UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

“Estudo dos principais fatores que contribuem para o desenvolvimento das anemias hipocrômicas microcíticas em

crianças na fase escolar”

Cristiane Fernandes de Freitas Tavares

Ribeirão Preto 2011

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

“Estudo dos principais fatores que contribuem para o desenvolvimento das anemias hipocrômicas microcíticas em

crianças na fase escolar”

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biociências Aplicadas à Farmácia para obtenção do Título de Doutor em Ciências Área de Concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia Orientada: Cristiane Fernandes de Freitas Tavares Orientadora: Profa. Dra. Ana Maria de Souza

Ribeirão Preto 2011

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,

POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E

PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Tavares, Cristiane Fernandes de Freitas “Estudo dos principais fatores que contribuem para o

desenvolvimento das anemias hipocrômicas microcíticas em crianças na fase escolar”. Ribeirão Preto, 2011

137p.; il. 30cm. Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de

Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia.

Orientador: Souza, Ana Maria de.

1. Anemia hipocrômica microcítica 2. Hemoglobinopatias 3. Plumbismo 4. Anemia por deficiência de ferro

FOLHA DE APROVAÇÃO Cristiane Fernandes de Freitas Tavares “Estudo dos principais fatores que contribuem para o desenvolvimento das anemias

hipocrômicas microcíticas em crianças na fase escolar”.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biociências Aplicadas à Farmácia para obtenção do Título de Doutor em Ciências Área de Concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia. Orientadora: Profa. Dra. Ana Maria de Souza

Aprovado em:

Banca Examinadora Prof.Dr._____________________________________________________________

Instituição:_______________________Assinatura: __________________________

Prof.Dr._____________________________________________________________

Instituição:_______________________Assinatura: __________________________

Prof.Dr._____________________________________________________________

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Prof.Dr._____________________________________________________________

Instituição:_______________________Assinatura: __________________________

Prof.Dr._____________________________________________________________

Instituição:_______________________Assinatura: __________________________

Agradeço a Deus pelo fôlego de vida, pelo Seu amor, Sua graça e Sua

misericórdia que se renova a cada manhã.

Dedico este trabalho ao meu marido Sérgio pelo incentivo; ao meu filho

Augusto pela paciência; aos meus pais que me educaram e estiveram

sempre ao meu lado; aos meus familiares e amigos que acreditaram em

mim!

Agradecimentos À Deus, pela presença constante em minha vida e ter permitido este trabalho,

dando-me sabedoria, conhecimento e determinação na superação dos desafios;

À Profa. Dra. Ana Maria de Souza, por ter me recebido e me dado a oportunidade de

aprimorar meus conhecimentos científicos. Agradeço pelo carinho e amizade

durante estes anos;

À Profa. Dra. Raquel Fernanda Gerlach e Dra. Glauce Costa de Almeida, pela

colaboração e parceria neste trabalho;

À Profa. Dra. Fabíola Attié de Castro e Prof. Dr. Marcelo Dias Baruffi, pela

colaboração por colocarem à disposição a utilização do laboratório e equipamentos;

Ao Prof. Dr. Fernando Barbosa Júnior e funcionários pela colaboração na utilização

do equipamento para a realização dos níveis de chumbo plasmático utilizados neste

projeto;

À Zita Maria de O. Gregório, Solange A. F. Bocardo e Jennifer M. Yokoya, pela

dedicação e contribuição nos serviços prestados a este trabalho;

Às colegas do laboratório Julise Miranda, Flávia Paina e Jacqueline Guimarães, pela

colaboração na execução de alguns experimentos, pela amizade e momentos de

descontração;

À Edna Barizon, do Serviço de Análises Clínicas da FCFRP-USP, pelo apoio e

colaboração na realização de alguns experimentos;

Aos pais das crianças, que fizeram parte desse projeto, pelo consentimento em

participarem do estudo e confiança depositada em nosso trabalho;

Aos diretores e professoras das escolas que fizeram parte desse projeto, pela

atenção, confiança e colaboração durante o período de coleta do material biológico;

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo

apoio financeiro;

A todos que contribuíram direta ou indiretamente pela concretização desse trabalho

e para meu crescimento científico.

i

RESUMO

TAVARES, C.F.F. Estudo dos principais fatores que contribuem para o desenvolvimento das anemias hipocrômicas microcíticas em crianças na fase escolar. 2011. 137f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011.

Vários fatores contribuem para o desenvolvimento da anemia, que constitui um dos mais graves problemas de saúde pública. A anemia hipocrômica microcítica é a forma mais comum em crianças e adolescentes. Dentre as causas desta anemia estão: a) deficiência de ferro, que resulta de um longo período do balanço negativo do micronutriente e causa retardo no crescimento e comprometimento do desempenho cognitivo de crianças; b) contaminação por chumbo (plumbismo) que também afeta o desenvolvimento das crianças, podendo ser agravada nos portadores de polimorfismo da enzima ALAD; c) hemoglobinopatias (hemoglobinas variantes e talassemias), anemias herdadas que afetam 7% da população mundial. Devido à alta prevalência destas patologias, o presente trabalho teve como objetivo estudar um grupo de crianças de escolas públicas, identificando os fatores que contribuem para o desenvolvimento de anemias hipocrômicas microcíticas e estabelecer relações entre as características laboratoriais das doenças. Participaram do estudo 427 crianças, com idade entre 6 a 9 anos, sendo 235 do sexo feminino e 192 do sexo masculino, alunos de Escolas Municipais e Estaduais, da zona norte da cidade de Ribeirão Preto-SP. Foram analisados: a) número global de eritrócitos e leucócitos, concentração de hemoglobina, hematócrito, índices hematimétricos e distribuição da amplitude das células vermelhas (contador automático Micros 45 – Horiba ABX®) e cálculo do índice matemático RDWI; b) níveis plasmáticos de chumbo (espectrômetro de massa com plasma indutivamente acoplado VG Plasmaquad PQII®) e estudo das deleções dos polimorfismos da enzima ALAD, por PCR; c) status férrico pelos níveis de ferritina sérica (imunoquimioluminescência utilizando kit Ferritin Immulite – DPC® e equipamento Immulite 1 - DPC®), receptor de transferrina solúvel (ensaio imunoenzimático, utilizando o kit Quantikine soluble transferrin receptor da R&D Systems® e o leitor de microplacas de ELISA READER 210, modelo Microwell System Organon Teknika®) e cálculo do índice sTfR/log ferritina; d) análise das hemoglobinas por eletroforese em acetato de celulose, pH alcalino, por HPLC (sistema automatizado Variant II Bio-Rad® e kit “β-talassemia Short Program) e PCR para a principal deleção de α-talassemias. Com base no critério recomendado pela OMS para definir anemia (Hb menor que 11,5 g/dL), verificou-se que 75 (17,6%) crianças eram anêmicas, sendo 33 (44%) portadoras de algum tipo de hemoglobinopatia, 29 (38,6%) com anemias de causa desconhecida e 13 (17,4%) com anemia por deficiência de ferro. Das anemias, apenas 14 eram anemias hipocrômicas microcíticas, sendo que 10 (71,4%) eram algum tipo de hemoglobinopatia, 2 (14,2%) ADF e 2 (14,2%) de causa desconhecida. Na população estudada, a prevalência de hemoglobinopatias foi de 16,6% , a saber: 11,6% com α-talassemia; 4% com aumento de Hb F; 3,5% com Hb AS; 2,8% com β-talassemia; 0,96% com α/β-talassemia e 0,24% com Hb AC. Os níveis de chumbo plasmático, em todos os participantes do estudo, estavam dentro do recomendado pelo Center for Disease Control and Prevention (< 10 µg/dL), não havendo interferência do metal na patogênese das anemias. Não houve associação entre os polimorfismos da ALAD-1 (ALAD1-1 e ALAD1-2) e os níveis de chumbo plasmático. Anemia por deficiência de ferro foi diagnosticada em 3% das crianças e DF em 6,1%, utilizando um cut off de 30 ng/mL para ferritina sérica. Houve concordância na identificação de hemoglobinopatias utilizando as metodologias eletroforese de hemoglobina em acetato de celulose e HPLC, sendo que estas metodologias não são úteis para diagnosticar α-talassemia. Para identificar os portadores da deleção de α-talassemia (–α3,7) é necessária a utilização da

ii

análise molecular (PCR). A suspeita de Hb S/β-talassemia identificada por HPLC deve ser confirmada por análise dos pais e/ou irmãos. A ferritina foi um bom parâmetro para identificar DF precocemente e útil para diferenciar os portadores de hemoglobinopatias dos portadores de DF e ADF. O índice sTfR/log da ferritina foi mais sensível do que o sTfR, na diferenciação de DF e talassemia. No diagnóstico das anemias hipocrômicas microcíticas é necessário analisar um conjunto de determinações, incluindo exame hematológico, status férrico, perfil eletroforético, em alguns casos incluindo avaliação dos familiares, e análise molecular das hemoglobinopatias.

Palavras-chave: Anemia hipocrômica microcítica, Hemoglobinopatias, Plumbismo, Anemia por deficiência de ferro.

iii

ABSTRACT

TAVARES, C.F.F. Study about the main factors contributing to the development of hypochromic microcytic anemia in school children. 2011. 137f. Thesis (Doctor’s Degree). School of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto – University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2011.

Several factors contribute to the development of anemia, which constitutes one of the most serious problems in public health. The hypochromic microcytic anemia is the most common type in children and adolescents. Among the causes for this type of anemia are: a) iron deficiency, which results from a long period of negative balance of the micronutrient, causing delay in growth and compromising the cognitive performance of the children; b) contamination by lead (lead poisoning), which also affects the development of children, and may be aggravated in carriers of polymorphism of the enzyme ALAD; c) hemoglobinopathies (variants hemoglobin and thalassemia), inherited anemia that affects 7% of the world population. Due to the high prevalence of these pathologies, the present study aimed at studying a group of children from public schools, identifying the factors that contribute to the development of hypochromic microcytic anemia and establishing relations between the laboratorial characteristics of the diseases. The study had the participation of 427 children, aged between 6 and 9 years old, being 235 female and 192 male students from Municipal and State Schools in the north area of Ribeirão Preto-SP. It analyzed: a) number of erythrocytes and leucocytes, hemoglobin concentration, hematocrit, red cell indices and red cell distribution width (automatic counter Micros 45 – Horiba ABX®) and calculation of the mathematical index RDWI; b) plasma lead levels (inductively coupled plasma mass spectrometer VG PlasmaQuad PQII®) and study of the deletions of the polymorphisms of the enzyme ALAD, by PCR; c) iron status by serum ferritin levels (immunochemiluminescence using the kit Ferritin Immulite – DPC® and the equipment Immulite 1 - DPC®), soluble transferrin receptor (enzyme immune assay, using the kit Quantikine soluble transferrin receptor of R&D Systems® and the microplate reader ELISA READER 210, model Microwell System Organon Teknika®) and calculation of the sTfR/log ferritin index; d) hemoglobin analysis by electrophoresis on cellulose acetate at alkaline pH, HPLC (automated system Variant II Bio-Rad® and the kit “β-thalassemia Short Program) and PCR for the main deletion of α-thalassemias. Based on the WHO criteria by to define anemia (Hb under 11.5 g/dL), it was verified that 75 (17.6%) children were anemic, being 33 (44%) with hemoglobinopathy, 29 (38.6%) with anemia of unknown causes and 13 (17.4%) with iron deficiency anemia. Among the anemias, only 14 were hypochromic microcytic, 10 (71.4%) being some sort of hemoglobinopathy, 2 (14.2%) due to iron deficiency and 2 (14.2%) due to unknown causes. In the studied population, the prevalence of hemoglobinopathies was 16.6%, namely: 11.6% with α-thalassemia; 4% with Hb F elevated; 3.5% with Hb AS; 2.8% with β-thalassemia; 0.96% with α/β-thalassemia and 0.24% with Hb AC. The plasma lead levels, in all participants of the study, were within the levels recommended by the Center for Disease Control and Prevention (< 10 µg/dL), without the interference of the metal in the pathogenesis of the anemias. There was no significant association between the polymorphisms of the ALAD-1 (ALAD1-1 and ALAD1-2) and the plasma lead levels. Iron deficiency anemia was diagnosed in 3% of the children and ID in 6.1%, using a cutoff of 30 ng/mL for serum ferritin. There was agreement in the identification of hemoglobinopathies using the methodologies electrophoresis of hemoglobin in cellulose acetate and the HPLC, as these methodologies are not useful to diagnose α-thalassemia. In order to identify the carriers of α-thalassemia gene deletion (–α3,7) it is necessary to use the molecular analysis (PCR). The suspicion of Hb S/β-thalassemia identified by HPLC must be confirmed through the analysis

iv

of the parents and/or siblings. The ferritin was a good parameter to identify ID early and useful to differ the carriers of hemoglobinopathies of the carriers of ID and IDA. The sTfR/log ferritin level was more sensitive than the sTfR, in the differentiation of ID and thalassemia. In the diagnosis of the hypochromic microcytic anemias, it is necessary to analyze a set of determinations, including hematological exam, iron status, electrophoretic profile, in some cases including relatives, and molecular analysis of the hemoglobinopathies.

Keywords: Hypochromic microcytic anemia, Hemoglobinopathies, Lead poisoning, Iron deficiency anemia.

v

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Metabolismo do ferro ......................................................................................... 5

Figura 2 – Ciclo do ferro e a síntese do heme...................................................................... 7

Figura 3 – Efeito do chumbo na biossíntese do heme........................................................ 10

Figura 4 – Estrutura dos genes de α e β-globinas.............................................................. 15

Figura 5 – Mecanismo de recombinação desigual nas deleções –α3,7 (rightward deletion) e –α4,2 (leftward deletion).................................................................. 18

Figura 6 – Exemplos de cromatograma. A: perfil de um participante sem hemoglobinopatia (fenótipo AA); B: perfil de um participante com traço falciforme (fenótipo AS) .................................................................................. 31

Figura 7 – Fluxograma dos procedimentos laboratoriais realizados na pesquisa .............. 35

Figura 8 – Fluxograma das análises moleculares realizadas na pesquisa .......................... 36

Figura 9 – Distribuição das crianças estudadas, em relação ao sexo................................. 38

Figura 10 – Distribuição das concentrações de hemoglobina nos grupos anêmicos e não-anêmicos .................................................................................................... 39

Figura 11 – Distribuição dos 47 casos de hemoglobinopatias na população estudada, segundo as metodologias de eletroforese e HPLC ........................................... 41

Figura 12 – Níveis de Hb A2 por eletroforese em acetato de celulose e HPLC nos participantes com suspeita de Hb S/β-talassemia............................................. 42

Figura 13 – Exemplos de análise da deleção –α3.7 por PCR................................................ 43

Figura 14 – Distribuição dos 71 casos de hemoglobinopatias na população estudada, segundo as metodologias de eletroforese, HPLC e PCR.................................. 44

Figura 15 – Níveis séricos de receptores de transferrina nos pacientes com deficiência de ferro.............................................................................................................. 46

Figura 16 – Valores do índice receptores de transferrina/ log ferritina nas crianças com deficiência de ferro ........................................................................................... 47

Figura 17 – Comparação dos níveis plasmáticos de chumbo dos grupos............................ 48

Figura 18 – Correlação entre os níveis plasmáticos de chumbo e os polimorfismos da ALAD ............................................................................................................... 48

Figura 19 – Comparação dos níveis de hemoglobina nos grupos estudados....................... 49

Figura 20 – Comparação dos valores de RDW nos grupos estudados................................. 50

Figura 21 – Comparação dos níveis de ferritina sérica nos grupos estudados..................... 51

Figura 22 – Comparação dos níveis de receptores de transferrina nos grupos estudados ... 51

Figura 23 – Comparação dos níveis do índice receptor de transferrina/log da ferritina nos grupos estudados........................................................................................ 52

vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Média dos parâmetros hematológicos dos grupos anêmicos e não-anêmicos.. 39

Tabela 2 – Distribuição das hemoglobinopatias na população estudada, realizada pelas metodologias de eletroforese e HPLC.............................................................. 41

Tabela 3 – Pesquisa de alterações quantitativas e qualitativas das frações de hemoglobina dos pais e/ou irmãos das crianças com suspeita de Hb S/β-talassemia, realizada pela metodologia de HPLC ............................................ 42

Tabela 4 – Distribuição das hemoglobinopatias na população estudada, segundo as metodologias de eletroforese, HPLC e PCR .................................................... 44

Tabela 5 – Análise morfológica dos portadores de hemoglobinopatias............................. 45

Tabela 6 – Status férrico dos grupos estudados ................................................................. 45

Tabela 7 – Dados laboratoriais dos participantes com hemoglobinopatias e ferritina abaixo de 30 ng/mL .......................................................................................... 53

Tabela 8 – Parâmetros hematológicos e bioquímicos dos grupos β-TT e ADF................. 53

vii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ADC Anemia das doenças crônicas

ADF Anemia por deficiência de ferro

ALA Ácido aminolevulínico

ALAD Ácido δ-aminolevulínico desidratase

ATP Adenosina trifosfato

BFU-E Erythroid burst-forming units (Unidade formadora de burst eritróide)

CHCM Concentração de hemoglobina corpuscular média

Cp Ceruloplasmina

CD Cluster of differenciation (Marcador celular)

CDC Centers for Disease Control and Prevention (Centro de Prevenção e Controle de Doenças dos Estados Unidos)

Dctyb Citocromo b duodenal ferroredutase

DF Deficiência de ferro

DMT-1 Transportador de metal divalente – 1

DNA Desoxiribonucleic acid (Ácido desoxirribonucléico)

dNTP Desoxinucleotídeos

E Número de eritrócitos

EDTA K2 Etileno diamino tetracetato de potássio

ELFIA (Enzyme Linked Fluorescent Immunoassay)

EPO Eritropoetina

EROS Espécie reativa de oxigênio

FPN-1 Ferroportina - 1

GABA Gamma aminobutyric acid (Ácido γ-aminobutírico)

Hb Hemoglobina

HCM Hemoglobina corpuscular média

viii

HCP-1 Proteína carreadora do grupo heme

HO-1 Heme oxigenase - 1

Hp Hefaestina

HPLC High performance liquid chromatography (Cromatografia líquida de alta pressão)

Ht Hematócrito

IRP Iron regulatory protein (Proteínas regulatórias do ferro)

LCR Região controladora do locus

LIP Pool iron label (Pool de ferro lábil)

mRNA Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro)

OMS Organização Mundial da Saúde

PCR Polymerase chain reaction (Reação em cadeia de polimerase)

PHHF Persitência Hereditária de Hemoglobina Fetal

RBC Red blood cell (Eritrócitos ou glóbulos vermelhos)

RDW Red cell distribuition width (Distribuição da amplitude das células vermelhas)

RFLP Restriction fragment length polymorphism (Análises dos fragmentos de restrição de tamanhos diferentes)

sTfR Receptor de transferrina solúvel

Tf Transferrina

TfR-1 Receptor de transferrina – 1

TFR-2 Receptor de transferrina – 2

TFR-F Índice receptor de transferrina/log de ferritina

TT Traço talassêmico

UTR Untranslated region (Seqüência de nucleotídeos não traduzidos)

VCM Volume corpuscular médio

WHO World Health Organization (Organização Mundial da Saúde)

SUMÁRIO

Resumo ....................................................................................................................................... i

Abstract ....................................................................................................................................iii

Lista de figuras ......................................................................................................................... v

Lista de tabelas ........................................................................................................................vi

Lista de abreviaturas..............................................................................................................vii

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................1 1.1 Homeostasia do ferro............................................................................................................4

1.2 Exposição ao chumbo...........................................................................................................8

1.3 Interações entre a deficiência de ferro e o plumbismo .......................................................12

1.4 Hemoglobinopatias.............................................................................................................13

1.5 Diferenciação entre traço talassêmico e anemia por deficiência de ferro ..........................21

2. OBJETIVOS .......................................................................................................................24

3. CASUÍSTICA E MÉTODOS ............................................................................................26 3.1 Características do local do estudo ......................................................................................27

3.2 Coleta de sangue.................................................................................................................28

3.2.1 Coleta de sangue das crianças participantes do projeto...................................................29

3.2.2 Coleta de sangue dos pais e/ou irmãos das crianças participantes do projeto.................29

3.3 Avaliação hematológica .....................................................................................................30

3.3.1 Hemograma completo .....................................................................................................30

3.3.2 Detecção qualitativa e quantitativa das hemoglobinopatias por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).............................................................................................................30

3.3.3 Detecção qualitativa das hemoglobinopatias por eletroforese em acetato de celulose em pH alcalino (pH 8,6) ...........................................................................................................31

3.3.4 Detecção quantitativa de Hb A2 por eletroforese em acetato de celulose em pH alcalino (pH 8,6) .......................................................................................................................31

3.4 Avaliação do status férrico .................................................................................................32

3.4.1 Ferritina sérica .................................................................................................................32

3.4.2 Receptor solúvel de transferrina (sTfR) ..........................................................................32

3.4.3 Índice sTfR/log ferritina ..................................................................................................32

3.5 Chumbo plasmático ............................................................................................................32

3.6 Análise molecular da principal deleção da α-talassemia (-α3,7).........................................33

3.6.1 Extração e quantificação do DNA genômico ..................................................................33

3.6.2 Amplificação do DNA genômico e identificação da deleção –α3.7 .................................33

3.7 Análise molecular dos polimorfismos da enzima ácido σ-aminolevulínico desidratase (ALAD) ....................................................................................................................................34

3.8 Divisão dos grupos de estudo .............................................................................................34

3.9 Análise estatística ...............................................................................................................35

4. RESULTADOS ...................................................................................................................37 4.1 Classificação morfológica das anemias..............................................................................38

4.2 Classificação etiológica das anemias..................................................................................40

4.2.1 Hemoglobinopatias..........................................................................................................40

4.2.2 Deficiência de ferro .........................................................................................................45

4.2.3 Chumbo ...........................................................................................................................47

4.3 Correlações entre os grupos estudados...............................................................................49

5. DISCUSSÃO .......................................................................................................................54

6. CONCLUSÕES...................................................................................................................69

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................71

APÊNDICES ...........................................................................................................................88

ANEXOS ...............................................................................................................................135

1. INTRODUÇÃO

---------------------------------------------------------- Introdução------------------------------------------------------------ 2

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), anemia refere-se à diminuição da

concentração de hemoglobina ou do número de eritrócitos circulantes, a valores abaixo do

limite inferior de normalidade, que variam de acordo com a idade, sexo e condição

fisiológica. A anemia pode ser atribuída à perda de sangue, destruição excessiva ou produção

reduzida de eritrócitos. Deficiência nutricional, infecção parasitária, malária e alterações

genéticas na hemoglobina são alguns dos fatores que contribuem para o desenvolvimento da

anemia (WHO, 2008).

O diagnóstico diferencial das anemias é de grande importância clínica, podendo ser

baseado nas alterações morfológicas eritrocitárias, da qual origina a classificação em anemias

normocrômicas normocíticas, hipocrômicas microcíticas ou macrocíticas (GUALANDRO,

2000). Para um diagnóstico preciso da anemia é necessária a avaliação de um conjunto de

exames laboratoriais e clínicos, não sendo indicado a avaliação de dados isolados (WHO,

2008).

A anemia microcítica é a forma de anemia mais comum em crianças e adolescentes

(IOLASCON et al., 2009). As anemias hipocrômicas microcíticas compartilham

características morfológicas, como concentração de hemoglobina reduzida e presença de

células anormalmente pequenas, detectadas pela redução dos índices de hemoglobina

corpuscular média (HCM) e volume corpuscular médio (VCM), respectivamente (BORGES

et al., 2001; RAHIM, 2009).

Para a biossíntese da hemoglobina é necessário que seus três componentes, ferro,

protoporfirina e globinas, estejam em quantidades suficientes no organismo. As anemias

hipocrômicas microcíticas geralmente são causadas por distúrbios no metabolismo de ferro,

como a anemia por deficiência de ferro e anemia das doenças crônicas; distúrbios na síntese

de globina, como as hemoglobinopatias; e distúrbios da síntese de porfirinas e heme, como a

anemia sideroblástica e a intoxicação por chumbo (KILLIP et al., 2007).

A anemia por deficiência de ferro é a forma mais comum de anemia afetando

aproximadamente dois bilhões de pessoas no mundo, principalmente mulheres em idade

reprodutiva e crianças (KOULAOUZIDIS et al., 2009; KORDAS, 2010).

O ferro é essencial para a sobrevivência de quase todos os organismos vivos. Como

componente de moléculas ligantes de oxigênio (hemoglobina e mioglobina), citocromos e

muitas enzimas (peroxidase, catalase, ribonucleotídeo redutase, etc.), desempenha importantes

---------------------------------------------------------- Introdução------------------------------------------------------------ 3

funções no metabolismo humano, como: transporte e armazenamento de oxigênio; síntese de

hormônios; proliferação e diferenciação celular; cadeia respiratória e transferência de

elétrons; regulação gênica (ANDREWS, 2004; CAIRO et al., 2006; MUÑOZ et al., 2011).

Em condições fisiológicas, ocorre a produção de 200 bilhões de eritrócitos, diariamente,

sendo necessário 25 mg de ferro para a síntese de hemoglobina, o que solicita 80% da

demanda de ferro humano. O desequilíbrio da necessidade do ferro no organismo pode ser

observado na alta prevalência de deficiência de ferro, predominante em crianças e

adolescentes, devido ao rápido crescimento e aumento fisiológico da demanda de ferro

(HENTZE et al., 2004; FLEMING, 2008; BEAUMONT; DELABY, 2009).

A deficiência de ferro é o resultado final de um longo período do balanço negativo desse

metal, que ocorre de forma gradual e progressiva, levando à anemia. O primeiro estágio,

depleção de ferro, afeta os depósitos de ferro nos hepatócitos, macrófagos do fígado, baço e

medula óssea, podendo ter consequências funcionais. O segundo estágio, deficiência de ferro,

é referido como uma eritropoese ferro-deficiente e caracteriza-se por alterações bioquímicas

que refletem a insuficiência de ferro para a produção normal de hemoglobina e outros

compostos férricos, mesmo que a concentração de hemoglobina ainda não esteja reduzida. O

terceiro e último estágio, anemia por deficiência de ferro (ADF), caracteriza-se pela

diminuição dos níveis de hemoglobina com prejuízos às funções dos eritrócitos (PAIVA et

al., 2000; KOULAOUZIDIS et al., 2009).

Em crianças, a ADF está associada ao retardo no crescimento, comprometimento do

desempenho cognitivo e diminuição da função muscular (KWONG et al., 2004; YANG et al.,

2008). Pode ocorrer o comprometimento do sistema imunológico, como diminuição da

resistência às infecções ou infecções de repetição em intervalos curtos de tempo (BISCEGLI

et al., 2006). A deficiência de ferro nas células pode comprometer seu desenvolvimento,

levando à morte celular (MONTEIRO et al., 2006).

Existem diversos parâmetros hematológicos e bioquímicos que refletem a deficiência de

ferro e/ou anemia, podendo ser utilizados no diagnóstico do estado nutricional de ferro da

população. O número e a morfologia de eritrócitos, a concentração de hemoglobina, o valor

do hematócrito, os índices hematimétricos volume corpuscular médio, hemoglobina

corpuscular média e concentração de hemoglobina corpuscular média (VCM, HCM e CHCM,

respectivamente) e a distribuição do tamanho dos eritrócitos (RDW, do inglês Red Cell

Distribution Width) são ferramentas úteis no diagnóstico das anemias. O diagnóstico da

---------------------------------------------------------- Introdução------------------------------------------------------------ 4

deficiência de ferro inclui a determinação dos níveis séricos de ferro, saturação de

transferrina, capacidade de ligação do ferro, ferritina sérica e receptor solúvel de transferrina

(PAIVA et al., 2000; ESPANEL et al., 2007; GONZÁLES et al., 2009; MUÑOZ et al.,

2011).

1.1 Homeostasia do ferro

O balanço do ferro é determinado pela regulação da absorção intestinal, no duodeno e

jejuno proximal, que é inversamente proporcional ao estoque de ferro corpóreo. Essa

regulação ocorre por diferentes vias de sinalizações celulares.

Na dieta alimentar, o ferro melhor absorvido é o ferro-heme, encontrado nas carnes

vermelhas. O ferro de origem vegetal é o ferro não-heme, pouco absorvido devido sua

insolubilidade em pH ácido (HUNT, 2002; DE DOMENICO et al., 2008). O heme entra nos

enterócitos, células epiteliais da mucosa intestinal, através da proteína carreadora de heme

(HCP1, do inglês heme carrier protein 1) expressa na membrana apical. Após a internalização,

o heme é catabolisado pelo sistema heme oxigenase (HO-1), tendo como produto o ferro

ferroso (Fe+2), a biliverdina e o monóxido de carbono. O Fe+2 é liberado no citosol podendo

ser exportado para o plasma, através da ferroportina, localizada na membrana basolateral do

enterócito (DUNN et al., 2006; SHEFTEL et al., 2007; MUÑOZ et al., 2011).

