Etiopatogenia das Doenças Priônicas

e identificação genética do agente infeccioso

Vilma Regina Martins, PhD

Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer

I I SEMINÁRIO ESTADUAL DE VIGILÂNCIA DAS DOENÇAS PRIÔNICAS NO SEMINÁRIO ESTADUAL DE VIGILÂNCIA DAS DOENÇAS PRIÔNICAS NO ESTADO DE SÃO PAULOESTADO DE SÃO PAULO

6 de novembro de 2006 Vila Mariana, São Paulo, SP.

Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis

Animais

Encefalolia Espongiforme Bovina (BSE) marta

(MTE), cervo (CWD), felinos (FSE), antílopes

(EUE) e primatas (ZPSE)

“Scrapie” ovelhas e carneiros

HumanosKuruDoença de Creutzfeldt-Jakob (CJD)

Doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS)Insonia Familiar Fatal

Kuru

BSE

Scrapie

CJD

Encefalopatias Espongiformes transmissíveis (cérebros)

Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis

Quem é o agente infeccioso?

Quais são suas características físico-químicas?

Como ocorre sua propagação?

Cérebro de animais infectados

extrato

Inoculação em um animal sadio

Produção da mesma patologia vista no primeiro animal

Purificação do agente infeccioso

menor inóculo tem maior atividade infecciosa

Caracterização do agente infeccioso

Susceptibilidade do agente infeccioso à UV

scrapie

(%)

ati

vid

ade

Dose de UV

gene

bactéria

bacteriófago

Características químicas do agente infeccioso

Resistentes a agentes modificadores de ácidos nucléicos (nucleases e UV)

Sensíveis a agentes modificadores de proteínas (proteases, SDS, fenol)

Agente infeccioso sem material genético (DNA ou RNA)composto apenas de proteína (PrPsc)

Prions = proteinaceus infectious particle

Stanley Prusiner, 1983

Identificação do agente infeccioso

agente infeccioso purificado

Imunização de coelhos

Produção de anticorpos contra o agente infeccioso

Reação positivaem cérebro infectado

Reação positivaem cérebro NÃO infectado

???

Cérebro sadio tem uma proteína

semelhante à infecciosaPrion celular

Como ocorre a geração de novo agente infeccioso na ausência de material

genético?

Proposta:

A proteína infecciosa catalisa a formação de novas proteínas infeccionas a partir da homóloga normalmente produzida pela célula.

Prova:

Importância da proteína prion celular na doença.

Proteína prion celular

Gene codificadorPRNP

Cromossomo 20 humanoCromossomo 2 camundongo

Deleção de PRNP em camundongos

Animais “knockout” para PrPc

Camundongo PRNP “knockout”

Büller et al., Cell 73, 1339-47, 1993

A presença da proteína celular é absolutamente necessária para o estabelecimento de infecção por prions!

90 140 190 240 340 390 440

100

60

40

20

0

80

Incubation time (days)

Anim

ais

sem

doença

(%

)

PrP +/+

CD-1PrP 0/0

Tempo de incubação (dias)

0

40

60

80

100

20

Mecanismo de conversão PrPc- Prion

PrP gene

PrP mRNA

PrPc

Célula normal

PrP gene

PrPc

PrPsc

PrP mRNA

Célula infectada

Adaptado de Weissmann, 1994

Hipótese de “protein only” só proteína

PrPc Prion

NormalAltamente insolúvel

Deposição em placas

Proteínas com diferenças conformacionais

Prions“Proteinaceous infection particles”

•Resistentes a agentes modificadores de ácidos nucléicos

(nucleases e UV)

•Sensíveis a agentes modificadores de proteínas (proteases, SDS, fenol)

•Contém uma forma anormal de uma proteína celular, PrPc

•Diferem de PrPc apenas estruturalmente

•Presença de PrPc é absolutamente necessária para a infecção

Doenças humanas por prions Infecciosas/Iatrogenicas

Transplante de córnea (CJD)Inoculação acidental de tecido cerebral(CJD)Hormônio de Crescimento (cadáver)canibalismo (Kuru)vCJD injestão de carne contaminada com BSE

Genéticas Mutações no gene de Prion celularGSS, FFI, CJD

Esporádicascaso completamente desconhecido 1:2,000,000

BSE X vCJD

2000 – 79 cases of vCJD (Hilton DA, J. Neuroph. Appl. Neurobiol 26 (5), 405-407)

Evidências da transmissão do BSE para humanos

Transmissão de BSE para macacos induziu a formação de placas “floridas” similares às presentes na nvCJD.

