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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DOS RECEPTORES DA

ADENOSINA SOBRE A AÇÃO CARDIOPROTETORA DA

ESPIRONOLACTONA E EPLERENONA EM

CARDIOMIÓCITOS DE RATO

Ouro Preto – MG

2016

GABRIELA DE OLIVEIRA FARIA

ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DOS RECEPTORES DA ADENOSINA

SOBRE A AÇÃO CARDIOPROTETORA DA ESPIRONOLACTONA E

EPLERENONA EM CARDIOMIÓCITOS DE RATO

Orientador: Prof. Dr. Mauro César Isoldi

Ouro Preto – MG

2016

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte

integrante dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em

Ciências Biológicas, área de concentração Bioquímica

Metabólica e Fisiológica.

Dedico este trabalho aos meus pais Agenor e Iolanda,

à minha irmã Aline e ao Gustavo pelo amor e apoio

durante essa caminhada. Dedico também à Milla pela

ajuda e solidariedade durante todo o tempo.

Agradecimentos

Agradeço primeiramente a Deus pelo dom da vida e pelas bênçãos concedidas.

À minha família, em especial ao meu pai Agenor por me proporcionar incondicional

apoio, orientação e incentivo para realizar meus sonhos, sempre com sabedoria e pés no chão. À

minha mãe Iolanda, minha irmã Aline pelo apoio nas horas difíceis e por compartilhar as alegrias

nas vitórias.

Agradeço de forma muito especial ao Gustavo que, mesmo de longe, desde o início dessa

caminhada me apoiou em cada situação adversa, me dando seus sábios conselhos, ombro amigo

sempre disponível, carinho e amor que foram imprescindíveis para conseguir continuar a

caminhar. Sua paciência e apoio foram fundamentais para chegar ao fim dessa trajetória. Muito

obrigada amor!

Agradeço a meu orientador Prof. Dr. Mauro César Isoldi pela oportunidade de iniciar no

trabalho científico. Com sua filosofia de trabalho aprendi e cresci muito nesses anos de

laboratório. Meu imenso obrigada à Milla, minha “mãe” na ciência. Milla, foi um prazer

trabalhar com você! Passamos muitos apertos juntas, mas com certeza aprendemos e

amadurecemos muito! Serei sempre grata por sua disponibilidade para ajudar, ensinar, fazer

companhia que seja. Você é um exemplo de dedicação e amizade e sentirei sua falta. Obrigada

por tudo!

Obrigada a toda equipe do Laboratório de Hipertensão pelos ensinamentos, ajuda sempre

disponíveis e pela boa companhia. Durante meus 6 anos de LH, o laboratório foi uma segunda

casa para mim e vocês, definitivamente colaboraram para isso tornando meus dias muito mais

agradáveis.

Muito obrigada ao prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade pelos ensinamentos e

colaboração, e a todo pessoal do Laboratório de Enzimologia e Proteômica pela receptividade

e boa vontade durante os períodos em que lá estive preparando amostras para os experimentos

de HPLC e Espectometria de Massas. Milton, sem sua ajuda não sei se conseguiria chegar aos

resultados. Agradeço também à Ananda Lima Sanson, técnica de nível superior do Laboratório

de Caracterização Molecular e Espectrometria de Massas da UFOP, responsável pela leitura

das minhas amostras no equipamento. Muito obrigada!

Agradeço ao professor Dr. Luís Carlos Crocco Afonso e ao Laboratório de

Imunoparasitologia pela disponibilidade de empréstimo de equipamentos. Agradeço de forma

muito especial à professora Dra. Silvana de Queiroz Silva, demais professores e equipe do

Laboratório de Biologia e Tecnologia de Microrganismos (LBTM) da UFOP pelo apoio e

empréstimos realizados. Me sinto praticamente parte dessa equipe! Muito obrigada!

Agradeço aos professores do NUPEB que de alguma forma contribuíram para a realização

deste trabalho tirando dúvidas, dando conselhos ou até mesmo emprestando algum material

necessário para a execução dos experimentos. Agradeço ainda ao Centro de Ciência Animal da

UFOP, em especial à Lorena, pelo cuidado correto para com os animais, proporcionando um

bom trabalho.

À FAPEMIG e ao CNPq pelo apoio financeiro, e à Fundação Gorceix, em especial à

Aline que tanto ajudou durante o processo de aquisição de materiais e controle dos gastos do

projeto, muito obrigada.

Agradeço também à Ana Cláudia, Karininha, Jéssica, Renatinha, Laila e Brab que,

nesses últimos 2 anos, em momentos diferentes, foram mais do que colegas de república e sim

amigas e companheiras para todas as horas. Com vocês dividi minhas lutas, vitórias, alegrias e

tristezas. Vocês são muito importantes pra mim!

Meu sincero obrigada ao “PIVICantina” pelos momentos descontraídos, sempre com

discussões de alto nível, apesar de bem mais raros que na época da graduação. Ao nosso professor

orientador Dr. Fábio, à Ana Maria Sampaio Rocha, eterna Miss Mariana, Brab, Léozinho,

Felipe, Nalaura, Silêncio e Bruninha à distância. Ter vocês como amigos é uma honra.

Passamos muitos momentos sensacionais juntos e, com certeza vocês serão o maior motivo de

saudade que já sinto em não estar mais em Ouro Preto. Amocês demais da conta!!!

Brab, te agradeço de forma especial, pois, além da parceria (sempre certa e eficaz) nos

trabalhos desde os tempos da graduação, enfrentamos o desafio do mestrado juntas. Você se

tornou uma grande amiga e, convivendo com você no dia-a-dia aprendi que a vida é muito mais

do que fazemos dentro da universidade. Obrigada por me ouvir nos momentos difíceis, por sua

sinceridade nas opiniões e sincera disposição a ajudar sempre, enfim, pelo companheirismo que

foi mais importante para mim do que possa imaginar. Muito obrigada!

A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização desse trabalho e para

minha formação, meu muito obrigada.

Resumo

Adenosina, e os fármacos espironolactona e eplerenona são conhecidos cardioprotetores.

Fármacos com esse perfil costumam mimetizar a ação da adenosina, que pode interagir com

cardiomiócitos através de quatro receptores (A1R, A2AR, A2BR e A3R). Nosso objetivo foi testar

a ação de dois conhecidos cardioprotetores, os antagonistas do receptor MR espironolactona e

eplerenona, assim como da adenosina e seus antagonistas como controle. Culturas primárias de

cardiomiócitos de ratos neonatos da linhagem Wistar foram utilizadas em ensaios onde foram

simuladas as condições de pré- e pós-condicionamentos isquêmicos. Nossos resultados

demonstraram que, por meio de análise de viabilidade celular por MTT, os danos sofridos pelos

cardiomiócitos, impostos pela isquemia, foram igualmente revertidos por espironolactona,

eplerenona e pela adenosina. Entretanto, ao associa-los a antagonistas dos receptores da

adenosina A1R, e A3R no pré-condicionamento e A2AR e A2BR no pós-condicionamento, não

houve diferença significativa na proteção das células em condições isquêmicas. Ao dosar a

adenosina por espectrometria de massas nas amostras de cardiomiócitos submetidos a isquemia,

observamos adenosina detectada e mostramos, pela primeira vez, que houve aumento na

concentração de adenosina nas células tratadas com espironolactona no pré-condicionamento e

no tratamento com eplerenona no pós-condicionamento farmacológico. As amostras do grupo

normóxia, no entanto, não apresentaram adenosina detectada. A análise conjunta dos nossos

resultados comprova o efeito protetor da espironolactona, eplerenona e adenosina em condições

de isquemia, além disso, na presença desses antagonistas do MR houve uma maior

disponibilidade de adenosina, agente associado a todo um quadro direto e indireto de proteção

cardíaca em estados de isquemia. Esses resultados nos levam a crer que há mediação entre a ação

da espironolactona e eplerenona com a adenosina, contudo parece ocorrer por outro mecanismo

que não via ligação aos receptores da adenosina. Adicionalmente, nossos resultados são

consequentes de uma análise aguda, feita 18 horas após os tratamentos, podendo não ter sido

tempo suficiente para observar os resultados consequentes dessa possível mediação de ação entre

receptores da adenosina e espironolactona e eplerenona.

