viral. Entre estas duas regies situa-se a origem de replicao do DNA do vrus. Um produto de expresso da regio precoce o antgeno T, o qual responsvel pela transformao maligna de clulas no permissveis (clulas nas quais o vrus no completa a suareplicao),comotambmpeloinciodareplicaoviralemclulaspermissveis.Os produtos de expresso codificados pela regio tardia correspondem s protenas que formam o capsdeo da partcula viral. A figura 13 ilustra o genoma do virus SV40. Figura 13. O DNA do virus SV40 4.1. Clonagem no vrus SV40 AproduodeDNArecombinantenovrusSV40,podeserrealizadaatravsda substituio do segmento de expresso precoce ou do segmento de expresso tardia. No primeiro caso, o vrus recombinante no produz o antgeno T, ao passo que na segundaoponohaverproduodasprotenasdocapsdeo.Entretanto,estasfunes deletadas podem ser suprimidas como veremos a seguir. 4.1.1. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia Quando a regio tardia do SV40 substituda com outro DNA, perde-se a expresso dasprotenasdocapsdeo(funestardias).Paraqueosistemadeclonagemfuncione adequadamentepode-serealizarainfecosimultneacomumoutrovrusSV40quetem oExpressoprecoceExpressotardiaSV40Genoma do SV40DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 23 umadeleonosgenesdaregioprecoce,masaregiotardiaintacta.Nasclulasco-infectadasasprotenasdaregioprecoceseroproduzidaspelovrusrecombinanteeas protenasdocapsdeopelovrusdeletado.Comoresultado,teremosaproduodeuma populao de partculas virais mistas, ou seja, vrus deletado e vrus recombinante. A figura 14 ilustra este procedimento. Figura 14. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia SV40genecotransfecopartculas ViraisSV40Regio funcional tardiaRegio funcionalprecoceOdaglobinaSV40-globinaempacotamento e liseDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 24 4.1.2. Clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce QuandoaclonagemnoSV40feitanaregioprecoce,aproduodepartculas viraisdependedosuprimento,porumaoutrafonte,dasprotenascodificadaspelaregio precoce(antgenoT).ParaevitarumainfecomistacomumvrusSV40deletado,usa-se uma linhagem celular, as clulas COS as quais, apresentam uma poro do genoma do SV40 integradoaoseuprpriocromossomo.Estalinhagemcelularproduzaprotenaviral denominadaantgenoT,aqualliga-senaorigemdereplicaodovruseinduzasua replicao. A figura 15 ilustra este tipo de clonagem. Apesardestesistemaviraltersidousadocomovetordeexpressoemmuitas estratgias de clonagem, existem algumas desvantagens de seu uso. Uma delas que o gene a ser clonado no pode ser grande, a outra que as clulas hospedeira s podem ser clulas demacacosefinalmente,ogenomadaclulahospedeirapodesofrerrearranjadosou delees. Atualmente, dois outros sistemas virais mais versteis esto em uso, so eles o vrus davacinaeoBaculovrus,osquaispodemaceitargenesbemmaioresdoqueaqueles aceitospeloSV40.Uminconvenienteparaestesdoissistemasviraisqueambos apresentam um grande genoma e o gene a ser clonado s pode ser inserido por processos de recombinaodentrodasclulas,oqualbastantelentoemrelaoaosprocessos tradicionais em uso na metodologia do DNA recombinante.Finalmente,umsistemaviralbastantepromissorsoosretrovrusquesovrus cujo material gentico o RNA e apresentam um ciclo bastante diferente dos mencionados anteriormente que so ciclos lticos. Os retrovrus infectam uma grande variedade de clulas demamferoseoseuRNAtranscritoreversamenteparaDNAoqualincorporadoao genoma da clula hospedeira. Neste estado ele produz continuamente novas partculas virais, juntamentecomoprodutodogeneneleclonado.Devidoasuaversatilidade,osretrovrus so atualmente os vetores eleitos para uso em terapia gnica. 5. BACTERIFAGO M13 ObacterifagoM13umfagofilamentosodaE.coliecontmumanicafitade DNAenvolvidaporprotenasvirais.Duranteoseuciclo,aclulahospedeirainfectada DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 25 pelafita(+)aqualservircomomoldeparaasntesedaoutrafita(-).Aduplafita denominadadeformareplicativa,permanecenointeriordaclulahospedeirae amplificadaat200cpias por clula, quando ento a fita negativa no mais se replica e a fitapositivacontinuaasersintetizada,adquireas protenas da cpsula viral e sai da clula hospedeira atravs de processo no ltico (Figura 16). DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 26 Figura 15. Esquema de clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce. SV40genePartcula ViralOda Regio funcionaltardiaRegiofuncionalprecoceSV40-Hahemaglutinina (Ha)co-transfecoSV40mutanteempacotamentoe liseSV40 mutanteintegrado aogenoma da clula COSantgeno T replicaoDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 27 Figura 16. Replicao do bacteriofago M13. 5.1. Clonagem no bacterifago M13 A grande utilidade deste sistema de clonagem a sua facilidade na produo de DNA fitasimples,facilmenterecuperveldosobrenadantedeumaculturalquidadaE.coli infectada com este vetor. Como veremos futuramente, este DNA fita simples bastante til noprocessodesequenciamentodoDNApelomtododesenvolvidoporSangere colaboradores (1977). Parafacilitaroseuusoespecialmenteemestratgiasdeseqenciamento,foram desenvolvidosvetoresdasrieM13mp,osquaiscontmoMSCinseridonogeneque expressa a |-galactosidase.Mutaes foram realizadas de tal modo que a enzima s ativa quando o vetor est naclulahospedeira,convenientementepreparada.Esteprocessodenomina-sede alfacomplementao.A incluso do mltiplo stio de clonagem no gene da| galactosidade visaaidentificaodospossveisrecombinantesquandonapresenadeumsubstrato cromognicooX-galouBluogal(5-bromo-4-cloro-indolil-|-D-galactosdeo)eoindutor IPTG.Quandoovetorestintacto(norecombinante),aenzimafuncionalefrenteao substrato cromognico este clivado produzindo placas de cor azul. Por outro lado, quando umfragmentodeDNAinseridonomltiplositiodeclonagem,aexpressodaenzima suprimida,portantoasclulassoincapazesdemetabolizarosubstratocromognico formando placas incolores. + + +++-M13E.coliDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 28 5.2. Estratgia de clonagem em vetores da srie M13mp A utilizao de vetores com diferentes orientaes do mltiplo stio de clonagem, tais comoM13mp8eoM13mp9,facilitaainserodeumfragmentodeDNAemambasas orientaes. Como veremos adiante, esta estratgia apresenta grande aplicao no programa de sequenciamento de um DNA pelo mtodo de Sanger. A figura 17 ilustra a insero de um fragmento de DNA clivado com as enzimas Pst1 (P) e EcoRI (E) nos vetores M13mp8 e M13mp9, ambos clivados com as mesmas enzimas. EstaclonagemorientadapermiteainserodofragmentodeDNAnaorientao5'3'no vetor M13mp8 e na orientao 3'5' no vetor M13mp9. Figura 17. Clonagem de um fragmento de DNA nos vetores M13mp8 e M13mp9 clivados com as enzimas EcoRI (E) e PstI (P). 6. FAGOMDEOS ApesardobacterifagoM13apresentargrandeaplicabilidadeespecialmentenos processosdeseqenciamentodeDNA,foramdesenvolvidasoutrasgeraesdefagos,os quais reunem as vantagens do fago M13 e a do plasmdeo. Os primeiros foram os vetores da srie pEMBL e mais tarde os plasmdeos pTZ, pBluescript e pGEM (+/-). Estes vetores so chamados de fasmdeos ou fagomdeos e apresentam as seguintes caractersticas principais: P5 3P EEPEE PPEM13 mp9 M13 mp8DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 29 -fagomdeoapresentaumverstilMSC,permitindoaclonagemdegrandes insertossemmaioresdificuldades,almdeque,asenzimassituadasnestestio foramordenadasdetalmodoapermitirumaalternativainteressanteduranteo processo de sequenciamento. -utilizandoumacombinaoestratgicadeduas enzimas de restrio, possvel criarterminaes5'e3'proeminentes,tornandoagoraumaextremidade(ado inserto)susceptvelaodaExonucleaseIII.Estaestratgia,permitea obteno progressiva e controlada de vrios fragmentos deletados do inserto, os quais aps a recircularizao tornam-se apropriados para o sequenciamento. Este procedimento,facilitaoseqenciamentodeumgrandeinsertodeDNA,sema necessidadedemltiplassubclonagenscomousualnosistemaM13oua sntesedevriosoligonucleotdeosinternos,usadoscomoiniciadoresno processo de seqenciamento. 