aula 02 expressao genica farmacia

7/31/2019 Aula 02 Expressao Genica Farmacia

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Controle da expresso gnica

Prof. Dr. Jos Luis da C. Silva
http://www.unioeste.br/


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Controle da Expresso gnicaProcariotos


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Organismos procariontes e eucariontes soOrganismos procariontes e eucariontes so

sensveis pequenas variaes do meio ambiente, taissensveis pequenas variaes do meio ambiente, tais

como a disponibilidade de nutrientes, sinais hormonais,como a disponibilidade de nutrientes, sinais hormonais,

etc.etc.

Assim a regulao da expresso dos seus genes sAssim a regulao da expresso dos seus genes snecessidades celulares objetiva uma melhor adaptaonecessidades celulares objetiva uma melhor adaptao

s variaes do meio.s variaes do meio.

Princpios da regulao gnica


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Genes para os produtos que so requeridos durantetodo o tempo so expressos em nveis constantes. So

os chamados genes da economia domstica

(housekeeping).

A expresso invarivel destes genes denominada de

expresso gnica constitutiva. Ex. Enzimas do Ciclo de

Krebs

Genes que so expressos em resposta a sinais

moleculares enquadram-se na expresso gnica

regulada. Estes genes podem ser induzidos ou

reprimidos de acordo com as necessidades celulares

Princpios da regulao gnica


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Alvos da regulao gnicaAlvos da regulao gnica


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Os principais alvos da regulao esto no nvel de

transcrio e traduo da informao do mRNA.

O problema bsico que a clula enfrenta possuir mecanismos

para reprimir ou desligar a transcrio de todos os genes

codificantes de enzimas que no so necessrias e ativar a

transcrio destes genes quando as enzimas so necessrias


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Protenas reguladoras da transcrio

(ativadores, repressores)

Protenas reguladoras geralmente ligam-se a sequncias especficas

do DNA. A afinidade para essas sequncias alvo de 104 a 106 vezes

maior do que para outras regies do DNA.

Essas protenas possuem domnios (regies pequenas e delimitadas)

de ligao ao DNA que interagem com as sequncias alvo.

A maioria dos contatos que permitem especificidade incluem grupos

qumicos das bases do DNA expostos no sulco principal do DNA.


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Interaes entre protenas-DNA


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Hlice-volta-hlice

Este motivo de ligao ao DNA crucial para a interao de muitas

protenas reguladoras procariticas. Este motivo engloba cerca de 20 aa

em dois segmentos -helicoidais separados por uma volta do tipo .

Este o domnio do repressor

do Operon da Lactose,

denominado de repressor Lac


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Zper de LeucinaEste motivo uma -hlice anfiptica com aa hidrofbicos em um dos

lados do motivo. Neste motivo, a cada 7 resduos de aa h um Leucina(Leu) formando uma linha reta ao longo da superfcie hidrofbica. O

domnio de ligao rico em resduos bsicos (Lys ou Arg) que

interagem com cargas negativas dos fosfatos do DNA. So encontrados

em muitas protenas reguladoras de eucariotos.

GCN4 de levedura


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Sistemas operons da E. coli:

Operon lac (controlador da sntese das enzimas do

metabolismo de lactose),

Operon trp (controle da sntese das enzimas

sintetizadores de triptofano)

Regulao Transcricional


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Muitos genes esto em complexos chamados OPERONS, e

nestes complexos normalmente existe uma protenarepressora e uma ativadora da transcrio de vrios genes

que, atuando em "parceria", determinam certas

caractersticas.

Modelo de operon procaritico


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No metabolismo da lactose

por E. coli so necessrias

duas enzimas que fazem

parte de um operon chamado

lac. A primeira enzima

capaz de clivar a lactose em

glicose e galactose que assim

serviro como fonte de

carbono para a clula.


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A -galactosidase dita uma enzima indutvel, ou seja,

sua expresso varia com as necessidades celulares.

Caso a bactria esteja crescendo em meio rico em

lactose, sua expresso ser alta;

Caso a fonte de carbono seja outro carboidrato, suaexpresso ser reduzida.


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O gene I codifica o repressor Lac que uma molcula com dois stios

de reconhecimento, um que pode reconhecer a sequncia operadora

especfica para o operon Lac e outro que pode reconhecer a lactose

e alguns anlogos da lactose. Na ausncia da Lactose, os genes do

operon Lac esto reprimidos pela ligao do repressor Lac.