Se por um lado a reperfusão é necessária para a sobrevivência do tecido, por outro a

reperfusão em si pode também causar danos teciduais, fato denominado lesão de reperfusão.

Abstract

Adenosine as well as eplerenone and spironolactone display cardioprotective effects. Drugs

with this profile tend to mimic the actions of adenosine, which interact with cardiomyocytes via

four receptors (A1R, A2ARs, A2BR and A3R). Primary neonatal rat cardiomyocyte cultures from

Wistar rat were used in trials where the conditions of pre- and postischemic conditioning was

simulated. Our aim was test the cardioprotective effect of two known MR antagonists,

spironolactone and eplerenone, as well as adenosine and its antagonist as a control. Per cell

viability analysis by MTT, our results demonstrated that the damage sustained by

cardiomyocytes, imposed by ischemia, were equally reversed by spironolactone, eplerenone and

by adenosine. However, by associating them to A1R and A3R antagonists at preconditioning and

A2ARs and A2BR at postconditioning, there was no significant difference in protecting cells in

ischemic conditions. Adenosine was dosed by mass spectrometry in the samples of

cardiomyocytes underwent ischemia, where adenosine was detected and, for the first time, we

show there was an increase of the concentration of adenosine in cells treated with spironolactone

at preconditioning and posttreatment with eplerenone as pharmacological postconditioning.

However, samples of normoxia group showed no detected adenosine. The analysis of our results

demonstrates the protective effect of spironolactone, eplerenone and adenosine in ischemic

conditions. In addition, the presence of these MR antagonists there was a greater availability of

adenosine, agent associated directly and indirectly with protection to the heart ischemic. These

results lead us to believe that there is a mediation between the action of spironolactone and

eplerenone with adenosine however it seems to occur by other mechanism than via binding to

adenosine receptors. In addition, our results are consequent of an acute analysis made 18 hours

after treatment and may not have been enough time to observe the consequent results of possible

mediation action of adenosine receptors and spironolactone and eplerenone.

Lista de Ilustrações

Figura 1: Fotos de dois corações de porcos submetidos ao infarto evidenciando a área infartada

em cor mais clara (coloração trifenil tetrazólio). ........................................................................ 20

Figura 2: Esquema ilustrativo dos ciclos de isquemia-reperfusão do pré-condicionamento

isquêmico. ................................................................................................................................... 21

Figura 3: Esquema da ativação da via RISK induzida por receptor opióide. ............................ 22

Figura 4: Esquema ilustrativo dos ciclos de isquemia-reperfusão do pós-condicionamento

isquêmico. ................................................................................................................................... 23

Figura 5: Vias de sinalização desencadeadas no pré- e pós-condicionamento isquêmico. ....... 24

Figura 6: Esquema resumindo as vias de sinalização envolvidas no condicionamento isquêmico

..................................................................................................................................................... 25

Figura 7: Estrutura química da adenosina. ................................................................................ 26

Figura 8: Esquema ilustrativo das vias de produção e degradação da adenosina. ..................... 27

Figura 9: Vias de sinalização envolvidas na ativação dos receptores de adenosina. ................. 28

Figura 10: Fórmulas estruturais dos antagonistas do receptor mineralocorticóide da aldosterona.

..................................................................................................................................................... 30

Figura 11: Cromatograma e espectro de massas obtidos da amostra “espironolactona” do pré-

condicionamento. ........................................................................................................................ 47

Figura 12: Cromatograma e espectro de massas obtidos da amostra “controle” do pré-


Figura 13: Cromatograma e espectro de massas obtidos da amostra “controle” do pós-


Figura 14: Cromatograma e espectro de massas obtidos da amostra “controle” normóxia. ..... 49

https://d.docs.live.net/8861ed9428c7bd54/Dissertação%20-%20Versão%20final.docx#_Toc462389145

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Lista de Gráficos

Gráfico 1: Análise do dano isquêmico mediante exposição dos cardiomiócitos a condições de

isquemia ..................................................................................................................................... 46

Gráfico 2: Análise da ação da espironolactona, eplerenona e adenosina no pré-condicionamento

e no pós-condicionamento farmacológico .................................................................................. 50

Gráfico 3: Análise da ação dos antagonistas dos receptores A1R e A3R da adenosina no pré-

condicionamento farmacológico ................................................................................................ 51

Gráfico 4: Análise da ação dos antagonistas dos receptores A2AR e A2BR da adenosina no pós-

condicionamento farmacológico ................................................................................................ 51

Gráfico 5: Análise da ação dos antagonistas dos receptores A1R e A3R da adenosina associados

à espironolactona no pré-condicionamento farmacológico ........................................................ 52

Gráfico 6: Análise da ação dos antagonistas dos receptores A2AR e A2BR da adenosina associados

à espironolactona no pós-condicionamento farmacológico ........................................................ 53

Gráfico 7: Análise da ação dos antagonistas dos receptores A1R e A3R da adenosina associados

à eplerenona no pré-condicionamento farmacológico ................................................................ 53

Gráfico 8: Análise da ação dos antagonistas dos receptores A2AR e A2BR da adenosina associados

à eplerenona no pós-condicionamento farmacológico ................................................................ 54

Lista de Tabelas

Tabela 1: Composição da solução de BRDU [10-2M] (5-Bromo-2'-deoxiuridina) .................... 38

Tabela 2: Composição do meio de cultura normal ..................................................................... 38

Tabela 3: Composição da solução tampão de digestão .............................................................. 38

Tabela 4: Composição do meio de cultura para isquemia .......................................................... 38

Tabela 5: Composição da solução de parada para evitar degradação da adenosina .................. 38

Tabela 6: Concentração de adenosina detectada nos cromatogramas para amostras dos grupos

normóxia, pré-condicionamento e pós-condicionamento ........................................................... 49

Tabela 7: Informações gerais dos antagonistas do MR, espironolactona, eplerenona, canrenona

e finerenona ................................................................................................................................ 74

Lista de Abreviaturas

A1R Receptor da adenosina subtipo A1R

A2AR Receptor da adenosina subtipo A2AR

A2BR Receptor da adenosina subtipo A2BR

A3R Receptor da adenosina subtipo A3R

AC Adenilato Ciclase

ADA Adenosinas deaminase

ADO Adenosina

Akt Serina/Treonina Quinase (ou Proteína Quinase B – PKB)

AMP Adenosina monofosfato

AMPc Adenosina monofosfato cíclico

ANOVA Análise de variância

AP1 Ativador de proteína 1

ATP Adenosina trifosfato

AVE Acidente Vascular Encefálico

BAY60-6583 Agonista do receptor A2A da adenosina

BAY94-8862 Antagonista do MR Finerenona

BRDU 5-Bromo-2'-deoxyuridine

Ca2+ Íon cálcio

CCA Centro de Ciência Animal

CCPA Agonista do receptor A1 da adenosina

CEUA Comitê de Ética de Uso Animal

CI-IB-MECA Agonista do receptor A3R da adenosina

CO2 Dióxido de Carbono

COX-2 Ciclooxigenase (também conhecida como prostaglandina G/H sintetase)