6.1. Clonagem no fagomdeo Vamosutilizarcomoexemplo,ofagemdeoZAPqueparticularmentetilpara clonagemdecDNA.Estevetor,incorporaabiologiadofagoM13detalmodoqueum cDNA clonado neste vetor pode ser automaticamente excisado do fago para um fagomdeo denominado pBluescript. Basicamente, qualquer DNA clonado no MSC inativa o gene LacZ, produzindo uma protenadefusoquandonaorientaocorreta,podendoassimtambmserrastreadacom anticorpos. QuandoumacepadaE.coli(F')infectadacomofagorecombinantee superinfectadacomofagoauxiliar,esseproduzasprotenasdosistemaM13.Essas protenasreconhecemossinaisdeiniciaoetrminodasntesedeDNAdofagoauxilar (f1) que esto flanqueando o pBluescript, que por sua vez est incorporado no fago ZAP e carregaoinserto.Comaclivagemdestasduasseqncias,oDNAautomaticamente circularizadonabactriaparaoriginaraformarecombinantedoplasmdeoBluescript SK(M13). OinsertoclonadonoBluescriptflanqueadoporpromotoresparaasRNA polimerasesdosfagosT3eT7.Nestesentido,apsovetorserconvenientemente DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 30 linearizado,cpiasdoRNArelativoaoinserto,podemserobtidasemambasasdirees atravs do uso das RNA polimerases T3 e T7. 7. VETORES PARA TRANSFORMAO DE LEVEDURAS OgrandeinteresseexistentenoestudodaslevedurasSaccharomycescerevisiaee Schizosacharomycespombedeve-seaofatodequetratam-sedeorganismoseucariotos inferiores e como tais possuem organizao celular similar de eucariotos superiores. Alm disso,muitasprotenasdelevedurassosimilaresestruturalefuncionalmentessuas homlogasemmamferos.Autilizaodelevedurascomoummodelodeestudotrazas seguintes vantagens: -tempodecrescimentoreduzidoquepermiteaobtenodegrandesquantidades de leveduras em pouco tempo. -genomadepequenotamanho,cercade200vezesmenorqueogenomade mamferos, o que simplifica anlises moleculares e genticas. -possibilidade de manter as leveduras como clulas haplides ou diplides, o que permiteaobtenodemutaesrecessivasemclulashaplides,bemcomoa realizaodeexperimentosdecomplementaogentica.Asclulasde mamferossodiplidesoquetornaimpossveladetecodemutaes recessivas. Existem diferentes marcadores de seleo que so utilizados em leveduras. A maior parte dos genes marcadores utilizados em leveduras so genes envolvidos na biossntese de aminocidosenucleotdeos.Umdosmarcadoresfrequentementeutilizadosogenede levedura LEU2 que codifica para uma das enzimas da via de sntese da leucina, a enzima |-isopropilmalato dehidrogenase. A linhagem mutante de levedura,leu2, no cresce em meio de cultura que no contm leucina. Assim quando o gene LEU2 utilizado na transformao da linhagem leu 2, as clulas desta linhagem que adquiriram o gene LEU2 sero capazes de crescer em meio de cultura deficiente no aminocido leucina. Esta estratgia semelhante a resistnciaampicilinaadquiridaporbactriasqueforamtransformadascomplasmdeos que contm o gene que promove a resistncia ampicilina. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 31 Atabelaaseguirlistaalgunsdosmarcadoresdeseleocomumenteutilizadosem levedura. GENEENZIMASELEO HIS3 Imidazol glicerolfosfato desidrataseHistidina LEU2 |-Isopropilmalato desidrogenaseLeucina LYS2 o-Aminoadipato redutaseLisina TRP1 N-(5'-fosforibosil)- antranilato isomeraseTriptofano URA3 Orotidina-5'fosfato decarboxilaseUracil Tabela2.Genesmarcadoresdeseleoemlevedura.Osmeiosdeculturautilizadosemgeral contmtodososaminocidosnecessriosmanutenodaleveduracomexceodeum.Assim, porexemplo,clulastransformadascomogeneHIS3soselecionadasemmeiodecultura deficiente em histidina. Osvetoresutilizadosnatransformaodelevedurassocapazesdesepropagar tanto em E. coli quanto em levedura. A manipulao destes vetores (clonagem, mutagnese, seqenciamento, etc) realizada em bactria como para qualquer plasmdeo convencional e entoomesmotransferidoparalevedura,organismoondeosensaiosdeinteresseso realizados. Tais vetores so denominados vetores do tipo ponte (shuttle vectors) e contm entreoutroselementosorigensdereplicaodebactriaelevedurabemcomogenes marcadores que funcionam para a seleo nos dois organismos. Diferentes tipos de vetores so utilizados na transformao de leveduras: Vetoresdeintegrao:taisvetorescontmorigemdereplicaodebactriasegenes marcadoresparaseleoembactriaelevedura.Nestecasooplasmdeonocapazde replicar de modo autnomo na levedura. O modo pelo qual este tipo de vetor propagado e capaz de expressar o marcador de seleo atravs da integrao em um dos cromossomos de levedura. Vetoresquereplicamemlevedura:taisvetorestambmcontmorigemdereplicaode bactriaegenesmarcadoresparaseleoembactriaelevedura.Doistiposdeorigensde replicaodelevedurasoempregadasnestesplasmdeos.Oprimeirotipoconsistena origemdereplicaodoplasmdeode2m,quedeocorrncianaturalemlevedura.O segundo consiste de origens de replicao isoladas de DNA cromossomal denominadas ARS (AutonomouslyReplicatingSequence,sequnciasdereplicaoautnoma).Plasmdeos contendo a origem de replicao do plasmdeo de 2m ou sequncias tipo ARS replicam em DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 32 mltiplascpiasem levedura(Figura 18). Uma variante deste tipo de vetor inclui, alm da sequnciaARS,umasequnciatipocentromrica,denominadaCEN,quegarantequea replicaodestesplasmdeossejaestvel,ocorrendoumanicavezporciclocelulareque elessejamsegregadosdemodoprecisoduranteamitoseemeiose.Vetorescontendo sequncias tipo CEN so mantidos em cpia nica na levedura (Figura 18). YACs: (Yeast Artificial Chromosome, cromossomo artificial de levedura) so uma variao deumvetordecpianica,quecontmsequnciascentromricas(CEN)esequncias telomricas,quesosequnciasdasextremidadesdoscromossomos.Apresenade sequnciastelomricasnestesvetorespermitequesejamreplicadoscomomolculas lineares,comcomportamentosemelhanteaodoDNAcromossomal.YACsnoso utilizadosderotinaemexperimentosdeclonagem,entretanto,tmsemostradouma ferramenta valiosa na caracterizao de grandes segmentos genmicos na medida em que possvel clonar em um YAC fragmentos que vo de 100 a 2000 kb (Figura 19). Figura 18. Vetores de levedura. Contm sequncias de plasmdeo (aqui de pUC118) que permitem apropagaoedoresistnciaaampicilinaemE.coli,ogenedeseleoemlevedura(nestecaso LEU 2) e stios nicos de restrio. Vetores multicpias: Estes plasmdeos existem na forma circular na levedura.Alguns destes vetores empregam a origem de replicao do plasmdeo de 2 m, outros utilizamorigensdereplicaoisoladasdecromossomosquesodenominadasARS.2meARS permitem a replicao do plasmdio em mltiplas cpias. Vetores cpia nica: Vetores que contm origensdereplicaotipoARSpodemsermantidosestavelmenteatravsdaadiodesequncias centromricas,CEN.AexistnciadesequnciastipoCEN assegura que o plasmdeo seja mantido em 1 ou 2 cpias na levedura e segregado de modo preciso durante a diviso celular. GLOSSRIO -ARS: (autonomous replication sequence, sequncia de replicao autnoma). Sequncia que funciona como uma origem de replicao em