O ferro não-heme (Fe+3) deve ser reduzido para Fe+2 pela citocromo b redutase duodenal

(Dcytb), enzima associada à membrana enterocítica. Após esse processo, o ferro é

internalizado através do transportador de metal divalente (DMT-1, do inglês divalent metal

transporter), expresso na membrana apical dos enterócitos. No enterócito absortivo, o ferro

tem dois possíveis destinos: ser estocado como ferritina, apoproteína com capacidade de

armazenar até 4500 átomos de ferro, ou ser transferido através da membrana basolateral, pela

ferroportina, alcançando o plasma. Durante sua exportação para o plasma, o ferro é convertido

de Fe+2 para Fe+3 pela hefaestina, uma ceruloplasmina (Cp), proteína plasmática homóloga a

ferroxidase (Figura 1) (JEONG; DAVID, 2003; DUNN et al., 2006). O ferro que permanece

na forma de ferritina tem o tempo de vida limitado pelo ciclo de vida do enterócito, ou seja,

com a senescência da célula, deixa o corpo através do trato gastrointestinal, representando um

importante mecanismo de perda de ferro (CRICHTON et al., 2002; DE DOMENICO et al.,

2007).

---------------------------------------------------------- Introdução------------------------------------------------------------ 5

A hepcidina, peptídeo sintetizado pelo hepatócitos, foi recentemente descrita como um

regulador negativo da absorção intestinal do ferro, atuando ainda na reciclagem de ferro pelos

macrófagos e mobilização dos estoques hepáticos. Seu mecanismo de ação parece estar

relacionado com a inibição do influxo de ferro através da ferroportina, o único exportador de

ferro conhecido de enterócitos, macrófagos e hepatócitos Os níveis de hepcidina estão

aumentados na sobrecarga de ferro e inflamação e diminuídos nos casos de deficiência de

ferro, eritropoese acelerada e hipóxia (NEMETH; GANZ, 2009).

Aproximadamente 3 a 5% do ferro constituem o pool de ferro lábil (LIP), no qual os

íons Fe estão associados a ligantes de baixa afinidade e mantidos em quantidades reduzidas

em condições normais. Os danos celulares consequentes do estresse oxidativo são causados

pelo LIP e mediados por espécies reativas de oxigênio (EROS) (PRUS; FIBACH, 2010).

Figura 1 – Absorção do ferro no enterócito. Adaptada de DUNN et al. Iron uptake and metabolism in the new millennium. Cell Biol., v.17, n.2, p.93-100, 2006.

Dcytb – citocromo b duodenal ferroredutase; DMT1 – transportador de metal divalente 1; FPN1 – ferroportina 1; HCP1 – proteína carreadora do grupo heme 1; HO-1 – heme oxigenase 1; HP – hefaestina; LIP – pool de ferro lábel; Tf – transferrina.

---------------------------------------------------------- Introdução------------------------------------------------------------ 6

O ferro plasmático é transportado pela transferrina (Tf), proteína com alta afinidade pelo

átomo de ferro férrico. Para a internalizacão do ferro, a transferrina diférrica liga-se ao

receptor de transferrina (TfR1, do inglês transferrin receptor), glicoproteína transmembrânica

composta de duas cadeias polipeptídicas idênticas apresentando em cada uma delas um sítio

de ligação para a transferrina diférrica. Após a formação do complexo (Tf-TfR1) ocorre a

endocitose, formando uma vesícula (endossomo). O conteúdo do endossomo é acidificado por

uma bomba de prótons liberando o ferro da transferrina. Uma ferroredutase, identificada

como STEAP3, reduz Fe+3 para Fe+2, permitindo que este seja transportado, através do DMT-

1, para o citoplasma, podendo ser utilizado em vários processos celulares. Durante esse

processo, a vesícula é translocada a superfície da membrana, onde o pH neutro provoca a

liberação da apoferritina ao plasma e o TfR1 é expresso novamente na membrana celular,

sendo utilizado em um próximo ciclo (CONRAD; UMBREIT, 2002; HENTZE et al., 2004;

SPEECKAERT et al., 2011).

Os receptores TfR1 estão expressos em várias células, principalmente nos precursores

eritróides devido à necessidade de ferro para a síntese de hemoglobina (Figura 2). O número

de TfR, na superfície das células, reflete a necessidade de ferro no organismo (BEGUIN,

2003; YANG et al., 2008). O TfR2 é uma proteína homóloga, encontrada nos hepatócitos,

células duodenais e células eritróides, apresentando uma menor afinidade com a transferrina,

quando comparada com o TfR1 e sua expressão não é controlada pelas proteínas regulatórias

do ferro (IRP1 e IRP2, do inglês iron regulatory protein) como ocorre com o TfR1 (HAILE,

1999; HENTZE et al., 2004; LE GAC et al., 2004; RECALCATI et al., 2006). O receptor de

transferrina sérico (sTfR) é uma forma solúvel e truncada, que perde 11 resíduos de

aminoácidos, como resultado da clivagem do receptor de membrana por uma serina protease,

produzindo um fragmento solúvel circulante (SPEECKAERT et al., 2011).

O controle molecular do metabolismo do ferro, em células de mamíferos, implicado na

homeostase celular, é regulado pelos níveis intracelulares de ferro, através de interações entre

IRP-1 e IRP-2 e RNA mensageiros (RNAm) específicos (KIM; PONKA, 2002a; b; LIEU et

al., 2001). As IRP-1 e IRP-2 se ligam aos elementos responsivos ao ferro (IRE, do inglês iron

responsive element), localizados em regiões diferentes dos RNA mensageiros, que codificam

proteínas envolvidas no metabolismo do ferro como ferritina e receptor de transferrina-1,

entre outros. Dependendo da região em que a IRP se liga ao IRE, este pode agir na ativação

ou na repressão da tradução. Sob condições em que há deficiência de ferro, a ligação das IRPs

ao IRE, presente na região 5´ não traduzida no RNAm da ferritina, promove o bloqueio da

---------------------------------------------------------- Introdução------------------------------------------------------------ 7

tradução de ferritina. Por outro lado, a mesma ligação na região 3´ não traduzida no RNAm

do TfR1, promove aumento de sua estabilidade e, portanto da expressão do TfR1, na

superfície celular. Nas condições em que há níveis elevados de ferro, a ligação das IRPs ao

IRE é inibida, resultando na tradução eficiente da ferritina e uma diminuição da estabilidade e

conseqüente expressão do TfR1 (LIEU et al., 2001; HENTZE et al., 2004; RECALCATI et

al., 2006).

Figura 2 – Ciclo da transferrina e síntese do heme. Adaptada de Iolascon et al. Molecular basis of inherited microcytic anemia due to defects in acquisition or heme synthesis. Haematologica, v.94, n.3, p.395-408, 2009.

Apo – apoferritina; DMT1 – transportador de metal divalente 1; Tf – transferrina.

O ferro é constantemente reciclado em nosso organismo. O ferro resultante da

destruição de eritrócitos pode ser armazenado ou reutilizado na eritropoese. Nas anemias

hemolíticas, em que ocorre hemólise intravascular, a hemoglobina, presente no plasma, é

transportada pela haptoglobina, uma proteína de fase aguda sintetizada no fígado. O complexo

hemoglobina-haptoglobina é internalizado pelas células paranquemais do fígado ou pelas

células do sistema reticuloendotelial (monócitos e macrófagos) que expressam o receptor

CD163 (KRISTIANSEN et al., 2001; BEAUMONT; DELABY, 2009). Os eritrócitos

senescentes são fagocitados pelos macrófagos, principalmente do baço. O Fe+2 presente na

célula pode ficar armazenado na forma de ferritina ou ser exportado pela ferroportina e

---------------------------------------------------------- Introdução------------------------------------------------------------ 8

imediatamente ser convertido em Fe+3 pelo complexo glicosilfosfatidilinositol-

ceruloplasmina, presente na membrana do macrófago. O Fe+3 pode então se ligar na

transferrina sendo transportado para o fígado ou para ser utilizado na eritropoese. Pacientes

com deficiência de ceruloplasmina apresentam acúmulo de ferro nos macrófagos, hepatócitos

e nas células do Sistema Nervoso Central, resultando em uma eritropoese restrita em ferro e

neurodegenerações (DE DOMENICO et al., 2008).

1.2 Exposição ao chumbo

O chumbo (Pb) é um metal tóxico não essencial para o organismo. A toxicidade do

chumbo é um problema de saúde pública, afetando o desenvolvimento das crianças e a saúde

humana (KWONG et al., 2004). O envenenamento pelo chumbo, conhecido como

plumbismo, pode causar efeitos graves na infância como menor quociente de inteligência e

deficiência cognitiva. Agências de saúde e de controle ambiental recomendam como limite

máximo de chumbo sérico de 10µg/dL (CDC, 1991), entretanto estudos recentes mostraram

que o sistema nervoso pode ser afetado com exposição inferior a este valor (LANPHEAR et

al., 2000; PATRICK, 2006). Lanphear e colaboradores (2005) reafirmaram a ocorrência de

uma associação inversa entre os níveis de chumbo e o quociente de inteligência, mesmo em

crianças com concentrações séricas menores que 10 µg/dL.

A contaminação pelo chumbo pode ocorrer por inalação do metal, em incêndios ou

poluição industrial, ou por ingestão, através de mãos, alimentos e objetos contaminados.

Dados do Centers for Disease Control and Prevention (CDC) apontam que um milhão de

crianças de 1 a 6 anos de idade, nos Estados Unidos, apresenta concentração sérica de chumbo

superior a 10µg/dL, sendo muitas vezes expostas ao chumbo em suas casas (BINNS et al.,

2007). No Brasil, o controle de pessoas expostas ao chumbo é praticamente inexistente.

Existem relatos que crianças absorvem e retém mais chumbo do que os adultos

(KWONG et al., 2004; CHEN et al., 2008). Segundo Markowitz (2000), na infância,

aproximadamente 50% do chumbo pode ser absorvido, enquanto que na fase adulta apenas 10

a 15% é absorvido. A absorção do metal é maior na presença de vários fatores mais frequentes

em crianças do que em adultos, como a desidratação, deficiência de cálcio, ferro, fósforo,

vitamina D, ácido ascórbico, entre outros (PERAZA et al., 1998; BELLINGER, 2004). Após

absorção no trato gastrointestinal, o metal passa a ser distribuído por todo organismo através

---------------------------------------------------------- Introdução------------------------------------------------------------ 9

da corrente circulatória. A maior parte, cerca de 95%, liga-se aos eritrócitos e pode depositar

em tecidos moles como fígado, cabelo, unhas, músculos, pulmões, glândulas, rins, ou em

tecidos duros/mineralizados como ossos e dentes ou ainda ser excretado. O restante do metal,

cerca de 5%, permanece no plasma, ligado a albumina e γ-globulina, difundindo-se para

tecidos alvos, principalmente o Sistema Nervoso Central. Os níveis de chumbo no sangue

podem representar uma exposição recente ao metal, uma vez que sua meia-vida é de

aproximadamente 30 a 40 dias (RABINOWIT, 1991; MOREIRA; MOREIRA, 2004).

A concentração plasmática de chumbo pode ser o marcador mais relevante para

monitorar a exposição aguda e distribuição ao metal no sangue, pois reflete mais rapidamente

as frações de chumbo na circulação (COSTA DE ALMEIDA et al., 2010). Os níveis em

tecidos mineralizados podem representar uma exposição crônica, pois a meia-vida em tecidos

é estimada em 20 a 30 anos, sendo um biomarcador melhor (NEEDLEMAN, 1992;

PATRICK, 2006).

Níveis altos de chumbo no sangue, em crianças de 1 a 7 anos, podem estar associados à

redução do peso, altura e circunferência de tórax quando comparados aos valores padrões para

crianças do mesmo sexo, idade e raça (BALLEW et al., 1999). A exposição excessiva ao

chumbo também pode causar nefropatia, caracterizada por uma redução gradual da função

renal, podendo ter como consequência a gota saturnínica, devido à interferência do chumbo na

excreção de sais de ácido úrico. Na exposição, também há interferência do chumbo na

atividade enzimática afetando o metabolismo dos eritrócitos (MORTADA et al., 2001).

A anemia que acompanha o envenenamento por chumbo é o resultado de vários efeitos

inibitórios do metal sobre a biossíntese do heme. Geralmente é uma anemia hipocrômica

microcítica leve a moderada. A anemia não é uma manifestação precoce do plumbismo,

sendo evidente quando os níveis de chumbo estão significantemente elevados por períodos

prolongados (SERWINT et al., 1999; KORDAS, 2010). Suplido e Ong (2000) observaram

que 90% dos trabalhadores de uma indústria de baterias, com chumbo sanguíneo maior que 40

µg/dL, eram anêmicos com hemoglobina menor que 13 g/dL para homens e 11,5 g/dL para

mulheres.

O chumbo pode prejudicar a produção de hemoglobina, inibindo as enzimas ácido

aminolevulínico sintetase (ALAS), ácido δ-aminolevulínico desidratase (ALAD),

ferroquelatase, coproporfirinogênio oxidase e porfobilinogênio desaminase (Figura 3). A

alteração da biossíntese do heme reflete a inibição de vários passos enzimáticos e se

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------10

correlaciona com os níveis de chumbo. Rahman e colaboradores (2002) relatam que os níveis

de hemoglobina são negativamente associados com o elevado nível de chumbo sanguíneo.

Existem três mecanismos propostos para a inibição da ferroquelatase pelo Pb, sendo o

primeiro, a ocorrência da inibição enzimática em decorrência da ligação do Pb aos radicais

sulfidrilas da enzima. Na segunda hipótese, a ligação do Pb à enzima altera a conformação do

seu sítio ativo e, consequentemente, inibe a atuação enzimática. O terceiro mecanismo

proposto, é a interferência do Pb não com a enzima, mas com o transportador intracelular de

ferro, impedindo sua ligação à protoporfirina (PATRICK, 2006).

Figura 3 - Efeito do chumbo na biossíntese do heme. Adaptada de Kelada et al. δ-aminolevulinic acid dehydratase genotype and lead toxicity: a Huge review. Am. J. Epidemiol., v.154, n.1, p.1-12. 2001.

ALA- ácido delta amino levulínico; CP – coproporfirinogênio; UP-uroporfirinogênio

O gene que codifica a enzima ALAD está localizado no cromossomo 9q34 e é altamente

expresso no fígado e eritrócitos. Indivíduos portadores do polimorfismo do gene ALAD são

mais susceptíveis a exposição ao chumbo. Foram descritos dois alelos do polimorfismo da

ALAD (ALAD-1 e ALAD-2) com três fenótipos ALAD 1-1, ALAD 1-2 e ALAD 2-2, que

variam segundo a raça e localização geográfica, tendo ambos a mesma função catalítica e

Pb

Pb

PbPb

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------11

estando associados com altos níveis de chumbo sanguíneo (CHEN et al., 2008). A análise da

sequência de aminoácidos demonstra que a diferença entre os polipeptídeos ALAD-1 e

ALAD-2 está na substituição do resíduo 59, que normalmente é lisina, pela asparagina,

resultante da troca da base nitrogenada guanina (G) por citosina (C), na posição 117 da região

codificante do gene. Devido à troca do aminoácido carregado positivamente (lisina) por um

neutro (asparagina), indivíduos hetero ou homozigotos para o alelo ALAD-2 expressam uma

isoforma mais eletronegativa, com maior afinidade pelo chumbo, podendo reter o metal por

um tempo maior (KELADA et al., 2001).

A atividade da ALAD nos eritrócitos está reduzida em proporção aos níveis sanguíneos

de chumbo, podendo resultar em baixas concentrações de hemoglobina, ou seja, anemia

(JAFFE et al., 2000; FLEMING et al., 1999). A inibição da ALAD resulta na formação e

acúmulo do ácido δ-aminolevulínico, detectável no plasma e urina, mesmo quando o nível de

chumbo sanguíneo é menor que 10 µg/dL, e consequentemente no aumento do ácido gama

aminobutírico (GABA), no sistema nervoso central. A ação da ALAD pode ser inibida

também por álcool, cigarro e pelo estado nutricional do indivíduo (KELADA et al., 2001).

O efeito do chumbo sobre a produção do heme está relacionado com o metabolismo do

ferro. Em células eritróides, o chumbo pode limitar a liberação de ferro e, o zinco presente nas

células, é inserido na protoporfirina pela ferroquelatase, podendo acumular zinco-

protoporfirina. Vahter e colaboradores (1997) observaram, em crianças expostas, com níveis

de chumbo plasmático de aproximadamente 60µg/dL, diminuição no valor de hemoglobina e

aumento de protoporfirina, indicando alteração na síntese do heme. Entretanto, há limitação

na utilização da determinação dos níveis de protoporfirina para o diagnóstico do plumbismo,

pois outras situações podem produzir efeito similar na síntese do heme (PATRICK, 2006).

Foi observado ainda diminuição da meia-vida dos eritrócitos seguida de eritropoese ineficaz

como consequência da exposição prolongada ao chumbo. Neste caso, parece que uma

alteração no arranjo espacial das proteínas da membrana dos eritrócitos, inibe a ATPase

levando à perda de K+ (KWONG et al., 2004). Osterode e colaboradores (1999) sugeriram

dois mecanismos para a eritropoese ineficaz. Pode ocorrer redução das células progenitoras

eritrocitárias (BFU-E) ou produção limitada de eritropoetina (EPO), prejudicando a maturação

das BFU-E.

O chumbo afeta ainda o metabolismo de nucleotídeos eritrocitários, inibindo a enzima

pirimidina 5’-nucleotidase (P5N), enzima que tem a função de eliminar os nucleotídeos

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------12

residuais na maturação dos eritrócitos. A inibição desta enzima determina o aparecimento de

corpos de inclusão nos eritrócitos, denominados ponteado basófilo, decorrente da deposição

de ácidos nucléicos nestas células. Esta interferência pode causar anemia hemolítica em casos

de intoxicação pelo metal (MARINAKI et al., 2001).

O chumbo pode alterar a síntese das globinas, porém o mecanismo dessa interferência

não está bem esclarecido. A hipótese mais provável é que o metal se ligue ao ânion fosfato

das nucleoproteínas e/ou em bases pirimídicas. Tanto as bases quanto o fosfato participam da

formação do RNA transportador (t-RNA), que atua na síntese de proteínas. Com esta

interferência não haveria formação adequada de t-RNA e consequentemente deficiência da

síntese das globinas (PATRICK, 2006).

1.3 Interações entre a deficiência de ferro e o plumbismo

Deficiência de ferro é a desordem nutricional mais comum do mundo. Estima-se que 4 a

5 bilhões de pessoas tenham algum grau desta deficiência e aproximadamente 2 bilhões sejam

anêmicos, sendo as crianças especialmente vulneráveis (WHO, 2008). Silva e colaboradores

(2001) observaram, no Estado de São Paulo, uma prevalência de anemia de 35,6%, na década

de 80, e 46,9%, na década de 90. Estudos epidemiológicos relatam interação entre as crianças

portadoras de deficiência de ferro e plumbismo. Ambas as condições podem afetar crianças

com idade inferior a cinco anos, de baixo nível sócio-econômico e moradores de centros

urbanos (WRIGHT et al., 2003). Esse grupo populacional também está mais suscetível ao

plumbismo, devido a fácil contaminação e uma maior absorção quando comparadas aos

adultos (KWONG et al., 2004; KORDAS, 2010).

Wright (1999) relatou que animais com deficiência de ferro pré-existente apresentavam

maior absorção de chumbo, sugerindo uma maior suscetibilidade ao plumbismo em

indivíduos com esta deficiência. Recentemente, essa mesma relação foi observada em

crianças urbanas (WRIGHT et al., 2003). O ferro pode ser capaz de competir com o chumbo,

inibindo sua ligação com o DMT-1, ou seja, em um estado repleto de ferro o indivíduo está

menos susceptível ao plumbismo (BANNON et al., 2002; GARRICK et al., 2006).

Deficiência de ferro e intoxicação por chumbo afetam o desenvolvimento das crianças,

causando prejuízo ao desenvolvimento físico, mental e neurocomportamental (KORDAS,

2010; KHAN et al., 2011). Ambas causam anemia hipocrômica microcítica, que pode ser

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------13

mais severa, na presença de ambas as condições, com microcitose e hipocromia acentuadas. O

valor do hematócrito pode sofrer redução proporcional ao aumento de chumbo eritrocitário.

Evidências importantes têm demonstrado um efeito sinérgico entre deficiência de ferro e

plumbismo, interferindo tanto na eritropoese quanto no metabolismo do ferro (CLARK et al.,

1988; KWONG et al., 2004). Os níveis de zinco-protoporfirina podem estar elevados na

deficiência de ferro e no plumbismo, sendo muitas vezes um parâmetro auxiliar no

diagnóstico dessas patologias, porém como há relatos de aumento deste parâmetro nas

hemoglobinopatias, sua utilização no diagnóstico diferencial é limitada (RONIN; STREHL,

1998).

1.4 Hemoglobinopatias

As hemoglobinopatias constituem um grupo de doenças hereditárias, que são

classificadas com base na presença de hemoglobinas estruturalmente anormais, como as

hemoglobinas S, C, D e E, e/ou na deficiência de uma ou mais cadeias globínicas, as

talassemias. (CLARK; THEIN, 2004; HENDERSON et al., 2010). Estas patologias estão

incluídas dentre as doenças genéticas mais frequentes no mundo, com prevalência estimada

em 7% da população mundial (MELO-REIS et al., 2006; MANCA; MASALA, 2008). Sua

distribuição abrange uma ampla faixa geográfica, que se estende pela África, Ásia, Europa e

América Latina (SCHWARTING et al., 2008; HENDERSON et al., 2009).

No Brasil, as hemoglobinopatias estão relacionadas à diversidade das origens raciais e

ao grau de miscigenação, podendo ter caráter regional. As hemoglobinas variantes com maior

frequência são as S e C, de origem africana, no entanto com a miscigenação ocorrida no

Brasil, essas hemoglobinas passaram a ser encontradas em outros grupos étnicos (AIGNER et

al., 2006). O impacto das migrações populacionais aumenta as combinações das

hemoglobinas anormais e a variedade de mutações (HENDERSON et al., 2009).

Estudos desenvolvidos nos Estados de São Paulo (ORLANDO et al., 2000), Rio Grande

do Sul (SANDRINE et al., 2005) e Goiás (MELO-REIS et al., 2006) mostraram que a α-

talassemia é a alteração hereditária mais frequente, com prevalência de 50,4%, 32,2% e 8,9%,

respectivamente. Os métodos utilizados para o diagnóstico nos estudos referidos foram

eletroforese em acetato de celulose, pH 8,4, e em agarose, pH 6,2; resistência globular

osmótica em solução de NaCl a 0,36%; pesquisa de corpos de Heinz e de corpos de

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------14

hemoglobina H; análise da morfologia eritrocitária e HPLC, no entanto, não foi realizada

análise molecular.

Existem loci genéticos distintos para cada cadeia polipeptídica normal, assim há os

genes alfa (α), beta (β), gama (γ), delta (δ), epsilon (ε) e zeta (ζ). O gene α está localizado no

braço curto do cromossomo 16 (16p13.3) e inclui um gene ζ embrionário (ζ2), um

pseudogene (ψζ1), dois pseudogenes α (ψα2 e ψα1), dois genes α (α2 e α1) e um gene teta (θ)

de função indeterminada, arranjados no sentido 5’→ 3’. O elemento regulatório (HS-40)

possui um sítio hipersensível à DNAse I e está situado 40 kb a 5’ do gene ζ2. O gene β está

localizado no cromossomo 11 (11p15.5) e é composto pelo gene embrionário ε, por dois

genes γ (Gγ e Aγ), que diferem em guanina ou alanina na posição 136, pelo pseudogene β (ψβ)

e pelos genes δ e β, dispostos, ao longo do cromossomo, na mesma ordem em que são

expressos. A região controladora do locus β (LCR) possui cinco sítios hipersensíveis à

DNAse I e se localiza de 6 a 20 kb a 5’ do gene ε (HIGGS, 2004; RIBEIRO; SONATI, 2008)

(Figura 4).

A síntese de globinas embrionárias inicia-se no saco vitelínico, na 3ª semana de

gestação, com a produção das hemoglobinas embrionárias transitórias Gower 1 (ζ2ε2), Gower

2 (α2ε2) e Portland (ζ2γ2). A hemoglobina (Hb) predominante ao longo da vida fetal é a Hb

F (α2γ2), que constitui aproximadamente 70% da hemoglobina total ao nascimento. Há uma

substituição gradual da Hb F pelas hemoglobinas adultas, de tal modo que após o 6º mês de

vida, esta substituição está completa (COSTA et al., 2002). Em um adulto saudável, está

presente aproximadamente 95% de Hb A (α2β2), até 3,5% de Hb A2 (α2δ2) e uma quantidade

inferior a 1% de Hb F (α2Gγ2 e α2Aγ2) (MANCA; MASALA, 2008).

Na maioria das hemoglobinas anormais ocorre uma mutação pontual, ou seja,

substituição de um único aminoácido. Já foram descritas mais de 1.100 hemoglobinas

variantes envolvendo as cadeias α, β, δ e γ (SANDRINE et al., 2005). No estado heterozigoto,

ocorre produção de Hb A e hemoglobina variante, representada laboratorialmente por Hb AS,

AC, AD e AE, sem graves manifestações clínicas. No estado homozigoto, indivíduos SS, CC,

DD, EE, a Hb A está ausente, podendo ter como consequência uma anemia grave. Pode

ocorrer ainda interação de duas hemoglobinas variantes ou a combinação de uma

hemoglobina variante e uma alteração genética para talassemia (CLARK; THEIN, 2004).

Dependendo de qual aminoácido é substituído, ocorrem mudanças na estabilidade,

solubilidade e na função da molécula da hemoglobina. A hipóxia causada pela alta afinidade

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------15

da hemoglobina pelo O2 é uma condição clínica que pode ser encontrada (FERNÁNDEZ et

al., 2008).

Figura 4 – Estrutura dos genes de α e β-globinas. Adaptado de MANCA; MASALA. Disorders of the synthesis of human fetal hemoglobin. Life, v.60, n.2, p.94-111, 2008.

HS – elemento regulatório (hipersensível); LCR – região controladora do locus.

A doença falciforme é uma das patologias hematológicas hereditárias mais investigadas.

É causada por mutação no gene beta da globina, onde há troca da base nitrogenada adenina do

códon GAG para guanina (GTG), resultando na substituição do aminoácido da posição de

número 6 da cadeia β, que normalmente é o ácido glutâmico pela valina (ZAGO, 2004;

MOUSA; QARI, 2010). Caracteriza-se pela presença de drepanócitos no sangue periférico. O

afoiçamento dos eritrócitos é resultante da formação de polímeros intracelulares de

hemoglobina S, durante deoxigenação (SCHNOG et al., 2004). Os polímeros têm impacto

direto sobre a membrana dos eritrócitos, expondo epitopos de proteínas e glicolipideos

normalmente internos na célula. Estas mudanças e a expressão anormal de moléculas de

adesão explicam a maior aderência dos drepanócitos ao endotélio vascular e os eventos de

vaso oclusão (FRENETTE; ATWEH, 2007). A alteração de morfologia torna as células suscetíveis

à destruição, causando hemólise extravascular crônica. Dessa forma, justifica-se a presença de

eritrócitos macrocíticos atribuídos a um maior número de reticulócitos circulantes e,

consequente policromatofilia. O traço falciforme é a forma heterozigota da doença. O

portador geralmente é assintomático, apresentando uma expectativa de vida semelhante a da

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------16

população geral. Estima-se que, no Brasil, aproximadamente 2 milhões de pessoas são

portadoras de traço falcêmico (AS) (SILVA; GIOVELLI, 2010).

A hemoglobina C (Hb C) é a segunda hemoglobina variante mais comum no Brasil.

Origina-se pela substituição do ácido glutâmico por lisina, na posição 6 da cadeia β, em

decorrência da mutação do códon 6 do gene da globina beta de GAG para AAG, ou seja,

substituição de uma guanina por adenina (ZAGO, 2004). A patologia está associada à

capacidade da Hb C induzir desidratação dos eritrócitos e formação de cristais intracelulares.