DPCPX Antagonista do receptor A1R da adenosina

DAG Diacilglicerol

DMEN Dulbeco´s Modified Eagle Medium

DMSO Dimetilsulfóxido

ECA Enzima conversora de angiotensina

eNOS Óxido nítrico sintase endotelial

EPHESUS Eplerenone Heart failure na Survival study – Principal estudo clínico sobre

eplerenona

ERK 1/2 Quinase regulada por sinais extracelulares tipo 1/2

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

Gi Proteína G inibitória

GMPc Guanosina 3’,5’-monofosfato cíclico

Gq Proteína G tipo q

GR Receptor glicocorticoide

Gs Proteína G estimulatória

H+ Íon hidrogênio

HC Hospital das Clínicas

HPLC-MS High performance liquid chromatography- mass spectrometry – Cromatografia

Líquida de Alta Performance – Espectometria de Massas

HSPs Heat shock protein – Proteínas de choque térmico

IAM Infarto Agudo do Miocárdio

IC Insuficiência cardíaca

InCor Instituto do Coração

IP3 Inositol trifosfato

I-R Isquemia-Reperfusão

KATP Canais de potássio sensíveis a ATP

LDH Enzima Lactato Desidrogenase

MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno

MEK 1/2 Proteína quinase ativada por mitógeno tipo 1/2

MR Receptor mineralocorticoide

MRS 1523 Antagonista do receptor A3R da adenosina

MRS 1706 Antagonista do receptor A2BR da adenosina

MTT Brometo de 3-4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5-difeniltetrazólio

m/z Massa/carga

N2 Gás nitrogênio

n.d. Não detectado

NFκB Fator de transcrição NF-kappaB

NO Óxido nítrico

NrF2 Fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2

O2 Gás oxigênio

p38 Subfamília de proteína quinase MAPK

p70S6K Proteína S6 quinase 1

PCI Pré-condicionamento isquêmico

PCIR Pré-condicionamento remoto

PI3K Enzima fosfatidilinositol-3-quinase

PIP2 Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato

PKA Proteína quinase A

PKC Proteína quinase C

PLC Fosfolipase C

PTK Proteína tirosina quinase

PTPM Poros de transição de permeabilidade mitocondrial

q.s.p Quantidade suficiente para

RAF Proteína quinase específica para Ser/Thr

RALES Randomized Aldosterone Evaluation Study – Principal estudo clínico sobre

espironolactona

RISK Reperfusion Injury Salvage Kinase – Quinases de salvamento da lesão de

reperfusão

ROS Espécie reativa de oxigênio

rpm Rotações por minuto

SAH S-adenosil-homocisteína

SCH58261 Antagonista do receptor A2A da adenosina

SD Linhagem de rato – Spreague Dawley

SEM Erro padrão da média

SRAA Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona

STAT Transdutor de sinal e ativador de transcrição

T1/2 Tempo de meia-vida

tr Tempo de retenção

UFOP Universidade Federal de Ouro Preto

ZM 241385 Antagonista do receptor A2AR da adenosina

Sumário

1- INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 18

1.1- Epidemiologia ...................................................................................................................... 19

1.1. Condicionamento Isquêmico ..................................................................................... 20

1.2. Adenosina .................................................................................................................... 26

1.3. Receptores da adenosina ............................................................................................ 28

1.4. Antagonistas do receptor mineralocorticoide da aldosterona (MR) ..................... 29

1.5. Antagonistas do receptor mineralocorticóide (MR), receptores de adenosina e o

condicionamento isquêmico .................................................................................................. 31

2- OBJETIVOS ....................................................................................................................... 34

OBJETIVO GERAL ................................................................................................................... 35

3- METODOLOGIA ............................................................................................................... 36

3.1. Animais ........................................................................................................................ 37

3.2. Cultura Primária de Cardiomiócitos........................................................................ 37

3.3. Soluções Utilizadas nos Ensaios ................................................................................ 37

3.4. Desenho experimental ................................................................................................ 39

3.5. Indução da isquemia in vitro ..................................................................................... 40

3.6. Validação do método de isquemia in vitro ................................................................ 41

3.7. Determinação da adenosina em cardiomiócitos ventriculares de ratos neonatos sob

condições de isquemia ........................................................................................................... 42

3.8. Avaliação da possível ação da espironolactona e eplerenona mediada pelos receptores

da adenosina (A1R, A2AR, A2BR e A3R) em condições de isquemia .................................. 43

3.9. Análise estatística ........................................................................................................... 44

4- RESULTADOS .................................................................................................................. 45

4.1. Validação do método de Isquemia in vitro .......................................................................... 46

4.2. Determinação da adenosina em cardiomiócitos ventriculares de ratos neonatos sob

condições de isquemia ........................................................................................................... 46

4.3. Espironolactona e eplerenona x Antagonistas da adenosina em condições de isquemia

................................................................................................................................................. 50

5- DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 55

6- CONCLUSÃO .................................................................................................................... 60

7- REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 62

8- ANEXOS ............................................................................................................................ 73

18

1- INTRODUÇÃO

Introdução

19

1.1- Epidemiologia Doenças cardiovasculares estão entre as doenças não contagiosas que mais levam a óbito

segundo a Organização Mundial da Saúde. Estimativa feita no ano de 2012 mostrou que das 56

milhões de mortes no mundo, cerca de 36 milhões foram consequentes de doenças não

contagiosas como diabetes (4%), doenças respiratórias crônicas (10,7%), câncer (21,7%) e

doenças cardiovasculares (46,2% ou 17,6 milhões de pessoas). Uma projeção estima que o

número de mortes por doenças cardiovasculares passará de 17,6 milhões ocorridas em 2012 para

22,2 milhões no ano de 2030 (WHO – World Health Organization, 2014).

Dados do Ministério da Saúde mostram que as doenças cardiovasculares foram

responsáveis por 29,4% das mortes no Brasil, isto é, 308 mil pessoas morreram principalmente

por infarto e acidente vascular encefálico (AVE) no ano de 2007 (Portal da Saúde). Segundo o

DATASUS/MS, o número de óbitos causados por doenças cardiovasculares entre 2006 a 2013

foi de 3.153.175, equivalente a 40 mortes por segundo (Portal da Sociedade Brasileira de

Cardiologia – Cardiômetro).

Diante destes números, é evidente que doenças cardiovasculares são um problema de saúde

pública importante e, estudos voltados à prevenção e tratamento são essenciais para reduzir a

morbidade e mortalidade dos pacientes.

Segundo Nicolau e colaboradores (1999), a hipertensão é um dos fatores de risco mais

importantes para o desenvolvimento de infarto agudo do miocárdio (IAM) (Nicolau et al., 1999).

O coração infartado tem seu tecido lesionado podendo levar à arritmia e insuficiência cardíaca.

No caso específico do IAM, clinicamente, a meta é restabelecer o fluxo sanguíneo para a área

isquêmica o mais rapidamente possível para evitar maiores danos celulares que poderiam ser

provocados pela isquemia. Se por um lado a reperfusão é necessária para a sobrevivência do

tecido, por outro a reperfusão em si pode também causar danos teciduais, fato denominado lesão

de reperfusão. Os danos provocados pelo processo de isquemia-reperfusão atingem as

mitocôndrias de forma significativa, nas quais ocorre redução na síntese de ATP, aumento no

acúmulo de cálcio e acentuada geração de espécies reativas de oxigênio, acarretando em lesões

e morte celular (Silva Jr. et al., 2002). Dessa forma, também já foi demonstrado que células

viáveis, mesmo após a isquemia, no ato da reperfusão sofrem necrose, o que pode contribuir para

até 50% da área infartada final, mitigando os benefícios da reperfusão (Bulluck e Hausenloy,

2015).

Introdução

20

Encontrar uma forma de tornar as células cardíacas resistentes à morte por isquemia-

reperfusão (I-R) é um alvo terapêutico pertinente para promover cardioproteção. Dentre as

formas de minimizar esses efeitos estão o uso de antagonistas do receptor mineralocorticoide da

aldosterona (MR) e o condicionamento isquêmico.