cromossomos de levedura. -BAC:(bacterialartificialchromosome,cromossomoartificialdebactria).Vetor utilizado na clonagem de DNA genmico, baseado no fator F de plasmdeo que assegura que o plasmdeo seja mantido em pequeno nmero de cpias na bactria. LEU2LEU2ARSARSPuc118Puc118DNA LeveduraDNA Levedura Cpia nicaCENMulticpiasDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 33 -Centrmero:regiodocromossomoqueapresentaumaconstricoequalliga-seo fusomitticoduranteameioseoumitose.necessriaparaamanutnoda estabilidade e segregao correta dos cromossomos durante a diviso celular. -Origem de replicao: regio onde iniciada a sntese de DNA em um dado fragmento de DNA. -Telmero:extremidadedocromossomoquecontmsequnciasrepetitivasdeDNA sintetizadaspelaenzimatelomeraseeimportantesnamanutenodaintegridade cromossomal. -YAC:(yeastartificialchromosome,cromossomoartificialdelevedura).Sistemade clonagem em levedura que consiste de um vetor linear que tem capacidade de replicao autnomaequecontmumcentromrodeleveduraeduassequnciastelomricasem suas extremidades. Figura19.YACs:Contmumcentrmero,doistelmeros,gene(s)marcadoresparaseleoem levedura e uma seqncia tipo ARS. Devido presena destas seqncias os YACs so replicados como pequenos cromossomos lineares na levedura. III. CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE AobtenodeumamolculadeDNArecombinante,atravsdaligaodeum fragmentodeDNAdeinteressecomoDNAdeumvetor,umprocessodiretoe relativamentesimples.Entretanto,problemasespeciaissurgemquandoofragmentode interesse constitui uma frao pequena do DNA total.Este o caso encontrado comumente quandooobjetivooisolamentodegenespresentesemumanicacpianumgenoma complexo, ou quando o objetivo o isolamento de clones portadores do DNA complementar AmpRTRP1ARS1CEN4EcoRIURA3+EL +ELHI BamYACDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 34 RNA mensageiro raro.Deste modo, claro que quando queremos clonar um determinado geneouoDNAcomplementardamensagemoumensagensporelecodificado(s) necessrioobtenodecoleesdeclonesrecombinantes,portadoresdemolculas representantesdetodoogenoma,oudecoleesdeclonesdecDNAsderivadosdetodaa populaodemensageirosdaclulaoutecidodeinteresse.Essascoleesdeclonesde DNA recombinante so chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genmica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genmico ouBiblioteca de cDNA, no caso dos clones terem sido construdos a partir de DNA complementar. ODNAdeorganismossuperioresbastantecomplexo:porexemplo,ogenoma haplidedemamferocompostodeaproximadamente3x109 paresdebases(pb).Portanto,seofragmentodeinteressetiver3000pb,elecompreendersomente1parteem 106 deumapreparaodoDNAtotal.Demodosimilar,umaespciedeRNAm particularmenterarapodecompreendersomente1parteem105 ou106 dafraode RNA mensageiros de uma clula. Deste modo, para que seja garantida a presena na biblioteca de pelo menos uma verso de todas as seqncias da populao alvo, um dos pontos principais na construo de bibliotecas teis a obteno de grandes quantidades de clones.Embora a soluodesteproblemaenvolvaestratgiasespecficasnopreparodoDNAalvoena escolha do vetor de clonagem, em linhas gerais a construo de bibliotecas genmicas e de cDNAssegueumprocedimentobsicobastantesemelhante.Nosdoiscasos,oDNA genmico ou os cDNAs so preparados para a insero no vetor escolhido. O vetor e o DNA alvosoligadoseintroduzidosemE.coliatravsdeinfecoouemalgunscasos,por transformao direta (Figura 20). 1. BIBLIOTECA DE cDNA Adescobertadaenzimatranscriptasereversa,umaDNApolimerasedependentede RNA encontradapredominantemente em vrus de RNA de tumor, tornou possvel a sntese invitrodeDNAusando-secomomoldeRNAm.ODNAprodutodessareaooDNA complementaroucpiadamensagem,abreviadamentechamadodecDNA.Asntesee possvelclonagemdecDNAscontriburamparagrandesavanosnaanlisedaestruturae expressodegenesdeeucariotosepropiciaramumarevoluotecnolgicanasindstrias farmacutica e de alimentos. Esses clones so comumente isolados de bibliotecas de cDNA, DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 35 construdasapartirdapopulaodeRNAmisoladadaclulaoudotecidodeinteresse. Portanto, em comparao com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas so enriquecidas comseqnciasgnicas.UmavezqueocDNAcpiadamensagem,elenocontm intronseapresentasignificativamentepoucasseqnciasquenocodificamparaprotenas (Figura21).AausnciadeintronspermitequecDNAsrelativosaclulasdeeucariotos superioressejamdiretamentetranscritosetraduzidosembactriaseemoutros microorganismos,permitindoassimaproduoemgrandeescaladepolipeptdios importantes tanto na rea de pesquisa como na rea aplicada. A ausncia de introns tambm facilitaadeterminaodiretadaseqnciadamensagemesubseqentededuoda seqncia de aminocidos da protena por ela codificada. Isso tem resultado na identificao da seqncia de uma enorme quantidade de protenas, algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas gentica ou bioquimicamente. Figura 20. Passos envolvidos na construo de Bibliotecas de cDNA e Bibliotecas genmicas. Escolha doVetormRNATecidoDNAcDNADigerir o DNA,Fracionar por tamanhoDNA clonvelTitulao e caracterizaoda BibliotecaLigar DNA a um vetorIntroduzir o produto da ligao em E.coliParcial ou completamenteDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 36 Figura 21. Diagrama representando de forma simplificada as diferenas entre um fragmento de DNA genmico e do cDNA relativo a ele. De modo resumido, o procedimento para a sntese, clonagem e isolamento de cDNAs especficos envolve 4 etapas: 1) Sntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros isolados do tecido de interesse. 2) Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor escolhido. 3) Introduo dos cDNA recombinantes nas clulas hospedeiras, onde sero replicados.Isto resultar na amplificao dos recombinantes e dependendo do vetor utilizado, na expresso das protenas codificadas pelas mensagens que deram origem aos cDNAs. 4)Identificaodosclonesdeinteresseatravsdeumprocessodetriagemdosclones recombinantes. 1.1. Sntese de cDNAs de fita dupla AconstruodeumabibliotecadecDNAinicia-secomoisolamentodoRNA total do tecido e subseqente seleo da frao de RNA poli(A)+, que compreende a maioria das mensagens presentes na clula. O isolamento de RNA poli(A)+ de boa qualidade essencial, DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 37 uma vez que qualquer degradao do RNAm afetar a representatividade das seqncias na biblioteca. Uma vez obtida a frao de RNA poli(A)+, procede-se sntese dos cDNAs atravs deumasriedereaesenzimticas(Figura22).Nosltimosdezanosforamdescritos vriosmtodosparasntesedecDNA,cadaumapresentandovantagensedesvantagens particulares.Comoexemplo,apresentamosaseguirumprocedimentoamplamenteusado para esse fim: a) Sntese da fita de DNA complementar ao RNAm (cDNA) atravs da enzima transcriptase reversa.Essaenzimacapazdecatalisarinvitroapolimerizaode DNA a partir RNA e requerum"primer"comaextremidade3'OHlivreparainiciarasntese.Namaioriadas vezes, a molcula utilizada como "primer" um oligo (dT), que se anela na cauda poli (A)+ do RNA. b)ApsasntesedessafitadecDNA,oRNAmparcialmenteremovido,pelousoda RNase A para cortar pedaos do RNA da molcula hbrida RNA-DNA.c)Utilizandocomo"primer"osfragmentosdeRNAnodigeridospelaRNaseA,aDNA polimerasedeE.colisubstituieficientementeoRNAporDNA,resultandoemuma molcula de cDNA de fita dupla. d) O cDNA fita dupla tratado com T4 polimerase. Atravs da atividade 3'-5' exonuclesica dessa enzima remove-se possveis nucleotdeos extras nas extremidades 3'. e)Oprodutofinaldesseconjuntodereaesuma molcula de DNA de fita dupla, cpia exata da mensagem. 