A forma homozigota, referida como doença da hemoglobina C, resulta em anemia hemolítica

moderada. Em alguns casos, podem ocorrer interações entre as hemoglobinopatias, como a

doença da hemoglobina SC, que resulta da hereditariedade de um gene da βS (Hb S) e outro

βC. Nesta doença, onde coexistem quantidades iguais de Hb C e Hb S, a Hb C aumenta as

propriedades patogênicas da HbS, resultando em uma doença clinicamente significante;

entretanto, na maioria dos indivíduos a doença é mais moderada que a anemia falciforme

(NAGEL et al., 2003)

A Hemoglobina E é causada pela substituição do ácido glutâmico pela lisina, na posição

26 da cadeia β. Pacientes heterozigotos para hemoglobina E (Hb AE) não apresentam

manifestações clínicas significativas. Os portadores homozigotos (Hb EE) podem apresentar

anemia com hipocromia e microcitose. O diagnóstico dos portadores heterozigotos é

fundamental para a realização do aconselhamento genético, visto que a associação dessa

variante com outras hemoglobinopatias pode levar a alterações clínicas significativas. Na

interação Hb E/β-talassemia, por exemplo, a anemia pode ser severa necessitando de

transfusão sanguínea (REES et al., 1998; VICHINSKY, 2007).

Nos heterozigotos com hemoglobinopatias C e E, a morfologia dos eritrócitos é normal,

com exceção de algumas células em alvo. Enquanto que, nos homozigotos, pode-se observar

uma discreta anemia microcítica (VERRASTRO, 2002). A mobilidade eletroforética da

hemoglobina E é similar a hemoglobina C em pH básico, devendo ser diferenciadas pela

eletroforese em pH ácido.

Pode ocorrer ainda combinação da herança de um gene de Hb S e um gene de β-

talassemia, geralmente são heterozigotos para um alelo de β+-talassemia, o que permite a

produção de aproximadamente 20% de Hb A, originando uma anemia de células falcêmicas

menos grave do que a anemia falciforme (WILD; BAIN, 2006). Os casos de Hb S-β0-

talassemia podem ser clinicamente indiferenciáveis da anemia falciforme, dificultando o

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------17

diagnóstico clínico (LUKENS, 1998). A combinação da Hb S e Hb E (Hb SE) resulta em uma

síndrome falcêmica semelhante à combinação HbS/β+-talassemia (VICHINSKY, 2007).

Diferentes tipos de talassemias são encontrados na população, sendo as mais comuns a α

e β-talassemia (GALANELLO et al., 1998; RIGGS, 2004; COUSENS et al., 2010). A α-

talassemia é a doença herdada mais frequente no mundo e, no Brasil, afetando principalmente

descendentes de asiáticos e alguns grupos de africanos. Estudos recentes mostram que a α-

talassemia afeta 5% da população mundial (VICHINSKY, 2010). Até pouco tempo, a

frequência desta patologia era subestimada devido a métodos diagnósticos inadequados. No

Brasil, estudos mostram uma frequência de 10 - 12%, em algumas regiões, e de até 25%, em

grupos específicos. Para a β-talassemia, estudos populacionais no Brasil são escassos; no

Estado de São Paulo, em descendentes caucasóides, a razão estimada é de 3% (BONINI-

DOMINGOS, 2004).

As mutações ou deleções podem resultar na ausência de produção de globina (β0 e α0)

ou diminuição na produção destas (β+ e α+) (CUNNINGHAM, 2010).

Mais de 95% dos casos de α-talassemia são delecionais, sendo que as deleções -α5,2 e -α 20,5 comumente causam α0-talassemia e as -α3,7 e -α4,2 causam α+-talassemia (ZAGO, 2004).

No estado de São Paulo, análises moleculares indicam uma alta prevalência da deleção -α3,7

(SONATI et al., 1991; BORGES et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2006).

Os genes α estão localizados dentro de uma região homóloga de 4 kb de comprimento,

denominadas X, Y e Z, interrompidas por duas regiões curtas e não homólogas, a primeira

entre os genes ψα1 e α2 e a segunda entre os genes α2 e α1 (WEATHERALL, 2008; HIGGS;

GIBBONS, 2010). Os segmentos duplicados Z distam 3,7 kb um do outro e os segmentos X,

4,2 kb. O pareamento desigual entre os segmentos homólogos Z, remove 3,7 kb de DNA,

dando origem a deleção -α3,7, também referida, como deleção à direita (rightward deletion). O

produto final dessa deleção é o gene α híbrido (α2α1) que corresponde à região 3’ do gene α2

e 5’ do gene α1. De modo similar, o pareamento desigual entre os segmentos X remove 4,2 kb

de DNA, originando a deleção -α4,2, conhecida também como deleção à esquerda (leftward

deletion) (Figura 5). Neste caso o gene α2 é totalmente removido, restando apenas o gene α1

(WEATHERALL, 2001; WANG et al., 2003).

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------18

Figura 5 – Mecanismo de recombinação desigual nas deleções –α3,7 (rightward deletion) e –α4,2 (leftward deletion). Adaptado de HIGGS; GIBBONS. The molecular basis of α-talassemia: a model for understanding human molecular genetics. Hematol., v.24, n.6, p.1033-1054, 2010.

O fenótipo de α0-talassemia (--/--) resulta na deleção dos quatro genes para α-globina

e/ou seu elemento regulatório (HS-40), causando hidropsia fetal e morte in utero. A α+-

talassemia ou estado heterozigoto resulta na deleção de apenas um dos dois genes para α-

globina conhecido como portador assintomático (-α/αα) ou a perda de dois genes α de um

único cromossomo (--/αα) ou um gene α de cada um dos cromossomos (-α/-α) (RIGGS, 2001;

SANDRINE et al., 2005).

No feto, a ausência de três genes α (--/-α), produz um excesso de cadeia γ, que se

tetrameriza formando a hemoglobina de Barts (γ4), após o sexto mês de vida, o excesso se

deve à cadeia β, dando origem à hemoglobina H (β4), ambas instáveis, com alta afinidade

pelo oxigênio causando menor fornecimento para os tecidos (ZAGO, 2004). A formação de

precipitados intracelulares durante o desenvolvimento dos eritroblastos pode ocasionar morte

celular intramedular e consequentemente eritropoese ineficaz (FUCHAROEN;

VIPRAKASIT, 2009). A formação dos precipitados da hemoglobina H nos eritrócitos

circulantes leva a disfunção da membrana eritrocítica antecipando a morte celular (CHUI et

al., 2003).

Em portadores com dois ou três genes afetados ocorre anemia microcítica e

anisopoiquilocitose moderada. O diagnóstico laboratorial para α-talassemia pode ser

caracterizado pela precipitação da hemoglobina H, visualizados por coloração supravital. O

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------19

diagnóstico geralmente é feito por exclusão de β-talassemia e/ou deficiência de ferro

(VULLIAMY; KAEDA, 2006). Esse diagnóstico pode ser dificultado quando há uma

concomitante hemoglobinopatia, como Hb S, Hb C, Hb E ou β-talassemia, pela diminuição ou

ausência de Hb H e inclusões celulares (CHUI et al., 2003).

As síndromes de β-talassemia resultam, na maioria das vezes, de mutações pontuais que

afetam a expressão dos genes, já tendo sido descrito mais de 200 mutações. Pessoas com β0-

talassemia apresentam ausência da síntese de β-globina, ou seja, a transcrição do gene é

inteiramente suprimida, que pode ser chamado de Talassemia Maior ou Anemia de Cooley

(SCHWARTING et al., 2008). O excedente de cadeias α precipita e forma agregados nas

células, os corpos de Heinz, provocando lesões na membrana celular que interferem

mecanicamente com a célula. A anemia envolve eritropoese inefetiva, que é provavelmente

mediada por apoptose acelerada de precursores eritróides na medula óssea, bem como

sobrevida encurtada de eritrócitos. E esta diminuição da sobrevida é devida aos danos no

citoesqueleto causados por espécies reativas de oxigênio e promovidos por hemicromos

derivados de cadeias α acumuladas na membrana celular. A anemia leva ao aumento da

produção de eritropoetina, expansão da medula óssea e deformidades no esqueleto. A

eritropoese inefetiva promove maior absorção de ferro e, juntamente com as transfusões

frequentes levam a sobrecarga de ferro e consequente falência de órgãos. (BIRGENS;

LJUNG, 2007). O grau da anemia depende do desbalanço entre as cadeias α e β nos

precursores eritróides. Crianças com Talassemia Maior, nos primeiros dois anos de vida,

podem apresentar severa anemia, requerendo regulares transfusões (GANELLO; ORIGA,

2010).

A β-Talassemia Intermediária possui uma variedade de genótipos e fenótipo clínico

intermediário entre as formas maiores e menores; a severidade da doença é bastante variável

indicando que a base molecular é complexa. Geralmente é produzida pelo estado de

homozigose de alguns alelos de β-talassemia grave e para a β+-talassemia de menor

gravidade, não requerendo transfusões constantes. Em indivíduos com apenas um gene

afetado (β+), a quantidade de mRNA para a β-globina encontra-se reduzida de três a dez

vezes, sendo classificado como Talassemia menor ou heterozigota (BIRGENS; LJUNG,

2007; GANELLO; ORIGA, 2010).

Na β-talassemia heterozigótica geralmente os pacientes são assintomáticos, podendo

apresentar discreta hipocromia e microcitose com presença de células em alvo e ponteado

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------20

basófilo. No estado homozigótico, a anemia hipocrômica microcítica é acentuada, com

anisopoiquilocitose intensa e presença de eritroblastos. Há aumento de Hb A2, podendo haver

também aumento de Hb F, importante para o diagnóstico laboratorial dos estados

heterozigotos e homozigotos, respectivamente (EL-AGOUZA et al., 2002; ZAGO, 2004).

Alguns fenótipos distintos podem ocorrer como a δβ-talassemia, que se caracteriza por

diminuição ou ausência da síntese de δ e β-globina, decorrente de deleções dos genes das

globinas. A produção elevada de γ-globina é suficiente para manter a doença branda. Outra

forma raramente encontrada é a γδβ-talassemia, caracterizada pela deleção ou inativação de

todos os β-genes, causando uma anemia hemolítica neonatal severa (MANCA; MASALA,

2008).

Na Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal (PHHF), semelhante ao que ocorre no

fenótipo δβ-talassemia, a síntese das cadeias δ e β está reduzida ou ausente, com persistência

da síntese da hemoglobina fetal até a vida adulta. No entanto, a síntese deficiente de cadeias β

é compensada pela produção aumentada de cadeias γ, resultando em uma síntese equilibrada

de cadeias de globinas e ausência de manifestações clínicas. Esse fenótipo ocorre por deleções

ou substituição de bases na região promotora de gene. A concentração de hemoglobina pode

se encontrar discretamente elevada em consequência da maior afinidade da Hb F pelo

oxigênio (MANCA; MASALA, 2008).

Em geral, o método mais utilizado para a identificação das hemoglobinopatias é a

eletroforese de hemoglobina em acetato de celulose, em pH alcalino, entretanto sua

sensibilidade é limitada, especialmente nos casos de co-migração de isoformas, como a Hb S

e a Hb D (CHINELATO-FERNANDES et al., 2003). Desse modo, são necessários testes

confirmatórios, como eletroforese ácida em agarose, embora haja controvérsias sobre este

método quanto à distinção das Hb D e G, da Hb O e E (ONDEI et al., 2007). A cromatografia

líquida de alta pressão (HPLC) e técnicas de biologia molecular, como a reação em cadeia da

polimerase (PCR), análise dos fragmentos de restrição de tamanhos diferentes (RFLP) e

sequenciamento gênico são métodos mais precisos para o diagnóstico das hemoglobinopatias

(BERTHOLO; MOREIRA, 2006). Hughes e colaboradores (2009) relatam a importância da

análise conjunta de todas as metodologias no diagnóstico das hemoglobinopatias, uma vez

que, os métodos analisados isoladamente apresentam limitações e podem causar uma má

interpretação no resultado.

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------21

Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, do inglês High-performance Liquid

Chromatography) é um método que permite a detecção de hemoglobinas anormais e

quantificação das Hb A2 e Hb F, de maneira rápida e precisa, usando pequena quantidade de

amostra. A determinação da porcentagem de uma hemoglobina variante e seu tempo de

retenção possibilita uma identificação mais precisa do que os métodos eletroforéticos,

tornando-se um importante método de investigação diagnóstica (JOUTOVSKY et al., 2004).

Com HPLC, frações de hemoglobina são separadas com base em suas interações iônicas com

a coluna catiônica sob alta pressão e por eluição com dois tampões fosfatos diferentes em pH

e força iônica. O resultado é um cromatograma com a porcentagem e tempo de retenção de

cada fração de hemoglobina (ONDEI et al., 2007).

Métodos moleculares para detectar as deleções de α-talassemia tipicamente requerem o

uso de Southern blot, o que permite a detecção de múltiplas deleções em uma única reação. O

uso de marcadores não-radioativos melhorou a segurança do procedimento, entretanto o

método permanece trabalhoso, caro e demorado. A PCR desenvolvida para amplificar

especificamente deleções individuais requer reações múltiplas com reagentes e condições de

ciclagem específica para cada deleção (LIU et al., 2000). Um método PCR multiplex foi

desenvolvido para identificar as seis deleções mais comuns para α-talassemia (CHONG et al.,

2000), possibilitando a análise de vários polimorfismos simultaneamente; quando interpretado

por um sistema automatizado é capaz de avaliar a intensidade das hibridizações, expressos em

gráficos ou em tabelas de genótipos (VULLIAMY; KAEDA, 2006).

1.5 Diferenciação entre traço talassêmico e anemia por deficiência de ferro

A anemia por deficiência de ferro (ADF) e a talassemias são as causas mais comuns de

anemias microcíticas (IOLASCON et al., 2008; VANVRANKEN, 2010). A prevalência de

ADF pode ser sobrestimada em regiões onde são comuns as hemoglobinopatias (PANOMAI

et al., 2010). A utilização dos parâmetros hematológicos clássicos para a diferenciação dessas

anemias é considerada imprópria (ELDIBANY et al., 1999).

Em ambas as anemias são observadas redução do número de eritrócitos e dos índices

hematimétricos VCM e HCM, dificultando a diferenciação de portadores de traço talassêmico

e de ADF (URRECHAGA, 2008). A utilização de métodos como protoporfirina eritrocitária

livre, saturação de transferrina, ferritina e valor da hemoglobina A2 não apresentam 100% de

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------22

sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de ADF ou talassemia, podendo sofrer

interferências de outras patologias.

Em pacientes talassêmicos, independente da necessidade de transfusão, pode-se

observar aumento da absorção de ferro e acúmulo de ferro no fígado, causado pela baixa

regulação da hepcidina. Recentemente, foi relatado que a ferritina sérica pode não ter

correlação com o aumento de ferro no fígado, o que não ocorre em pacientes transfundidos,

pois o ferro é distribuído no sistema reticuloendotelial e detectado pelo aumento da ferritina

(PAKBAZ et al., 2007). Em algumas mutações de β- traço talassêmico e em heterozigotos de

α-talassemias a hemoglobina A2 pode não se encontrar elevada, dificultando ainda mais o

diagnóstico das talassemias (DEMIR et al., 2002).

Vários estudos relataram que a variação do tamanho dos eritrócitos ou anisocitose, que é

evidenciado pelo parâmetro distribuição do tamanho dos eritrócitos (RDW), é maior na ADF

quando comparado com β- traço talassêmico (ASLAN et al., 2002; GALANELLO; CAO,

2005). Melo e colaboradores (2008) consideram a elevação do RDW um importante índice

discriminador na ADF, mas sua sensibilidade deve ser considerada insuficiente para o

diagnóstico final. Ntaios e colaboradores (2007) relataram aumento do RDW tanto no β-traço

talassêmico como na ADF, não sendo indicado para a diferenciação de ambas. O traço δβ-

talassêmico tem como característica uma elevação da Hb F, o qual ocorre de forma

heterogênea nos eritrócitos, podendo ser, também, evidenciado pelo aumento do RDW. Dessa

forma, concluiu-se este índice não é eficiente na distinção de ADF e talassemias (ASLAN et

al., 2002).

Desde 1973, vários autores postulam possíveis índices com maior sensibilidade para a

diferenciação entre os traços talassêmicos e a ADF. Esses índices matemáticos são calculados

a partir do número de eritrócitos (E), dos índices hematimétricos, volume corpuscular médio

(VCM) e hemoglobina corpuscular média (HCM), e do RDW. São conhecidos: índice de

Mentzer (MI =VCM/RBC); índice de Shine e Lal (S & L= VCM2 x HCM); índice de England

e Fraser (E & F= VCM – (Hb x 5) – RDW – ka); índice de Green e King (G & K= VCM2 x

RDW/Hb x 100); índice de RDW (RDWI= VCM x RDW/RBC); índice de Srivastava (SI=

HCM/RBC); índice de Ricerca (RI= RDW/RBC); índice Ehsani (VCM – 10 x RBC) e índice

de Youlden’s (sensibilidade + especificidade – 100). Entretanto, há controvérsias na

utilização desses índices, quanto ao grau de sensibilidade e especificidade, conforme relatado

previamente (BEYAN et al., 2007, ALFADHLI et al., 2006 e BENCAIOVA et al., 2006).

---------------------------------------------------------- Introdução-----------------------------------------------------------23

Demir e colaboradores (2002) concluíram que o número de eritrócitos e o índice de

RDWI, em crianças, foram os melhores parâmetros para diferenciar β- traço talassêmico da

ADF. Em adultos, observou-se que apenas o número de eritrócitos fornece uma maior

sensibilidade e especificidade na diferenciação da β- traço talassêmico e da ADF (BEYAN et

al., 2007; ALFADHLI et al., 2006).

Diferentes grupos raciais participaram do processo de colonização da região na qual se

realizou a pesquisa, e diversas etnias migraram para cá em busca de melhores condições de

vida, o que justifica os estudos sobre hemoglobinopatias. Apesar do desenvolvimento sócio-

econômico de Ribeirão Preto, nosso grupo de pesquisa tem verificado que ainda é alta a

prevalência de deficiência de ferro na região. Temos que considerar a possibilidade de ocorrer

interações entre estas patologias, o que dificulta o diagnóstico e interfere na patogênese das

doenças relatadas. Conhecendo as graves consequências da deficiência de ferro, intoxicação

por chumbo e hemoglobinopatias, em crianças, este trabalho objetivou, principalmente,

analisar as diferentes causas que contribuem para o desenvolvimento de anemias

hipocrômicas microcíticas e discutir o diagnóstico laboratorial destas patologias. Com base

nos resultados, pretendemos ainda destacar a importância da investigação das

hemoglobinopatias para o aconselhamento genético e planejamento familiar.

2. OBJETIVOS

----------------------------------------------------------- Objetivos------------------------------------------------------------25

Geral:

Estudar um grupo de crianças de escolas públicas de Ribeirão Preto- SP, identificando

os fatores que contribuem para o desenvolvimento de anemias hipocrômicas microcíticas e

estabelecer relações entre as características laboratoriais das doenças.

Específicos:

1. verificar a ocorrência de anemia hipocrômica microcítica, pela avaliação dos

parâmetros hematológicos;

2. identificar os portadores de deficiência de ferro e anemia por deficiência de ferro, pela

avaliação do status férrico;

3. avaliar a concentração plasmática de chumbo;

4. relacionar o plumbismo com polimorfismo genético da enzima ácido δ-

aminolevulínico desidratase;

5. avaliar a prevalência das α e β talassemias utilizando testes laboratoriais

convencionais e confirmatórios, a saber, eletroforese de hemoglobina, quantificação das

frações de hemoglobina por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e análise da

deleção mais frequente que causa α talassemias (-α3,7) por biologia molecular;

6. verificar a ocorrência da coexistência de patologias e as dificuldades no diagnóstico

laboratorial.

3. CASUÍSTICA E MÉTODOS

----------------------------------------------------Casuística e Métodos-----------------------------------------------------27

A equipe responsável pelo desenvolvimento desta pesquisa foi composta pelas Profas.

Dras. Ana Maria de Souza (orientadora) e Fabíola Attié de Castro, pelo Prof. Dr. Fernando

Barbosa Jr, pela doutoranda Cristiane Fernandes de Freitas Tavares, todos do Departamento

de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas da Faculdade Ciências Farmacêuticas

de Ribeirão Preto-USP, e pela Profa. Dra. Raquel Fernanda Gerlach do Departamento de

Morfologia, Estomatologia e Fisiologia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto-USP.

Participaram do projeto 427 crianças, de 6 a 9 anos de idade, de ambos os sexos, de

escolas estaduais e municipais na cidade de Ribeirão Preto-SP, a saber: Centro Municipal de

Educação Infantil Virgílio Salata (Alto do Ipiranga), Escola Municipal de Educação Antônio

Diederichsen (Campos Elíseos); Escola Dr. Tomas Alberto Whatelly (Campos Elíseos),

Escola de Educação Dom Luis Amaral Mousinho (Campos Elíseos), Escola Estadual Dom

Alberto José Gonçalves (Campos Elíseos).

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de

Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (processo n. 2006.1.797.58.5,

Anexo A) e obteve o apoio da Secretaria Municipal de Saúde. Os participantes se integraram

ao projeto após consentimento prévio endossado por seu responsável (Anexo B). Todos os

participantes do estudo receberam os resultados dos exames laboratoriais realizados.

3.1 Características do local do estudo

A pesquisa foi desenvolvida nos bairros Campos Elíseos e Ipiranga da cidade de

Ribeirão Preto, situada ao nordeste do Estado de São Paulo, a 313 km da Capital.

Ribeirão Preto foi cenário da expansão cafeeira no século XIX, com núcleos coloniais

que abrigavam imigrantes para a mão de obra nos cafezais. Este cenário coincidiu com a crise

agrária italiana, o que colaborou para que a maioria das imigrações fosse de origem italiana,

mas outras nacionalidades vieram para esses núcleos, como portugueses, espanhóis, franceses

e alemães. A expansão cafeeira provocou um grande crescimento populacional; em 1874, a

população era em torno de 5.552 pessoas passando para 10.420 no ano de 1886 (SILVA,

1976).

O núcleo colonial localizado em Ribeirão Preto, chamado “Antônio Prado”, se

encontrava na várzea do ribeirão Preto e do córrego Retiro, ladeando a estrada de ferro

----------------------------------------------------Casuística e Métodos-----------------------------------------------------28

Mogiana. Este núcleo proporcionou os primeiros centros urbanos com ruas e residências, o

qual deu origem aos bairros “Barracão de Baixo” e “Barracão de Cima”, assim chamados

devido sua localização em relação à ferrovia; os nomes dos bairros foram alterados, na década

de 1960, para Campos Elíseos e Ipiranga, respectivamente (SILVA, 2006).

A expansão dos centros urbanos, no final do século XIX e início do século XX,

contribuíram para a diversificação das atividades agrícolas, comerciais e industriais, além da

criação do “Código de Postura” ou “Posturas Municipais”. Começou então a delinear os

contornos da nova geografia social da cidade, ou seja, a população mais luxuosa se localizava

na área central e região sul e a população mais pobre nas periferias (região norte). No início

do século XX, havia aproximadamente 60 mil habitantes em Ribeirão Preto, sendo 80% de

origem italiana (SILVA, 2006).

No ano de 1980, com a veiculação na mídia de notícias sobre a renda per capita de

Ribeirão Preto, que passou a ser conhecida como “Califórnia Brasileira”, houve uma

migração de trabalhadores não-especializados de todo o país para nossa região,

principalmente da população nordestina, aumentando a miscigenação e elevando a pobreza

(SILVA, 2004).

Os bairros Campos Elíseos e Ipiranga estão localizados na região norte e oeste da cidade

de Ribeirão Preto, respectivamente. Estes bairros fazem parte do início da colonização de

Ribeirão Preto, participando e refletindo a miscigenação da cidade. Hoje apresentam

características sócio-econômicas de níveis C e D, respectivamente.

3.2 Coleta de sangue

A coleta do material biológico foi realizada nas próprias escolas, pela manhã, com jejum

de 8 horas, por um profissional com reconhecida prática, de maneira a garantir uma punção

venosa o menos traumática possível. Imediatamente após a coleta, o material foi transportado

em recipiente apropriado para o Laboratório de Hematologia da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP.

Foram coletados, por punção das veias da fossa cubital, dez mililitros (mL) de sangue,

distribuídos em três tubos: um contendo etileno diamino tetracetato de potássio (EDTA K2)

10%, que foi utilizado na avaliação hematológica, eletroforese de hemoglobina, quantificação

----------------------------------------------------Casuística e Métodos-----------------------------------------------------29

das frações de hemoglobina por HPLC e extração do material genético; outro isento de

anticoagulante destinado à obtenção de soro, utilizado nas determinações dos níveis de

ferritina e receptores de transferrina; e o último com heparina (5.000 UI/mL) utilizado para

dosagem do chumbo plasmático.

3.2.1 Coleta de sangue das crianças participantes do projeto

Os profissionais da saúde que realizaram a coleta de sangue não se preocuparam apenas

com os cuidados físicos, mas também com as necessidades emocionais das crianças

participantes do projeto. Foram utilizadas técnicas adequadas de comunicação e de

confiabilidade, como o ato de presentear as crianças participantes da coleta de sangue, com

brinquedos, bexigas decorativas e balas. A utilização desses materiais e técnicas estimulou

mais a socialização das crianças com os profissionais da saúde e as incentivou a participarem

da coleta de sangue de forma mais positiva, diminuindo a tensão emocional durante o

procedimento.

3.2.2 Coleta de sangue dos pais e/ou irmãos das crianças participantes do projeto

Treze pais e dois irmãos participaram do projeto com a finalidade de confirmar os

resultados de crianças que apresentaram a presença de Hb S e o aumento da Hb A2, sugestivo

da hemoglobinopatia HbS/β-talassemia. Primeiro os familiares foram esclarecidos sobre a

importância de sua participação no projeto e do procedimento a ser realizado. A coleta do

material biológico foi agendada previamente e realizada no domicílio dos participantes. O

contato direto com as famílias demonstrou a atenção e responsabilidade deste projeto de

pesquisa para com as crianças e proporcionou a explicação, de forma mais clara, das

patologias investigadas. Foram colhidos cinco mililitros (mL) de sangue, dispensado em tubo

contendo etileno diamino tetracetato de potássio (EDTA K2) 10%, que foi utilizado na

identificação e quantificação das frações de hemoglobina por cromatografia líquida de alta

pressão (HPLC).

----------------------------------------------------Casuística e Métodos-----------------------------------------------------30

3.3 Avaliação hematológica

3.3.1 Hemograma completo

A avaliação do perfil hematológico foi realizada pela determinação do número global de

eritrócitos e leucócitos, concentração de hemoglobina, valor do hematócrito, índices

hematimétricos (volume corpuscular médio, hemoglobina corpuscular médio e concentração

de hemoglobina corpuscular médio) e distribuição da amplitude das células vermelhas

(RDW), utilizando o contador automático Micros 45 – Horiba ABX®, França. O estudo da

morfologia eritrocitária e contagem específica de leucócitos foram realizados por observação

de extensão sanguínea corada por Leishman, por microscopia óptica, usando o microscópio

binocular – Carl Zeiss Jenamed 2®.

3.3.2 Detecção qualitativa e quantitativa das hemoglobinopatias por cromatografia

líquida de alta pressão (HPLC)

A determinação e quantificação das hemoglobinas normais e variantes foram realizadas

pelo sistema automatizado Variant II Bio-Rad®, USA, pertencente ao Laboratório de

Hemoglobinopatias do Centro Regional de Hemoterapia da FMRP-USP (Hemocentro -

Ribeirão Preto), que gentilmente permitiu seu uso. Foi utilizado o kit “β-talassemia Short

Program”, pelo qual se procede a separação e quantificação das hemoglobinas A2 e F. Este

método também permite a identificação das hemoglobinas anormais (variantes) pelo método

de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), associada à cromatografia de troca iônica.

Os dados das análises são apresentados em um cromatograma, de acordo com o tempo

transcorrido entre a injeção da amostra até o ápice do pico da hemoglobina, referido como

tempo de retenção de cada hemoglobina (Figura 6).

----------------------------------------------------Casuística e Métodos-----------------------------------------------------31

A B

Figura 6 – Exemplos de cromatograma. A: perfil de um participante sem hemoglobinopatia (fenótipo AA); B: perfil de um participante com traço falciforme (fenótipo AS).

3.3.3 Detecção qualitativa das hemoglobinopatias por eletroforese em acetato de celulose

em pH alcalino (pH 8,6)

Para a obtenção da solução de hemoglobina as amostras foram submetidas a hemólise. O

hemolisado foi aplicado na extremidade da fita de acetato de celulose (polo negativo), em

contato com a solução tampão Tris-EDTA-Borato pH 8,6 (0,025M) na cuba de eletroforese,

submetida a 200 Volts, por 40 minutos. As frações de Hb foram analisadas durante os cinco

primeiros minutos para observar a presença ou não da Hb H. As demais frações foram

observadas ao término do procedimento, primeiramente, sem coloração e, posteriormente

coradas com Ponceau S (NAOUM, 1999).