1.1. Condicionamento Isquêmico

Condicionamento isquêmico é o termo usado, atualmente, que engloba estratégias

cardioprotetoras endógenas, baseadas em ciclos breves de isquemia-reperfusão, sejam elas

aplicadas diretamente no coração como no pré-condicionamento isquêmico e no pós-

condicionamento isquêmico, ou indiretamente como é o caso do pré-condicionamento remoto.

Além da completa reperfusão, o condicionamento isquêmico é conhecido como a intervenção

mais poderosa na redução da área infartada (Figura 1) (Hausenloy e Yellon, 2016).

Figura 1: Fotos de dois corações de porcos submetidos ao infarto evidenciando a área infartada em cor mais clara

(coloração trifenil tetrazólio). A primeira imagem mostra um coração onde não houve proteção e a segunda de um

coração protegido. Ao lado, um gráfico mostra a área infartada em relação ao fluxo sanguíneo residual. Fonte:

(Heusch, 2015).

1.1.1. Pré-condicionamento isquêmico (PCI)

Descrito pela primeira vez em 1986 por Murry e colaboradores, o pré-condicionamento

isquêmico (PCI) é caracterizado por breves episódios de isquemia seguida de reperfusão,

realizados antes de um episódio isquêmico longo. Estudando cães, Murry e colaboradores

demonstraram que era possível proteger o coração dos danos causados pelo infarto ao executar

4 ciclos de 5 minutos de oclusão da artéria coronária esquerda, intercalados por 5 minutos de

reperfusão realizados antes da oclusão prolongada (Fig. 2). Este procedimento foi capaz de

reduzir 75% do dano promovido pela isquemia em comparação ao grupo controle, não submetido

aos ciclos de isquemia-reperfusão (Murry et al., 1986).

Introdução

21

Figura 2: Esquema ilustrativo dos ciclos de isquemia-reperfusão do pré-condicionamento isquêmico.

Após sua descoberta, a função protetora do PCI foi demonstrada em todas as espécies

testadas, como camundongos, ratos, coelhos, gatos, cães, ovelhas, macacos e corações humanos

(Hausenloy e Yellon, 2016).

Nos primeiros anos após a descoberta do pré-condicionamento isquêmico, a hipótese mais

aceita era a de que o PCI protege por melhorar o equilíbrio metabólico durante o período

isquêmico. Vários estudos examinaram os efeitos metabólicos e iônicos do PCI em corações e

observaram que o miocárdio apresenta menor concentração do nucleotídeo adenina, um aumento

substancial de fosfato de creatina, excesso de glicose intracelular e déficit contrátil (Murry et al.,

1991; Jennings et al., 2001). Adicionalmente, durante o período isquêmico prolongado,

cardiomiócitos pré-condicionados exibem uma taxa mais lenta de depleção de ATP, assim como

de lactato e acúmulo de H+. Por meio desses resultados, os autores concluíram que a redução da

procura de energia é um componente essencial para o mecanismo de proteção cardíaca no pré-

condicionamento (Jennings et al., 2001).

Tem sido descrito que o pré-condicionamento atua por duas janelas de cardioproteção

distintas, caracterizadas como precoce e tardia devido ao tempo que perdura a proteção

promovida em cada uma delas. O pré-condicionamento precoce ocorre imediatamente após os

estímulos de isquemia-reperfusão e dura de 2 a 3 horas. O pré-condicionamento tardio, por sua

vez, tem início entre 12 e 24 horas mais tarde e dura entre 48 e 72 horas (Hausenloy e Yellon,

2016).

Atualmente, sabe-se que durante os breves ciclos de isquemia-reperfusão promovidos

durante o pré-condicionamento, é iniciada a produção de uma série de autacóides como a

adenosina, bradicinina, endotelina e opióides, nos cardiomiócitos. A ligação desses autacóides a

seus respectivos receptores presentes na membrana plasmática das células cardíacas, transmite

sinais para a mitocôndria que promoverão a cardioproteção. Espécies reativas de oxigênio (ROS)

são geradas na mitocôndria e ativam proteínas quinases tais como a Akt (serina/treonina quinase),

Introdução

22

ERK1/2 (proteína quinase regulada por sinal extracelular), PKC (proteína quinase C) e tirosina

quinase (PTK). Esse processo permite que o efeito cardioprotetor possa durar de 2 a 3 horas,

caracterizando assim o pré-condicionamento precoce (Hausenloy e Yellon, 2016).

Estímulos químicos liberados endogenamente por pequenas moléculas, tais como íons

cálcio, espécies reativas de oxigênio (ROS), espécies reativas de nitrogênio e sulfeto de

nitrogênio também eliciam a cardioproteção (Heusch, 2015). Íons de cálcio extracelulares podem

atuar por meio da adenosina e pela ativação da PKC, no entanto, aparentam possuir um papel

menor no pré-condicionamento (Heusch, 2015), uma vez que, segundo Wallbridge e

colaboradores, o uso de antagonistas de cálcio não interfere no PCI (Wallbridge et al., 1996;

Heusch, 2015).

No pré-condicionamento tardio, proteínas quinase ativam fatores de transcrição como a

proteína ativadora-1 (AP-1), o fator de transcrição nuclear NF-κB, o fator NrF2 (fator nuclear

eritróide 2 relacionado ao fator 2) e o transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) 1/3.

Estes fatores de transcrição levam à síntese de mediadores como a prostaglandina (G/H) sintetase

(também conhecida como COX-2), proteínas heat shock (Hsp72) e óxido nítrico sintase induzível

que induzem o efeito cardioprotetor entre 12-24h após o estímulo do PCI (Heusch, 2015).

Vias de sinalização também têm sido descritas como atuantes na prevenção da lesão de

reperfusão, dentre elas pode-se citar a via RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase). A via

quinase de salvamento da lesão de reperfusão (RISK) é um grupo de quinases pró-sobrevivência

que incluem as proteínas Akt e ERK 1/2 (figura 3). Quando ativada no início da reperfusão, esta

via é capaz de promover cardioproteção (Hausenloy e Yellon, 2010).

Figura 3: Esquema da ativação da via RISK induzida por receptor opióide. Fonte: (Luna-Ortiz et al., 2011).

Introdução

23

Estudos in vitro também têm sido realizados simulando isquemia-reperfusão ao expor

células cardíacas mantidas em meio pobre em nutrientes a uma atmosfera de N2 ou mistura gasosa

composta por 95% de N2 e 5% de CO2. Dessa forma, é possível mimetizar a isquemia e buscar

compreender diretamente nas células, os mecanismos envolvidos no condicionamento

isquêmico. Safran e colaboradores, por meio de ensaios in vitro, avaliaram o papel dos receptores

A1R e A3R da adenosina em cardiomiócitos de ratos e concluíram que ambos receptores,

ativados, são capazes de atenuar a lesão de miócitos durante a hipóxia (Safran et al., 2001).

1.1.2. Pós-condicionamento isquêmico

Apesar de sua eficácia em proteger o coração, o pré-condicionamento isquêmico possui

uma grande desvantagem: a intervenção deve ser feita antes da isquemia prolongada, tornando-

o inviável em casos de infarto agudo do miocárdio. Felizmente, estudos subsequentes ao PCI

demonstraram também que a aplicação de pequenos ciclos de isquemia-reperfusão no início do

período de reperfusão também é capaz de reduzir a área do infarto e da apoptose de modo similar

ao pré-condicionamento (Zhao et al., 2003); (Crisostomo et al., 2006). A esse fenômeno deu-se

o nome de pós-condicionamento isquêmico – Fig. 4.

Figura 4: Esquema ilustrativo dos ciclos de isquemia-reperfusão do pós-condicionamento isquêmico.

Zhao e colaboradores demonstraram que o pós-condicionamento confere uma miríade de

efeitos cardioprotetores, como a redução dos níveis de edema do miocárdio, diminuição do

estresse oxidativo, acúmulo de neutrófilos polimorfonucleares, e função endotelial preservada

(Zhao et al., 2003; Hausenloy e Yellon, 2016).