1.2. Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor Uma vez obtido o cDNA, o prximo passo prepar-lo para a insero em um vetor declonagem(Figura.22).Paraissotambmexistemvriosmtodosdisponveis,que diferementresidependendodotipodevetorescolhido:plasmdiooufago.Ofagotem sidoovetordeescolhaparaaconstruodebibliotecasdecDNA.Arazobsicadesta prefernciaaeficincia.Emcomparaocomplasmdios,ofagorequercercade16 vezesmenoscDNAporgdovetorparaproduzirnmeroequivalentedeclones recombinantes. Alm disso, bibliotecas em fago so mais fceis de serem manipuladas do DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 38 quebibliotecasemplasmdios.Entretanto,umadesvantagemdosvetoresquenoso favorveis para procedimentos de seqenciamento do DNA e de mutagnese dirigida. Mais recentemente, outro tipo de vetor foi idealizado para suprir essas deficincias. Essa classe de vetorescompreendeosfagemdiosque,comooprprionomesugere,soplasmdios contendo pores do genoma de fago e que renem vantagens desses dois vetores. Figura 22. Sntese de cDNA fita dupla. Para dar uma noo dos passos implicados na clonagem do cDNA relatamos a seguir um procedimento adotado para a clonagem de cDNA em fago . - metilao dos stios de EcoRI atravs do tratamento do cDNA com EcoRI, na presena de S-adenosilmetionina.EssepassoessencialparaprotegerosstiosEcoRIquepossam existirnocDNAcontraaaodaEcoRIemdigestoaser realizada subseqentemente no processo de clonagem. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 39 - adiodeadaptadores,comostioEcoRI,nasduasextremidadesdocDNA.Essareao resulta em molculas de cDNA com adaptadores mltiplos ligados nas duas pontas (ver figura 23). - um nico stio deEcoRI produzido em cada ponta do cDNA pela digesto comEcoRI, liberandooexcessodeadaptadoresligadosnamolcula.AmetilaoprviadocDNA garante que no haja digesto interna do cDNA. - antesdeserinseridonovetor,ocDNAseparadodoexcessodemolculasde adaptadores. Isso feito atravs de filtrao em colunas de Sephadex. - as molculas de cDNA so ligadas ao vetor, atravs de reao com T4 ligase. - o produto da ligao empacotado com as protenas formadora do capsdeo do fago. - osfagosobtidossoutilizadosparainfectarbactriadelinhagemquefavoreceo crescimento dos recombinantes. - apsainfecodabactriacomoscDNArecombinantestemoscomoprodutouma bibliotecadecDNA,quedevecontercpiasdetodaasseqnciasdeRNAmda populao original. Essa biblioteca pode ser estocadana geladeira, ou submetida a uma triagem em busca do clone de interesse. 2. BIBLIOTECA GENMICA Paraseobterinformaessobreaestruturamoleculardeumgenedeeucariotos necessriooisolamentodaporodoDNAgenmicoquecontenhatodaaunidadede transcrio, mais as regies flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da expresso desse gene. O modo mais eficiente para se conseguir isolar essa poro do DNA atravs do uso de uma biblioteca genmica, que deve conter clones portando fragmentos de DNArepresentantesdetodoogenomadoorganismoemquesto.Destemodo,oaspecto principalconsideradonaconstruodeumabibliotecagenmicaestnaobtenodeum nmerograndedeclonesportandofragmentosdogenoma,obtidosaleatoriamente.O tamanhonecessriodeuma biblioteca genmica, para que um dado fragmento de interesse estejaentreosfragmentosclonados,determinadopelotamanhodofragmentoclonadoe DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 40 pelotamanhodogenoma.Destemodo,aestratgiabsicanaconstruodebibliotecas genmicasbuscaminimizaronmerodeclonesnecessriosatravsdaclonagemde fragmentosdeDNAdemaiortamanhopossvel,emaximizaraeficinciadaclonagem, atravsdautilizaodevetoresbaseadosnofago.Basicamente,aconstruoda biblioteca genmica envolve os seguintes passos: a)isolamentodeDNAdealtopesomolecular,queposteriormentequebradode modo a produzir fragmentos de tamanho compatvel com o vetor de clonagem.b)ligaodessesfragmentosnovetoreintroduodosrecombinantesobtidosnas clulas hospedeiras. Figura 23. Clonagem de cDNA em fago . 15 62 347 8 9MeMeMetilao do cDNA para protegeros stios internos deRI EcoLigao dos adaptadoresRIcom o cDNAEcoDigesto comRI paragerar stios coesivosRIEcoEcoSeparao do cDNA do excesso deadaptadorescDNA purificado Ligao do cDNA dos braosdo fago lambdaEmpacotamento dos recombinantescom as protenas formadoras dapartcula viralInfeco da bactria hospedeira o fago recombinantePlaqueamento dos recombinantesDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 41 Dentreessespassos,omododepreparodos fragmentos a serem clonados (insertos) merece ser discutido criticamente dada sua importncia na representatividade da biblioteca. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 42 2.1. Preparo do DNA do inserto Arepresentatividadedeumabibliotecagenmicadependegrandementeda aleatoriedadecomqueosfragmentosaseremclonadossogerados,paraquenohaja exclusosistemticadenenhumaseqncia.OfracionamentomecnicodoDNAomeio de se obter completa aleatoriedade na fragmentao do DNA. Entretanto, esse mtodo no comumenteadotadodevidotrabalhosamanipulaonecessriaparaqueosfragmentos assim obtidos possam ser inseridos no vetor. Com bom senso e cuidado possvel conseguir fragmentaosuficientemente aleatriaatravsde digestesparciais do DNA com enzimas derestrio.UmavantagememseutilizaradigestoparcialdoDNAaproduode fragmentoscompontascoesivaseque,portanto,podemserdiretamenteligadosaovetor. Paragarantirqueadigestoatinjatodoogenomasoutilizadasenzimasderestrioque cortamfreqentementeoDNAequenoapresentamdesviosdedistribuiodestios.A enzima Sau3A I, que reconhece o stio de 4 bases GATC, e que gera fragmentos compatveis comstiosdeclonagemdevriosfagosecosmdios,temprovadoserbastantetilna produo de bibliotecas de DNA genmico digerido parcialmente. Aps a digesto parcial, osfragmentosgeradosprecisamserfracionadosantesdeserem ligados ao vetor. Sem esse fracionamento,fragmentospequenospoderoligar-seentresiproduzindofalsos recombinantes. Fragmentos muito grandes que no permitem o crescimento do fago podero ligar-seaosbraosdofago,alterandoarelaoentreasquantidadesdeDNAdeinsertoe vetor. Ummtododefracionamentofreqentementeadotadoodecentrifugaoem gradientedesacarose.Apsadigestoparcial,asoluodeDNAaquecidaparaque possveisfragmentosagregadossedissociem,eento,aplicadasobreumgradientede sacarosedealtasalinidade.Apsacentrifugao,socoletadasfraesdessegradiente. Essas fraes so analisadas por eletroforese em um gel de agarose.As fraes contendo os fragmentosdeDNAdetamanhoapropriadosoutilizadasparaaligaocomovetor.A figura abaixo ilustra esse procedimento. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 43 Figura24.MtodoparafracionamentodoDNAporcentrifugaoemgradientedesacarose.O gradienteaspirado,debaixoparacima,comajudadeumabombaperistltica.Aporomais densa do gradiente contendo o DNA de maior peso molecular, aspirada primeiro. Uma vez garantida a aleatoriedade dos fragmentos clonados, bastante razovel se pensarqueaprobabilidadedeumadadaseqnciadeinteresseestarpresenteemuma bibliotecagenmicapossaserestimadaestatisticamente,combasenadistribuiode Poisson.Especificamente,onmerodecloneindependentes(N)queprecisamsertriados para uma probabilidade (P) de se isolar uma seqncia especfica dada por: N = ln(1-P)/ ln[1-(I/G)] onde I o tamanho mdio dos fragmentos clonados, em pares de base, e G o tamanho do genoma, em pares de base. Destemodo,precisamostriarcercade690.000clonesdeumabibliotecaqueusa comovetorumfago,paratermos99%dechancedeisolarqualquerdadaseqncia presente em uma nica cpia em um genoma tpico de mamfero. N = ln(1-0,99)/ln[1- (2x104/3x109)]= 690.000 2.2. Vetores utilizados na construo biblioteca genmica Fagos e cosmdeos so comumente usados na construo de bibliotecas genmicas. Nos dois casos, fragmentos grandes de DNA gerados por fragmentao aleatria so ligados comoDNAdovetorparaformarconcatmerosquepodementoserempacotadosem 1TubodeplsticoTubocapilarTubos decoletaBombaGradientedesacarose2 3 4 5DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 44 partculas de fago . As bibliotecas construdas em vetores so armazenadas e propagadas naformadefagosrecombinantes.Nocasodeclonagememcosmdios,entretanto,essas partculasviraisservemmeramentecomoveculosparaintroduziroDNArecombinante dentro da bactria. Uma vez dentro da bactria o cosmdio se comporta como um plasmdio grande.Oscosmdiospodem aceitarinsertos de aproximadamente 45kb, quase duas vezes o tamanho dos insertos clonveis em fago . Deste modo, usando-se o cosmdio como vetor, necessrio gerar somente 350.000 recombinantes para atingir 99% de probabilidade de uma seqnciadecpianicaestarrepresentadaemumabibliotecagenmicademamfero. Entretanto,bibliotecasemcosmdiossomaisdifceisdeseconstruiremanterdoqueas bibliotecas de fagos. Cosmdios so ento usados quando o gene de interesse muito grande ouquandoumaregioextensadoDNAcromossomaldesejada.Nocasodeisolamento rotineirodesegmentosdegenesouemcircunstnciasondeabibliotecaserusadamuitas vezes, o uso de vetores mais recomendado. Na figura abaixo apresentamos um diagrama da estrutura de um vetor tipo , bastante utilizado na construo de bibliotecas genmicas. Figura 25. Estrutura do vetor EMBL3. BE=brao esquerdo; BD=brao direito; stuffer= fragmento central; S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI. Conformeindicadonodiagramaestevetorapresentaumfragmentocentral flanqueadopordoisfragmentosessenciais(direitoeesquerdo).Ofragmentoesquerda, chamado de brao esquerdo, codifica para as protenas do capsdeo e o fragmento direita, chamadodebraodireito,contmaorigemdereplicaodofagoepromotoresdeoutros genesessenciais.Entreofragmentocentraleosdoisbraosencontram-seosstiosde restrio utilizados na clonagem - SalI, BamHI, EcoRI - em orientao inversa.5'5' 3'3'BEBE=braoesquerdo BD=braodireitoB BSE ESBDFragmentocentral coscosDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 45 Comotodofago,aextremidadedecadabraoapresentaumsegmentodefita simples(cos).Essessegmentossocomplementaresentresiepermitemarecircularizao da molcula, e a conseqente replicao do DNA do fago dentro da clula hospedeira. Essetipodevetorchamadodevetordesubstituioporquenoprocessode clonagemapartecentraldoDNAdofagosubstitudapelofragmentodeDNAaser clonado, originando a molcula recombinante. Maisrecentementeoutrosvetorescomcapacidadeparagrandesinsertosforam desenvolvidos. Os cromossomos artificiais de levedura (YACs) so molculas lineares de DNAcujaarquiteturamimetizaaestruturadeumcromossomoautntico(Figura26).Os YACsrecombinantessocriadospelaligaodefragmentosgrandesdeDNAgenmico exgeno(at2000kb)comosdois"braos"dovetorYACeoprodutodaligao introduzido na levedura por transformao. Nos YACs recombinantes, o segmento de DNA genmico exgeno flanqueado de um lado por um centrmero, uma origem de replicao e umamarcadeseleoepelooutrolado,porumasegundamarcadeseleo.Asleveduras transformantes com cromossomo artificial so selecionadas como colnias em meio com as drogas de seleo. Oscromossomosartificiaisdebactrias(BAC)somolculasdeDNAcirculares que carregam uma marca de seleo a antibitico. Os segmentos de DNA genmico exgeno soclonadosnovetorBACinvitroeoprodutodareaodeligaointroduzidopor eletroporaoemcepasdeE.coli,ondemantidocomoumplasmdiodecpianica.Os vetoresBACscarregammarcadoresquepermitemadiscriminaodosclonesvaziose cheios. A mdia de tamanho dos clones de BACs 120 kb, mas alguns clones podem chegar 300kb.OsvetoresdebacterifagoP1acomodamfragmentosgenmicosde70a100Kb. Neste sistema, as molculas lineares recombinantes geradas a partir de seqncias do vetor e dogenomasoempacotadasinvitroembacterifagoP1.ApsainjeoemE.coli,as molculassetornamcircularespelaatividadedeumarecombinase,quepromovea recombinao de seqncias especficas presentes no vetor. Estes vetores carregam marca de seleoparaantibitico,marcadeseleopositivaparaseleodosclonescominsertode DNAgenmicoexgenoeumaorigemdereplicaoplasmdialP1,quemantmumaou DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 46 duascpiasdosplasmdiosrecombinantesnaclula.Umasegundaorigemdereplicao pode ser ativada para amplificao dos plasmdios antes do isolamento do DNA. Figura26.Construindoumcromossomoartificialdelevedura(YAC).OvetorYACcarregauma origemdereplicao(ORI),umcentrmero(CEN),doistelmerosemarcasdeseleo(XeY). Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 29-16, p. 1139. OscromossomosartificiaisP1combinamascaractersticasdosbacterifagosP1e dos BACs, incluindo a marca de seleo positiva e as origens de replicao do bacterifago P1. Os clones circulares recombinantes de PACs gerados durante a reao de ligao in vitro so introduzidos em E.coli por eletroporao e mantidos como um plasmdio de cpia nica na clula. Os insertos da biblioteca de DNA do genoma humano em PACs variam de 60kb a 150kb. IV. DETECO E ANLISE DO CLONE RECOMBINANTE DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 47 Um passo crucial na Tecnologia do DNA recombinante encontrar o clone correto na misturadeclonesquefoicriadaduranteosprocedimentosdaconfecodabiblioteca genmica ou de cDNA. Embora seja relativamente fcil selecionar as colnias que abrigam osvetoresdeclonagemusandoosmarcadoresderesistnciaaantibiticosqueesto presentesnosvetores(Figura27A),muitomaisdifcil selecionaro clone que contenha o genedeinteresse.Notequenocasodovetorserumplasmdiodeveroserexaminadas milhares de colnias de bactrias crescidas em placas de petri contendo agar, para a deteco daquela(s) colnia(s) que produza(m) pequenas quantidades da protena expressa pelo gene deinteresseouentoquepossua(m)ogenedeinteressesemqualquerexpressoprotica queocaracterize(Figura27B).Serdiscutidainicialmenteasituaonaqualaprotena expressa no hospedeiro. Em seguida ser discutida a situao mais comum onde a protena noexpressaeaanliseserfeitaatravsdaprpriapresenadoDNAdeinteresseno fago ou na bactria. 1. QUANDO O GENE DE INTERESSE EXPRESSO NO HOSPEDEIRO Seogenedeinteressecapazdeseexpressarnaclulahospedeirapode-se identificaroclonequecarregaestegenepelapresenadestaprotenaentreascolnias recombinantes.Paraisto,ohospedeironodeveproduzirestaprotena,amenosqueele carregueoclonequeaproduza.Seestaprotenaforproduzidanormalmentepelaclula hospedeira, ser ento necessrio o uso de uma clula hospedeira defectiva ou mutante para ogenedeinteresse.Quandoestegeneforincorporadoelepodeserdetectadopor complementaodaquelafuno.Seaprotenaaserdetectada for especfica de mamfero, porexemplo,aclulahospedeirajsernaturalmentedefectiva.Seaprotenaforuma enzimaquecatalisaumareaomensurvelpodeserpossveltriarascolniasporsua atividade enzimtica.Seaprotenadeinteressenoforumaenzimacomfunodetectvel,umaoutra estratgia ser necessria para a identificao do clone correto, como por exemplo, o uso de umanticorpoespecficoparaaprotenadeinteresse.Anticorpoumaprotenadosoro produzidapelosmamferosquesecombinacomaltaespecificidadecomoutraprotena,o antgeno.Nestecaso,aprotenadeinteresseoantgeno.Comooanticorposecombina especificamente com o antgeno, se o antgeno estiver presente em uma ou mais colnias de DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 48 uma placa de petri, a identificao destascolnias poder ser feita observando-se a reao antgeno-anticorpo. Figura 27. Em A, estrutura do plasmdio pBR322, um tpico vetor de clonagem. Em B, mtodo da inativao insercional para isolar plasmdios contendo DNA exgeno. A insero do DNA exgeno noplasmdiopBR322causainativaodaresistnciatetraciclina,permitindooisolamentode transformantes contendo o fragmento de DNA clonado (B). Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 29-6, p. 1126. Para que o antgeno seja produzido na clula hospedeira a biblioteca de cDNA ter de serconstrudanumvetordeexpresso.NestecasooscDNAssoinseridosnestesvetores emregiesquepromovamsuaexpressoemE.coli,normalmenteempromotoresque possam ser regulados. Esta protena antignica ser expressa como umaprotena de fuso, ou seja, ser sintetizada subseqente a alguns aminocidos pertencentes protena do vetor DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 49 bacteriano.Estasprotenasdefusosogeralmentemaisestveisqueacorrespondente protenadeeucariotoproduzidaembactriae,portantopodemserobtidasemgrande quantidade. Para visualizar a produo destas protenas, uma parte dos fagos de cada placa delise(oubactrias)recombinantesdesenvolvidosnumaplacadePetrisotransferidos (como um carimbo) para uma membrana de nitrocelulose, tratados para expor suas protenas eentosubmetidosaumasoluocontendoumanticorpoespecficoparaaprotena desejada.Depoisqueosanticorposlivressoremovidos,umsegundoanticorpo adicionadoparalocalizaraposiodoprimeiro.Osegundoanticorponormalmente radioativoepodeseridentificadoporautoradiografiautilizando-seumfilmederaio X. Se umacolniaradioativaestiverpresente,umamanchanofilmederaios-Xserobservada depoisqueofilmeforrevelado(Figura28).Alocalizaodestamanchanofilme correspondelocalizaodacolniaqueproduziuaquelaprotena,naplacadepetri original. Esta colnia ser ento recuperada da placa original e cultivada.Umalimitaodesteprocedimentoque o anticorpo utilizado nesta triagem precisa serespecficoparaaprotenadeinteresse.Aproduodeanticorpospodeserobtidapela injeodaprotena(antgeno)emumanimal.Noentanto,estaprotenainjetadadeveser pura, caso contrrio mais que um anticorpo ser formado. 2. O USO DE SONDAS MOLECULARES DE CIDOS NUCLICOS PARA IDENTIFICAR O GENE DE INTERESSE Comopodeserdetectadoumgenedeinteresseentreascolniasdabiblioteca genmica ou de cDNA, se este gene no expresso?QuandooDNAemsoluoaquosaaquecido100C,ouexpostopHalto,as basescomplementaresquenormalmenteseguramasduplashlicesjuntassodissociadas emduasfitassimples.Esteprocessochamadodedesnaturao.Estasmesmasfitas simplespoderosereassociarseforemconservadas65C,porlongosperodos,num processo chamado de renaturao (ou hibridao, quando a associao ocorre entre cidos nuclicosdediferentesorigens).Reaesdehibridaoocorrementrequaisquerduas cadeiasdecidosnuclicosdefitasimples(DNA:DNA,RNA:DNAouRNA:RNA)desde que tenham seqncias de nucleotdeos complementares. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 50 Figura 28. Triagem de bibliotecas de expresso com anticorpos. Se o inserto estiver na orientao correta e na apropriada seqncia aberta de leitura traduzido em protena de fuso (antgeno). Os anticorpos identificam as placas de lise especficas destes antgenos. P r o m o t o rE c o R I l a c| - G a l a c t o s i d a s e g f l lE c o R IE c o R IE c o R IE c o R Il i n k e rc D N AP r o t e i n a d e F u s oE m p a c o t a m e n t o d o s f a g o se p l a q u e a m e n t o e mc a m a d a b a c t e r i a n ai n v i t r oM e m b r a n a d en i t r o c e l u l o s eP l a c a s d e l i s eN i t r o c e l u l o s es o b r e a s p l a c a sd e l i s eR e m o o d am e m b r a n aP r o t e n a s s e l i g a ma n i t r o c e l u l o s eI n c u b a m e m b r a n a c o ma n t i c o r p o p r i m r i oL a v a m e m b r a n aI n c u b a m e m b r a n a c o ma n t i c o r p o s e c u n d r i oa n t i c o r p o s e c u n d r i oa n t i c o r p o p r i m r i oF i l m e d e r a i o - X""DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 51 EsteprincpiodahibridaomolecularfundamentalparacaracterizarDNAs recombinantesquandoogenedeinteressenoexpresso.Sondasdecidosnuclicos (fragmentosdecidonuclicomarcadosradioativamente,geralmentecom 32P)so utilizadas para localizar clones, numa biblioteca genmica ou de cDNA, que carreguem uma seqncia de DNA de interesse. Aps a confeco da biblioteca genmica (ou de cDNA) os fagoscarregandoDNArecombinantesoespalhadosjuntamentecomumasuspensode bactriasnumaplacadepetricontendomeiodeculturaslido.Umavezvisualizadaas placas de lise (ou as colnias, no caso do vetor ser um plasmdio) preparada uma rplica de cada placa de petri com uma membrana de nilon ou de nitrocelulose. Este processo permite atransfernciadeumaporodefagosdecadaplacadelise(oudebactriasdecada colnia) para a membrana, de tal maneira que o padro das placas de lise da placa de petri original seja mantido na membrana. Para identificar qual das placas de lise porta o gene de interesse esta membrana tratada para expor e desnaturar o DNA das colnias ali presentes eincubadoscomumasoluodeDNAouRNAfitasimples,marcadaradioativamentee complementar ao gene de interesse para permitir a hibridao. Dois polinucleotdios simples fitas somente iro se hibridar se forem complementares. A localizao da placa de lise que sehibridousondadeterminadaapsaexposiodamembranaaumfilmedeRaios-X (autoradiografia) e a comparao deste filme com a disposio das colnias na placa de petri original (Figura 29). Esta sonda molecular radioativa pode ser parte de um gene j clonado para o qual se procura o gene total, pode ser o DNA de um gene vizinho ao gene de interesse, pode ser o RNA de genes que so expressos em tecidos especficos ou em estgios especficos do ciclo celular, ou mesmo o gene de uma outra espcieque codifica para a mesma protena. Neste ltimo caso, a reao de hibridao pode serrealizada em baixa temperatura (420C ao invs de650C)eembaixaconcentraodesal(baixaestringncia)parapermitirahibridao mesmo entre DNAs que tenham algumas bases no complementares. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 52 Figura29.TriagemdeumabibliotecagenmicaoudecDNA,construdasnofago,comuma sondamolecularparaencontrarumclonedeinteresse.Esta triagem feita espalhando-se os fagos previamente incubados numa cultura de bactrias, em vrias placas de agar. Depois que as placas de lise tornam-se visveis, so feitas as rplicas em membrana de nitrocelulose, seu DNA exposto e hibridizadocomasondamolecular.Aposiodoclonerecombinantedeinteresseidentificada atravsdeautoradiografia.ODNAisoladodosfagospresentesnaplacadelisepositiva, identificada na placa de petri original e submetida a anlises posteriores. M e m b r a n a d en i t r o c e l u l o s eP l a c a s d e l i s eF a g o s a b s o r v e m an i t r o c e l u l o s eP l a c a m e s t r aM e m b r a n a r p l i c aS o n d a d e c i d on u c l e i c o m a r c a d ac o m 3 2 pS o n d a H i b r i d i z aD N A l i g a d o a o f i l t r oL a v a g e m d a s s o n d a sn o i n c o r p o r a d a sS o n d a h i b r i d i z a a o D N A d o f a g oq u e c o n t e m a s e q u n c i a c o m p l e m e n t a rF i l m e d e r a i o - XP