3.3.4 Detecção quantitativa de Hb A2 por eletroforese em acetato de celulose em pH

alcalino (pH 8,6)

Vinte µL de hemolisado foi aplicado na extremidade da fita de acetato de celulose (polo

negativo), em contato com a solução tampão Tris-EDTA-borato pH 8,6 (0,025M), na cuba de

eletroforese, submetida a 300 Volts, por uma hora. Após o fracionamento, as hemoglobinas A

----------------------------------------------------Casuística e Métodos-----------------------------------------------------32

e A2 foram separadas e eluídas em tubos contendo água destilada, na quantidade de 3 mL para

a Hb A2 e 9 mL para a Hb A. Após 2 horas de eluição, em temperatura ambiente, as

absorbâncias das amostras foram obtidas no espectrofotômetro digital B-342 II - Micronal®,

em comprimento de onda de 410 nm. A porcentagem de Hb A2 foi calculada pela fórmula:

% Hb A2 = DO. A2 X 100 / DO. A X 3 + DO. A2

3.4 Avaliação do status férrico

3.4.1 Ferritina sérica

Os níveis séricos de ferritina foram determinados pelo método de

Imunoquimioluminescência, utilizando o kit Ferritin Immulite – DPC® e o equipamento

Immulite 1 - DPC®, England, de acordo com as recomendações do fabricante.

3.4.2 Receptor solúvel de transferrina (sTfR)

Os níveis do receptor solúvel de transferrina foram determinados por ensaio

imunoenzimático, utilizando o kit Quantikine soluble transferrin receptor da R&D Systems®,

Minneapolis – EUA e o aparelho com leitor de microplacas de ELISA READER 210, acoplado a

lavadora de placas WASHER 200, modelo Microwell System Organon Teknika®, Áustria.

3.4.3 Índice sTfR/log ferritina

O índice sTfR/log ferritina foi calculado dividindo os níveis do receptor solúvel de

transferrina (sTfR) pelo logaritmo da concentração de ferritina sérica.

3.5 Chumbo plasmático

A determinação dos níveis plasmáticos de chumbo esteve sob a responsabilidade do

Prof. Dr. Fernando Barbosa Jr. Foi realizada em amostra de sangue total anticoagulado com

heparina, centrifugada a 2000rpm, durante 15 minutos, para a obtenção do plasma. Toda

vidraria utilizada na análise foi tratada previamente com ácido nítrico 10% para evitar

----------------------------------------------------Casuística e Métodos-----------------------------------------------------33

possíveis contaminações por metais. Utilizou-se o espectrômetro de massa com plasma

indutivamente acoplado (ICPMS) VG Plasmaquad PQII® (VG Elemental, Winsford,

Chesshire, UK) e nebulizador Microneb 2000 com injeção direta (CETAC Technologies,

Omaha, USA).

3.6 Análise molecular da principal deleção da α-talassemia (-α3,7)

3.6.1 Extração e quantificação do DNA genômico

Para a detecção da deleção –α3.7, o DNA genômico foi extraído a partir de sangue total

anticoagulado com EDTA 10%, sendo primeiro lisado os eritrócitos pelo método de

SALAZAR et al., 1998. Os pellets foram armazenados a -200C até o momento da realização

do ensaio de reação em cadeia de polimerase (PCR). A extração do DNA foi baseada na

adição de proteinase K e precipitação do material genético por cloreto de sódio 5M.

A estimativa da concentração do DNA foi realizada através de espectrofotômetro

(BioPhotometer, Eppendorf®), medindo-se a absorbância em 260 e 280 nm e calculando a

razão entre as leituras (A260/A280). As amostras de DNA, cujos valores variaram entre 1,5 a

2,0, foram submetidas a PCR.

3.6.2 Amplificação do DNA genômico e identificação da deleção –α3.7

O DNA foi amplificado pela técnica da PCR, com a utilização de primers específicos

(DODÉ et al., 1992): 5’ CCA TGC CTG GCA CGT TTG CTG AGG 3’(C9); 5’ GAT GCA

CCC ACT GGA CTC CT 3’ (C10). Foram adicionados 3 µL do DNA genômico em um

volume final de 23 µL da suspensão para o PCR: água mili-Q; Buffer 10X (pH 8,5); DMSO;

mix dNTP (10mM); os 2 primers (100nM); 5U de Taq polimerase (Invitrogen). A reação de

PCR foi processada em termociclador (Mastercycle Eppendorf), sendo realizado 30 ciclos de

940C/2min., 560C/1min., 720C/2min., precedida por um passo de desnaturação inicial a

940C/5 min., e seguida de um passo de extensão final a 720C/10min (adaptado de DODÉ et

al., 1992). Foi aplicado 2 µL de loading buffer para cada 10 µL do material amplificado. A

mistura foi submetida à eletroforese horizontal em gel de agarose 1% com brometo de etídio,

com um tempo de corrida de 1 hora e 20 minutos a 90 volts, 220 mÅ. Em seguida, o gel foi

exposto à luz ultravioleta para a visualização das bandas presentes.

----------------------------------------------------Casuística e Métodos-----------------------------------------------------34

3.7 Análise molecular dos polimorfismos da enzima ácido σ-aminolevulínico desidratase

(ALAD)

A análise dos polimorfismos esteve sob a responsabilidade da Profa. Dra. Raquel

Fernanda Gerlach, a qual foi realizada em células epiteliais da boca colhida através de

bochecho com solução de dextrose a 3%. O DNA foi extraído utilizando Acetato de Amônio

e, fragmentos específicos contendo o polimorfismo genético da ALAD (JAFFE et al., 2000;

KAMEL et al., 2003) sendo amplificados, por meio da reação de PCR. Os produtos

amplificados foram submetidos à ação de enzimas de restrição específicas, e os fragmentos

gerados analisados e submetidos à análise estatística pelo teste Odds Ratio.

3.8 Divisão dos grupos de estudo

Após a análise dos resultados hematológicos, status férrico, análises moleculares da

deleção de α-talassemia (-α3.7) e dos polimorfismos da ALAD, os participantes foram

divididos em 4 grupos, seguindo os seguintes critérios:

a) grupo controle – participantes, não anêmicos, com concentração de hemoglobina

igual ou acima de 12,0 g/dL, sem alterações significativas na morfologia celular, ferritina

sérica acima de 40 ng/mL, chumbo plasmático abaixo de 10 µg/dL e sem apresentar

hemoglobinopatias;

b) grupo com deficiência de ferro – participantes, não anêmicos, com concentração de

hemoglobina igual ou acima de 11,5 g/dL, ferritina sérica abaixo de 30 ng/mL, chumbo

plasmático abaixo de 10 µg/dL, receptor solúvel de transferrina acima de 30,8 nmol/L e índice

sTfR/log de ferritina acima de 23,9 nmol/L;

c) grupo com anemia por deficiência de ferro – participantes anêmicos, com

concentração de hemoglobina abaixo de 11,5 g/dL, ferritina sérica abaixo de 30 ng/mL,

chumbo plasmático abaixo de 10 µg/dL, receptor solúvel de transferrina acima de 30,8

nmol/L e índice sTfR/log de ferritina acima de 23,9 nmol/L;

d) grupo com hemoglobinopatias – participantes que apresentaram alterações

qualitativas ou quantitativas de hemoglobina, detectadas pelas análises das eletroforeses de

hemoglobina, HPLC e PCR.

----------------------------------------------------Casuística e Métodos-----------------------------------------------------35

3.9 Análise estatística

Foram aplicados os testes não paramétricos de Kruskal-Wallis, seguido do teste de

Dunns de comparação múltipla ou o teste de Mann-Whitney. As diferenças foram

consideradas estatisticamente significantes quando p<0,05. Na realização dos testes utilizou-

se o programa GraphPad, Software Incorporated, Prism, versão 2.0.

As Figuras 7 e 8 sumarizam os experimentos realizados na pesquisa.

Figura 7 - Fluxograma dos procedimentos laboratoriais realizados na pesquisa.

427 participantes – 6 a 9 anos

10 mL de sangue venoso

7 mL de sangue total 3 mL para soro

EDTA

Hemograma completo;

Eletroforese de hemoglobina;

Quantificações das frações de hemoglobina;

Extração do DNA para análise da deleção de α-talassemia (α-3.7);

Heparina

Chumbo plasmático.

Ferritina sérica;

Receptor solúvel de transferrina (sTfR).

Cálculo do índice sTfR/log de ferritina

......

----------------------------------------------------Casuística e Métodos-----------------------------------------------------36

Figura 8 - Fluxograma das análises moleculares realizadas na pesquisa.

427 participantes – 6 a 9 anos

Extração do DNA genômico

Células epiteliais da boca – bochecho com solução de dextrose a 3%

Leucócitos do sangue periférico

Análise do polimorfismo da enzima ácido δ-aminolevulínico desidratase (ALAD)

Análise da principal deleção da α-talassemia (α-3.7)

......

n = 217 n = 217

4. RESULTADOS

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------38

Participaram deste estudo 427 crianças, alunos de Escolas Municipais e Estaduais da

cidade de Ribeirão Preto (SP), com idade entre 6 a 9 anos, sendo 235 (55%) do sexo feminino

e 192 (45%) do sexo masculino (Figura 9). Não houve diferença estatística significativa na

distribuição das crianças analisadas em relação ao sexo.

feminino masculino0

50

100

150

200

250

sexo

cria

nças

Figura 9 - Distribuição das crianças estudadas, em relação ao sexo. Teste de Mann

Whitney, p > 0,05.

Na população estudada, foram selecionadas 55 crianças que, por apresentarem todos os

parâmetros analisados dentro de valores normais, constituíram o grupo controle. Os resultados

hematológicos do grupo controle se encontram no Apêndice A.

4.1 Classificação morfológica das anemias

A ocorrência de anemia foi analisada utilizando como critério o valor de referência de

concentração de hemoglobina (Hb) recomendado pela OMS, para definir anemia, a saber, em

crianças menores de 12 anos de idade, de ambos os sexos, Hb menor que 11,5 g/dL. Das

crianças analisadas, 75 (17,6%) eram anêmicas e 352 (82,4%) não-anêmicas. A média da Hb

das crianças anêmicas foi de 10,8 ± 0,50 g/dL, enquanto a média das não anêmicas foi de 12,2

± 0,64 g/dL (Tabela 1, Figura 10). Houve diferença significativa entre os parâmetros

hemoglobina, VCM, HCM, CHCM, RDW (p < 0,001).

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------39

Tabela 1 - Média dos parâmetros hematológicos dos grupos anêmicos e não-anêmicos.

Grupos

(nº casos / %)

Hb (g/dL) X ± σ

VCM (fL)

X ± σ

HCM (pg)

X ± σ

CHCM (g/dL) X ± σ

RDW (%)

X ± σ Anêmicos

(n =75 / 17,6%)

10,8 ± 0,50

80,3 ± 6,58

24,3 ± 2,43

30,2 ± 1,27

14,1 ± 1,31

Não-anêmicos (n = 352 / 82,4%)

12,2 ± 0,64

84,4 ± 3,15

26,4 ± 1,36

31,3 ± 1,01

13,3 ± 0,66

X ± σ = média ± desvio padrão

anêmicas não anêmicas9.09.5

10.010.511.011.512.012.513.013.514.014.515.015.5

Grupos

Hb

(g

/d

L)

Figura 10 - Distribuição das concentrações de hemoglobina nos grupos anêmicos e não-anêmicos. Teste Mann Whitney, ***p < 0,001.

Hb - hemoglobina

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------40

A classificação morfológica das anemias foi feita com base nos valores dos índices

hematimétricos (VCM, HCM, CHCM), na distribuição da amplitude das células vermelhas

(RDW) e na análise das extensões sanguíneas coradas com Leishman. Dentre as anemias, 33

(44,0%) foram classificados como hipocrômicas normocíticas, 28 (37,3 %) como

normocrômicas normocíticas, 7 (9,4%) como hipocrômicas microcíticas, com valor de RDW

dentro dos limites de normalidade, e 7 (9,4%) como hipocrômicas microcíticas, com RDW

aumentado.

4.2 Classificação etiológica das anemias

Das 75 crianças anêmicas, 33 (44%) eram portadoras de algum tipo de

hemoglobinopatia, 29 (38,6%) apresentavam anemias de causa desconhecida, sendo dois

casos com leucograma sugestivo de infecção e 13 (17,4%) com anemia por deficiência de

ferro.

4.2.1 Hemoglobinopatias

Os resultados das eletroforeses de hemoglobina, em acetato de celulose e em agarose, e

da cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) de 427 crianças estudadas apontaram a

presença de 47 (11%) crianças com hemoglobinopatias (Apêndice B), sendo: 17 com aumento

de Hb F; 14 com aumento da Hb A2, compatível com o fenótipo de β-talassemia; 11 com

aumento de Hb A2 e presença de Hb S, compatível com o fenótipo Hb S/β-talassemia; 4 com

presença de Hb AS, sugestivo de traço falcêmico e 1 com presença da Hb AC, sugestivo de

heterozigose para a doença da Hb C (Tabela 2, Figura 11).

A Hb F média dos 17 (4%) casos que apresentaram aumento desta fração foi de 3,0 ±

1,78% (1,2 – 7,8).

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------41

Tabela 2 - Distribuição das hemoglobinopatias na população estudada, realizada pelas metodologias de eletroforese e HPLC.

Hemoglobinopatias Nº de casos e Índice

percentual no total de participantes

Nº de casos e Índice percentual nas 47 crianças

com hemoglobinopatias

Hb F ↑ 17 / 4% 17 / 34%

β-talassemia 14 / 3,3% 14 / 29,7%

Hb S/ Hb A2 ↑ 11 / 2,6% 11 / 25,5%

Hb AS 04 / 0,94% 04 / 8,5%

Hb AC 01 / 0,24% 01 / 2,1%

4

11

17

1

14 HbASHbS/HbA2↑HbF↑HbACβ-talassemia

Figura 11 - Distribuição dos 47 casos de hemoglobinopatias na população estudada, segundo as metodologias de eletroforese e HPLC.

A determinação dos níveis de Hb A2 dos 11 participantes com suspeita de Hb S/β-

talassemia foi realizada por HPLC e por eluição das frações obtidas em eletroforese em

acetato de celulose. As medianas dos níveis de Hb A2, determinadas por HPLC e por eluição

foram 6,3% (±1,1) e 7,0% (±1,6), respectivamente. Não foram observadas diferenças

significativas nos níveis de Hb A2 aferidos pelos dois métodos (Figura 12). Para confirmação

da suspeita de ocorrência Hb S/β-talassemia, realizou-se a pesquisa de alterações quantitativas

e qualitativas das frações de hemoglobina nos pais e/ou irmãos, pelo método de HPLC

(Tabela 3).

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------42

Acetato de celulose HPLC3.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.5

Métodos

Do

sag

em

de H

bA

2 (

%)

Figura 12 - Níveis de Hb A2 determinados por eletroforese em acetato de celulose e HPLC nos participantes com suspeita de Hb S/β-talassemia. Teste de Mann Whitney, p > 0,05.

HPLC – cromatografia líquida de alta pressão

Tabela 3 - Pesquisa de alterações quantitativas e qualitativas das frações de hemoglobina dos pais ou irmãos das crianças com suspeita de Hb S/β-talassemia, realizada pela metodologia de HPLC.

Crianças Mãe Pai Criança nº 43

A (63%) + S (28,7%) + A2 (8,3%) A (55,3%) + S (41,2%) + A2 (3,5%) A (97,1%) + A2 (2,9%)

Criança nº 107 Mãe Pai A (56,5%) + S (40,0%) +

A (63,8%) + S (29,5%) + A2 (6,8%) A (97,0%) + A2 (3,0%) A2 (3,5%)

Criança nº 118 Mãe Pai A (61,2%) + S (35,4%) +

A (62,1%) + S (31,4%) + A2 (6,5%) A (97,2%) + A2 (2,8%) A2 (3,4%)

Criança nº 162 Mãe Pai A (62,4%) + S (30,4%) + A2 (7,2%) A (56,6%) + S (40,0%) + A2 (3,4%) A (96,8%) + A2 (3,2%)

Criança nº 171 Mãe Pai

A (55,8%) + S (40,7%) + A (62,9%) + S (29,4%) + A2 (7,7%) A (97,2%) + A2 (2,8%) A2 (3,5%)

Criança nº 194 Mãe Pai

A (61,6%) + S (29,8%) + A2 (8,6%) A (58,6%) + S (37,9%) + A2 (3,5%) A (97,0%) + A2 (3,0%)

Criança nº 219 Mãe Irmã

A (61,8%) + S (31,5%) + A2 (6,7%) A (97,3%) + A2 (2,7%)

A (97,2%) + A2 (2,8%) Irmão

A (56,5%) + S (40,1%) + A2 (3,4%)

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------43

A análise da deleção mais frequente da α talassemias (-α3,7) foi realizada, em 207

participantes do estudo, por biologia molecular (PCR). Verificou-se a presença de 26 (12,6%)

crianças portadoras da deleção -α3,7, sendo 24 heterozigotas e 2 homozigotas. Exemplos de

resultados das análises são mostrados na Figura 13.

Assim 71 crianças, 16,6% das crianças estudadas, apresentaram alguma alteração

qualitativa ou quantitativa das cadeias globínicas (Tabela 4, Figura 14).

Figura 13 – Exemplos de análises da deleção -α3.7 por PCR. As amostras 1,4 e 6 apresentam genótipos normais; as amostras 2 e 5 são heterozigotas para a deleção e as 3 e 7 são homozigotas.

M – marcador (λ Hind III)

2.1kb ----- 1.9kb -----

M 1 2 3 4 5 6 7

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------44

Tabela 4 – Distribuição das hemoglobinopatias na população estudada, segundo as metodologias de eletroforese, HPLC e PCR.

Hemoglobinopatias Nº de casos e Índice

percentual no total de participantes

α-talassemia 24 / 11,6%

Hb F ↑ 17 / 4%

Hb AS 15 / 3,5%

β-talassemia 12 / 2,8%

α/β-talassemia 02 / 0,96%

Hb AC 01 / 0,24%

15

2

17112

24HbASα/β-talassemiaHbF↑HbACβ-talassemiaα-talassemia

Figura 14 - Distribuição dos 71 casos de hemoglobinopatias na população estudada, segundo as metodologias de eletroforese , HPLC e PCR.

Dentre os portadores de hemoglobinopatias, 33 (46,4%) eram anêmicos, segundo os

critérios da OMS, sendo: 5 com hipocromia e microcitose, sem alteração de RDW (1 com Hb

F aumentada e 4 com α-talassemia); 5 com hipocromia e microcitose e RDW aumentado (1

com Hb F aumentada, 2 com α-talassemia e 2 com β-talassemia); 12 com hipocromia e

normocitose (1 com α/β-talassêmico, 2 Hb AS, 1 com Hb F aumentada e 8 com α-talassemia)

e 10 apresentando normocromia e normocitose (3 com aumento de HbF, 2 Hb AS, 1 com β-

talassemia e 4 α-talassêmico). Destes, 11 (36,6%) apresentaram, na análise das extensões

sanguíneas, poiquilocitoses, outra característica das hemoglobinopatias.

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------45

Os demais (55%) não apresentaram anemia, sendo que 8 apresentaram discreta

hipocromia (1 com α/β-talassemia, 1 Hb AS, 2 Hb F aumentada e 4 α-talassemia) e 31 sem

alterações significativas no eritrograma (Tabela 5, Apêndice C).

Tabela 5 - Análise morfológica dos portadores de hemoglobinopatias

Morfologia ______________

nºcasos

Hipocromia Microcitose

Hipocromia Normocitose

Normocromia Normocitose

Hipocromia

Sem alterações

α-talassemia (n = 24) 6 8 4 4 2

Hb F ↑ (n = 17) 2 1 3 2 9

Hb AS (n = 15) _____ 2 2 1 10

β-talassemia (n = 12) 2 _____ 1 _____ 9

α/β-talassemia (n = 2) _____ 1 _____ 1 _____

Hb AC (n = 1) _____ 1 _____ _____ _____

4.2.2 Deficiência de ferro

A Tabela 6 apresenta os resultados do status férrico de 16 crianças pertencentes ao

grupo controle e das crianças portadoras de hemoglobinopatias, DF ou ADF. As

significâncias estatísticas estão representadas nas Figuras 21 a 23.

Tabela 6 - Status férrico dos grupos estudados.

Grupos (nº casos / %)

Ferritina X ± σ

sTfR X ± σ

sTfR/log ferritina X ± σ

Controle (n = 16)

66,7 (±12,64)

24,7 (±6,26)

13,7 (±3,88)

Hbpatias (n = 73)

52,2 (±23,6)

33,7 (±4,83)

20,6 (±5,36)

DF (n = 26)

18,8 (±5,42)

36,7 (±7,0)

29,6 (±7,9)

ADF (n = 13)

18,3 (±6,19)

33,7 (±3,24)

28,2 (±7,5)

X ± σ = média ± desvio padrão; Hbpatias - hemoglobinopatias

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------46

Para definir deficiência de ferro utilizamos como critério níveis séricos de ferritina menores que 30 ng/mL (DIMITRIOU et al., 2000). Foram observados 55 (12,9%) participantes com níveis inferiores ao valor de referência estabelecido (Apêndice D). Os valores médios de ferritina neste grupo foram 20,0 ± 5,7 ng/mL.

A determinação dos níveis de receptor de transferrina solúvel (sTfR) e o cálculo do índice sTfR/log ferritina foram utilizados para confirmar o diagnóstico de deficiência de ferro (DF) e de anemia por deficiência de ferro (ADF). Como critério de normalidade, estabeleceu-se que os níveis de sTfR deveriam ser inferiores a 30,8 nmol/L e o índice sTfR/log ferritina inferior a 23,9 (DIMITRIOU et al., 2000). Foram diagnosticados 26 (47,3%) casos de DF e 13 (23,6%) de ADF, com valor médio de sTfR 36,7 e 33,7 nmol/L respectivamente (Figura 15). Dezesseis crianças (29,1%) apresentaram diminuição apenas nos níveis séricos de ferritina, o que caracteriza o estado de depleção de ferro. Dentre os participantes com DF e ADF, 20 deles (51,2%) apresentaram níveis de ferritina superior ao valor preconizado pela OMS (cut off de 15 ng/mL).

Na Figura 16, está representada a distribuição dos valores do índice sTfR/log ferritina, nos grupos DF e ADF, com valores médios de 29,6 e 28,2, respectivamente (Apêndice E). Não houve diferença estatisticamente significativa dos valores de sTfR e do índice sTfR/log ferritina nos grupos com DF e ADF (p= 0,18 e p= 0,45, respectivamente).

No grupo ADF (n=13), 07 apresentaram anemia normocrômica normocítica, 01 anemia hipocrômica microcítica com RDW aumentado, 01 anemia hipocrômica microcítica e RDW dentro da normalidade e 04 com anemia hipocrômica normocítica (Apêndice F).

DF ADF20

30

40

50

60

Grupos

sTfR

(nm

ol/L

)

Figura 15 - Níveis séricos de receptores de transferrina nas crianças com deficiência de ferro. Teste de Mann Whitney, p > 0,05.

sTfR – receptor de transferrina solúvel (V.R: > 30,8) ; DF – deficiência de ferro; ADF – anemia por deficiência de ferro.

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------47

DF ADF20

25

30

35

40

45

50

55

Grupos

sTfR

-F

Figura 16 - Valores do índice receptores de transferrina/ log ferritina nas crianças com deficiência de ferro. Teste de Mann Whitney, p > 0,05.

sTfR-F – receptor de transferrina solúvel/log da ferritina (VR: < 23,9 nmol/L); DF – deficiência de ferro; ADF – anemia por deficiência de ferro.

4.2.3 Chumbo

Todas as crianças estudadas apresentaram níveis plasmáticos de chumbo plasmático

inferiores a 10 ug/dL. Não houve diferença estatisticamente significativa nos valores de Pb

sanguíneo (ug/dL) entre os grupos estudados (p > 0,05) (Figura 17). A média dos valores de

Pb sanguíneo foi de 2,5 ug/dL para os grupos controle e hemoglobinopatias e 2,3 ug/dL para o

grupo DF e ADF.

A análise dos polimorfismos da ALAD-1 (ALAD 1-1 e ALAD 1-2), em 290

participantes do projeto, mostrou que 248 (85,5%) apresentaram o polimorfismo ALAD 1-1 e

42 (14,5%) o polimorfismo ALAD 1-2.

Não houve correlação entre os polimorfismos da enzima ácido δ aminolevulínico

desidratase (ALAD 1-1 e ALAD 1-2) com os níveis plasmáticos de chumbo (p = 0,05), no

grupo com DF (Figura 18).

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------48

Controle Hbpatias DF ADF012345678

Grupos

Pb (u

g/dL

)

Figura 17 - Comparação dos níveis plasmáticos de chumbo nos grupos estudados. Teste de Kruskal-Wallis, p > 0,05.

Hbpatias - hemoglobinopatias; DF – deficiência de ferro; ADF – anemia por deficiência de ferro; Pb – chumbo.

ALAD 1-1 ALAD 1-20.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5

Polimorfismo ALAD

Pb (u

g/dL

)

Figura 18 - Correlação entre os níveis plasmáticos de chumbo e os polimorfismos da ALAD. Teste de Mann Whitney, p > 0,05.

ALAD - ácido δ aminolevulínico desidratase.

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------49

4.3 Correlações entre os grupos estudados

Houve diferença significativa nos níveis de Hb (g/dL) entre os grupos controle e

hemoglobinopatias (p < 0,001), controle e ADF (p < 0,001), controle e DF (p < 0,05),

hemoglobinopatias e DF (p < 0,05), DF e ADF (p < 0,001) (Figura 19).

Controle Hbpatias DF ADF9.09.5

10.010.511.011.512.012.513.013.514.014.5 ***

*** **

***

Grupos

Hb

(g/d

L)

Figura 19 - Comparação dos níveis de hemoglobina nos grupos estudados. Teste de Kruskal Wallis, *p < 0,05 e ***p < 0,001.

Hbpatias - hemoglobinopatias; DF – deficiência de ferro; ADF – anemia por deficiência de ferro.

Observou-se diferença significativa nos valores de RDW (%) entre os grupos controle e

hemoglobinopatias (p < 0,001), controle e ADF (p < 0,05) e hemoglobinopatias e DF (p <

0,05) (Figura 20). Os resultados hematológicos dos grupos DF e ADF se encontram nos

Apêndices G e F, respectivamente.

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------50

Controle Hbpatias DF ADF11

12

13

14

15

16

17*

*** *

Grupos

RD

W (%

)

Figura 20 - Comparação dos valores de RDW nos grupos estudados. Teste de Kruskal Wallis, *p < 0,05 e ***p < 0,001.

Hbpatias - hemoglobinopatias; DF – deficiência de ferro; ADF – anemia por deficiência de ferro; RDW – distribuição da amplitude das células vermelhas.

Houve diferença estatística significante nos níveis séricos de ferritina (ng/mL) entre os

grupos controle e ADF (p < 0,001), controle e DF (p < 0,001), hemoglobinopatias e DF (p <

0,001), hemoglobinopatia e ADF (p < 0,001) (Figura 21).

Em relação aos níveis de sTfR (nmol/L), foram observadas diferenças significativas

entre os grupos controle e ADF (p < 0,001), controle e DF (p < 0,001), controle e alfa-

talassêmicos (p < 0,001), controle e TT-β (p < 0,001), alfa-talassêmicos e DF (p < 0,05)

(Figura 22).

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------51

Controle Hbpatias DF ADF0

102030405060708090

100110120130

*** ****** ***

Grupos

Ferr

itin

a (n

g/m

L)

Figura 21 - Comparação dos níveis de ferritina sérica nos grupos estudados. Teste de Kruskal Wallis, ***p < 0,001.

Hbpatias - hemoglobinopatias; DF – deficiência de ferro; ADF – anemia por deficiência de ferro.

controle TT-β T- α DF ADF0

10

20

30

40

50

60***

***

******

*

Grupos

sTfR

(nm

ol/L

)

Figura 22 - Comparação dos níveis de receptores de transferrina nos grupos estudados. Teste de Kruskal Wallis, *p < 0,05 e ***p < 0,001.

DF – deficiência de ferro; ADF – anemia por deficiência de ferro; sTfR – receptor de transferrina solúvel; TT-β - traço β-talassêmico; T-α - alfa-talassemia.

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------52

Foram observadas diferenças significativas nos valores do índice de sTfR/log ferritina

entre os grupos controle e ADF (p < 0,001), controle e DF (p < 0,001), controle e TT-β (p <

0,01), TT-β e DF (p < 0,05), alfa-talassêmicos e ADF (p < 0,001), alfa-talassêmicos e DF (p <

0,001) (Figura 23).