O Operon Lac est sujeito a regulao negativa


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Represso do Operon Lac

promotor do repressor Lac

Operador principal

Pseudo-operadores

Repressor ligado aos operadores

A ligao dor repressor reduz a

transcrio por um fator de 100x,

mas no absoluta


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O alvio da represso chamado de induo. Os derivados de lactose

que inativam o repressor e levam a expresso dos genes lac so

chamados de indutores.


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Os indutores de lac so efetores alostricos e quando se ligamao stio alostrico, causam uma alterao conformacional na

protena reguladora, alterando a estrutura do domnio deligao ao DNA


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A alta concentrao do cAMP necessria para a

ativao do operon lac.

Os mutantes que no podem converter ATP em cAMP

no podem ser induzidos a produzir -galactosidase,

pois a concentrao de cAMP no grande o suficiente

para ativar o operon lac.

Regulao positiva do Operon LacRegulao positiva do Operon Lac


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Em bactrias, o AMPc liga-se aoCAP ou

CRP (catabolite gene activator protein -protena ativadora de genes por

catablitos; codificada pelo gene crp),

uma protena dimrica com 2

subunidades idnticas de 22Kd. Cada

subunidade possui um domnio de

ligao ao DNA e ao AMPc. Somente o

complexo CAP-AMPc capaz de

estimular a transcrio e se ligar a

determinados promotores.

No operon lac, CAP se liga prximo a

regio que se liga a RNA polimerase e

interage com a RNA polimerase.


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Mas como se d essa modulao da transcrio viacAMP?


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A ativao da transcrio exige duas condiesA ativao da transcrio exige duas condies

Com alta [glicose] no h

formao do complexo

CRP-AMPc

A Lactose no suficiente

para induzir a ativao do

operon Lac


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Mas como se d essa modulao da transcrio viacAMP?


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Na ausncia de lactose para servir de indutor, o repressor lac capaz de se ligar ao operador; independente dos nveis de cAMP

e da presena de CAP, a produo de mRNA reprimida.


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Com lactose presente para se ligar ao repressor, este incapaz de

se ligar ao operador. Entretanto, apenas pequenas quantidades de

mRNA so produzidos, pois a presena de glucose mantm os

nveis de cAMP baixos e, portanto, no se forma o complexo

cAMP-CAP e no h ligao ao promotor.


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Com o repressor inativado pela lactose e com altos nveis de

cAMP presentes (devido a ausncia de glucose), cAMP liga-se CAP. O complexo cAMP-CAP ento capaz de se ligar ao

promotor e aumentar a trancrio em 50x. O operon lac ento

ativado e so produzidos grandes quantidades de mRNA.


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Resposta estringente na sntese de rRNAResposta estringente na sntese de rRNA

Em procariotos a sntese dos rRNA a partir dos 7 operons, responde

taxa do crescimento celular e s alteraes na disponibilidade dos

nutrientes cruciais, particularmente os aminocidos.

Essa regulao coordenada chamada de resposta estringente. Quando

as concentraes dos aa so baixas, a sntese do rRNA interrompida.

A carncia dos aa leva ligao dos tRNAs no carregados no stio A dos

ribossomos e isso desencadeia a ligao de uma enzima chamada de

fator de estringncia (protena RelA) ao ribossomo.


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Mecanismo da resposta estringenteMecanismo da resposta estringente

A protena RelA catalisa a formao do

nucleotdeo no usual Guanosina

Tetrafosfato (ppGpp), adicionando

pirofosfato posio 3 do GTP:

GTP + ATP ppGpp + AMP

A elevao abrupta do ppGpp, em

resposta carncia dos aa, leva a uma

grande reduo na sntese do rRNA,

medido em parte pela ligao do

ppGpp RNA polimerase e inibio.

ppGpp e cAMP so nucleotdeos

modificados que atuam como 2

mensageiros intracelulares.


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Resposta SOS requer a destruio de protenasResposta SOS requer a destruio de protenasrepressorasrepressoras

A leso abrangente do DNA no cromossomo bacterianodesencadeia a induo de muitos genes envolvidos na respostaSOS de reparo do DNA. Os elementos chave so a protena RecAe o repressor LexA.