l a c a m e s t r aD N A l a m b d ai s o l a d o d a p l a c a d el i s eD N A c l o n a d oC l o n e l a m b d a p u r i f i c a d oDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 53 Genes que respondem a um mesmo mecanismo de regulao podem ser identificados numabibliotecadecDNAporhibridaodiferencial.Isto,genesexpressosemtecidos especficos,emestgiosespecficosdodesenvolvimentooudociclocelularegenes reguladosporfatoresdecrescimento so adequados para serem analisados por este tipo de abordagem.Paraestaidentificaonecessrioproduzirduaspopulaescelulares(ou extrair mRNA de dois diferentes tecidos) uma na qual eles no se expressam e outra na qual elesseexpressam.Suponhaporexemplo,queumabibliotecadecDNAsejapreparada usandoomRNAisoladodeclulastratadascomfatoresdecrescimento.Estabiblioteca plaqueada e transferida para dois conjuntos de membranas de nitrocelulose. Um conjunto ensaiado com DNA marcado radioativamente preparado por transcrio reversa do RNA das clulas tratadas com os fatores de crescimento. O outro conjunto de filtros hibridado com cDNA preparado de clulas no tratadas. Clones positivos identificados por hibridizar mais fortemente com a primeira sonda codificam mRNAs induzveis pelos fatores de crescimento (Figura 30). QuandooDNAaserclonadoexpressaumaprotenacujaseqnciaconhecida pode-seinferiraseqnciadeumtrechodeDNAquelhedeuorigemesintetizar oligonucleotdeosquelhesejamcomplementaresparaseremutilizadoscomosondas moleculares. Estes nucleotdeos devem ter pelo menos 17 a 20 nucleotdeos de comprimento paraserespecficoparaaseqnciaprocurada.Umproblemaenfrentadoparasintetizar estesoligonucleotdeosadegenerecnciadocdigogentico.Algunsaminocidosso codificadosporquatrooumesmoseisdiferentescdonse,portantomesmoumpequeno polipeptdiopodetersidocodificadoporvriasseqnciasdeDNA.Paracontornareste problema as sondas oligonucleotdicas so algumas vezes sintetizadas como uma mistura de todasaspossveiscombinaesdoscdonsquesotraduzidasnaquelaseqnciaprotica (Figura 31). Uma destas seqncias correta e ir hibridar com o clone de interesse, mas a possvel hibridao dos outros oligonucleotdeos com seqncias sem interesse pode levar a obteno de clones falsos positivos. Uma variao deste mtodo utilizar o menor nmero possvel de oligonucleotdeos comosonda,escolhendoaregiodaprotenaquecontmomenornmeropossvelde cdonsdegenerados(porexemplo,metioninasomentecodificadapelocdonAUG). DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 54 Deve-se levar em conta tambm qual o cdon de uso mais freqente para cada aminocido, na espcie que est sendo analisada. Figura30.Clonagemdegenesreguladosporfatoresdecrescimentoatravsdehibridao diferencial.Estaestratgiautilizadaparaclonarumafamliadegenesquesoinduzidasquando clulas quiescentes so estimuladas a crescer pela adio dos fatores de crescimento. AAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAClulas com fatoresde crescimentoClulas QuiescentesCresce em 3 hsIsol a o mRNA poli (A)Isol a o mRNA pol i(A)mRNA i nduzi do pelosfatores de cresci mentoOli go(dt)TranscritaseReversa32p-dNTPAhibridaoOli go(dt)TranscritaseReversa32p-dNTPAhibridaoPrepara bi bl iotcade cDNA com fagolambda e i nfecta Ecol iPl aca mestraRpl ica em membrana de nitrocel ul oseAutoradiogrfi aAutoradiogrfi aFi lmede raio-XFi lmede raio-XcDNAcomumClone de cDNAindusvelporfatores de crescimento Isol a o cl onedo fagoPl aca mestraHibri daonegligenciavelDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 55 Figura 31. Desenho de sondas oligonucleotdicas baseadas na seqncia protica. Como a maioria dosaminocidosespecificadapordoisoumaiscdonsestesoligonucleotdeossosintetizados usando-seumamisturadosnucleotdeosdasposiesambguas.Aseqnciacorretaestar representadaentreosoligos.Umaoutrapossibilidadeusarumasondatentativacujaescolha baseada na freqncia de uso do cdon na espcie em estudo. Neste caso pareamentos incompletos podem ocorrer. 3. ANLISE DO DNA E RNA POR ELETROFORESE EM GEL E BLOTTINGVriastcnicasforamdesenvolvidasbaseadasnaspropriedadesdehibridaodos cidos nuclicos visando a triagem e isolamento de seqncias especficas destas molculas. Amaioriadestastcnicas,conformejmencionado,trabalhacomumarplica do DNA de TG -ATG-GA -GA -ATG-AA -AG -AA -ATTTCCTAGAGAG CTACCGACGTTGTATGGATGAAATGAATGTATGGACGAAATGAATGCATGGACGAAATGAATGCATGGATGAAATGAATGTATGGATGAGATGAATGTATGGATGAGATGAATGCATGGACGAGATGAATGCATGGATGAGATGAATGCATGGACGAGATGAAGCGCAACATCTGCATGGACGAAATGAATGCATGGACGA ATGAAGCGCAA ATC---ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG------ACGTACCTGCT TACTTCGCGTT TAG---5'5'5'3'3'3'G CTACys-Met-Asp-Glu-Met-Lys-Arg-Asn-IleSequnci a Parci alde Ami noci dosSequnci as Possvei sdo DNAParte da sequnci a compouca ambi gi dadeSondas contendotodas as possvei s combi naesde condonsde parteda sequnci aSonda tentati vaHi bri dao com cDnaDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 56 interesseimobilizadonumsuporteslidotalcomoumamembranadenilonoude nitrocelulose.Umdestesmtodos,desenvolvidonadcadade70porE.M.Southern, tornou-se conhecido por "Southern blotting". Nesta tcnica o DNA digerido com uma ou mais enzimas de restrio e os fragmentos resultantes separados por eletroforese num gel de agarose. Os fragmentos de DNA dupla fita so visualizados por colorao com brometo de etdio, desnaturados 'in situ' com hidrxido de sdio e transferidos para uma membrana por capilaridade,comoauxliodeumasoluodealtaconcentraosalina.Taiscondies permitemqueoDNAsejaretidonamembrananopontodecontactoentreogelea membrana,criandoumarplicadogel.ODNAcovalentementeligadomembrana usando-secalorouluzultravioleta.Sondasdecidosnuclicos(DNAouRNAmarcados radioativamente)podemserutilizadasparahibridarcomoDNAfixadonamembranaea posionaqualaligaoespecficaocorrerpodeserdetectadaporautoradiografiada membrana(Figura32).Opadrodehibridaopodesercomparadodiretamentecoma regio no gel original que contm a seqncia de DNA de interesse. Southern blotting uma tcnicatopoderosaquepermitequeasinformaesobtidassejamutilizadasparaa construodeummapaderestriodeumadeterminadapartedoDNAclonado,por exemplo,paraidentificararegioquecontmogenedeinteresse.Estatcnicapossibilita tambmqueas sondas de cidos nuclicos sejam utilizadas para diagnsticos de distrbios genticos, ensaiando-se o DNA genmico dos indivduos afetados e de seus familiares. De modoanlogo,molculasdeRNAtambmpodemseridentificadasapsseremseparadas poreletroforese,transferidasparanitrocelulose,sofreremhibridaocomsondasdeDNA ou RNA. Esta tcnica de analisar RNA, por analogia ao Southern blotting, recebeu o nome deNorthernblotting.EstatcnicatilcomoauxiliarnaanlisedeclonesdecDNA porque,otamanhodomRNAespecficopodesercomparadocomotamanhodoscDNAs clonados,revelandoaintegridadedosclones.Almdisto,estatcnicapermiteindicarem qualtecidooutipocelularumdeterminadogeneexpressoouquaissoosfatoresque regulam a sua expresso. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 57 Figura 32. Southern blotting. Um fragmento de DNA especfico pode ser identificado separando-se amisturadefragmentosporeletroforese,transferindo-separanitroceluloseehibridizando-secom uma sonda molecular complementar seqncia e marcada com 32P. 4. COMO OS GENES CLONADOS SO UTILIZADOS? Oclonedeinteressepodeserexploradosobvriosaspectos.Elepodeser seqenciadoecomparadocomoutrasseqnciasjdescritas,serutilizadonoestudoda expressognicado(s)gene(s)contido(s)noclone,seralteradoespecificamentepor mutagnesestiodirigidaouserusadoparagerarumprodutodeinteressecomercial.Para istoquasesempresernecessriotransferiroclone,oupartedesteparaumvetormais apropriadoparaatingirosobjetivosdesejados.AtransfernciadepartedoDNAclonado paraumnovovetorconhecidacomosubclonagem.Algumasdestasaplicaessero abordadas nos captulos seguintes. 