Controle TT-β T-α DF ADF05

10152025303540455055

*********

******

Grupos

sTfR

-F(n

mol

/L)

Figura 23 - Comparação dos níveis do índice receptor de transferrina/log da ferritina nos grupos estudados. Teste de Kruskal Wallis, *p < 0,05; **p < 0,01 e ***p < 0,001

DF – deficiência de ferro; ADF – anemia por deficiência de ferro; índice sTfR-F – receptor de transferrina solúvel / log ferritina; TT- β – traço β-talassêmico; T-α - alfa- talassemia.

Três crianças apresentaram hemoglobinopatias, sendo 02 com β-talassemia (n. 98 e 314)

e 01 com Hb AS (n. 194), e níveis de ferritina abaixo de 30 ng/mL, indicando um possível

sinergismo com DF (Tabela 7).

---------------------------------------------------------- Resultados -----------------------------------------------------------53

Tabela 7 – Dados laboratoriais dos participantes com hemoglobinopatias e ferritina abaixo de 30 ng/mL.

Participantes

Hb (g/dL) RDW (%) Ferritina

(ng/mL) sTfR

(nmol/L) Índice sTfR-F

Nº 98 11,6 12,8 14,4 39,4 34

Nº 194 12,9 14,6 26,7 23,4 16

Nº 314 11,6 14,0 20,2 26,8 20 Hb – hemoglobina; RDW – distribuição da amplitude das células vermelhas; sTfR – receptor de transferrina solúvel; índice sTfR-F – receptor de transferrina solúvel / log ferritina

A Tabela 8 resume os parâmetros hematológicos e bioquímicos dos grupos com traço β-

talassêmico e ADF, incluindo o índice de RDWI (VCM x RDW / E).

Tabela 8 - Parâmetros hematológicos e bioquímicos dos grupos β-TT e ADF.

Parâmetros β-TT X ± σ

ADF X ± σ

Hb (g/dL) 12,0 (± 0,71) 10,7 (± 0,57)

E (milhões/µL) 5,4 (± 0,36) 4,6 (± 0,51)

VCM (fL) 91,9 (± 8,2) 78 (± 6,4)

HCM (pg) 28,5 (± 3,0) 23,8 (± 2,5)

RDW (%) 13,7 (± 1,0) 14,3 (± 1,6)

RDWI 266 (± 29,9) 243 (± 40,9)

Ferritina (µg/mL) 49,9 (± 27,4) 18,3 (± 6,2)

sTfR (nmol/L) 35,5 (± 6,2) 33,7 (± 3,1)

sTfR/log ferritina 22,1 (± 5,9) 28,2 (± 9,3)

X ± σ = média ± desvio padrão; Hb – hemoglobina; E - eritrócitos; RDW – distribuição da amplitude das células vermelhas; VCM - volume corpuscular médio; HCM- hemoglobina corpuscular média; sTfR – receptor de transferrina solúvel; índice sTfR-F – receptor de transferrina solúvel / log ferritina.

5. DISCUSSÃO

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------55

A deficiência de ferro é a desordem nutricional mais prevalente do mundo. Estudos

indicam que a deficiência de ferro acomete 4 a 5 bilhões de pessoas no mundo, sendo mais

prevalente em crianças e adolescentes, devido ao rápido crescimento e aumento fisiológico da

demanda de ferro. A deficiência de ferro é o resultado final de um longo período do balanço

negativo desse metal, tendo como consequência anemia por deficiência de ferro (ADF) e, em

crianças, está associada ao retardo no crescimento, comprometimento cognitivo e diminuição

da função muscular (KWONG et al., 2004; MURRAY-KOLB; BEARD, 2009).

Segundo a Organização Mundial da Saúde (WHO, 2008), a anemia no Brasil representa

um problema de saúde pública de intensidade moderada e grave para gestantes e crianças pré-

escolares, respectivamente. A ADF está frequentemente associada com condições sócio-

econômicas desfavoráveis, registrando seus maiores índices nas áreas mais pobres do país

(CAPANEMA et al., 2003; MAHONEY, 2008). Sendo assim, as amostras biológicas das

crianças participantes deste estudo foram coletadas em escolas municipais e estaduais,

localizadas nos Bairros Ipiranga e Campos Elíseos, região norte da cidade de Ribeirão Preto –

SP, classificados como pertencentes às classes sócio-econômicas D e C, respectivamente.

Um grande desafio na área clínica é diagnosticar deficiência de ferro antes do

desenvolvimento da anemia (MUÑOZ et al., 2011). O reconhecimento dos grupos de risco,

dos fatores associados e o diagnóstico precoce podem interferir no curso natural da doença,

prevenindo danos de caráter irreversível (CAPANEMA et al., 2003). Lozoff (2007) relata que

a duração e a severidade da deficiência de ferro podem interferir na gravidade da doença no

futuro.

Em nosso estudo, 17,6% das crianças apresentaram anemia, utilizando como critério

para definir anemia o valor de concentração de Hb menor que 11,5 g/dL, conforme

preconizado pela OMS para a faixa etária de 6 a 9 anos, de ambos os sexos. Este valor foi

menor que o relatado pela OMS (2008) para crianças na idade escolar, no Brasil, a saber,

19.9% a 30,9%.

Para classificação morfológica das anemias encontradas foram utilizados os valores dos

índices hematimétricos (VCM, HCM, CHCM), da distribuição da amplitude das células

vermelhas (RDW) e a análise das extensões sanguíneas corada com Leishman. Em nosso

estudo, as anemias mais prevalentes foram as hipocrômicas normocíticas (44,0%),

normocíticas normocrômicas (37,3%) e hipocrômicas microcíticas (18,6%).

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------56

A anemia microcítica é a anemia mais frequente em crianças e adolescentes, sendo as

causas mais comuns a deficiência de ferro (DF) e talassemias (BEYAN et al., 2007;

URRECHAGA, 2008; IOLASCON et al., 2009). Dos 14 casos de anemia hipocrômica

microcítica, 10 deles (71,4%) apresentavam algum tipo de hemoglobinopatia e 2 (14,2%)

apresentaram DF e 2 (14,2%) de causa desconhecida. Microcitose não foi o achado mais

comum nas crianças anêmicas, entretanto, hipocromia, outro achado indicativo de ocorrência

de DF ou talassemias, estava presente em 62,1% dos casos de anemia.

As hemoglobinopatias, conhecidas também como distúrbios hereditários da

hemoglobina, são doenças que apresentam significativa morbidade em todo o mundo. Estima-

se que aproximadamente 12 a 15% da população mundial são portadores assintomáticos de

uma ou mais formas de anemias hereditárias (LEONELI et al., 2000). No Brasil, há grande

heterogeneidade genética devido à miscigenação resultante das imigrações européias e

asiáticas (ORLANDO et al., 2000; AIGNER et al., 2006). A maioria dos estudos sobre

prevalência de hemoglobinopatias, descritos no Brasil, tem caráter regional devido à

diversidade racial de cada região (AIGNER et al., 2006).

No ano de 1900, devido à expansão cafeeira, estima-se que mais da metade da

população de Ribeirão Preto eram imigrantes europeus. A partir de 1980, com a veiculação na

mídia sobre a renda per capita de Ribeirão Preto, que passou a ser conhecida como

“Califórnia Brasileira”, houve uma migração de trabalhadores não-especializados de todo o

país para nossa região, principalmente da população nordestina, aumentando a miscigenação

(SILVA, 2004). Dessa forma, a cidade de Ribeirão Preto e região refletem a diversidade de

origens raciais de todo país, o que se relaciona com a grande heterogeneidade genética.

Henderson e colaboradores (2009) relataram que as imigrações provocam aumento de

mutações que causam hemoglobinopatias e aumento da possibilidade de combinações e

interações de diferentes mutações.

O diagnóstico de hemoglobinopatias foi realizado utilizando os métodos de eletroforese

de hemoglobina, em acetato de celulose em pH alcalino, e cromatografia líquida de alta

pressão (HPLC). As α-talassemias foram diagnosticadas através de biologia molecular, pelo

método de PCR. Ondei e colaboradores (2005) discutem a utilização da eletroforese em

acetato de celulose, uma vez que esta metodologia não permite a distinção de hemoglobinas

com co-migração, como as que migram em posição semelhante à Hb S, em pH alcalino.

Portanto, para um diagnóstico correto e seguro é necessário a associação de métodos

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------57

eletroforéticos clássicos com metodologias complementares como as análises

cromatográficas.

Os programas de triagem neonatal seguem as normas estabelecidas no PNTN (Portaria

do Ministério da Saúde nº822/01) que recomendam a utilização de dois métodos presuntivos

para a determinação do perfil eletroforético. Atualmente, os programas de triagem,

substituíram os métodos tradicionais, como as eletroforeses em acetato de celulose, em pH

alcalino, e em ágar citrato, em pH ácido, pela eletroforese por focalização isoelétrica (IEF) e

pela cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). Apesar dos novos métodos presuntivos

apresentarem melhor sensibilidade e especificidade, eles são suscetíveis a interferências; e em

alguns casos, como no diagnóstico de α-talassemia é necessária a utilização da metodologia

molecular (HUNGHES et al., 2009).

Em nosso estudo, 83,4 % da população analisada apresentaram perfil hemoglobínico

normal e 16,6 % algum tipo de anormalidade qualitativa ou quantitativa. Não encontramos

divergências nos resultados obtidos com os dois métodos utilizados (eletroforese de

hemoglobina em acetato de celulose e HPLC), porém algumas vantagens são significativas na

análise automatizada, como a pequena quantidade de amostra utilizada, maior sensibilidade

devido o tempo de retenção das amostras e rapidez nos resultados (VAN DELFT et al., 2009).

A partir dos anos 50, quando houve os primeiros relatos sobre a separação eletroforética

das frações de hemoglobinas, diversos autores afirmam que os níveis de Hb A2 são

marcadores definitivos para diagnóstico dos portadores de β-talassemia. Níveis de Hb A2

acima de 4% são suficientes para diagnosticar β-talassemia menor, embora alguns portadores

tenham níveis entre 3,5 e 4% (MOSCA et al., 2009; COUSENS et al., 2010).

Em 1978, o Comitê Internacional de Padronização em Hematologia (ICSH, 1978)

recomendou a cromatografia de troca iônica como método de referência para quantificação de

Hb A2. Atualmente, a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) tem sido o método de

escolha pela maioria dos laboratórios. Segundo Giambona e colaboradores (2009), o método

de HPLC é considerado o mais sensível, específico e com melhor reprodutibilidade para a

dosagem da Hb A2. Entretanto, discute-se que a porcentagem de Hb A2, medida por HPLC,

pode ser afetada pela presença de hemoglobina S (HbS), em indivíduos heterozigotos para β-

talassemia. Isto ocorre devido a afinidade reduzida das cadeias βS para cadeias α, o que leva

as cadeias α livres a combinar com cadeias δ, aumentando Hb A2, e a co-eluição de HbS com

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------58

Hb A2, elevando falsamente sua porcentagem (HEAD et al., 2004; KALLEAS et al., 2007).

Não foram observadas diferenças significativas na quantificação dos níveis de Hb A2,

realizadas pelos métodos de eletroforese em acetato de celulose por eluição e HPLC. Este

achado parece afastar a possibilidade de co-eluição de HbS com Hb A2, mas não a de

combinação das cadeias α e δ, aumentado os níveis de Hb A2.

Assim, para confirmar estes casos sugestivos de Hb S/β-talassemia, foram avaliados os

pais e/ou irmãos destas crianças. Em todos os casos analisados (Tabela 3), verificou-se que os

pais possuíam apenas o gene βS e níveis de Hb A2 normais, descartando a possibilidade das

crianças serem portadoras da interação Hb S/β-talassemia. Assim, acreditamos que o aumento

da Hb A2 encontrado nestas crianças foi devido à combinação das cadeias α livres e δ e não

por apresentarem mutações que comprometem a síntese de cadeias β, ou seja, as crianças são

portadoras apenas de traço talassêmico (Hb AS).

Estudos relatam que as doenças das hemoglobinas S e C são as hemoglobinopatias mais

frequentes nas diversas regiões brasileiras, podendo apresentar-se nas formas heterozigotas,

Hb AS e Hb AC, ou homozigotas, anemia falciforme e doença de hemoglobina C (AIGNER

et al., 2006). No Brasil, a prevalência do traço falciforme varia de 2 a 8%, conforme a

ocorrência da população negra em cada região.

Detecção das hemoglobinas variantes S e C é feita por eletroforese ou HPLC,

dispensando a realização de estudos moleculares. Segundo Murao e Ferraz (2007), o método

de HPLC pode ser utilizado de forma isolada para o diagnóstico da doença falciforme, uma

vez que é um método de alta precisão para o gene S. Porém, para os casos com resultados

duvidosos, o ideal é a utilização do método clássico, como a eletroforese de hemoglobina, e

outro complementar. Identificamos em nosso estudo, utilizando o método eletroforético

clássico e HPLC, 15 (3,5%) crianças portadoras de Hb AS e 1 (0,24%) de Hb AC (Tabela 4).

Em nosso estudo, o número de portadores de traço falcêmico foi maior que o relatado em uma

revisão realizada por Murao e Ferraz (2007), em que os autores estimam 1,9% de portadores

de Hb AS, no estado de São Paulo. Como dito anteriormente, nossa região recebeu muitos

migrantes da região nordeste, o que deve justificar este maior número de casos.

Após o nascimento, a Hb F corresponde a menos 1% da hemoglobina total. Seu aumento

é encontrado na persistência hereditária da hemoglobina fetal (PHHF), nas hemoglobinopatias

S e C, nas interações entre as hemoglobinas variantes e nas β e δβ-talassemias; algumas

condições adquiridas como doenças medulares malignas, anemia perniciosa, anemia aplástica

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------59

e hipertireoidismo também podem elevar seus níveis (MELO-REIS et al., 2006; MOSCA et

al., 2009; VAN DELFT et al., 2009). O método clássico usado para quantificar Hb F, a

desnaturação alcalina foi substituída pelo HPLC ou espectrometria de massa. Para a

metodologia HPLC, o valor limite de normalidade, comumente adotado pelo fabricante, é de

até 1,0% de Hb F. Porém, a fração da Hb F pode eluir juntamente com a fração da Hb A1C,

elevando falsamente seu resultado, que pode chegar a 3% (VAN DELFT et al., 2009). Em

nosso estudo, houve a ocorrência de 17 (4%) casos com Hb F aumentada, com valor médio de

3%, sendo que esta alteração não estava associada a nenhuma outra anormalidade de cadeia

globínica. A prevalência de PHHF no Brasil é estimada em 0,1%, assim os casos encontrados

neste estudo foram, provavelmente, devidos à eluição com a fração da Hb A1C. Outra possível

causa é a ocorrência de mutações únicas, polimorfismos ou pequenas deleções que requer,

para seu diagnóstico, estudos moleculares (MOSCA et al., 2009).

Estima-se que a α-talassemia afeta 5% da população mundial, sendo a mais comum de

todas as desordens genéticas (VICHINSKY, 2010). No Brasil, estudos relatam que a deleção

mais frequente para α-talassemia (-α3,7) adentrou no país predominantemente com a vinda dos

escravos africanos e, um número menor, com os portugueses e italianos (BORGES et al.,

2001; CARDOSO; GUERREIRO, 2010). A história indica que as regiões norte, nordeste e

sudeste do Brasil apresentam uma mistura entre europeus, portugueses, africanos e

ameríndios, contribuindo para as diferentes composições étnicas regionais e

consequentemente para a diversidade genética (OLIVEIRA et al., 2006; CARDOSO;

GUERREIRO, 2010).

Cançado (2006) relata que a prevalência da α-talassemia, na população brasileira, pode

atingir de 10 a 20%; entretanto, se considerar os indivíduos afro-descendentes, essa

frequência pode alcançar até 25%. Adorno e colaboradores (2005) encontraram uma

prevalência de 22,2% de α-talassemia em recém-nascidos da cidade de Salvador. Wagner e

colaboradores (2010) mostram uma prevalência para α-talassemia de 23,1% na população

afro-descendente do Rio Grande do Sul. No sudoeste do estado de São Paulo, estima-se que a

α-talassemia atinge aproximadamente 10% da população (MELO et al., 2008).

Apesar da elevada frequência, essa é a hemoglobinopatia menos investigada no país

(WAGNER et al., 2010). Estudos recentes ressaltam a necessidade da análise molecular para

o diagnóstico de α-talassemias, uma vez que os métodos convencionais podem não detectar

esse distúrbio hereditário (OLIVEIRA et al., 2006; LEUNG et al., 2008; HUNGHES et al.,

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------60

2009). A Hb H é instável, se desnatura com facilidade, o que pode dificultar a visualização de

sua banda pela eletroforese em acetato de celulose, em pH alcalino. Estima-se que 50% dos

heterozigotos das α-talassemias não são detectados por esse método (CANÇADO, 2006).

Em nosso estudo, os métodos clássicos de eletroforese em acetato de celulose, em pH

alcalino e HPLC (kit β-talassemia Short Program) não identificaram portadores de α-

talassemias, ressaltando a importância da análise molecular no diagnóstico de α-talassemia.

A deleção -α3,7, em nosso estudo, foi investigada em 207 participantes, pela técnica de

PCR (DODÉ et al., 1992). Verificou-se a presença de 26 (12,6%) casos positivos para a

deleção -α3,7, sendo 24 (11,6%) heterozigotos e 2 (1%) homozigotos (Tabela 4). Estes

resultados são próximos aos indicados pela literatura (CANÇADO; 2006; MELO et al.,

2008), que apontam uma prevalência de α-talassemia entre 10 e 20% na população brasileira,

justificando a necessidade de investigação mais ampla na cidade de Ribeirão Preto, para

caracterizar a prevalência em sua população, visto que não há relatos, na literatura científica,

sobre esta prevalência. Com as técnicas moleculares, o diagnóstico das hemoglobinopatias

ficou mais rápido e preciso, porém essa metodologia ainda não faz parte da rotina laboratorial.

Assim, este estudo contribui para a caracterização molecular da α-talassemia na população

infantil da cidade de Ribeirão Preto.

Deve-se ressaltar que, apesar de vários relatos na literatura sobre a utilização de PCR

para identificação das deleções de α-talassemia, a padronização da técnica é trabalhosa. Cada

laboratório deve estabelecer as condições de amplificação do DNA genômico e identificação

da deleção –α3.7. Em Ribeirão Preto, nosso laboratório foi o primeiro a padronizar a pesquisa

da principal deleção de α-talassemia.

A β-talassemia é mais prevalente nos países do Mediterrâneo, Ásia, Índia, África,

América Central e Oriente Médio. Estima-se, aproximadamente, que 1,5% da população

mundial (80 a 90 milhões de pessoas) são portadores de algum tipo de β-talassemia

(GANELLO; ORIGA, 2010).

No Brasil, não se conhece a prevalência real de β-talassemia em cada Estado, mas

estima-se, para o Estado de São Paulo, uma prevalência de aproximadamente 3% de

portadores (BONINI-DOMINGOS, 2004). Em nosso estudo, foi observada uma prevalência

de β-talassemia de 3,27%, valor discretamente superior aos encontrados nos estudos de Seixas

e colaboradores (2008) e Orlando e colaboradores (2000), os quais demonstraram uma

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------61

prevalência de 2,73% e 0,38% de β-talassemia em 585 e 203 amostras analisadas,

respectivamente.

A combinação genética de variantes de hemoglobina e talassemias podem ser explicadas

pelas imigrações, aumentando a diversidade de genótipos e a incidência de hemoglobinopatias

em países com baixa prevalência da doença (COUSENS et al., 2010). Em nosso estudo,

foram identificados dois casos de interação de talassemias (α/β-talassemia). Estas interações

eram esperadas, pois Ribeirão Preto reflete a diversidade racial resultante da sua história de

imigrações européias e asiáticas e migrações de trabalhadores de outras regiões do país.

Laboratorialmente, essa interação, pode levar a normalização dos índices hematológicos e

uma síntese de cadeias globínicas balanceadas (BAIN, 2006). Os resultados do eritrograma

destas crianças confirmam essa afirmação (Tabela 5, Apêndice C). O número de casos de

hemoglobinopatias, encontrado neste estudo, é preocupante, principalmente porque todos os

pais desconheciam que os filhos eram portadores destas patologias.

No presente estudo foi evidenciado, no grupo anêmico, 14 (18,8%) crianças com

anemia hipocrômica microcítica, com alteração ou não do RDW. Estudos recentes

comprovam que as características morfológicas dos eritrócitos não são bons parâmetros para

diferenciá-las (HARRINGTON et al., 2008, MATOS et al., 2008), tendo em vista,

principalmente, o aspecto subjetivo da análise. É bastante conhecido que, quando três

hematologistas examinam uma extensão sanguínea, dois concordam e um discorda em relação

a analise morfológica das células.

Apenas 8 participantes com hemoglobinopatias e 2 com ADF apresentaram anemia

hipocrômica microcítica. Os demais apresentaram hipocromia ou microcitose, isoladamente

(Apêndices C e F). Há relatos da presença de microcitose e hipocromia sem anemia

(BORGES et al., 2001). A heterozigose das talassemias, também denominada “portador

silencioso”, podem apresentar ou não discretas alterações hematológicas (WEATHERALL,

2006). Segundo Désidéri-Vaillant e colaboradores (2009), microcitose é evidenciada em 26%

dos pacientes com hemoglobinopatias, confirmando que este achado não é obrigatório nos

portadores destas patologias. Recente publicação aponta que somente 24,5% de crianças com

deficiência de ferro apresentavam microcitose (BORTOLINI; VITOLO, 2011).

Para identificar as possíveis causas das anemias hipocrômicas microcíticas é

imprescindível avaliar o status férrico, investigando os compartimentos de estoque, transporte

e o ferro eritróide (MONTEIRO et al., 2006). Os marcadores bioquímicos que auxiliam na

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------62

detecção da deficiência de ferro (ferritina sérica, transferrina sérica, ferro sérico e capacidade

total de ligação do ferro) muitas vezes sofrem influência da presença de outras patologias

(PUNNONEN et al., 1997). Muitos pesquisadores vêm estudando o “melhor indicador” para

a DF durante a fase de depleção funcional dos compartimentos de ferro, antes do

desenvolvimento da anemia (ONG et al., 2007; CHOULIARAS et al., 2009).

A pesquisa de ferro, em aspirado de medula óssea, é o marcador definitivo para DF,

porém é um método invasivo e de grande desconforto, inviável para estudos populacionais. A

determinação dos níveis de ferro sérico sofre grandes interferências como contaminação

durante a execução da técnica, variação diurna e utilização de terapia de reposição, não sendo

indicado como um bom parâmetro para avaliar o status férrico (TIWARI et al., 2010). Com

isso, os níveis séricos de ferritina tornaram-se o marcador laboratorial mais utilizado para

investigar os estoques de ferro no organismo (KOULAOUZIDIS et al., 2009).

A inclusão da determinação dos níveis séricos de receptor de transferrina (sTfR), como

critério laboratorial para identificar ADF e diferenciá-la de outras anemias, foi muito útil, pois

este parâmetro não é influenciado pelos processos inflamatórios, não sendo um reagente de

fase aguda (ONG et al., 2007). sTfR tem sido usado para avaliar e monitorar o tratamento

com eritropoetina recombinante humana (rHuEPO) e a suplementação oral de ferro (ONG et

al., 2007; UAPRASERT et al., 2009; SPEECKAERT et al., 2011). Entretanto, os níveis

aumentados do sTfR estão correlacionados ainda com eritropoese estimulada, como nas

talassemias e outras anemias hemolíticas. Alguns autores afirmam que a ferritina sérica é tão

sensível e específica quanto o sTfR para diagnosticar a DF (YANG et al., 2008) e, que o

cálculo do índice sTfR/ log da ferritina seria o marcador mais precoce, sensível e específico

para a DF refletindo o estoque de ferro e o ferro funcional (DIMITRIOU et al., 2000;

JAYARANEE; STHANESHWAR, 2006).

Segundo a OMS, valores inferiores a 15 µg/L, para crianças de ambos os sexos, são

indicativos de DF. Este valor deve ser revisto, uma vez que tem sido relatado que mais da

metade dos portadores de DF apresentaram valores de ferritina superiores ao estabelecido pela

OMS (KOULAOUZIDIS et al., 2009). Alguns autores têm utilizado valores de cut off mais

altos para ferritina, mas estes critérios foram empiricamente definidos (COOK, 1999;

KOULAOUZIDIS et al., 2009). Dimitriou e colaboradores (2000) relataram, em crianças

normais, uma média de ferritina de 27,04 (±3,1) µg/L.

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------63

Com base nestes relatos e em trabalhos anteriores realizados por nosso grupo,

consideramos como deficientes em ferro os participantes que apresentaram níveis de ferritina

sérica menor que 30 ng/mL. Dentre os participantes do estudo, 12,9% apresentou DF segundo

este critério. Se considerarmos o valor preconizado pela OMS, seria 8,2% (n=35) com DF.

Os pesquisadores da área têm apontado a necessidade de estabelecer limites mais fidedignos

para definição de DF, pois o cut off de 15 ng/mL subestima a ocorrência deste grave

problema. Nas formas leves e moderadas de deficiência de ferro, sem anemia, as funções

teciduais estão diminuídas, como, por exemplo, há aumento da susceptibilidade às doenças

infecciosas, em razão da diminuição da resposta imunológica, o que justifica a adoção de

limites mais amplos para definir este estado.

Dos 55 participantes com ferritina < 30ng/mL, 16 (29,1%) apresentaram apenas níveis

séricos de ferritina diminuídos e, portanto foram considerados no 1º estágio do período do

balanço negativo do ferro, ou seja, depleção de ferro, onde a falta de ferro afeta os depósitos

do metal, podendo causar consequências funcionais nos órgãos (KOULAOUZIDIS et al.,

2009). Em nosso estudo, os níveis séricos de ferritina demonstraram ser um parâmetro

sensível para a detecção da deficiência de ferro antes do surgimento da anemia, utilizando um

cut off superior ao recomendado pela OMS. Segundo Mast e colaboradores (1998), a

sensibilidade deste parâmetro pode aumentar de 25% para 92%, na identificação de DF,

quando é utilizado o cut off de 30 µg/L.

A determinação dos níveis de sTfR foi utilizada como critério para divisão dos grupos

DF e ADF. Utilizamos como cut off níveis de sTfR de 30,9 nmol/L (DIMITRIOU et al.,

2000). Dos 55 participantes com ferritina < 30 ng/mL, 39 (70,9%) foram diagnosticados,

como portadores de deficiência de ferro com e sem anemia, por apresentarem níveis de

ferritina e do sTfR alterados. Observamos diferença significativa nos níveis de sTfR e nos

valores do índice sTfR/log ferritina entre os grupos controle e DF (p < 0,001), controle e ADF

(p < 0,001), mostrando que ambos são bons parâmetros para o diagnóstico de DF e ADF

(Figuras 21 a 23).

A determinação dos níveis de sTfR tem se mostrado um parâmetro promissor,

principalmente em crianças, entretanto, ainda há controvérsias se os níveis de sTfR oferecem

ou não vantagem sobre a ferritina na avaliação de estágios precoces e intermediários da

deficiência de ferro. A utilidade dos ensaios de sTfR tem sido limitada pelo alto custo e a falta

de padronização internacional (SPEECKAERT et al., 2011). Segundo Beguin (2003), a

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------64

combinação dos parâmetros sTfR e ferritina sérica pode aumentar a especificidade do

diagnóstico de DF. Nossas pesquisas sobre a utilização dos níveis de sTfR no diagnóstico da

deficiência de ferro têm mostrado que este parâmetro é decisivo para caracterizar este estado.

Houve diferença significativa nos níveis de ferritina entre os grupos com

hemoglobinopatias e DF (p < 0,001) e hemoglobinopatias e ADF (p < 0,001), mostrando ser

um bom parâmetro para diferenciar os portadores de DF e ADF dos participantes com

hemoglobinopatias.

Chouliaras e colaboradores (2009) relataram a eficiência do sTfR para diagnosticar DF

apenas em pacientes não talassêmicos, pois na presença de talassemias os níveis de sTfR se

elevam. O aumento dos níveis de sTfR está associado com eritropoese ineficaz como ocorre

nas talassemias e outras anemias hemolíticas, principalmente durante crise reticulocítica

(SPEECKAERT et al., 2011). Em nosso estudo, não houve diferença significativa (p > 0,05)

nos níveis de sTfR entre os grupos β-talassêmicos e DF e β-talassêmicos e ADF,

confirmando esta afirmação. O índice sTfR/log ferritina, utilizando um cut off de 23,9,

mostrou maior sensibilidade para diferenciar o grupo β-talassêmico do grupo DF (p < 0,05).

Os níveis de sTfR e os valores de sTfR/log da ferritina do grupo α-talassêmicos foram

inferiores aos dos grupo β-talassêmicos e DF apresentando diferença significativa (p < 0,05 e

p < 0,001, respectivamente). O sTfR/log da ferritina também se mostrou mais sensível na

diferenciação dos grupos α-talassêmicos e DF (p < 0,001); α-talassêmicos e ADF (p < 0,001)

(Figuras 21 a 23).