O pós-condicionamento compartilha algumas vias de sinalização do PCI (tais como as vias

RISK), no entanto, possui mecanismos de ação particulares. Por exemplo, a reperfusão gradual

promovida pelo pós-condicionamento atrasa o restabelecimento do pH intracelular, o que pode

contribuir para a inibição da abertura dos poros de transição de permeabilidade mitocondrial

(PTPM) em corações pós-condicionados (Hausenloy e Yellon, 2016). A inibição de PTPM

mantém a integridade da mitocôndria, evitando assim a liberação de proteínas pró-apoptóticas.

Introdução

24

A cascata de sinalização promovida pela ligação da adenosina ao receptor, resulta na

ativação de fosfolipase C (PLC). Paralelamente, a hidrólise do fosfatidilinositol 4,5-bifosfato

(PIP2) produz inositol trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). A PLC ativa o DAG formado e

então, a proteína quinase C (PKC) que é ativada diretamente pelo DAG e indiretamente por Ca2+.

PKC pode promover proteção pela ativação dos canais KATP mitocondriais ou ativação da

proteína tirosina quinase (PTK), que ativa proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK),

família de proteínas conhecida pela promoção da cardioproteção – Fig. 5 (Crisostomo et al.,

2006).

Figura 5: Vias de sinalização desencadeadas no pré- e pós-condicionamento isquêmico. Fonte: (Crisostomo et al.,

2006)

1.1.3. Pré-condicionamento remoto (PCIR)

O pré-condicionamento remoto recebe atenção especial na prática clínica, pois, em

oposição ao pré- e ao pós-condicionamento que exigem uma intervenção direta no coração, no

pré-condicionamento remoto o estímulo é realizado em um órgão ou tecido “distante”

(Hausenloy e Yellon, 2016).

Semelhante ao pré-condicionamento clássico, Przyklenk e Whittaker propuseram em 1994

o pré-condicionamento remoto (PCIR) ou “pré-condicionamento à distância”. Com base em um

modelo matemático e em dados experimentais, os pesquisadores levantaram a hipótese de que

breves episódios de isquemia-reperfusão aplicados em tecidos ou órgãos distantes, tais como

Introdução

25

músculo esquelético, rins e mesentério, são capazes de provocar um fenótipo de proteção no

coração, tornando o músculo cardíaco resistente a um episódio longo de isquemia subsequente

(Przyklenk e Whittaker, 2011).

Evidências têm indicado que o efeito cardioprotetor subjacente promovido pelo pré-

condicionamento remoto, ocorre por uma via neuro-humoral central. A reperfusão do órgão

remoto promove a proteção cardíaca por meio de uma “lavagem” que transporta a substância ou

o fator humoral gerado pelo PCIR até o coração – Fig. 6 (Hausenloy e Yellon, 2016).

Figura 6: Esquema resumindo as vias de sinalização envolvidas no condicionamento isquêmico. Fonte:

(Hausenloy e Yellon, 2016) .

1.1.4. Condicionamento farmacológico

Apesar dos benefícios notórios promovidos pelos três tipos de condicionamento isquêmico,

a saber, PCI, PCIR e pós-condicionamento, na maior parte das vezes necessitam de intervenção

cirúrgica para serem executados, o que não os isenta de riscos. Como alternativa, já foi

demonstrado que a perfusão de algumas substâncias antes da isquemia prolongada ou durante a

reperfusão, podem desencadear alterações celulares capazes de proteger o coração. A esse

fenômeno chamou-se condicionamento farmacológico, podendo também ser dividido em pré- e

pós-condicionamento, conforme o momento em que é realizado. Tanto o pré- quanto o pós-

Introdução

26

condicionamento farmacológico são capazes de reduzir a necrose e apoptose no miocárdio

durante isquemia-reperfusão (Li et al., 2015).

Assim como o PCI e o pós-condicionamento isquêmico compartilham de mecanismos de

ação semelhantes, no pré- e pós-condicionamento farmacológico também ocorrem semelhanças

funcionais. Por exemplo, tem sido relatado que o pré-condicionamento por meio de sevoflurano

melhora a função ventricular e recupera o miocárdio, e seu uso no pós-condicionamento reduz

arritmias da reperfusão (Tian et al., 2013).

A ativação de mediadores farmacológicos durante isquemia-reperfusão pode mimetizar ou

mesmo intensificar os efeitos do condicionamento isquêmico. Desvendar os mecanismos de

atuação desses agentes de condicionamento farmacológico pode abrir caminhos importantes para

a prática clínica.

Dentre as substâncias envolvidas no condicionamento farmacológico, pode-se citar a

adenosina, bradicinina, eritropoietina, óxido nítrico (NO) (Gulati e Singh, 2014), opióides e

antagonistas do receptor mineralocorticoide (MR) da aldosterona como espironolactona e

eplerenona (Chai, Garrelds, Arulmani, et al., 2005; Chai, Garrelds, De Vries, et al., 2005).

1.2. Adenosina

A adenosina (ADO) é um autacóide que, assim como a bradicinina, é liberado a partir do

endotélio e células intersticiais durante os ciclos de isquemia-reperfusão no condicionamento

isquêmico (Heusch, 2015). Constituído por uma adenina ligada a uma ribose (Fig. 7), esse

nucleosídeo endógeno é um dos moduladores plausíveis para a proteção do miocárdio isquêmico

(Safran et al., 2001). Possui papel fundamental no controle da homeostase (Cunha, 2001), é um

vasodilatador potente (Berne, 1964; Sollevi, 1986) e neuromodulador importante na regulação

da transmissão sináptica e excitabilidade neuronal do sistema nervoso central (Cunha, 2001;

Rahman, 2009). Em 1985, foi descoberto que adenosina exerce efeitos cardioprotetores diretos

sobre os miócitos (Ely et al., 1985).

Figura 7: Estrutura química da adenosina. Fonte: http://www.universitario.com.br/noticias/n.php?i=16780

http://www.universitario.com.br/noticias/n.php?i=16780

Introdução

27

A adenosina é formada a partir de AMP pela família de 5'-nucleotidases – Fig. 8 (Chiu e

Freund, 2014). No miocárdio, pode ser produzida pela desfosforilação do AMP promovida

intracelularmente pela ação da endo-5’-nucleotidase, localizada no citosol (Sommerschild e

Kirkebøen, 2000). A ecto-5’-nucleotidase, por sua vez, é responsável por desfosforilar o AMP

no espaço intersticial, gerando a maior parte da adenosina extracelular. Outra maneira de síntese

intracelular da adenosina é pela clivagem da S-adenosil-homocisteína (SAH), no entanto é menos

comum (Chiu e Freund, 2014). A formação de adenosina a partir de SAH é catalisada pela S-

Adenosil-homocisteína hidrolase, no entanto, a taxa de hidrólise de SAH durante a isquemia não

aumenta muito, sugerindo que esta via não seja fonte significativa de produção de adenosina no

tecido cardíaco nessas condições (Sommerschild e Kirkebøen, 2000).

Além da síntese de adenosina, os processos de degradação podem estar envolvidos no

aumento de sua disponibilidade. Sua degradação é feita pelas enzimas adenosina quinase e

adenosina deaminase (ADA), que convertem a adenosina em inosina por uma desaminação

irreversível – Fig. 8 (Chiu e Freund, 2014).

Figura 8: Esquema ilustrativo das vias de produção e degradação da adenosina. Fonte: (Latini e Pedata, 2001).

A adenosina atua via receptores transmembrana acoplados a proteínas G, divididos em 4

subtipos: A1R, A2AR, A2BR e A3R. Estudos têm demonstrado que todos os receptores da

Introdução

28

adenosina são expressos no coração e estão envolvidos na cardioproteção. Além disso, há

evidências de que todos podem ser expressos em miócitos ventriculares (Zhan et al., 2011), no

entanto pouco se sabe quanto à suas ações.