O repressor LexA inibe a trancrio de todos os genes SOS e ainduo requer a remoo do LexA. O mecanismo a auto-clivagem do LexA com o auxlio da RecA produz 2 fragmentospeptdicos inativos.

RecA no uma protease, mas sua interao com LexA facilita areao de auto-clivagem, sendo chamada de atividade co-protease. A RecA fornece a ligao entre o sinal biolgico (lesono DNA) e a induo dos genes SOS.


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Mecanismo da resposta SOSMecanismo da resposta SOS

Leses extensas no DNA

levam a ligao da protena

RecA ao DNA fita simples,

quando RecA estiver ligada

facilitar a auto-clivagem

de LexA.


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CONTROLE DA EXPRESSO GNICA EMEUCARIOTO


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Os cromossomos eucariticos so maiores e tm um graumais complexo de organizao estrutural do que os

procariticos. Os genomas de levedura, mosca das frutas e

humanos contm cerca de 4, 40 e 1000 vezes mais DNA,

respectivamente que o genoma de Escherichia coli. Esta

abundncia dota os eucariontes de potencialidades que esto

ausentes nos procariontes e adiciona desafios replicao e

expresso.

Estrutura da Cromatina e regulao da expresso


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Estado basal transcricional restritivo em eucariotos

Diferentemente de procariotos, os promotores fortes de eucariotos so

geralmente inativos in vivo na ausncia de sequncias regulatrias, ou

seja, o estado transcricional restritivo.

Os genes eucariticos requerem ativao para serem transcritos, o

que no ocorre em procariotos.

Em procariotos, no havendo repressores ligados os genes so

transcritos (no-restritivo)


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3: As clulas eucariticas possuem protenas reguladorasmultimricas maiores e mais complexas do que as

bactrias.

4: A transcrio no ncleo eucaritico est separada tanto

no espao quanto no tempo da traduo no citoplasma.


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Estrutura do gene eucaritico


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CROMATINACROMATINA

Como as histonas se combinam com o DNA para formara fibra de CROMATINA? Em 1974, Roger Kornberg

props que a cromatina feita de unidades repetidas,

cada uma consistindo de 200pb de DNA e duas de cada

H2A, H2B, H3 e H4. Essas unidades repetidas so hojeconhecidas como nucleossomos. A maior parte do DNA

envolve externamente um cerne de histonas. O restante

do DNA, chamado DNA ligante, une nucleossomos

adjacentes e contribui para a flexibilidade da fibra de

cromatina. Portanto, uma fibra de cromatina uma

cadeia flexvel de nucleossomos.


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Estrutura da cromatinaEstrutura da cromatina


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Cromatina ativa e inativaCromatina ativa e inativa

A transcrio de um gene eucaritico fortemente reprimida quando oDNA est condensado na forma de cromatina. Nucleases, como a DNase I

clivam o DNA em fragmentos com mltiplos de 200 pb, refletindo a

estrutura regular dos nucleossomos.

Nas regies transcricionalmente ativas, os fragmentos produzidos pela

DNase I so menores e mais heterogneos em tamanho. So regies

chamadas de stios de hipersensibilidade a DNase I, consistindo em cerca

de 100 a 200 pb dentro de 1000 pb que flanqueiam as extremidades 5 dos

genes transcritos. Em alguns genes so encontradas na regio 3 e

dentro do gene.


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RemodelagemRemodelagem da cromatinada cromatina

As histonas possuem dois domnios estruturais distintos. Umdeles envolvido na interao histona-histona e um segundodomnio aminoterminal rico em Lisina na superfcie exteriorda partcula do nucleossomo montada. Esses resduos deLisina so acetilados porhistona acetiltransferases(HATs).

As HATs tipo B acetilam as histonas para montagem donucleossomo, a montagem das histonas tambm facilitadapor protenas adicionais: CAF1 e NAP.

As HATs tipo A auxiliam na acetilao no evento datranscrio. As histonas deacetilases atuam no silenciamentoda transcrio gnica.


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A cromatina remodelada pela acetilao e porA cromatina remodelada pela acetilao e pordeslocamentos nucleossomaisdeslocamentos nucleossomais

A cromatina transcricionalmente ativa tende a ser deficiente emHistona H1 e as outras histonas so modificadas por acetilao

ou ubiquitinao.