Recentes estudos discutem as dificuldades no diagnóstico laboratorial das talassemias,

principalmente quando β-talassemia menor está associada com a DF, pois a baixa

concentração de ferro pode interferir na síntese da globina δ, diminuindo a síntese de Hb A2,

o que dificultaria o diagnóstico das hemoglobinopatias (BEYAN et al., 2007; NAOUM;

BONINI-DOMINGOS, 2007). O contrário também é relatado, o traço talassêmico pode ser

diagnosticado como ADF, quando se utiliza o número de eritrócitos e a análise morfológica

das células (AULAKH et al., 2009). Três participantes do estudo, dois com β-talassemia e um

com traço falcêmico, apresentaram níveis séricos de ferritina abaixo de 30 ng/mL, sugerindo

que coexistia deficiência de ferro, entretanto não foi evidenciado, no eritrograma,

agravamento do quadro hematológico (Tabela 7). Observamos ainda que 3 participantes com

DF (números 330, 333, 344) e 1 com ADF (número 406) apresentaram níveis de Hb A2 no

limite da normalidade (Apêndice B), sendo possível levantar a hipótese que estas crianças

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------65

pudessem ser portadoras de β-talassemia; somente análise molecular das mutações

características da patologia poderia elucidar esta hipótese.

Utilizamos os parâmetros hematológicos (número de eritrócitos, Hb, VCM, HCM,

RDW, morfologia celular), bioquímicos (ferritina, sTfR e índice sTfR/log ferritina) e o índice

matemático RDWI (VCM x RDW/E), na tentativa de identificar e diferenciar os portadores de

DF, ADF e os portadores de hemoglobinopatias; assim como, um possível sinergismo entre

elas.

Observamos que houve diferença significativa na concentração de Hb (g/dL) entre os

portadores de hemoglobinopatias e de DF, assim como, entre os grupos controle e DF (p <

0,05). A concentração de Hb demonstrou ser um índice sensível na detecção da DF e útil na

diferenciação dos pacientes com alguma hemoglobinopatia e DF, pois o valor médio de Hb

dos portadores de hemoglobinopatias foi menor quando comparados aos dos portadores de DF

(Figura 19). As concentrações de Hb também foram significativamente diferentes entre os

participantes do grupo controle e dos grupos DF e ADF (p < 0,05). Observamos, no grupo

com hemoglobinopatias, concentração média de Hb de 11,6 g/dL, inferior ao encontrado por

Urrechaga (2008) que relata um valor médio de 12,6 g/dL para os pacientes com β-talassemia.

Danise e colaboradores (2008) relataram que as médias de Hb dos pacientes com traço-

talassêmicos e DF podem estar dentro da normalidade e próximos entre si. Assim, apesar de

nossos resultados, Hb médias 11,8 e 12,3 g/dL para traço β-talassêmico e DF,

respectivamente, mostrarem diferenças significativas nos grupos estudados, este parâmetro

isoladamente não contribui para o diagnóstico diferencial destas patologias.

O RDW (distribuição da amplitude das células vermelhas) é um índice que avalia a

variação do tamanho dos eritrócitos, referido como anisocitose (ASLAN et al., 2002).

Discute-se que o RDW seria um indicador prático e sensível para caracterizar DF, antes do

desenvolvimento da anemia. Em nosso estudo, não foi observada diferença significativa no

RDW entre os grupos controle e DF (p > 0,05), não sendo, portanto um parâmetro sensível

para identificar precocemente DF (Figura 20). Matos e colaboradores (2008) relataram que o

RDW não discriminou a ADF, β-talassemia e anemia das doenças crônicas (ADC), não sendo

uma ferramenta útil para a diferenciação das anemias hipocrômicas microcíticas. Ntaios e

colaboradores (2007) relataram que o RDW isoladamente não é um bom indicador para

diferenciar ADF e β-talassemia menor. Recentemente, Tiwari e colaboradores (2010)

mostraram que o RDW foi o índice de menor sensibilidade e especificidade para os grupos

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------66

com traço β-talassêmico (β-TT) e ADF. Nossos resultados apontam diferença significativa no

RDW entre os grupos com hemoglobinopatias e DF (p < 0,05), corroborando com a

afirmação de Aulakh e colaboradores (2009) de que o RDW é um parâmetro necessário,

juntamente com outras determinações, para diagnosticar ADF em crianças.

A análise morfológica das células eritrocíticas, em extensão sanguínea corada, não

demonstrou especificidade no grupo das hemoglobinopatias, pois foi encontrada

poiquilocitose, característica desta patologia, em apenas 11 casos (36,6%). Harrington e

colaboradores (2008) relataram que poiquilocitose com presença de células em alvo,

considerada característica das β-talassemias, foi encontrada presente em células de portadores

de ADF e β-TT, não sendo útil para a distinção destas patologias. Nosso estudo está em

concordância com este autor, visto que encontramos células em alvo tanto em portadores de

ADF quanto de β-TT.

Vários índices matemáticos têm sendo utilizados para diferenciar β-TT e ADF

(SIRDAH et al., 2008). Demir e colaboradores (2002) concluíram que o número de eritrócitos

(E) e o índice de RDWI (VCM x RDW / E), em crianças, são os melhores parâmetros para

diferenciar β-TT da ADF, quando os valores de RDWI são menores ou maiores que 220,

respectivamente. Beyan e colaboradores (2007) mostraram que o índice RDWI apresentou

uma sensibilidade e especificidade de 75,5% e 87,9%, respectivamente para ADF e de 87,9%

e 75,5% para traço β-talassêmico. Em nosso estudo, o índice matemático RDWI não foi um

bom parâmetro para diagnosticar traço β-talassêmico e ADF, visto que as médias encontradas

(266 e 243, respectivamente) não apresentaram diferença significativa (Tabela 8).

Melo e colaboradores (2002) discutem que valores elevados de eritrócitos, em anêmicos,

podem ser sugestivos de traço talassêmico. Segundo Ntaios e colaboradores (2007) se os

números de eritrócitos são maiores ou menores de 5 x 1012/L podemos diferenciar,

respectivamente, os casos de traço β-talassêmico e ADF. Nossos achados mostraram que o

número médio de eritrócitos é um parâmetro útil para identificar os grupos com traço

talassêmico e ADF (5,4 milhões/mL e 4,6 milhões/mL, respectivamente, p < 0,05), valores

semelhantes aos relatados por Demir e colaboradores (2002) e Ntaios e colaboradores (2007).

Urrechaga (2008) observou redução dos índices hematimétricos VCM e HCM nos

pacientes com β-TT e ADF, porém os valores se mostram mais baixos nos pacientes com

traço β-talassêmico. Nossos resultados não confirmam este achado, pois os portadores de β-

TT obtiveram valores médios superiores, quando comparado com os portadores de ADF.

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------67

Os níveis plasmáticos de chumbo, em todos os participantes do estudo, estavam dentro

do recomendado pelo Center for Disease Control and Prevention (CDC), ou seja, menores

que 10 µg/dL, não havendo interferência do metal na patogênese das anemias encontradas.

Estudos recentes mostraram que o Sistema Nervoso pode ser afetado com exposição inferior a

este valor (LANPHEAR et al., 2000; PATRICK, 2006). Binns e colaboradores (2007)

sugerem a necessidade de investigar os efeitos do chumbo quando os valores são inferiores a

10 µg/dL. O Scientific Committee on Neurotoxicology and Psychophysiology e o Scientific

Committee on Toxicology of Metals expuseram a urgência de reduzir a concentração de

chumbo sanguíneo, sendo corretamente recomendado utilizar cut off de 5 µg/dL (COSTA DE

ALMEIDA et al., 2010). Verificamos que 98,6% dos participantes do estudo apresentaram

níveis plasmáticos de chumbo inferiores ao cut off de 5 µg/dL, evidenciando que não há

contaminação de chumbo nesta população.

A anemia causada pelo plumbismo ocorre quando níveis elevados do metal são

mantidos por períodos prolongados (SERWINT et al., 1999). O chumbo pode prejudicar a

produção de hemoglobina, inibindo várias enzimas, sendo uma delas o ácido aminolevulínico

desidratase (ALAD). Indivíduos portadores do polimorfismo do gene que codifica a ALAD

são mais susceptíveis a exposição ao chumbo. Foram descritos dois alelos do polimorfismo da

ALAD G177C (ALAD-1 e ALAD-2), que variam geograficamente e segundo a raça, estando

ambos associados com altos níveis de chumbo sanguíneo (KELADA et al., 2001). Não houve

correlação significativa entre os polimorfismos da ALAD-1 (ALAD1-1 e ALAD1-2) e os

níveis plasmáticos de chumbo (Figura 18), resultados semelhantes aos obtidos por Chen e

colaboradores (2008).

Artigos recentes discutem que, nos países em desenvolvimento, as doenças nutricionais

sempre foram mais priorizadas do que as doenças genéticas, incluindo as hemoglobinopatias,

nos programas de saúde pública, O diagnóstico impreciso prejudica o conhecimento da

prevalência dessas doenças, de seus agravantes e, consequentemente, impossibilita um

tratamento adequado. Os programas de saúde implantados em países subdesenvolvidos e/ou

em desenvolvimento têm prolongado a sobrevida das crianças, permitindo o diagnóstico de

doenças herdadas como as hemoglobinopatias, fazendo surgir relatos de aumento da

prevalência destas patologias (WEATHERALL, 2010).

No Brasil, o Ministério da Saúde, através da Portaria nº 822/01, estabeleceu o Programa

de Triagem Neonatal utilizando dois métodos presuntivos para a determinação do perfil

---------------------------------------------------------- Discussão -----------------------------------------------------------68

eletroforético dos recém-nascidos. Apesar das dificuldades existentes para identificar as

diversas patologias e as interferências nos métodos convencionais, esse Programa tem

contribuído para obter informações sobre as hemoglobinopatias, nas diferentes regiões do

país, o que permitirá, no futuro, o estabelecimento de programas de aconselhamento genético.

Segundo Cousens e colaboradores (2010), a detecção de genes de hemoglobinas anormais

deve ser suplementada pela educação e aconselhamento dos portadores para que eles

compreendam a significância de sua condição e tomem medidas para prevenir o nascimento

de crianças com formas graves de hemoglobinopatias.

Concluindo, nossa pesquisa contribuiu para ressaltar a importância da utilização de

métodos confirmatórios que permitam diagnóstico preciso das anemias hipocrômicas

microcíticas permitindo, consequentemente, adotar a correta estratégia terapêutica. A

utilização de outros parâmetros, além dos convencionais, como a determinação dos níveis de

sTfR para diagnóstico de deficiência de ferro, e análise molecular para a identificação dos

portadores de α-talassemia, é essencial para alcançar este objetivo.

6. CONCLUSÕES

----------------------------------------------------------Conclusões-----------------------------------------------------------70

No estudo da ocorrência de anemias hipocrômicas microcíticas em escolares de

Ribeirão Preto, verificamos que:

• A prevalência das hemoglobinopatias nos participantes foi: 11,6% com α-talassemia;

4% com aumento de Hb F; 3,5% com Hb AS; 2,8% com β-talassemia; 0,96% com

α/β-talassemia e 0,24% com Hb AC.

• Houve concordância na identificação de alterações qualitativas e quantitativas nas

hemoglobinas utilizando as metodologias eletroforese de hemoglobina em acetato de

celulose e o HPLC, sendo que estas metodologias não são úteis para diagnosticar α-

talassemia. Para identificar os portadores da deleção de α-talassemia (–α3,7) é

necessária a utilização da análise molecular (PCR). A suspeita de Hb S/β-talassemia

identificada por HPLC deve ser confirmada pr análise dos pais e/ou irmãos.

• A anemia por deficiência de ferro foi diagnosticada em 3% das crianças e DF, sem

anemia, em 6,1%.

• Não foi detectada contaminação por chumbo na população estudada, portanto o

chumbo não está envolvido na fisiopatologia das anemias encontradas.

Sobre os parâmetros utilizados para identificar e diferenciar as possíveis causas das

anemias hipocrômicas microcíticas podemos afirmar que:

• O número de eritrócitos mostrou ser útil para diferenciar os grupos traço β-talassêmico

e ADF.

• As características morfológicas dos eritrócitos não são bons parâmetros para

diferenciá-las.

• Os índices RDW e RDWI, isoladamente, não são úteis para diferenciar talassemias e

deficiência de ferro, bem como para identificar DF precoce.

• Para o diagnóstico de DF e ADF bem como diferenciar estes estados das talassemias,

deve-se avaliar, em conjunto, os níveis séricos de ferritina e de sTfR, bem como o índice

sTfR/log da ferritina, que se mostrou mais sensível do que o sTfR para esta diferenciação.

• No diagnóstico das anemias hipocrômicas microcíticas é necessário a utilização de

métodos confirmatórios que permitam um diagnóstico preciso, devendo-se analisar um

conjunto de determinações, incluindo exame hematológico, status férrico, perfil

eletroforético, inclusive de familiares, e análise molecular das hemoglobinopatias.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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APÊNDICES

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices ----------------------------------------------------------------------------------------------- 89

Apêndice A - Avaliação hematológica das crianças do grupo controle paciente 15 paciente 104 paciente 105 paciente 109 paciente 116 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,81 4,2 4,67 4,69 4,88 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,3 12,1 12,1 12,2 13,2 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 40,1 37,5 38 38,8 41,5 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 83,0 89 81 83 85 77 - 95 HCM (pg) 25,6 28,9 26 26,1 27,1 25 - 33 CHCM (g/dl) 30,6 32,4 31,9 31,6 31,9 31 - 37 RDW (%) 12,7 12,6 13,2 12,9 13,1 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 5.000 5.100 5.500 6.900 7.600 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % % mm3 % mm3 Neutrófilos 47 2350 55 2805 55 3025 58 4002 63 4788 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 1 50 1 51 3 207 1 76 2_5 157 - 385 Segmentados 46 2300 54 2754 55 3025 55 3795 62 4712 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 1 50 2 102 1 55 1 76 1_3 90 - 220 Basófilos 1 55 1 69 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 48 2400 38 1938 39 2145 37 2553 32 2432 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 200 5 255 4 220 4 276 4 304 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 369 318 192 275 171 150 - 450 Morfologia I I I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices ----------------------------------------------------------------------------------------------- 90

Avaliação hematológica das crianças do grupo controle paciente 121 paciente 123 paciente 134 paciente 142 paciente 150 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,33 4,7 4,22 4,26 4,56 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,4 12,7 12,2 12 12,7 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 38,1 39,6 37,8 37,6 39,7 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 88 84 89 88 87 77 - 95 HCM (pg) 28,6 27 28,8 28,1 27,8 25 - 33 CHCM (g/dl) 32,5 32 32,2 31,9 31,9 31 - 37 RDW (%) 12,9 13 12,8 13 12,9 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 7.700 6.400 5.000 7.100 5.500 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 53 4081 43 2752 59 2950 50 3550 55 3025 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 1 77 1 64 2 100 1 71 3 165 2_5 157 - 385 Segmentados 52 4004 42 2688 57 2850 49 3479 52 2860 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 2 154 2 128 3 150 2 142 4 220 1_3 90 - 220 Basófilos 1 64 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 42 3234 51 3264 34 1700 45 3195 38 2090 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 231 3 192 4 200 3 213 3 165 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 318 266 286 223 216 150 - 450 Morfologia I I I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices ----------------------------------------------------------------------------------------------- 91

Avaliação hematológica das crianças do grupo controle paciente 154 paciente 156 paciente 157 paciente 161 paciente 182 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,67 4,85 4,4 4,46 4,51 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,7 12,7 12,4 12,6 12,1 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 38,6 41,1 39,6 39,7 37,9 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 83 85 90 89 84 77 - 95 HCM (pg) 27,1 26,2 28,1 28,2 26,8 25 - 33 CHCM (g/dl) 32,9 30,9 31,2 31,6 31,9 31 - 37 RDW (%) 13,2 13,4 13 13,4 13,6 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 5.700 5.500 7.700 6.400 9.700 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 39 2223 44 2420 51 3927 51 3264 60 5820 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 1 57 5 275 3 231 2 128 2 194 2_5 157 - 385 Segmentados 38 2166 39 2145 48 3696 49 3136 58 5626 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 2 114 3 165 2 154 3 192 2 194 1_3 90 - 220 Basófilos 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 55 3135 49 2695 43 3311 42 2688 35 3395 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 228 4 220 4 308 4 256 3 291 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 287 255 259 375 258 150 - 450 Morfologia I I I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices ----------------------------------------------------------------------------------------------- 92

Avaliação hematológica das crianças do grupo controle paciente 184 paciente 216 paciente 228 paciente 239 paciente 245 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,64 4,83 4,8 4,89 5,27 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,4 12,1 12,4 12,3 13,8 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 39,7 40,6 39,7 39,3 43,5 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 85 84 83 80 83 77 - 95 HCM (pg) 26,8 25,1 25,8 25,1 26,1 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,3 29,8 31,2 31,2 31,6 31 - 37 RDW (%) 14,3 14,5 14,3 13,2 12,7 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 6.800 4.800 4.500 4.800 5.800 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 53 3604 38 1824 64 2880 51 2448 51 2958 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 4 272 2 96 3 135 3 144 3 174 2_5 157 - 385 Segmentados 49 3332 36 1728 61 2745 48 2304 48 2784 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 2 136 3 192 3 135 3 144 1 58 1_3 90 - 220 Basófilos 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 42 2856 55 2640 30 1350 42 2016 44 2552 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 204 4 192 3 135 4 192 4 232 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 314 323 241 264 197 150 - 450 Morfologia I I I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices ----------------------------------------------------------------------------------------------- 93

Avaliação hematológica das crianças do grupo controle paciente 255 paciente 261 paciente 263 paciente 267 paciente 272 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,97 4,86 4,88 4,62 4,65 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,5 13,2 13 12,7 12,6 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 40,3 41,8 41,5 40 39,4 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 81 86 85 87 85 77 - 95 HCM (pg) 25,1 27,2 26,7 27,5 27,2 25 - 33 CHCM (g/dl) 31 31,5 31,4 31,7 32,1 31 - 37 RDW (%) 13,1 12,3 13 13,2 14,1 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 11.000 7.100 5.700 6.200 8.400 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 60 6600 64 4544 46 2622 55 3410 52 4368 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 4 440 1 71 1 57 2 124 3 252 2_5 157 - 385 Segmentados 56 6160 63 4473 45 2565 53 3286 49 4116 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 1 110 1 71 1 57 2 124 3 252 1_3 90 - 220 Basófilos 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 36 3960 32 2272 49 2793 40 2480 42 3528 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 330 3 213 4 228 3 186 3 252 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 336 312 252 198 327 150 - 450 Morfologia I I I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices ----------------------------------------------------------------------------------------------- 94

Avaliação hematológica das crianças do grupo controle paciente 279 paciente 284 paciente 291 paciente 304 paciente 308 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 5,22 4,52 5,07 4,45 4,83 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 13,4 12,4 14 12,2 12,6 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 41,5 38,6 42,8 39,1 40,3 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 80 85 84 88 84 77 - 95 HCM (pg) 25,7 27,5 27,7 27,4 26,2 25 - 33 CHCM (g/dl) 32,3 32,3 32,8 31,2 31,4 31 - 37 RDW (%) 14,1 13,6 12,3 13,3 12,9 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 6.100 6.200 4.700 8.600 7.200 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 55 3355 53 3286 53 2491 63 5418 50 3600 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 4 244 4 248 3 141 5 430 2 144 2_5 157 - 385 Segmentados 50 3050 49 3038 50 2350 58 4988 48 3456 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 1 61 2 124 1 47 2 172 3 216 1_3 90 - 220 Basófilos 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 42 2562 42 2604 42 1974 32 2752 43 3096 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 183 3 186 4 188 3 258 4 288 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 211 323 224 215 237 150 - 450 Morfologia I I I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices ----------------------------------------------------------------------------------------------- 95

Avaliação hematológica das crianças do grupo controle paciente 310 paciente 322 paciente 336 paciente 337 paciente 348 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,99 4,53 4,71 4,83 4,62 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,7 12,1 12,7 13 12,3 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 41,6 38,6 40 41,7 40,1 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 83 85 85 86 87 77 - 95 HCM (pg) 25,5 26,6 26,9 26,9 26,7 25 - 33 CHCM (g/dl) 30,6 31,2 31,7 31,1 30,7 31 - 37 RDW (%) 14,2 11,6 12,3 13,5 13,7 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 7.900 10.700 7.900 7.100 5.100 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 58 4582 59 6313 42 3318 59 4189 48 2448 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 2 158 5 535 2 158 2 142 2 102 2_5 157 - 385 Segmentados 56 4424 54 5778 40 3160 57 4047 46 2346 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 1 79 1 107 1 79 1 71 1 51 1_3 90 - 220 Basófilos 1 71 1 51 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 37 2923 36 3852 53 4187 34 2414 45 2295 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 316 4 428 4 316 5 355 5 255 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 241 369 258 275 222 150 - 450 Morfologia I I I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices ----------------------------------------------------------------------------------------------- 96

Avaliação hematológica das crianças do grupo controle paciente 350 paciente 352 paciente 355 paciente 357 paciente 359 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 5,19 4,86 4,92 4,99 4,72 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 13,6 12,9 12,7 13 12,2 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 43,4 39,9 42 42,7 39,5 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 84 82 85 86 84 77 - 95 HCM (pg) 26,2 26,6 25,7 25,9 25,8 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,4 32,4 30,1 30,3 30,8 31 - 37 RDW (%) 12,3 12,7 12,7 13 14,7 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 10.400 6.300 6.300 5.400 6.700 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 63 6552 51 3213 54 3402 49 2646 53 3551 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 2 208 2 126 1 63 3 162 2 134 2_5 157 - 385 Segmentados 61 6344 49 3087 53 3339 46 2484 51 3417 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 3 312 1 63 2 126 2 108 1 67 1_3 90 - 220 Basófilos 1 104 1 54 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 31 3224 45 2835 40 2520 45 2430 42 2814 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 312 3 189 4 252 3 162 4 201 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 181 311 266 185 192 150 - 450 Morfologia I I I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices ----------------------------------------------------------------------------------------------- 97

Avaliação hematológica das crianças do grupo controle paciente 362 paciente 363 paciente 364 paciente 371 paciente 373 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,52 5,03 4,57 4,62 4,91 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,8 13,9 12,2 12 13,1 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 41,2 44,7 38,3 38,1 42,2 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 91 89 84 82 86 77 - 95 HCM (pg) 28,3 27,5 26,8 25,9 26,6 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,1 31 31,9 31,4 31 31 - 37 RDW (%) 12,8 13,8 13 12,9 13,2 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 7.100 8.400 9.200 7.100 8.500 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 57 4047 55 4620 52 4784 59 4189 50 4250 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 3 142 2 184 2 142 2 170 2_5 157 - 385 Segmentados 55 3905 55 4620 50 4600 57 4047 48 4080 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 3 284 3 252 3 276 1 71 1 85 1_3 90 - 220 Basófilos 1 92 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 34 2414 39 3276 41 3772 38 2698 45 3825 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 5 355 3 252 3 276 3 213 4 340 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 318 437 381 307 283 150 - 450 Morfologia I I I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices ----------------------------------------------------------------------------------------------- 98

Avaliação hematológica das crianças do grupo controle paciente 375 paciente 377 paciente 385 paciente 389 paciente 392 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,6 5,26 4,6 4,5 4,94 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,1 13,2 12,8 12,4 12,5 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 38,4 43,6 40,9 38,6 39,8 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 83 83 89 86 81 77 - 95 HCM (pg) 26,3 25,1 27,7 27,6 25,3 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,5 30,3 31,2 32,2 31,4 31 - 37 RDW (%) 11,9 13,4 13,2 13,2 12,1 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 4.300 8.100 9.000 5.900 9.500 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 52 2236 57 4617 57 5130 51 3009 52 4940 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 2 86 3 243 1 90 5 295 2_5 157 - 385 Segmentados 50 2150 54 4374 56 5040 46 2714 52 4940 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 1 43 1 81 1 90 2 118 1 95 1_3 90 - 220 Basófilos 1 43 1 59 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 43 1849 38 3078 38 3420 42 2478 45 4275 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 129 4 324 4 360 4 236 2 190 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 231 226 226 307 373 150 - 450 Morfologia I I I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices ----------------------------------------------------------------------------------------------- 99

Avaliação hematológica das crianças do grupo controle paciente 405 paciente 411 paciente 417 paciente 419 paciente 427 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,35 4,54 4,61 4,92 5,2 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12 12,2 12,7 12,3 13,2 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 37,7 39,3 41,7 39,4 42,5 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 87 87 90 80 82 77 - 95 HCM (pg) 27,7 26,8 27,4 25 25,3 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,9 31 30,3 31,2 31 31 - 37 RDW (%) 11,9 12,6 13,3 13,1 13,4 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 6.100 9.100 9.200 8.900 10.300 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 53 3233 56 5096 65 5980 55 4895 51 5253 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 5 305 2 182 5 460 2 178 4 412 2_5 157 - 385 Segmentados 48 2928 54 4914 60 5520 53 4717 47 4841 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 1 61 1 91 2 184 3 267 3 309 1_3 90 - 220 Basófilos 1 61 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 42 2562 39 3549 30 2760 39 3471 42 4326 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 183 4 364 3 276 3 267 4 412 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 265 262 256 298 308 150 - 450 Morfologia I I I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

---------------------------------------------------------- Apêndices ---------------------------------------------------------100

Apêndice B - Resultados da eletroforese de hemoglobina e HPLC

Acetato de celulose HPLC Acetato de celulose HPLC Paciente Resultado Resultado Paciente Resultado Resultado

4 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 51 A + A2 A (97,4) + A2 (2,6) 8 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 52 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 9 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 53 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4)

10 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 54 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 11 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 55 A + F + A2 A (92,8) + F (4,3) + A2 (2,9) 12 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 56 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 13 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 57 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 14 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 58 A + A2 A (98,1) + A2 (1,9) 15 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 59 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 16 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 60 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 17 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 61 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 18 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 62 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 19 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 63 A + F + A2 A (94,4) + F (3,6) + A2 (2,0)

20 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 64 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 21 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 65 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 22 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 66 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 23 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 67 A + F + A2 A (94,0) + F (4,0) + A2 (2,0)

25 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 69 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 26 A + A2 A (97,3) + A2 (2,7) 70 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 27 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 71 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 28 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 72 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 29 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 73 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 30 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 74 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 31 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 75 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 32 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 76 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 33 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 79 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 34 A + S + A2 A (59,8) + S (32,6) + A2 (7,6) 80 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 35 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 82 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 36 A + C + A2 A (64,8) + C (32,8) + A2 (2,4) 83 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 37 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 84 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 38 A + A2 A (97,4) + A2 (2,6) 85 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 39 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 86 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 40 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 87 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 41 A + A2 A (97,3) + A2 (2,7) 88 A + A2 A (98,1) + A2 (1,9) 42 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 90 A + S + A2 A (57,6) + S (38,6) + A2 (3,8) 43 A + S + A2 A (63) + S (28,7) + A2 (8,3) 91 A + A2 A (95,7) + A2 (4,3) 44 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 92 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 45 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 93 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 46 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 94 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 47 A + A2 A (97,4) + A2 (2,6) 95 A + A2 A (97,3) + A2 (2,7) 48 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 96 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 49 A + A2 A (94,7) + F (2,9) + A2 (2,4) 97 A + A2 A (96,3) + A2 (3,7) 50 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 98 A + A2 A (95,2) + A2 (4,8)

Valor de referência: A > 95% / A2 = 2,0 - 3,7% / F < 1,0%

---------------------------------------------------------- Apêndices ---------------------------------------------------------101

Resultados da eletroforese de hemoglobina e HPLC Acetato de celulose HPLC Acetato de celulose HPLC

Paciente Resultado Resultado Paciente Resultado Resultado 99 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 141 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4)

101 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 142 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 102 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 143 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 103 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 144 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 104 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 146 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 105 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 147 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 106 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 148 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 107 A + S + A2 A (63,7) + S (29,5) + A2 (6,8) 149 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 108 A + A2 A (98,3) + A2 (1,7) 150 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 109 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 151 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 110 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 153 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 111 A + A2 A (97,4) + A2 (2,6) 154 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 112 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 155 A + A2 A (98,1) + A2 (1,9) 113 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 156 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 114 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 157 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 115 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 158 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 116 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 159 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 117 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 160 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 118 A + S + A2 A (62,1) + S(31,4) + A2 (6,5) 161 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 119 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 162 A + S + A2 A (62,4) + S (30,4) + A2 (7,2)