1.3. Receptores da adenosina

A ligação da adenosina a seus respectivos receptores exerce efeitos por meio da regulação

de AMPc (Chiu e Freund, 2014). No entanto, esses efeitos ocorrem de maneira diferente entre os

receptores. Enquanto os receptores A1R e A3R, acoplados respectivamente a proteínas Gi e Gq,

inibem adenilato ciclase (AC), receptores A2AR e A2BR, acoplados a proteína Gs, ativam AC,

levando à formação de AMPc e subsequente ativação de PKA (proteína quinase A dependente

de AMPc) – Fig. 9. A adenosina também ativa PKC diretamente, que por sua vez, ativa a via

RISK protegendo contra lesão de reperfusão (Heusch, 2015).

Figura 9: Vias de sinalização envolvidas na ativação dos receptores de adenosina. Fonte:

https://sites.google.com/a/unicam.it/diego-dal-ben/activities-and-collaborations

Sabe-se que os receptores A1R e A3R são ativados antes da isquemia, portanto, exercem

seus efeitos cardioprotetores no PCI. Em oposição, os efeitos protetores de A2AR e A2BR

aparecem durante a reperfusão, atuando assim, no pós-condicionamento isquêmico (Zhan et al.,

2011).

Estudos in vitro simularam a ação dos receptores de adenosina no PCI e pós-

condicionamento. Conforme descrito por Leshem-Lev e colaboradores, a ativação dos receptores

A1R e A3R por seus respectivos agonistas CCPA e CI-IB-MECA, protege os cardiomiócitos de

rato contra hipóxia por meio de fosforilação da MAPK p38, o que ocorre downstream à abertura

dos canais KATP da mitocôndria (Leshem-Lev et al., 2010). A sinalização promovida durante a

https://sites.google.com/a/unicam.it/diego-dal-ben/activities-and-collaborations

Introdução

29

ativação do receptor A1R ocorre por meio de sua associação a proteína Gi e efetores como a

MAPK (proteína quinase ativada por mitógeno), Akt e ERK 1/2 (St Hilaire et al., 2009).

O agonista altamente seletivo do receptor A2AR, BAY 60-6583, é capaz de reduzir a área

infartada de corações de coelho quando aplicado durante a reperfusão. O agonista dos receptores

A1R/A2R da adenosina, 5’-(N-ethylcarboxamido) aplicado durante a reperfusão limitou a área de

infarto, enquanto os antagonistas SCH58261 e MRS1706 dos receptores A2AR e A2BR,

respectivamente foram capazes de bloquear esse efeito (Xi et al., 2009).

Muitos aspectos da ação dos receptores de adenosina na I-R ainda são pouco

compreendidos. É consenso que receptores A1R e A3R são cardioprotetores quando ativados

antes da isquemia e receptores A2AR e A2BR, quando ativados durante a reperfusão. Muitas

questões ainda não estão claras, incluindo os mecanismos de sinalização ativados e se esses são

todos mediados via ação direta sobre os cardiomiócitos.

1.4. Antagonistas do receptor mineralocorticoide da aldosterona (MR)

Pacientes que sofrem infarto do miocárdio apresentam elevados níveis de aldosterona e

têm associado a isso, um aumento de fibrose, hipertrofia, morte celular, inflamação e estresse

oxidativo (Qin et al., 2003; Hayashi et al., 2008).

Aldosterona é um hormônio mineralocorticoide sintetizado na zona glomerulosa da supra-

renal sendo o efetor terminal da cascata de sinalização do Sistema Renina-Angiotensina-

Aldosterona (SRAA). Entretanto, elevados níveis plasmáticos de aldosterona resultam em

complicações vasculares, renal, cardíaca e metabólica independente da pressão sanguínea.

A grande quantidade de efeitos deletérios promovidos pela aldosterona sobre o sistema

cardiovascular tem motivado estudos sobre inibidores do receptor mineralocorticóide (MR).

Dois grandes estudos clínicos já realizados, o RALES (Randomized ALdosterone

Evaluation Study) e o EPHESUS (EPlerenone HEart failure and SUrvival Study), mostraram

que os antagonistas do MR reduzem a mortalidade em pacientes com insuficiência cardíaca e

disfunção ventricular esquerda após infarto. Esses estudos foram realizados com os dois

principais antagonistas do MR disponíveis comercialmente: espironolactona e eplerenona, e têm

apresentado excelentes resultados no tratamento de pacientes com disfunção ventricular esquerda

e evidência clínica de insuficiência cardíaca (IC) após infarto (Pitt et al., 1999; Pitt et al., 2003).

Introdução

30

Existem, atualmente, quatro principais antagonistas do receptor mineralocorticoide:

Espironolactona (Aldactone®), Eplerenona (Inspra®), Canrenona e o recém-sintetizado

Finerenona (BAY 94-8862) (Figura 10). Cada antagonista possui particularidades quanto às suas

características farmacológicas e ação (Tabela 7).

Figura 10: Fórmulas estruturais dos antagonistas do receptor mineralocorticóide da aldosterona. Fonte: Wikipedia

Espironolactona, o primeiro antagonista do MR produzido, é um anti-hipertensivo

poupador de potássio sintetizado na década de 1960. Em seu efeito antagonista a espironolactona

atua como um inibidor competitivo da aldosterona, contudo possui capacidade para se ligar a

receptores progesterônicos e androgênicos, promovendo efeitos adversos tais como

ginecomastia, alterações no ciclo menstrual e diminuição da libido (Delyani, 2000). Além de seu

papel na redução da pressão sanguínea, estudos clínicos têm mostrado efeitos anti-inflamatórios

(Zhang et al., 2014) e antifibróticos da espironolactona (Hermidorff et al., 2015; Zhao et al.,

2015).

Sintetizada a partir da espironolactona em 2002, eplerenona é o princípio ativo do fármaco

Inspra® (Núñez et al., 2006) que atua como um inibidor específico para o receptor de aldosterona

(Specific Aldosterone Receptor Antagonist – SARA). Em oposição à espironolactona, a

eplerenona apresenta maior seletividade pelo receptor mineralocorticóide e baixa afinidade pelos

receptores de progesterona (GR < 1%) e de andrógenos (0,1%). Essa maior seletividade pelo MR

e menor afinidade para os receptores esteroidais reduz os efeitos sexuais secundários observados

no tratamento a longo prazo com espironolactona, como ginecomastia, alteração no ciclo

menstrual, impotência, mastodinia e sangramento vaginal (Funder, 2013), tornando a eplerenona

mais segura para tratamento crônico. Adicionalmente, a eplerenona possui meia-vida (T1/2 = 4 –

6 h) maior que a espironolactona (T1/2 = 1,3 – 1,4 h) (Mcmahon, 2001), porém tem se mostrado

menos potente (Zannad et al., 2011).

Introdução

31

Estudos têm mostrado que a eplerenona atenua a síntese de colágeno induzida pela

corticosterona, exercendo, assim como a espironolactona, uma função de prevenir a fibrose

cardíaca (Omori et al., 2014; Hermidorff et al., 2015).

Canrenona é um metabólito ativo da espironolactona usado como diurético que possui

efeitos antiandrogênicos, demonstrados em pacientes com cirrose hepática (Andriulli et al.,

1989). É um fármaco de preço acessível e não tem apresentado limitações em sua prescrição nos

países em que está disponível. Estudos têm mostrado que, além de sua ação bloqueadora da

aldosterona, canrenona também reduz a progressão da resistência à insulina e de

microalbuminúria na diabetes tipo 2 e outras doenças relacionadas (Armanini et al., 2014).

Derosa e colaboradores demonstraram que canrenona é capaz de reduzir a pressão sanguínea em

pacientes com síndrome metabólica. Maiores estudos, porém, são necessários a respeito desse

metabólito da espironolactona (Derosa et al., 2013).