5. MAPA DE RESTRIO O mapa de restrio do DNA clonado ou de pequenas molculas de DNAs de fagos, plasmdiosoumitocndriaspodeserbastantetilnacaracterizaodamolcula.Esta tcnica envolve a separao por eletroforese dos fragmentos de DNA obtidos aps digesto doDNAtotalcomdeterminadaenzimaderestrio.Aordemdosfragmentos na molcula pode ser descoberta com o uso de outras enzimas de restrio, em duplas digestes e/ou por digestes seqenciais usando 2 enzimas. Assim cada fragmento obtido aps digesto com a enzima x removido do gel e submetido digesto com a enzima y e vice-versa (Figura 33). transfernciadoDNApor"blotting".SondadeDNAmarcadacomP32autoradiografiapapeldenitroceluloseautoradiogramaeletroforesegel deagaroseDNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 58 Informaes sobre o mapa de restrio de um fragmento de DNA so utilizadas, por exemplo, para subclonar partes deste fragmento para o seqenciamento. O mapa de restrio do DNA mitocondrial vem sendo til na caracterizao de linhagens e/ou espcies de vrios organismos, auxiliando em estudos taxonmicos e evolutivos. Figura33.MapaderestriodoDNAdofagoparavriasendonucleases.Asbarrasverticais indicam os locais de clivagem de cada enzima e os nmeros no alto indicam o tamanho da molcula em unidades de 5000 pares de bases. Esta molcula possui no total 48502 pares de bases. V. REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) A reao em cadeia da polimerase possibilita a amplificao de uma seqncia rara de DNA a partir de uma mistura complexa, sem a necessidade de clonagem molecular. Esta tcnica amplamente utilizada em pesquisa bsica, em medicina forense e no diagnstico de doenas genticas e infecciosas.Inicialmente,necessriaaconstruoporsntesequmicadedois oligonucleotdeosdeDNA(iniciadores)complementaresasextremidadesdecadafitade DNA,flanqueandoaregiodeinteresse.Estesoligonucleotdeosservemcomoiniciadores da sntese de DNA in vitro, que catalisada pela DNA polimerase. UmciclodePCRcomeacomadesnaturaoporcalor(95C),quepromovea separaodafitadupladeDNA.Areao resfriada na presenade um excesso dos dois oligonucleotdeos,possibilitandoahibridizaodosdoisiniciadorescomaseqncia complementarpresentenoDNAalvo.Emseguida,areaoincubadaparaatividadeda DNApolimerase,produzindonovasfitasdeDNAsapartirdosiniciadoreseutilizandoo quatro desoxirribonucleotdios (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) (Figura 34).DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 59 Figura 34. As 3 etapas do ciclo de PCR (http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/index.html). Acadanovociclodareaoinicia-secomoaquecimentoparadesnaturaoda dupla fita de DNA, seguido de resfriamento para hibridao dos iniciadores e sntese de uma novafitapelaDNApolimeraseapartirdosiniciadores,sendoqueasfitasdeDNArecm sintetizadasservemdemoldenocicloseguinte.Portanto,emcadaciclosintetizadoo dobro do DNA produzido no ciclo anterior (Figura 35). Usualmente, so realizados de 20 a 30 ciclos para amplificao de um segmento de DNA especfico dentro de um genoma. NasprimeirasiniciativasparaamplificarfragmentosdeDNAutilizava-seaenzima DNApolimerasedaEscherichicoli,quepossuiatividademximaa37C.Estaenzima deveriaseradicionadaacadaciclopoisopassodedesnaturaoinativaaenzima.Um importanteavanoocorreucomadescobertadaenzimaTaqDNApolimerase(Saikietal, 1988)oriundadabactriaThermusaquaticus.ATaqDNApolimerasepossuiatividade timaa72Cepermanecerazoavelmenteestvelmesmoa95Cecomisto,aenzima adicionada somente no inicio do processo . DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 60 Figura35.Osprimeiros4ciclosdeumPCRemdetalhes.Noterceirociclo,duasduplasfitasque apresentam o tamanho correto so copiadas (as duas fitas com o mesmo tamanho). No quarto ciclo, 8duplasfitasqueapresentamotamanhosocopiadas(http://allserv.rug.ac.be/ ~avierstr/index.html). Alm de ser utilizada para a amplificao de um segmento especfico de DNA dentro deumgenoma,ametodologiadePCRpodeserutilizadaparaamplificarumsegmentoou toda a seqncia de um produto gnico. Isso pode ser feito a partir da populao de RNA de uma determinada clula ou tecido. Entretanto, como a Polimeraseutilizada na metodologia dePCRumaDNAPolimerasedepedentedeDNA,elanopodeusarRNAdiretamente como molde para a amplificao. Assim, inicialmente realizada uma reao de transcrio reversa, onde pela ao da transcriptase reversa o RNA utilizado como molde para gerao decDNA,queentoutilizadocomomoldeemumaPCRsubsequente.Essaabordagem denominadadeRT-PCR(ReverseTranscriptionandPolimeraseChainReaction)muito til para se analisar de maneira rpida a expresso de genes de interesse, pois uma vez que a PCR realizada a partir de cDNA, o fragmento correspondente ao gene de interesse s ser amplificadonaquelasclulasoutecidosondeogeneexpresso.Estatcnicapodeser utilizada para clonagem de um cDNA de interesse, desde que j se tenha alguma informao de sua seqncia, sem a necessidade de se construir uma biblioteca de cDNA para isol-lo. DNA recombinante_ Desconheo a origemda apostila. Mas, muito Boa! 61 VI. SEQUENCIAMENTO DE DNA Apartirdofinaldadcadade70tornou-sepossveladeterminaraseqncia nucleotdica de fragmentos de DNA. O desenvolvimento da metodologia descrita por Sanger ecolsassociadoaavanostecnolgicos,permitequehojegenomasinteirossejam seqenciados. OprincpiodomtododeterminaodacadeiaparaseqenciamentodeDNA baseia-senasntesedeDNAinvitrorealizadanapresenadidesoxirribonucleotdeos.Um DNA purificado pode ser sintetizado in vitro em uma mistura que contm molculas de fita nicadeDNA,enzimaDNApolimerase,umDNAiniciadorquepossibilitaapolimerase iniciarasntesedeDNAutilizandoosdesoxirribonucleotdios.Alternativamente,na presenadedidesoxirribonucleotdeos(ddATP,ddCTP,ddGTPeddTTP)nareao,o elongamentodacadeiadeDNAbloqueadopelaincorporaodonucleotdeosemum grupo OH na posio 3'. NomtodooriginalmentedesenvolvidoporSangerparaseqenciamentodeDNA, umafitacomplementarsintetizadautilizandoummisturadedesoxirribonucleotdeos,um delesmarcadocomP32ouS35.Sorealizadas4reaesindependentes,contendouma pequena quantidade de um tipo de didesoxirribonucleotdio em cada uma das reaes. Cada reao produz um conjunto de cpias do DNA inicial que terminam em diferentes pontos da sua seqncia. Os produtos destas quatro reaes so separados por eletroforese, utilizando quatro raias paralelas em um gel de poliacrilamida e os fragmentos so detectados atravs da marcaoradioativa.Emcadaumdasraias,asbandasrepresentamfragmentosqueforam terminados em dado nucleotdeo em diferentes posies do fragmento inicial de DNA. Pela anlise da ordem das bandas, comeando pelo final do gel atravs das quatro raias, pode-se determinar a seqncia do DNA recm sintetizado (Figura 36).Estemtodoaindaamplamenteutilizado,sendoquevriosavanostornaramo seqenciamentodeDNAumatcnicasimpleserpida.Osprincipaisavanosforama adaptaodaPCRaomtododeterminaodacadeiaeautilizaode didesoxirribonucleotdeosmarcadoscomdiferentescorantesfluorescentes(fluorocromos). Autilizaodefluorocromospermitequetodasasquatroreaessejamrealizadasemum nico tubo e o produto da reao de seqenciamento seja separado em uma nica raia do gel. DNA recombinante_ Desconheo a ori