120 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 163 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 121 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 164 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 122 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 165 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 123 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 166 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 124 A + A2 A (98,1) + A2 (1,9) 167 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 125 A + A2 A (97,3) + A2 (2,7) 168 A + A2 A (98,2) + A2 (1,8) 126 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 169 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 127 A + S + A2 A (65,1) + S (32,6) + A2 (2,3) 170 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 128 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 171 A + S + A2 A (62,9) + S (29,4) + A2 (7,7)

129 A + A2 A (98,1) + A2 (1,9) 172 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 130 A + A2 A (98,3) + A2 (1,7) 173 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 131 A + A2 A (98,2) + A2 (1,8) 174 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 132 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 175 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 133 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 176 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 134 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 177 A + A2 A (98,1) + A2 (1,9) 135 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 178 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 136 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 179 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 137 A + A2 A (98,1) + A2 (1,9) 180 A + A2 A (98,4) + A2 (1,6) 138 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 181 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 139 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 182 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 140 A + S + A2 A (59,7)+F (1,5)+S(33,1)+A2 (5,7) 183 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2)

Valor de referência: A > 95% / A2 = 2,0 – 3,7% / F < 1,0%

---------------------------------------------------------- Apêndices ---------------------------------------------------------102

Resultados da eletroforese de hemoglobina e HPLC Acetato de celulose HPLC Acetato de celulose HPLC

Paciente Resultado Resultado Paciente Resultado Resultado 184 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 227 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 185 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 228 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 186 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 230 A + S + A2 A (59,1) + S (37,0) + A2 (3,9)

187 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 231 A + S + A2 A (75,3) + S (17,7) + A2 (7,0)

188 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 232 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 189 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 233 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 190 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 234 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 191 A + A2 A (98,6) + A2 (1,4) 235 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 192 A + A2 A (98,2) + A2 (1,8) 236 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 193 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 237 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 194 A + F + S + A2 A(58,7)+F(2,9)+S(29,8)+A2(8,6) 238 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 195 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 239 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 196 A + F + A2 A (93,4) + F (4,7) + A2 (1,9) 240 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 197 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 241 A + A2 A (97,4) + A2 (2,6) 198 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 242 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 199 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 243 A + A2 A (96,1) + F (1,4) + A2 (2,5)

200 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 244 A + A2 A (94,0) + A2 (6,0) 201 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 245 A + A2 A (96,5) + A2 (3,5) 202 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 246 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 203 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 247 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 204 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 248 A + A2 A (96,5) + A2 (3,5) 205 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 249 A + A2 A (96,4) + A2 (3,2) 206 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 250 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 207 A + F + A2 A (96,0) + F (1,9) + A2 (2,1) 251 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 208 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 252 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 209 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 253 A + A2 A (97,3) + A2 (2,7) 210 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 254 A + A2 A (97,2) + A2 (2,8) 211 A + A2 A (98,2) + A2 (1,8) 255 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 212 A + A2 A (98,6) + A2 (1,4) 256 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 213 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 258 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 214 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 259 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 215 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 261 A + A2 A (97,2) + A2 (2,8) 216 A + A2 A (98,3) + A2 (1,7) 262 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 217 A + A2 A (98,1) + A2 (1,9) 263 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 218 A + A2 A (98,0) + A2 (2,0) 264 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 219 A + S + A2 A (61,8) + S (31,5) + A2 (6,7) 266 A + A2 A (97,3) + A2 (2,7) 220 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 267 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 221 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 268 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 222 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 269 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 223 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 270 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 224 A + A2 A (97,4) + A2 (2,6) 272 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 225 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 273 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 226 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 274 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3)

Valor de referência: A > 95% / A2 = 2,0 - 3,7% / F < 1,0%

---------------------------------------------------------- Apêndices ---------------------------------------------------------103

Resultados da eletroforese de hemoglobina e HPLC Acetato de celulose HPLC Acetato de celulose HPLC

Paciente Resultado Resultado Paciente Resultado Resultado 281 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 325 A + A2 A (95,5) + F (1,2) + A2 (3,3)

282 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 326 A + A2 A (94,5) + A2 (5,5) 283 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 327 A + A2 A (96,3) + A2 (3,7) 284 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 328 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 285 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 329 A + S + A2 A (58,5) + S (37,2) + A2 (4,3)

286 A + A2 A (97,4) + A2 (2,6) 330 A + A2 A (96,4) + A2 (3,6) 287 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 331 A + A2 A (94,2) + A2 (5,8) 288 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 332 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 289 A + A2 A (97,4) + A2 (2,6) 333 A + A2 A (96,5) + A2 (3,5) 290 A + A2 A (97,2) + A2 (2,8) 334 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 291 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 335 A + A2 A (96,4) + A2 (3,5) 292 A + F + A2 A (95,2) + F (2,1) + A2 (2,7) 336 A + A2 A (96,4) + A2 (3,6) 293 A + A2 A (97,6) + A2 (2,4) 337 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 294 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 338 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 295 A + A2 A (97,3) + A2 (2,7) 339 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 296 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 340 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 297 A + S + A2 A (58,9) + S (37,2) + A2 (3,9) 342 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 298 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 343 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 299 A + A2 A (96,4) + A2 (3,6) 344 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 300 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 345 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 301 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 346 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 302 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 347 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 303 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 348 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 304 A + A2 A (96,5) + A2 (3,3) 349 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 305 A + A2 A (97,2) + A2 (2,8) 350 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 306 A + F + A2 A (91) + F (3,4) + A2 (5,6) 351 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 307 A + A2 A (97,3) + A2 (2,7) 352 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 308 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 353 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 309 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 354 A + A2 A (97,2) + A2 (2,8) 310 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 355 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 311 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 356 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 312 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 357 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 313 A + A2 A (96,4) + A2 (3,6) 358 A + F + A2 A (94,2) + F (2,7) + A2 (3,1)

314 A + A2 A (95,0) + A2 (5,0) 359 A + A2 A (97,8) + A2 (2,2) 315 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 360 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 316 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 361 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0)

Valor de referência: A > 95% / A2 = 2,0 – 3,7% / F < 1,0%

---------------------------------------------------------- Apêndices ---------------------------------------------------------104

Resultados da eletroforese de hemoglobina e HPLC Acetato de celulose HPLC Acetato de celulose HPLC

Paciente Resultado Resultado Paciente Resultado Resultado 362 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 405 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 363 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 406 A + A2 A (96,5) + A2 (3,5) 364 A + A2 A (96,5) + A2 (3,3) 407 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 365 A + A2 A (97,9) + A2 (2,1) 408 A + A2 A (96,5) + A2 (3,3) 366 A + A2 A (95,0) + A2 (5,0) 409 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 367 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 410 A + A2 A (96,5) + A2 (3,3) 368 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 411 A + A2 A (97,5) + A2 (2,5) 369 A + F + A2 A (89,2) + F (7,8) + A2 (3,0) 412 A + A2 A (95,4) + F (1,2) + A2 (3,4)

371 A + A2 A (96,5) + A2 (3,3) 413 A + A2 A (96,5) + A2 (3,5) 372 A + A2 A (96,5) + A2 (3,4) 414 A + A2 A (97,2) + A2 (2,8) 373 A + A2 A (96,5) + A2 (3,3) 415 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 374 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 416 A + A2 A (95,2) + A2 (4,7) 375 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 417 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 376 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 418 A + A2 A (96,5) + A2 (3,3) 377 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 419 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 378 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 420 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 379 A + A2 A (97,3) + A2 (2,7) 421 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 380 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 422 A + A2 A (95,0) + A2 (5,0) 381 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 423 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 382 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 424 A + A2 A (94,4) + A2 (5,6) 383 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 425 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 384 A + F + A2 A (93,7) + F (3,8) + A2 (2,5) 426 A + A2 A (96,4) + A2 (3,2) 385 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 427 A + A2 A (96,5) + A2 (3,5) 386 A + A2 A (95,7) + F (1,3) + A2 (3,0) 428 A + A2 A (96,4) + A2 (3,2) 387 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 429 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 388 A + A2 A (96,5) + A2 (3,4) 430 A + A2 A (94,3) + A2 (5,7) 389 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 431 A + A2 A (96,4) + A2 (3,2) 390 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 432 A + A2 A (96,4) + A2 (3,6) 391 A + A2 A (97,7) + A2 (2,3) 433 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 392 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 434 A + A2 A (96,6) + A2 (3,4) 393 A + A2 A (95,8) + F (1,0) + A2 (3,2) 435 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 394 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 436 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 395 A + A2 A (97,0) + A2 (3,0) 437 A + A2 A (96,7) + A2 (3,3) 396 A + A2 A (96,5) + A2 (3,5) 438 A + F + A2 A (96,5) + F (1,6) + A2 (1,9)

397 A + A2 A (96,8) + A2 (3,2) 439 A + A2 A (96,7) + A2 (3,3) 398 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 440 A + A2 A (96,5) + A2 (3,5) 399 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 441 A + A2 A (96,4) + A2 (3,6) 400 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 442 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9) 401 A + A2 A (95,2) + A2 (4,7) 443 A + A2 A (96,4) + A2 (3,2) 402 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 444 A + A2 A (96,4) + A2 (3,2) 403 A + A2 A (96,9) + A2 (3,1) 404 A + A2 A (97,1) + A2 (2,9)

Valor de referência: A > 95% / A2 = 2,0 - 3,7% / F < 1,0%

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 105

Apêndice C - Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 18(alfa-tal.) paciente 34 (HbS/HbA2) paciente 36 (Hb AC) paciente 43 (HbS/HbA2) paciente 49 (Hb F) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,36 3,99 4,24 5,13 5,10 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 10,2 11,1 10,1 12,8 11,6 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 34,6 35,9 34,6 43,1 40,8 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 79,0 90,0 82,0 84,0 80,0 77 - 95 HCM (pg) 23,4 27,7 23,8 24,9 22,6 25 - 33 CHCM (g/dl) 29,4 30,8 29,1 28,7 28,3 31 - 37 RDW (%) 14,2 12,6 13,3 12,2 13,4 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 6.000 4.600 7.300 10.900 6.500 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 53 3180 47 2162 62 4526 48 5232 54 3510 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 4 240 3 138 1 73 2 218 2 130 2_5 157 - 385 Segmentados 49 2940 44 2024 61 4453 46 5014 52 3380 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 2 120 4 184 1 73 2 218 3 195 1_3 90 - 220 Basófilos 1 60 1 65 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 40 2400 45 2070 33 2409 46 5014 36 2340 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 240 4 184 4 292 4 436 6 390 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 261 267 339 306 258 150 - 450 Morfologia II I IV II IV / Poiq.(hem.alvo) I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 106

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 55(HbF) paciente 63(HbF) paciente 67(HbF) paciente 90(HbS/HbA2) paciente 91(beta-tal.) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 5,66 4,84 4,7 4,55 4,42 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 10,9 9,5 10,5 11,2 12,8 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 38,8 34,0 36,2 37,3 40,6 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 69,0 70,0 77,0 82,0 92,0 77 - 95 HCM (pg) 19,2 19,6 22,2 24,5 28,9 25 - 33 CHCM (g/dl) 28,0 27,9 28,9 29,9 31,5 31 - 37 RDW (%) 15,2 14,0 14,1 13,7 13 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 6.000 6.800 7.800 6.300 10.700 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 65 3900 46 3128 68 5304 38 2394 49 5243 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 4 240 2 136 7 546 1 107 2_5 157 - 385 Segmentados 61 3660 44 2992 61 4758 38 2394 48 5136 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 2 120 5 340 1 78 7 441 12 1284 1_3 90 - 220 Basófilos 1 107 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 29 1740 45 3060 27 2106 52 3276 35 3745 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 240 4 272 4 312 3 189 3 321 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 246 292 252 239 215 150 - 450 Morfologia IV / Poiq.(hem.alvo) IV / Poiq.(hem.alvo) IV/Poiq.(hem.alvo) II I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 107

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 97(alfa-tal.) paciente 98(alfa/beta tal.) paciente 107(HbS/HbA2) paciente 115(alfa-tal.) paciente 118(HbS/HbA2) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,81 4,83 4,4 5,32 5,13 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 11,3 11,6 11,5 10,6 13 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 38,3 37,2 37 36,2 41,3 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 80,0 77,0 84 68 81 77 - 95 HCM (pg) 23,5 24,0 26,2 19,9 25,3 25 - 33 CHCM (g/dl) 29,6 31,1 31,2 29,3 31,5 31 - 37 RDW (%) 13,5 12,8 13,5 15,4 13 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 7.800 5.700 8.000 5.400 10.500 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 55 4290 50 2850 59 4720 48 2592 65 6825 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 2 156 2 108 4 420 2_5 157 - 385 Segmentados 53 4134 50 2850 59 4720 46 2484 61 6405 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 8 624 2 114 1 80 4 216 1 105 1_3 90 - 220 Basófilos 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 34 2652 45 2565 36 2880 45 2430 30 3150 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 234 3 171 4 320 3 162 4 420 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 315 196 315 366 268 150 - 450 Morfologia II II I / Poiq(hem.crenadas) IV/Poiq(elipt./hem.alvo) I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 108

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 119(alfa-tal.) paciente 120(alfa-tal.) paciente 127(Hb AS) paciente 128(alfa-tal.) paciente 133(alfa-tal.) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,46 3,8 4,46 4,86 4,34 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 11,4 10,3 11,6 12,2 10,5 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 36,7 32,7 37,7 38,9 33,5 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 82 86 85 80 77 77 - 95 HCM (pg) 25,7 27,1 25,9 25,1 24,2 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,2 31,5 30,7 31,3 31,4 31 - 37 RDW (%) 14 12,8 13,5 12,9 13,9 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 5.500 9.400 9.500 4.800 6.100 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 47 2585 73 6862 51 4845 59 2832 67 4087 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 3 165 4 376 2 190 2 96 1 61 2_5 157 - 385 Segmentados 44 2420 69 6486 49 4655 57 2736 66 4026 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 3 282 8 760 1 48 5 305 1_3 90 - 220 Basófilos 1 48 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 50 2750 21 1974 38 3610 35 1680 24 1464 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 165 3 282 3 285 4 192 4 244 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 297 325 371 280 222 150 - 450 Morfologia V/Poiq.(hem.alvo) V/Poiq(elip./hem.crenadas) I/Poiq.(hem.alvo) I IV/Poiq. (eliptocitos) I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 109

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 138(alfa-tal.) paciente 140(HbS/BbA2) paciente 146(alfa-tal.) paciente 162(HbS/HbA2) paciente 165(alfa-tal.) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,81 4,33 4,76 4,9 4,83 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 11,9 11,4 11 12,8 12,2 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 39 36,8 36,3 38,1 39,4 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 81 85 76 78 82 77 - 95 HCM (pg) 24,7 26,4 23,1 26,1 25,2 25 - 33 CHCM (g/dl) 30,5 31 30,2 33,4 30,9 31 - 37 RDW (%) 13,9 13,2 13,6 14,8 14,5 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 7.400 6.700 5.300 4.900 6.700 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 53 3922 58 3886 53 2809 35 1715 36 2412 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 1 74 3 201 2 106 2 98 3 201 2_5 157 - 385 Segmentados 52 3848 55 3685 51 2703 33 1617 33 2211 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 6 444 2 134 5 265 4 196 7 469 1_3 90 - 220 Basófilos 1 67 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 38 2812 36 2412 39 2067 57 2793 51 3417 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 222 4 268 3 159 3 147 5 335 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 278 207 279 258 254 150 - 450 Morfologia IV I III I V/Poiq.(eliptocitos) I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 110

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 168(alfa-tal.) paciente 171(HbS/HbA2) paciente 194(HbS/HbA2) paciente 196(HbF) paciente 199(alfa-tal.) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 5,59 4,63 4,54 4,4 3,77 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 11,4 12 12,9 11,4 10,8 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 37,9 38,7 37,4 36,8 32,3 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 68 84 82 84 86 77 - 95 HCM (pg) 20,4 25,9 28,5 25,9 28,7 25 - 33 CHCM (g/dl) 30,1 30,9 34,6 31 33,4 31 - 37 RDW (%) 16 14,5 14,3 14,6 14,7 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 9.400 5.300 8.500 10.200 7.400 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 56 5264 58 3074 49 4165 64 6528 39 2886 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 2 188 3 159 1 85 1 102 2_5 157 - 385 Segmentados 54 5076 55 2915 48 4080 63 6426 39 2886 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 5 470 3 159 3 255 7 714 10 740 1_3 90 - 220 Basófilos 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 35 3290 35 1855 45 3825 26 2652 48 3552 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 376 4 212 3 255 3 306 3 222 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 343 211 257 342 288 150 - 450 Morfologia IV I I V/Poiq.(eliptocitos) I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 111

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 201(alfa-tal.) paciente 207(HbF) paciente 217(alfa-tal.) paciente 219(HbS/HbA2) paciente 230HbS/HbA2) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,46 4,03 4,95 4,42 4,75 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 10,9 11,1 10,7 10,9 13 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 33,7 34,2 36,4 35,7 41 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 76,5 85 73 81 86 77 - 95 HCM (pg) 24,8 27,6 21,7 24,8 27,4 25 - 33 CHCM (g/dl) 32,5 32,4 29,5 30,6 31,7 31 - 37 RDW (%) 14,8 15,1 14,6 14,6 13,7 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 2.000 6.200 6.700 5.400 8.000 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 40 800 68 4216 61 4087 52 2808 53 4240 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 7 140 1 62 2 134 1 54 2_5 157 - 385 Segmentados 33 660 67 4154 59 3953 51 2754 53 4240 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 5 100 1 62 2 134 5 270 3 240 1_3 90 - 220 Basófilos 1 80 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 51 1020 28 1736 31 2077 40 2160 40 3200 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 80 3 186 3 201 3 162 3 240 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 185 370 227 201 311 150 - 450 Morfologia IV/Poiq.(hem.alvo) V III/Poiq.(hem.alvo) II I/Poiq.(hem.alvo) I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 112

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 231(HbS/HbA2) paciente 236(alfa-tal.) paciente 243(HbF) paciente 244(beta-tal.) paciente 250(alfa-tal.) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,8 4,31 4,63 4,29 4,79 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12 11,4 12,2 11,2 11,1 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 39,6 35,6 38,9 35,9 36,4 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 82 83 84 84 76 77 - 95 HCM (pg) 25 26,6 26,2 26 23,3 25 - 33 CHCM (g/dl) 30,4 32,1 31,2 31,1 30,6 31 - 37 RDW (%) 13,6 12,9 13,5 12,5 14 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 10.200 5.000 8.700 7.500 4.500 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 63 6426 54 2700 52 4524 63 4725 40 1800 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 1 102 5 250 3 261 4 300 1 45 2_5 157 - 385 Segmentados 62 6324 49 2450 49 4263 59 4425 39 1755 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 2 204 14 700 14 1218 1 75 11 495 1_3 90 - 220 Basófilos 1 45 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 31 3162 29 1450 30 2610 33 2475 45 2025 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 408 3 150 4 348 3 225 3 135 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 327 255 301 303 289 150 - 450 Morfologia I I I I/Poiq(hem.crenadas) III/Poiq(hem.crenadas) I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 113

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 275(HbF) paciente 277(HbF) paciente 292(HbF) paciente 297(HbS/HbA2) paciente 306(beta-tal.) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,01 4,15 4,79 4,71 5,97 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 11,1 11,6 12,6 11,9 9,8 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 35,9 36,9 40,1 36,9 35,7 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 90 89 84 78 60 77 - 95 HCM (pg) 27,8 28 26,3 25,3 16,4 25 - 33 CHCM (g/dl) 31 31,5 31,4 32,3 27,4 31 - 37 RDW (%) 15,2 13,7 13,3 15,1 16,7 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 6.400 14.700 8.500 8.800 11.000 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 61 3904 76 11172 49 4165 57 5016 44 4840 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 3 192 5 735 1 85 6 528 1 110 2_5 157 - 385 Segmentados 58 3712 71 10437 48 4080 51 4488 43 4730 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 3 192 6 882 2 170 13 1430 1_3 90 - 220 Basófilos 1 147 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 33 2112 15 2205 45 3825 39 3432 37 4070 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 192 2 294 4 340 4 352 6 660 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 255 282 326 392 320 150 - 450 Morfologia V I I V IV(hem.alvo/esferocitos) I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 114

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 311(alfa-tal.) paciente 312(alfa-tal.) paciente 314(beta-tal.) paciente 315(alfa-tal.) paciente 318(alfa-tal.) Valores de referência

GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,54 4,62 4,66 4,44 4,24 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 11 11,3 11,6 11 10,3 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 35,2 36,8 37,7 36,4 34 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 78 80 81 82 80 77 - 95 HCM (pg) 24,2 24,4 25 24,9 24,4 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,2 30,6 30,9 30,3 30,4 31 - 37 RDW (%) 14,2 14,6 14 14,7 12,9 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 8.700 6.500 12.500 7.900 10.700 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 66 5742 41 2665 63 7875 51 4029 56 5992 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 2 174 4 260 3 375 3 321 2_5 157 - 385 Segmentados 64 5568 37 2405 60 7500 51 4029 53 5671 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 2 130 5 625 1 79 1 107 1_3 90 - 220 Basófilos 1 65 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 30 2610 53 3445 28 3500 43 3397 39 4173 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 348 3 195 4 500 5 395 3 321 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 272 270 344 293 359 150 - 450 Morfologia II II/Pioq.(hem.alvo) I/Poiq.(hem.alvo) IV/Poiq.(eliptocitos) II/Poiq.(eliptocitos) I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 115

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 324(beta-tal.) paciente 325(HbF) paciente 326(beta-tal.) paciente 329(HbS/HbA2) paciente 331(beta-tal.) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,32 4,65 4,82 4,96 5,78 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 11,6 12,2 12,9 12,5 9,4 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 38,7 39,3 40,2 41,2 33,6 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 90 84 84 83 58 77 - 95 HCM (pg) 26,9 26,2 26,7 25,3 16,3 25 - 33 CHCM (g/dl) 30 31 32 30,4 28,1 31 - 37 RDW (%) 12,9 12,5 13,4 13,9 16,3 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 7.500 7.400 6.500 7.000 5.700 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 50 3750 64 4736 55 3575 68 4760 60 3420 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 1 74 2 130 4 280 1 57 2_5 157 - 385 Segmentados 50 3750 63 4662 53 3445 64 4480 59 3363 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 1 74 1 65 1 70 1_3 90 - 220 Basófilos 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 47 3525 32 2368 40 2600 25 1750 36 2052 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 225 3 222 4 260 4 280 4 228 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 298 333 286 202 269 150 - 450 Morfologia I/Poiq.(eliptocitos) I I I/Poiq.(hem.alvo) IV/Poiq.(hem.alvo/dacriocitos) I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 116

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 358(HbF) paciente 366(beta-tal.) paciente 369(HbF) paciente 384(HbF) paciente 386(HbF) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,87 4,91 4,4 4,45 4,91 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,4 12,4 11,7 12 11,6 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 40,2 39,4 38,4 39,1 38,6 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 82 80 87 88 79 77 - 95 HCM (pg) 25,5 25,3 26,7 26,9 23,6 25 - 33 CHCM (g/dl) 30,9 31,6 30,6 30,6 30 31 - 37 RDW (%) 13,5 13,9 12,6 12,3 13,2 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 7.000 8.700 8.100 11.300 11.700 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 54 3780 55 4785 40 3240 64 7232 56 6552 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 3 210 2 174 3 243 5 565 3 351 2_5 157 - 385 Segmentados 51 3570 53 4611 37 2997 59 6667 53 6201 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 2 140 1 87 17 1377 3 339 2 234 1_3 90 - 220 Basófilos 1 70 1 113 1 117 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 40 2800 40 3480 39 3159 29 3277 37 4329 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 210 4 348 4 324 3 339 4 468 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 268 381 296 465 265 150 - 450 Morfologia I I I I II/Poiq.(eliptocitos) I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 117

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 401(beta-tal.) paciente 403(alfa-tal.) paciente 409(alfa-tal.) paciente 412(HbF) paciente 416(alfa/beta tal.) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,65 4,35 4,91 4,5 4,87 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,2 10,7 11,7 12,4 11,4 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 39,5 35,2 38,9 39 38,1 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 85 81 79 87 78 77 - 95 HCM (pg) 26,3 24,6 23,9 27,6 23,4 25 - 33 CHCM (g/dl) 31 30,4 30,2 31,8 29,9 31 - 37 RDW (%) 13 14,1 13,3 12,5 12,7 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 10.200 8.500 7.500 5.700 6.700 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 46 4692 38 3230 57 4275 55 3135 46 3082 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 2 170 2 150 3 171 4 268 2_5 157 - 385 Segmentados 46 4692 36 3060 55 4125 52 2964 42 2814 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 4 408 1 85 2 150 1 57 5 335 1_3 90 - 220 Basófilos 1 85 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 46 4692 56 4760 38 2850 41 2337 46 3082 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 408 4 340 3 225 3 171 3 201 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 253 264 265 236 233 150 - 450 Morfologia I II/Poiq. (eliptocitos) II I II/Poiq. (eliptocitos) I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 118

Avaliação hematológica dos portadores de hemoglobinopatias paciente 422(beta-tal.) paciente 424(beta-tal.) paciente 425(alfa-tal.) paciente 430(beta-tal.) paciente 438(HbF) Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,6 4,4 4,9 4,8 4,6 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,1 11,8 11,4 12,7 11,9 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 39,5 38,4 38 41,6 38,3 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 86 87 78 87 83 77 - 95 HCM (pg) 26,3 26,8 23,3 26,6 25,8 25 - 33 CHCM (g/dl) 30,6 30,8 30,1 30,7 31 31 - 37 RDW (%) 13 13,6 13,4 13,7 13,6 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 10.000 5.800 8.400 8.200 5.600 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 50 5000 32 1856 61 5124 64 5248 55 3080 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 3 300 2 168 1 82 2 112 2_5 157 - 385 Segmentados 47 4700 32 1856 59 4956 63 5166 53 2968 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 7 700 4 232 1 84 3 246 1 56 1_3 90 - 220 Basófilos 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 39 3900 60 3480 34 2856 30 2460 40 2240 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 400 4 232 4 336 3 246 4 224 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 297 285 290 262 309 150 - 450 Morfologia I I II I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

---------------------------------------------------------- Apêndices ---------------------------------------------------------119

Apêndice D - Níveis de ferritina dos participantes do estudo participante ferritina participante ferritina participante ferritina participante ferritina

1 40 45 64,7 94 32,3 138 67,3 2 43,4 46 83,3 95 48,6 139 67,6 3 47,6 47 46,5 96 56,1 140 52,5 4 51 48 31,3 97 99,8 141 47,3 5 52,4 49 72,2 98 14,4 142 56,3 6 31,5 50 43,7 99 63,4 143 49,5 7 78,8 51 26,2 101 58,4 144 33 8 20,9 52 31,9 102 29,6 146 49,6 9 17 53 27,3 103 83,8 147 48,1

10 54,6 54 25,4 104 97,7 148 26,2 11 53 55 22,9 105 53,5 149 47,5 12 37,6 56 46,2 106 30 150 81,4 13 8 57 56,7 107 41,8 151 27,1 14 26,2 58 70,6 108 86,5 153 40,6 15 44,3 59 62 109 62,7 154 47,7 16 44 60 73,1 110 25,8 155 19,5 17 56,8 61 39,2 111 54,1 156 41,2 18 36,7 62 37,9 112 56,7 157 90,9 19 7,4 63 52,8 113 19,7 158 45,3 20 54,9 64 52,4 114 27,3 159 38,3 21 72,9 65 107 115 59,3 160 46,9 22 78,8 66 27,8 116 79,5 161 44,7 23 82,3 67 70,8 117 31,9 162 51,8 25 38,5 69 73,6 118 55,8 163 45,4 26 72,6 70 40,5 119 67,5 164 35,8 27 103 71 81,9 120 67,9 165 55,1 28 52,6 73 40,9 121 52,7 166 74,1 29 63,7 74 38,3 122 14,7 167 40,5 30 41,6 75 36,9 123 39,7 168 57,8 31 51,9 76 57,1 124 26,2 169 93 32 30,4 79 31,5 125 57,5 170 36,4 33 44,7 80 41,4 126 69,8 171 52,5 34 126 82 47,2 127 40,9 172 36,2 35 55,4 83 43,9 128 66,4 173 31,5 36 30,6 84 57,3 129 62,2 174 124 37 85,1 85 51,6 130 15,8 175 65,5 38 47,3 86 28,8 131 31,8 176 73,9 39 22,5 87 87,8 132 21,1 177 22,4 40 124 88 100 133 48,7 178 53,8 41 36,3 90 46,3 134 91 179 65,1 42 87,8 91 35,4 135 22,3 180 72,2 43 39,2 92 15,4 136 36,8 181 112 44 35,7 93 32,5 137 82,2 182 42,3