O antagonista Finerenona (BAY 94-8862) foi sintetizado em 2012 como um antagonista

não-esteroidal que possui maior seletividade ao MR que a espironolactona e maior afinidade

comparado à eplerenona. Um grande estudo clínico (ARTS – MinerAlocorticoid Receptor

Antagonist Tolerability Stud: NCT01345656) tem sido realizado para demonstrar a eficácia da

finerenona. Pitt e colaboradores demonstraram que doses de finerenona 5-10 mg/dia eram pelo

menos tão eficientes quanto a espironolactona 25 ou 50 mg/dia em diminuir biomarcadores do

estresse hemodinâmico em pacientes com insuficiência cardíaca, fração de ejeção ventricular

esquerda reduzida e doença renal crônica moderada. Entretanto, esse resultado foi associado a

menor incidência de hipercalemia e falha renal (Pitt et al., 2013). Por ser um composto recém-

sintetizado, mais estudos são necessários para comprovar a eficácia desse antagonista.

O presente trabalho é focado nos antagonistas do receptor mineralocorticoide

espironolactona e eplerenona por serem os medicamentos de uso mais comum na prática clínica.

1.5. Antagonistas do receptor mineralocorticóide (MR), receptores de

adenosina e o condicionamento isquêmico

Elevados níveis plasmáticos de aldosterona resultam em complicações vasculares, renal,

cardíaca e metabólica independente da pressão sanguínea. O tratamento de tais pacientes é feito

por meio do uso de antagonistas do receptor mineralocorticoide (MR) da aldosterona. Estudos

clínicos têm demonstrado que baixas doses desses antagonistas reduzem a morbidade e

mortalidade em pacientes com insuficiência cardíaca e infarto do miocárdio, apesar dos níveis

normais de aldosterona no plasma (Mccurley e Jaffe, 2012).

Introdução

32

A espironolactona foi originalmente desenvolvida para neutralizar os efeitos do hormônio

aldosterona, em especial os efeitos relacionados à excreção de potássio. Contudo, durante

décadas no mercado sendo usada para esse fim, começou-se a observar um papel secundário para

a espironolactona em relação aos diuréticos mais potentes (Nappi e Sieg, 2011).

Ao ligar-se ao receptor MR, a espironolactona promove efeitos benéficos sobre a

morfologia e função do ventrículo esquerdo em ratos submetidos a infarto do miocárdio

(Nagatomo et al., 2014). O estudo RALES demonstrou que a espironolactona associada ao

inibidor da enzima conversora de angiotensina (ECA), reduz significativamente a morbidade e

mortalidade em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva grave (Ma et al., 2014).

Estudo realizado por Sohn e colaboradores demonstrou que em corações de filhotes de rato

da linhagem Spreague Dawley (SD) a expressão da proteína p38 (subfamília de proteína quinase

ativada por mitógeno responsável por regular vários processos celulares como diferenciação

celular, apoptose, respostas à inflamação e crescimento celular) foi diminuída significativamente

após administração de 200mg/kg de espironolactona, além de reduzir a apoptose de

cardiomiócitos nesses ratos (Sohn et al., 2010).

Trabalhos experimentais e clínicos demonstraram que a eplerenona promove acentuada

proteção cardíaca, cerebral, vascular e renovascular na isquemia cardíaca após infarto do

miocárdio (Rudolph et al., 2004). Dentre estes podemos citar os trabalhos nos quais o tratamento

por longo prazo com eplerenona promoveu uma melhoria da função ventricular e vascular em

ratos cronicamente infartados (Fraccarollo et al., 2003; Schäfer et al., 2003).

Estudo prévio em nosso laboratório, avaliou a ação da espironolactona e eplerenona de

maneira comparativa, na presença e na ausência da aldosterona. Os resultados mostraram que

ambos promoveram proliferação de cardiomiócitos e reduziram a proliferação de fibroblastos,

mesmo na ausência do referido hormônio, sugerindo uma via de sinalização independente do

antagonismo sobre aldosterona (Hermidorff et al., 2015).

Possíveis vias de sinalização evocadas por esses fármacos também foram analisadas e

constatou-se que, tanto espironolactona quanto eplerenona foram capazes de aumentar os níveis

de Ca2+, GMPc e a atividade de ERK 1/2. Também reverteram a ação da aldosterona sobre a

atividade de PKC e ERK 1/2. Curiosamente, apenas espironolactona aumentou os níveis de

AMPc. Nossos dados apoiam o fato de que, para além da aldosterona, tanto espironolactona

quanto eplerenona possuem respostas rápidas (não genômicas) (Hermidorff et al., 2015).

Introdução

33

Existem evidências consistentes de que antagonistas do MR agem sobre as células

cardíacas, independentemente do bloqueio da ação da aldosterona. No entanto, o mecanismo pelo

qual eles promovem cardioproteção ainda é pouco compreendido.

Chai e colaboradores em estudos com corações isolados de ratos submetidos a isquemia e

reperfusão, relataram que antagonistas do MR administrados antes da isquemia reduziram a área

isquêmica em relação ao grupo controle, sugerindo que, de alguma forma, esses antagonistas

promovem pré-condicionamento farmacológico (Chai, Garrelds, Arulmani, et al., 2005; Chai,

Garrelds, De Vries, et al., 2005).

Em estudo subsequente, também realizado em coração isolado de ratos submetidos a I-R,

Schmidt e colaboradores demonstraram que antagonistas do MR também foram capazes de

reduzir a área infartada quando administrados antes da reperfusão (pós-condicionamento), e esses

efeitos foram bloqueados por um antagonista não-seletivo de receptores da adenosina. Neste

mesmo estudo, o efeito cardioprotetor do canrenoato de potássio (metabólito ativo da

espironolactona) foi bloqueado em camundongos knock-outs pela enzima ecto-5’-nucleotidase

(enzima envolvida na síntese de adenosina) (Schmidt et al., 2010).

Estas evidências somadas ao que se conhece sobre os efeitos cardioprotetores da adenosina

no coração, nos permite sugerir que a ação direta de antagonistas de MR sobre o coração pode

estar sendo mediada por uma interação com a adenosina, seja via seus receptores de membrana

ou atuando sobre a disponibilidade de adenosina.

34

2- OBJETIVOS

Objetivos

35

OBJETIVO GERAL Avaliar o efeito cardioprotetor da espironolactona e eplerenona sobre cardiomiócitos de

ratos submetidos à isquemia-reperfusão in vitro, na presença e na ausência de antagonistas dos

receptores A1R, A2AR, A2BR e A3R da adenosina.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Indução de isquemia in vitro (isquemia-reoxigenação).

2. Caracterização do dano isquêmico:

2.1. Avaliação da citotoxicidade por meio de ensaio por kit de LDH

3. Determinação da adenosina em cardiomiócitos ventriculares de ratos neonatos

3.1. Identificação do nucleosídeo por Espectrometria de Massas

4. Avaliação da possível ação da espironolactona e eplerenona mediada pelos receptores da

adenosina (A1R, A2AR, A2BR e A3R) em condições de isquemia nos miócitos cardíacos.

4.1. Análise da viabilidade celular por meio de ensaio por MTT

36

3- METODOLOGIA

Metodologia

37

3.1. Animais

Para obtenção de cardiomiócitos, foram utilizados ratos neonatos da linhagem Wistar,

fêmeas, pesando em média 5g. Estes permaneceram juntamente com a mãe até o dia do

experimento.

Os animas foram provenientes do Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade

Federal de Ouro Preto, com os protocolos CEUA-UFOP de número 2012/22 e 2016/07. As

progenitoras foram acomodadas uma por gaiola, com seus respectivos filhotes, mantidas em

ambiente silencioso, com temperatura controlada, em ciclos de 12 horas de período diurno (das

07:00 às 19:00 horas) e 12 horas de período noturno (das 19:00 às 07:00 horas) mantidos

artificialmente. Receberam água e ração Purina “ad libitum”. Todas as recomendações do Comitê

de Ética em Pesquisa Animal (CEUA-UFOP) foram seguidas, conforme protocolo em anexo.