Em genes ribossomais geralmente no so associadas as

histonas.


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Estrutura do DNA e atividade gnica


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Quatro nveis nos quais a expresso gnica pode ser

controlada:1. Transcrio

2. Processamento

3. Estabilidade do mRNA

4. Traduo

O nvel mais importante da regulao o incio de transcrio. A

partir de determinados sinais, sequncias regulatrias soreconhecidas, possibilitando a ativao de um gene ou grupo de

genes, havendo a transcrio, e posterior traduo do mRNA.


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Nvel transcricional da regulao

A iniciao da transcrio dependente de fatoresativadores (protenas), transativadores.

A estruturao da cromatina a provvel razo para a

necessidade de regulao positiva, de forma que osgenes esto inativos na ausncia de regulao.

Na regulao positiva, a maioria dos genes estnormalmente inativa (ou seja, a RNA pol no se liga

aos promotores) e a clula sintetiza apenas asprotenas ativadoras necessrias para a transcrio deum conjunto de genes.


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Enhancers e UASsA maioria das RNA pol II de eucariotos requerem alm das sequncias

TATA e Inr (Iniciadora), outras sequncias adicionais requeridas para aregulao da transcrio.

Enhancers so sequncias intesificadoras nos eucariotos superiores eUASs (sequncias ativadoras a montante) em Leveduras. A localizao

do enhancer pode ser montante, jusante ou mesmo dentro do gene.

Quando protenas reguladoras esto ligadas nestas sequncias adicionais,aumentam a transcrio dos promotores prximos, independentemente dasua orientao no DNA.

Os silenciadores so seqncias de ao cis que so ligadas a

repressores, inibindo assim os ativadores e reduzindo a transcrio.


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Alguns genes apresentam o enhancers (reforador ou acentuador), localizados a

uma distancia maior do stio de transcrio, tanto upstream como downstream (ausante), e que so capazes de estimular o nvel de transcrio.

Tanto os promotores como os enhancers podem apresentar elementos que

respondam a estmulos, como choque de calor (heat shock), hormnios ou

metais.


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Classes de protenas ativadoras da TranscrioClasses de protenas ativadoras da Transcrio

Fatores basais de transcrio: requeridos pela RNA pol II

Transativadores:Ligam-se aos Enhancers e UASsfacilitando a transcrio.

Co-ativadores: No agem diretamente no DNA, mas atuam

em interaes protenas-protena. Protenas repressoraspodem impedir estas interaes.


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Protena de ligao TATA (TBP)Protena de ligao TATA (TBP)Esta a primeira protena a se ligar no complexo de pr-iniciao nasequncia TATA de um promotor tpico da RNA pol II.

Nesse complexo, esto vrios fatores de transcrio gerais, quepode no se formar na ausncia de transativadores e co-ativadores.

Formadoras de alas


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O modelo para ao adistncia inclui algum tipo

de dobra do DNA. Neste

modelo, uma ala de DNA

coloca protenas

ativadoras ligadas aelementos acentuadores

distantes em proximidade

a complexos proticos

associados a seqncias de

ao cis proximais apromotores.

Animao


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Muitos promotores eucariticos so reguladospositivamente

RNA polimerases eucariticas possuem pouca ou nenhuma afinidade

intrnseca para os seus promotores: a iniciao da transcrio , quasesempre, dependente de mltiplas protenas ativadoras (regulao positiva).

O armazenamento do DNA, dentro da cromatina, efetivamente torna a

maioria dos promotores inacessveis. De forma que os genes esto

normalmente silenciosos na ausncia de outra regulao.


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Regulao do metabolismo da Galactose em LevedurasRegulao do metabolismo da Galactose em Leveduras

Os genes das enzimas do metabolismo da galactose em

leveduras esto dispersos em vrios cromossomos e no esto

organizados em um operon como em bactrias. Entretanto, todosos genes GAL possuem promotores semelhantes e so regulados

coordenadamente por um conjunto de protenas comuns.

SinalizaoGalactose + Gal3p

Represso

Gal4p + Gal80p


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Genes do metabolismo da Galactose em Leveduras


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A regulao pode ocorrer por meio da fosforilao de fatores de transcrio nuclearA regulao pode ocorrer por meio da fosforilao de fatores de transcrio nuclearem mamferosem mamferos

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