Valor de referência: ferritina > 30 ng/mL (Dimitriou et al., 2000)

---------------------------------------------------------- Apêndices ---------------------------------------------------------120

Níveis de ferritina dos participantes do estudo participante ferritina participante ferritina participante ferritina participante ferritina

183 131 226 92,4 275 42,2 318 95,3 184 44,8 227 43,1 276 45,8 319 59 185 31,5 228 53,8 277 88,9 322 91,5 186 52,5 231 30,9 278 139 323 75 187 35,7 232 79,1 279 47,9 324 46 188 18,4 233 56,8 280 40,2 325 36,6 189 82,1 234 35,4 281 39,2 326 39 190 25,9 235 41,6 282 57,1 327 49,7 191 68,6 236 47,4 283 71,1 328 133 192 17,3 237 41 284 44,1 329 116 193 49,5 238 56,2 285 36,5 330 15,7 194 26,7 239 76,6 286 91,4 331 94,9 195 15,9 240 62,6 287 65 332 57,6 196 39,9 241 12,2 288 33,3 333 14,6 197 31,7 242 11,5 289 31,9 334 108 198 39,7 243 102 290 31,4 335 55,6 199 41,2 244 89,9 291 44,3 336 70,3 200 57,7 245 65,1 292 97,9 337 41,2 201 81,5 246 74,5 293 43 338 39,2 202 81,5 247 64,3 294 33 339 99,1 203 117 248 39,3 295 35,5 340 64,7 204 56,1 249 11,3 296 55,3 341 50,1 205 36,8 250 48,9 297 84,5 342 68 206 74,8 251 32,5 298 46 343 157 207 49,7 252 20,6 299 31 344 18,2 208 80,7 253 30,8 300 35,3 345 41,1 209 54,2 254 29,5 301 95,9 346 31,6 210 54,2 255 81 302 35,8 347 15,9 211 74,1 256 31,7 303 59 348 75,1 212 57,8 258 40,9 304 59,5 349 54,7 213 99,5 259 116 305 36,3 350 56,3 214 125 261 60,8 306 104 351 47 215 55,5 262 28,7 307 31,3 352 51,2 216 48,1 263 80,9 308 42,4 353 42,6 217 54,6 264 75,2 309 42,1 354 44 218 44 266 20,9 310 58 355 81 219 98,2 267 45,8 311 75,5 356 60,8 220 47,6 268 51,4 312 40,5 357 71 221 43,1 269 31,3 313 52,2 358 36,5 222 49,3 270 49,7 314 20,2 359 74 223 60,8 272 44,7 315 45,7 360 45,5 224 46,6 273 34,3 316 78,8 361 86,7 225 55,1 274 34,7 317 43,2 362 63,6

Valor de referência: ferritina > 30 ng/mL (Dimitriou et al., 2000)

---------------------------------------------------------- Apêndices ---------------------------------------------------------121

Níveis de ferritina dos participantes do estudo participante ferritina participante ferritina

363 63,3 408 114 364 42,2 409 36,4 365 66,1 410 14,9 366 40,9 411 61,6 367 34,2 412 101 368 20,3 413 38,5 369 54,9 414 34,5 371 59 415 70,9 372 89,2 416 33,9 373 63,3 417 47,6 374 55,8 418 15,3 375 57,4 419 43,8 376 74,3 420 37,7 377 44 421 41,5 378 18 422 34 379 36,5 423 30,8 380 16,7 424 38,8 381 82 425 71,2 382 54,2 426 40,9 383 43,7 427 82,8 384 69,4 428 106 385 49,8 429 35,8 386 37,9 430 55,4 387 122 431 21 388 30,4 432 32,3 389 97,7 433 15,4 390 84 434 78,1 391 201 435 40,9 392 102 436 65,2 393 59,2 437 35,6 394 56,4 438 65,9 395 77,6 439 42,1 396 19,1 440 55,4 397 12,1 441 53,6 398 71,4 442 67,1 400 54,5 443 37,2 401 52,3 444 19 402 88,1 403 33,7 404 36,8 405 52,2 406 18,6 407 37,3

Valor de referência: ferritina > 30 ng/mL (Dimitriou et al., 2000)

---------------------------------------------------------- Apêndices ---------------------------------------------------------122

Apêndice E - Status férrico das crianças com ferritina < 30 ng/mL pacientes sTfR (nmol/L) sTfR (mg/L) ferritina (ng/mL) log/ferritina sTfR/logferritina

8 34 2,89 20,9 1,32 25,75 9 43,3 3,68 17 1,23 35,19

13 46,8 3,98 8 0,90 51,82 14 30,8 2,62 26,3 1,42 21,69 19 42 3,57 7,4 0,87 48,32 39 33,6 2,86 22,5 1,35 24,85 51 27,5 2,34 26,2 1,42 19,39 53 20,2 1,72 27,3 1,44 14,07 54 33,7 2,86 25,4 1,40 23,99 55 30,9 2,63 22,9 1,36 22,72 66 21,5 1,83 27,8 1,44 14,89 86 31,7 2,69 28,8 1,46 21,72 92 56,8 4,83 15,4 1,19 47,83 98 39,4 3,35 14,4 1,16 34,01

102 40,7 3,46 29,6 1,47 27,66 110 24,3 2,07 25,8 1,41 17,21 113 39,5 3,36 19,7 1,29 30,51 114 32,3 2,75 27,3 1,44 22,49 122 34,3 2,92 14,7 1,17 29,38 124 46,8 3,98 26,2 1,42 33,00 130 49,7 4,22 15,8 1,20 41,46 132 30,7 2,61 21,1 1,32 23,18 135 23,1 1,96 22,3 1,35 17,13 148 32,5 2,76 26,2 1,42 22,91 151 36,2 3,08 27,1 1,43 25,26 155 34 2,89 19,5 1,29 26,36 177 32,3 2,75 22,4 1,35 23,92 188 31,7 2,69 18,4 1,26 25,06 190 31,1 2,64 25,9 1,41 22,01 192 32,1 2,73 17,3 1,24 25,93 194 23,4 1,99 26,7 1,43 16,40 195 26,3 2,24 15,9 1,20 21,89 241 36,2 3,08 12,2 1,09 33,32 242 44,2 3,76 11,5 1,06 41,67 249 37,5 3,19 11,3 1,05 35,61 252 21,1 1,79 20,6 1,31 16,06 254 22,4 1,90 29,5 1,47 15,24 262 25,3 2,15 28,7 1,46 17,35 266 19,8 1,68 20,9 1,32 15,00 314 26,8 2,28 20,2 1,31 20,53 330 32,1 2,73 15,7 1,20 26,84 333 32,1 2,73 14,6 1,16 27,57 344 32 2,72 18,2 1,26 25,40 347 37 3,15 15,9 1,20 30,80 368 31,4 2,67 20,3 1,31 24,02

---------------------------------------------------------- Apêndices ---------------------------------------------------------123

Status férrico das crianças com ferritina < 30 ng/mL pacientes sTfR (nmol/L) sTfR (mg/L) ferritina (ng/mL) log/ferritina sTfR/logferritina

378 31 2,64 18 1,26 24,70 380 35,2 2,99 16,7 1,22 28,79 396 21,8 1,85 19,1 1,28 17,02 397 34,2 2,9 12,1 1,08 31,59 406 32,8 2,79 18,6 1,27 25,84 410 23 1,96 14,9 1,17 19,60 418 24 2,04 15,3 1,18 20,26 431 31,9 2,71 21 1,32 24,13 433 32,4 2,75 15,4 1,19 27,28 444 21,8 1,85 19 1,28 17,05

média 32 2,93 18,77 1,29 24,75 DP 6,9 0,68 4,33 0,14 7,15

Resultados do status férrico dos portadores de DF pacientes sTfR (nmol/L) sTfR (mg/L) ferritina (ng/mL) log/ferritina sTfR/logferritina

8 34 2,89 20,9 1,32 25,75 9 43,3 3,68 17 1,23 35,19

13 46,8 3,98 8 0,90 51,82 14 30,8 2,62 26,3 1,42 21,69 39 33,6 2,86 22,5 1,35 24,85 92 56,8 4,83 15,4 1,19 47,83 98 39,4 3,35 14,4 1,16 34,01

102 40,7 3,46 29,6 1,47 27,66 113 29,5 2,51 19,7 1,29 22,79 114 32,3 2,75 27,3 1,44 22,49 122 34,3 2,92 14,7 1,17 29,38 124 46,8 3,98 26,2 1,42 33,00 130 49,7 4,22 15,8 1,20 41,46 148 32,5 2,76 22,6 1,35 24,00 151 36,2 3,08 27,1 1,43 25,26 155 34 2,89 19,5 1,29 26,36 190 31,1 2,64 25,9 1,41 22,01 192 32,1 2,73 17,3 1,24 25,93 242 44,2 3,76 11,5 1,06 41,67 330 32,1 2,73 15,7 1,20 26,84 333 32,1 2,73 14,6 1,16 27,57 344 32 2,72 18,2 1,26 25,40 347 37 3,15 15,9 1,20 30,80 368 31,4 2,67 20,3 1,31 24,02 378 31 2,64 18 1,26 24,70 433 32,4 2,75 15,4 1,19 27,28

média 36,7 3,12 18,81 1,26 29,6 DP 7 0,6 5,42 0,13 7,9

Valores de Referência - ferritina > 30 ng/mL sTfR > 30,8 nmol/l

sTfR/log ferritina - cut off 23,9 nmol/l (Dimitriou et al., 2000)

---------------------------------------------------------- Apêndices ---------------------------------------------------------124

Status férrico dos portadores de ADF pacientes sTfR (nmol/L) sTfR (mg/L) ferritina (ng/mL) log/ferritina sTfR/logferritina

19 42 3,57 7,4 0,87 48,32 54 31,9 2,71 25,4 1,40 22,71 55 30,8 2,62 22,9 1,36 22,65 86 31,7 2,69 28,8 1,46 21,72 132 30,7 2,61 21,1 1,32 23,18 177 32,3 2,75 22,4 1,35 23,92 188 31,7 2,69 18,4 1,26 25,06 241 36,2 3,08 12,2 1,09 33,32 249 37,5 3,19 11,3 1,05 35,61 380 35,2 2,992 16,7 1,22 28,79 431 31,9 2,7115 21 1,32 24,13 397 34,2 2,91 12,1 1,08 31,59 406 32,8 2,79 18,6 1,27 25,84

média 33,7 2,86 18,3 1,23 28,2

DP 3,24 0,27 6,19 0,17 7,5

Status férrico do grupo controle pacientes sTfR (nmol/L) sTfR (mg/L) ferritina (ng/mL) log/ferritina sTfR/logferritina

15 19,5 1,66 44,3 1,65 11,84 104 20,1 1,71 97,7 1,99 10,10 105 18,8 1,60 53,5 1,73 10,88 109 22 1,87 62,7 1,80 12,24 116 23 1,96 79,5 1,90 12,10 121 15,8 1,34 52,7 1,72 9,18 123 23 1,96 40 1,60 14,36 134 21,5 1,83 91 1,96 10,97 142 20,9 1,78 56,3 1,75 11,94 150 25,9 2,20 81,4 1,91 13,56 255 19 1,62 81 1,91 9,96 263 9,9 0,84 80,9 1,91 5,19 310 25 2,13 58 1,76 14,18 350 24,9 2,12 56,3 1,75 14,22 352 30 2,55 51,2 1,71 17,55 355 26,8 2,28 81 1,91 14,04

média 24,78 1,83 66,7 1,8 13,76

DP 6,26 0,4 12,64 0,12 3,88

Valores de Referência - ferritina > 30 ng/mL sTfR > 30,8 nmol/l

sTfR/log ferritina - cut off 23,9 nmol/l (Dimitriou et al., 2000)

---------------------------------------------------------- Apêndices ---------------------------------------------------------125

Status férrico dos portadores de beta-talassemia pacientes sTfR (nmol/L) sTfR (mg/L) ferritina (ng/mL) log/ferritina sTfR/logferritina

91 32 2,72 35,4 1,55 20,66 98 47,5 4,04 14,4 1,16 41,01

244 42 3,57 89,9 1,95 21,50 306 37,4 3,18 104 2,02 18,54 314 32 2,72 20,2 1,31 24,51 324 37,4 3,18 46 1,66 22,49 326 37,4 3,18 39 1,59 23,51 331 47,5 4,04 94,9 1,98 24,02 366 31,4 2,67 40,9 1,61 19,48 401 29 2,465 52,3 1,71 16,95 416 30,8 2,62 33,9 1,53 20,13 422 31 2,64 34 1,53 20,24 424 32 2,72 38,8 1,59 20,14 430 30 2,55 55,4 1,74 17,21

média 35,5 3,01 49,9 1,63 22,1 DP 6,26 0,53 27,4 0,24 5,9

Status férrico dos portadores de alfa-talassemia pacientes sTfR (nmol/L) sTfR (mg/L) ferritina (ng/mL) log/ferritina sTfR/logferritina

18 30,9 2,62 36,7 1,56 19,74 97 32,3 2,75 99,8 2,00 16,16 98 47,5 4,04 14,4 1,16 41,01

115 31 2,64 59,3 1,77 17,48 119 30,5 2,59 67,5 1,83 16,67 128 30,8 2,62 66,4 1,82 16,90 133 30,9 2,63 48,7 1,69 18,31 138 29,5 2,51 67,3 1,83 16,14 146 32,1 2,72 49,6 1,69 18,90 165 29 2,47 55,1 1,74 16,66 168 31 2,64 57,8 1,76 17,59 199 30,5 2,59 41,2 1,61 18,89 201 29,9 2,54 81,5 1,91 15,64 217 31,5 2,68 54,6 1,74 18,13 236 30,8 2,62 47,4 1,68 18,38 250 31,5 2,68 48,9 1,69 18,65 311 32,2 2,73 40,5 1,87 17,21 312 30,8 2,62 40,5 1,61 19,16 315 34 2,89 45,7 1,66 20,48 318 32,1 2,72 95,3 1,98 16,22 398 32 2,72 71,4 1,85 17,26 403 31,7 2,69 33,7 1,53 20,75 409 31,9 2,71 36,4 1,56 20,43 416 31,8 2,7 33,9 1,53 20,78 425 33 2,81 71,2 1,85 17,81

Média 31,96 2,71 54,6 1,71 19,01 DP 3,4 0,29 19,8 0,17 4,82

Valores de Referência - ferritina > 30 ng/mL sTfR > 30,8 nmol/l

sTfR/log ferritina - cut off 23,9 nmol/l (Dimitriou et al., 2000)

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 126

Apêndice F - Avaliação hematológica dos portadores de ADF paciente 19 paciente 54 paciente 55 paciente 86 paciente 132 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,36 4,57 5,66 4,06 4,37 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 10,9 11,0 10,9 10,3 11,4 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 38,4 38,6 38,8 34,9 36,7 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 88,0 84,0 69,0 86,0 84 77 - 95 HCM (pg) 25,1 24,2 19,2 25,4 26,1 25 - 33 CHCM (g/dl) 28,4 28,6 28,0 29,5 31,1 31 - 37 RDW (%) 13,4 12,7 15,2 13,8 13,9 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 8.300 5.600 6.000 8.300 5.500 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 66 5478 35 1960 65 3900 61 5063 53 2915 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 4 332 2 112 4 240 1 83 1 55 2_5 157 - 385 Segmentados 62 5146 33 1848 61 3660 60 4980 52 2860 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 6 336 2 120 1 83 8 440 1_3 90 - 220 Basófilos 1 83 1 56 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 28 2324 54 3024 29 1740 34 2822 36 1980 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 5 415 4 224 4 240 4 332 3 165 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 249 221 246 316 247 150 - 450 Morfologia I / Poiq.(hem.alvo) II IV / Poiq.(hem.alvo) I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 127

Avaliação hematológica dos portadores de ADF paciente 177 paciente 188 paciente 241 paciente 249 paciente 380 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,41 4,52 4,17 4,91 4,54 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 9,7 10,6 11,2 11,3 11,4 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 34,2 36,4 34,8 36,3 37,1 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 77 81 83 74 82 77 - 95 HCM (pg) 21,9 23,5 26,9 23 25,1 25 - 33 CHCM (g/dl) 28,2 29,1 32,3 31,1 30,8 31 - 37 RDW (%) 16,9 15,7 11,6 14 14 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 7.100 8.400 5.900 4.100 7.800 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 58 4118 47 3948 50 2950 54 2214 63 4914 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 1 71 2 168 5 205 2_5 157 - 385 Segmentados 57 4047 45 3780 50 2950 49 2009 63 4914 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 7 497 1 84 1 59 1 41 7 546 1_3 90 - 220 Basófilos 1 71 1 59 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 30 2130 48 4032 45 2655 42 1722 27 2106 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 284 4 336 3 177 3 123 3 234 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 277 302 227 190 239 150 - 450 Morfologia IV IV/Poiq.(eliptócitos) I/Poiq.(eliptocitos) III I/Poiq.(hem.alvo/elipt.) I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 128

Avaliação hematológica dos portadores de ADF paciente 397 paciente 406 paciente 431 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,4 4,61 4,33 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 11,1 11,4 11,3 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 35,4 37,2 36,5 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 80 81 84 77 - 95 HCM (pg) 25,3 24,7 26 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,4 30,7 30,9 31 - 37 RDW (%) 14 13,1 13,5 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 8.800 7.700 8.600 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 49 4312 52 4004 47 4042 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 3 231 2_5 157 - 385 Segmentados 49 4312 49 3773 47 4042 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 3 264 9 774 1_3 90 - 220 Basófilos 1 77 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 45 3960 44 3388 40 3440 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 264 3 231 4 344 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 199 336 284 150 - 450 Morfologia I/Poiq.(hem.crenadas) II I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 129

Apêndice G - Avaliação hematológica dos portadores de DF paciente 8 paciente 9 paciente 13 paciente 14 paciente 39 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,33 5,06 5,19 5,23 4,47 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 11,8 12,0 13,6 14,2 11,8 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 37,9 39,5 44,8 44,8 39,6 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 87,0 78,0 86,0 86,0 89,0 77 - 95 HCM (pg) 27,2 23,8 26,1 27,1 26,4 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,1 30,5 30,2 31,6 29,8 31 - 37 RDW (%) 13,2 13,5 13,2 12,4 13,1 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 8.800 9.900 8.400 6.600 4.600 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 66 5808 56 5544 45 3780 63 4158 45 2070 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 1 88 3 297 4 336 3 198 1 46 2_5 157 - 385 Segmentados 65 5720 53 5247 41 3444 60 3960 44 2024 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 3 264 4 396 13 1092 1 66 6 276 1_3 90 - 220 Basófilos 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 28 2464 34 3366 38 3192 33 2178 45 2070 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 264 6 594 4 336 3 198 4 184 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 320 315 294 282 250 150 - 450 Morfologia I II I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 130

Avaliação hematológica dos portadores de DF paciente 92 paciente 98 paciente 102 paciente 113 paciente 114 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,36 4,83 4,51 4,96 4,5 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12 11,6 12,8 12,1 11,8 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 38,1 37,2 40,2 39,1 36,9 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 87,0 77,0 89,0 79 82 77 - 95 HCM (pg) 27,5 24,0 28,4 24,4 26,2 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,6 31,1 31,9 31 32 31 - 37 RDW (%) 13,2 12,8 13,3 13,4 13,6 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 10.800 5.700 6.800 6.800 7.100 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 66 7128 50 2850 63 4284 51 3468 57 4047 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 2 216 1 63 2_5 157 - 385 Segmentados 64 6912 50 2850 62 4216 51 3468 57 4047 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 3 324 2 114 4 272 2 136 1 71 1_3 90 - 220 Basófilos 1 63 1 68 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 28 3024 45 2565 26 1768 40 2720 39 2769 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 3 324 3 171 6 408 6 408 3 213 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 324 196 267 229 192 150 - 450 Morfologia I II I II V/Poiq. (eliptócitos) I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 131

Avaliação hematológica dos portadores de DF paciente 122 paciente 124 paciente 130 paciente 148 paciente 151 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,84 4,72 5,42 4,24 4,5 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,3 11,8 12 11,6 11,6 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 38,2 38,3 44 35,4 37,2 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 81 81 81 83 83 77 - 95 HCM (pg) 25,5 24,9 22,1 27,3 25,8 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,4 30,7 27,2 32,7 31,3 31 - 37 RDW (%) 13,1 12,7 12,9 13,6 13 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 7.400 4.100 7.800 4.900 7.600 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 43 3182 65 2665 55 4290 45 2205 57 4332 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 1 74 2 156 4 196 3 228 2_5 157 - 385 Segmentados 42 3108 65 2665 53 4134 40 1960 54 4104 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 16 1184 1 41 1 78 1 49 2 152 1_3 90 - 220 Basófilos 1 74 1 49 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 36 2664 31 1271 40 3120 49 2401 37 2812 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 296 3 123 4 312 4 196 4 304 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 285 296 295 255 192 150 - 450 Morfologia I/Poiq. (eliptocitos) II II I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 132

Avaliação hematológica dos portadores de DF paciente 155 paciente 190 paciente 192 paciente 242 paciente 330 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 5,22 4,71 4,39 4,68 4,51 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 12,2 13,2 11,6 11,7 12,3 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 39,1 41,7 37,8 37,1 38,7 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 75 89 86 79 86 77 - 95 HCM (pg) 23,4 28,1 26,4 25,1 27,3 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,2 31,8 30,6 31,6 31,8 31 - 37 RDW (%) 13,5 13,8 13,8 13,6 12,9 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 6.500 6.100 4.600 5.400 8.100 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 52 3380 58 3538 44 2024 35 1890 51 4131 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 3 195 2 122 3 138 1 54 1 81 2_5 157 - 385 Segmentados 49 3185 56 3416 41 1886 34 1836 50 4050 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 8 520 6 366 4 184 12 648 2 1_3 90 - 220 Basófilos 1 54 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 35 2275 33 2013 49 2254 49 2646 43 3483 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 5 325 3 183 3 138 3 162 4 324 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 253 288 283 275 316 150 - 450 Morfologia III I /Poiq.(eliptocitos) I I I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 133

Avaliação hematológica dos portadores de DF paciente 333 paciente 344 paciente 347 paciente 368 paciente 378 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,19 4,65 4,62 5,07 4,68 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 11,6 12 11,7 12,4 12 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 37,3 39,7 37,5 39,8 39,4 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 89 85 81 79 84 77 - 95 HCM (pg) 27,7 25,7 25,4 24,4 25,6 25 - 33 CHCM (g/dl) 31,2 30,1 31,3 31,1 30,4 31 - 37 RDW (%) 13,1 12,6 13,5 13 12,8 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 4.800 8.300 8.300 6.400 7.600 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 % mm3 Neutrófilos 55 2640 49 4067 56 4648 45 2880 45 3420 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 1 48 3 249 2 166 3 192 2_5 157 - 385 Segmentados 54 2592 46 3818 54 4482 42 2688 45 3420 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 5 240 7 581 1 83 2 128 2 152 1_3 90 - 220 Basófilos 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 36 1728 40 3320 40 3320 49 3136 49 3724 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 192 4 332 3 249 4 256 4 304 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 220 218 267 324 197 150 - 450 Morfologia I I I II I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose

II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) Poiq. - Poiquilocitose

------------------------------------------------------------------------------------------------Apêndices --------------------------------------------------------------------------------------------- 134

Avaliação hematológica dos portadores de DF paciente 433 Valores de referência GLÓBULOS VERMELHOS Eritrócitos (milhões/mm3) 4,54 4,6 - 5,2 Hemoglobina (g/dl) 11,8 11,5 - 15,0 Hematócrito (%) 38,6 35 - 45 INDICES HEMATIMÉTRICOS VCM (fl) 85 77 - 95 HCM (pg) 25,9 25 - 33 CHCM (g/dl) 30,5 31 - 37 RDW (%) 13,4 11,0 - 15,0 GLÓBULOS BRANCOS Leucócitos /mm3 8.700 4.5 - 13.5 % mm3 % mm3 Neutrófilos 59 5133 38 - 66 2340 - 5720 Mielócitos Metamielócitos Bastonetes 3 261 2_5 157 - 385 Segmentados 56 4872 36 - 61 2182 - 5335 Eosinófilos 1 87 1_3 90 - 220 Basófilos 1 87 0 - 1 22,5 - 55 Linfócitos 35 3045 20 - 42 1395 - 3410 Monócitos 4 348 3_7 225 - 550 Plaquetas (mil/mm3) 356 150 - 450 Morfologia I I

Descrição da morfologia: I - normocromia/normocitose II - hipocromia/normocitose III - hipocromia/microcitose IV - hipocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos) V - normocromia/anisocitose (micrócitos e macrócitos)

ANEXOS

------------------------------------------------------------ Anexos -----------------------------------------------------------136

Anexo A

Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa

------------------------------------------------------------ Anexos -----------------------------------------------------------137

Anexo B

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Nome da criança: _________________________________________________

Fui convidado a participar do estudo “UTILIZAÇÃO DE BIOMARCADORES DE DOSE INTERNA PARA DETERMINAÇÃO DE CCHHUUMMBBOO EE SSUUAA CCOORRRREELLAAÇÇÃÃOO CCOOMM AANNEEMMIIAA EE PPOOLLIIMMOORRFFIISSMMOOSS DDAA AALLAADD EE DDOO GGEENNEE RREECCEEPPTTOORR DDAA VVIITTAAMMIINNAA DD””, e por este instrumento de autorização, na qualidade de _________________________________________________ autorizo que o menor ________________________________________________________________ participe da pesquisa.

Justificativa: A contaminação por chumbo pode fazer muito mal às crianças e por isso o interesse em descobrir se as crianças apresentam ou não chumbo nos dentes, saliva e sangue. Objetivo: Correlacionar os níveis de chumbo encontrados na saliva, dentes e sangue com anemia. Procedimentos: Serão feitos exames clínicos rápidos, contagem de cárie, manchas no esmalte, coleta de saliva, DNA, amostras de sangue e um teste de esmalte para coletar pequena amostra de cálcio do dente, que será reposta pela aplicação de flúor gel. Desconfortos: quanto aos teste no esmalte e coletas de saliva, não há possibilidade de causarem desconforto ou trauma para a criança. A coleta de sangue pode causar algum desconforto inerente a este procedimento, mas que será realizado por profissional habilitado para fazer coleta de sangue. Riscos: Não haverá utilização de qualquer tipo de procedimento que traga risco aos participantes. Benefícios: esta pesquisa tratá informações importantes para a comunidade e para os indivíduos que participarem do estudo sobre contaminação por chumbo e sua correlação com anemia. Métodos alternativos: este estudo visa justamente buscar métodos alternativos para determinação da exposição ao chumbo, por isso, usamos os melhores métodos aceitos até o momento e não há métodos alternativos a esses. Forma de assistência e responsável: as crianças que participarão deste estudo já fazem parte de programa de atendimento odontológico existente nas escolas em que estudam. Se ocorrer algum imprevisto durante a execução dos procedimentos desta pesquisa, os pesquisadores se comprometem a prestar assistência (CD. Glauce Regina Costa de Almeida – Avenida do Café, S/N - Departamento de Morfologia, Estomatologia e Fisiologia - Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – Tel: 9119-3418). Esclarecimentos antes e durante a pesquisa sobre a metodologia: Se houver qualquer dúvida não esclarecida neste documento, o pai/mãe/responsável poderá procurar a CD Glauce Regina Costa de Almeida para maiores esclarecimentos. Liberdade de recusar ou retirar o consentimento sem penalização: para fazer parte do estudo a criança deve ter a autorização assinada e estar com vontade de participar, havendo plena liberdade para a criança deixar de participar da pesquisa em qualquer momento, sem que esta decisão implique em qualquer prejuízo para a criança. Garantia de sigilo e privacidade: esta pesquisa é científica e poderá ser publicada em jornais, revistas e/ou congressos científicos no país e no exterior, mantendo-se o sigilo e repeitando-se o código de Defesa do Menor e do Adolescente. Não está previsto o ressarcimento de despesas, uma vez que os sujeitos da pesquisa serão examinados nas próprias creches onde estudam mediante seu consentimento e sem nenhum custo adicional. Não está prevista qualquer forma de indenização referente a possíveis danos, visto que não existe essa possibilidade por se tratar somente de exames clínicos por visualização, coleta de saliva e teste de esmalte para coleta de quantidade mínima de minerais (cálcio) da superfície de um dente, sem riscos à saúde. Estou ciente de que esta pesquisa tem como responsável a Profª Drª Raquel Fernanda Gerlach e a Pós-Graduanda Glauce Regina Costa de Almeida.

Assino este documento de livre e espontânea vontade, estando ciente do seu conteúdo.

_____________________________, ______ de ________________ de 200___

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Assinatura do pai/mãe/responsável

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Profª Drª. Raquel F. Gerlach CD. Glauce Regina Costa de Almeida