Prion Biology and Diseases, Stanley Prusiner, 2ª edição, 2003

Do intestino ao cérebroTranslocação através do epitélio intestinal

Mabbott & MacPherson, Nat. Ver. Microb. 4:201-211, 2006

Neuroinvasão a partir do intestino

Splanchnic nerve

Vagus nerve

Mabbott & MacPherson, Nat. Ver. Microb. 4:201-211, 2006

Gado bovinoEEB - BSE

HumanosnvCJD

Scrapieovelha

Humanos

Cervos Chronic Wasting Disease

CWD

Barreira entre espécies

TransplantesTransfusão sangüínea

?

Barreira entre espécies

Barreira entre espécies

Possible transmission of variant Creutzfeldt-Jakob disease byblood transfusion

C A Llewelyn, P E Hewitt, R S G Knight, K Amar, S Cousens, J Mackenzie, R G Will

Findings 48 individuals were identified as having received alabile blood component from a total of 15 donors who laterbecame vCJD cases and appeared on the surveillance unit’sregister. One of these recipients was identified as developingsymptoms of vCJD 6·5 years after receiving a transfusion ofred cells donated by an individual 3·5 years before the donordeveloped symptoms of vCJD.

Interpretation Our findings raise the possibility that thisinfection was transfusion transmitted. Infection in therecipient could have been due to past dietary exposure to theBSE agent. However, the age of the patient was well beyondthat of most vCJD cases, and the chance of observing acase of vCJD in a recipient in the absence of transfusiontransmitted infection is about 1 in 15 000 to 1 in 30 000.

THE LANCET • Vol 363 • February 7, 2004

Forma Fenótipo

Adquirida KuruDoença de Creutzfeldt-Jakob iatrogênica (iDCJ ou iCJD)

Doença de Creutzfeldt-Jakob nova variante(vdcj ou vCJD)

Familial (hereditária)

fDCJ ou fCJD)

Insônia Familiar Fatal (IFF ou FFI)

Doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS)

Mista ou indeterminada

Esporádica sDCJ ou sCJD Típica (MM1 MV1)

Aparecimento precoce(VV1)

Longa duração (MM2)

Placas de Kuru (MV2)

Atáxica (VV2)

Insônia Fatal (sIF)

Doenças humanas por prions

ORF

EXON I INTRON EXON II

ORF

mRNA

5’ An

 

Prnp

O gene PRNP e a proteína prion celular

NH2 COOH

102 180

178

198

200

210

217

232

105

145

171117

octa

P

L

A

V

y

STOP

N

S

D

N

V

I

F

S

E

K

V

I

Q

R

M

R

4 ou 5

< 3 ou > 8

P

L

CJD

GSS

Doença Psiquiátrica

CJD ou FFI

Mutações na proteína PrPc associadas a doenças herdadas de padrão autossômico dominante

Martins e cols, in Neuropsiquiatria Geriátrica, 2000

183

T

A

Sporadic CJ

FFI

GSS New variant CJD

Curvas de mortalidade distribuídas por sexo e idade FFI

nvCJD X CJD esporádico

idade (anos) 29 60

Duratção (meses) 14 5

Sintomas iniciais•Anormalida

des Psiquiátricas

•Demência•Sintomas sensitivos

Sintomas cerebelares

(% dos pacientes)

100 40

nvCJD esporádico

 

Codon 129polimorfismo

M129M37%

M129V52%

V129V11%

Presença de polimorfismos no gene PRNP

Polimorfismo no codon 129 e susceptibilidade àsdoenças por prions

Doença#

indivíduos

MET/MET %

MET/VAL %

VAL/VAL %

sadios 261 37 52 11

CJDesporádic

o73 78 12 10

CJDIatrogênic

o63 60 11 20

vCJD 24 98 2 -

Procedimentos de diagnóstico para

doenças por prions

Cérebro, orgãos linfóides e músculo esquelético

Dosagem da proteína 13.3.3Em LCR

Avaliação de polimorfismos/mutaçõesno gene PRNP

Identificação de polimorfismos e/ou mutações no gene de prion celular (PRNP )

Sangue periférico

Separação dos leucócitos

Purificação do DNA

Seqüênciamento direto

DHPLCCromatografia líquida

de alta resolução

Identificação de polimorfismos e/ou mutações no gene de prion celular (PRNP )

Coleta de 5 ml de sangue periférico com anti coagulante (K3 EDTA)

Envio ao Centro de Referência

4ºC – máximo 12 h -20ºC – maior tempo de

armazenamento

Gelo secoGelo reciclável