3.2. Cultura Primária de Cardiomiócitos

O protocolo de extração de células cardíacas foi gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Eduardo

M. Krieger (InCor – HC – FMUSP). Resumidamente, foram utilizados 10 ratos neonatos em

cada cultura, os quais foram higienizados com álcool 70% e decapitados. Os corações foram

removidos e lavados em solução DMEM enriquecida com glicose 5mg/mL. Em seguida

selecionou-se os ventrículos que foram fragmentados e, posteriormente digeridos

enzimaticamente em solução tampão de digestão (Tabela 3), agitados em banho maria a 37oC em

4 ciclos de 20 min. A suspensão de células resultante desta etapa foi centrifugada com soro fetal

bovino (LGC Biotecnologia) a 1200rpm/10min. O pellet foi ressuspendido com meio de cultura

DMEM enriquecido com 5% de soro fetal bovino, 10% de soro de cavalo, 1% de

penicilina/estreptomicina e 0,1% de inibidor de fibroblasto BRDU (5-Bromo-2’-deoxiuridina –

Sigma-Aldrich) (Tabela 2). As células foram então distribuídas em placa de 24 poços e incubadas

em estufa de CO2 (5%) a 37ºC por 60min para adesão preferencial dos fibroblastos e aumentar

assim, a pureza da cultura. O sobrenadante desta etapa (cardiomiócitos) foi retirado e distribuído

em uma nova placa de 24 poços. A placa foi acondicionada em estufa de CO2 (5%) a temperatura

constante de 37ºC por 48 horas para adesão completa das células (Barreto-Chaves et al., 2000).

3.3. Soluções Utilizadas nos Ensaios

Metodologia

38

Tabela 1: Composição da solução de BRDU [10-2M] (5-Bromo-2'-deoxiuridina)

Componentes Quantidade

Água Milli-Q 165 mL

BRDU 0,5 g

Tabela 2: Composição do meio de cultura normal

Componentes Quantidade (q.s.p)

DMEN (Sigma-Aldrich) 42,5 mL

Soro de cavalo (LGC) 5,0 mL

Soro fetal bovino (LGC) 2,5 mL

Penicilina-estreptomicina (LGC) 0,5 mL

Solução de BRDU [10-2M] 50 µL

Tabela 3: Composição da solução tampão de digestão


Solução de DMEM + Glicose 5mg/mL 50 mL

Colagenase tipo II (Sigma-Aldrich) 10 mg

Pancreatina (Sigma-Aldrich) 30 mg

Tabela 4: Composição do meio de cultura para isquemia


DMEN (Sigma-Aldrich) 42,5 mL

Glicose 250 mg

Penicilina-estreptomicina (LGC) 0,5 mL

Solução de BRDU [10-2M] 50 µL

Tabela 5: Composição da solução de parada para evitar degradação da adenosina


Dipyridamole 75 µM

EHNA 15 µM

EDTA 3 mM

Solução salina isotônica (pH 6) 1 L

Todas as soluções utilizadas para cultivo e manutenção das culturas de cardiomiócitos

foram esterilizadas em membrana Millipore 0,22 µm.

Metodologia

39

3.4. Desenho experimental

As culturas foram divididas nos grupos Normóxia, Pré-condicionamento e Pós-

condicionamento farmacológico e os tratamentos foram igualmente administrados em ambos

grupos com as concentrações demonstradas na lista a seguir. Para facilitar a compreensão, os

antagonistas seletivos usados de cada receptor da adenosina foram identificados nessa lista (itens

de 6 a 9), contudo ao longo do trabalho serão referidos apenas como “antagonista do receptor

A1R”, ou simplesmente “ant. A1R”, por exemplo.

1. Controle normóxia: somente as células mantidas em condições normais

2. Controle isquemia: somente as células mantidas em condições de isquemia

3. Células tratadas com Espironolactona [10-9 M]

4. Células tratadas com Eplerenona [10-8 M]

5. Células tratadas com Adenosina [10-8 M]

6. Células tratadas com antagonista do receptor A1R (DPCPX [10-6 M])

7. Células tratadas com antagonista do receptor A2AR (ZM 241385 [10-9 M])

8. Células tratadas com antagonista do receptor A2BR (MRS 1754 [10-6 M])

9. Células tratadas com antagonista do receptor A3R (MRS 1523 [10-6 M])

10. Células tratadas com ant. A1R [10-6 M] + ant. A3R [10-6 M]

11. Células tratadas com ant. A2AR + ant. A2BR [10-6 M]

12. Células tratadas com Adenosina [10-8 M] + ant. A1R [10-6 M]

13. Células tratadas com Adenosina [10-8 M] + ant. A3R [10-6 M]

14. Células tratadas com Adenosina [10-8 M] + ant. A1R [10-6 M] + ant. A3R [10-6 M]

15. Células tratadas com Adenosina [10-8 M] + ant. A2AR [10-9 M]

16. Células tratadas com Adenosina [10-8 M] + ant. A2BR [10-6 M]

17. Células tratadas com Adenosina [10-8 M] + ant. A2AR [10-9 M] + ant. A2BR [10-6 M]

18. Células tratadas com Espironolactona [10-9 M] + ant. A1R [10-6 M]

19. Células tratadas com Espironolactona [10-9 M] + ant. A3R [10-6 M]

20. Células tratadas com Espironolactona [10-9 M] + ant. A1R [10-6 M] + ant. A3R [10-6 M]

21. Células tratadas com Espironolactona [10-9 M] + ant. A2AR [10-9 M]

22. Células tratadas com Espironolactona [10-9 M] + ant. A2BR [10-6 M]

23. Células tratadas com Espironolactona [10-9 M] + ant. A2AR [10-9 M] + ant. A2BR [10-6 M]

24. Células tratadas com Eplerenona [10-8 M] + ant. A1R [10-6 M]

25. Células tratadas com Eplerenona [10-8 M] + ant. A3R [10-6 M]

Metodologia

40

26. Células tratadas com Eplerenona [10-8 M] + ant. A1R [10-6 M] + ant. A3R [10-6 M]

27. Células tratadas com Eplerenona [10-8 M] + ant. A2AR [10-9 M]

28. Células tratadas com Eplerenona [10-8 M] + ant. A2BR [10-6 M]

29. Células tratadas com Eplerenona [10-8 M] + ant. A2AR [10-9 M] + ant. A2BR [10-6 M]

3.5. Indução da isquemia in vitro

Para avaliar a ação da espironolactona e eplerenona, como possíveis agentes de pré- e pós-

condicionamento farmacológico, foi necessário mimetizar isquemia in vitro. Isquemia é

caracterizada pela falta de sangue local que leva à deficiência na distribuição de O2 e nutrientes

na área afetada. Sendo assim, ao induzir isquemia in vitro, as células foram expostas por 2 horas

a uma mistura gasosa composta por 95% de N2 – responsável por substituir o O2 do meio – e 5%

de CO2. Associado a isso, as células também foram tratadas com meio de cultura pobre em

nutrientes, o qual é livre de soro, mas acrescido de 5mg/mL de glicose apenas para manutenção

dos cardiomiócitos (Safran et al., 2001).

Visando controlar a eficácia da indução das células à isquemia, em todos os ensaios foram

preparadas duas placas, uma submetida a condições ideais de nutrição e oxigênio para controle,

e uma para o ensaio de isquemia. Dessa forma, para melhor compreensão, demos os nomes a

essas placas de grupo normóxia e grupo isquemia. É importante salientar que, as células do grupo

normóxia se mantiveram em meio de cultura enriquecido normalmente, uma vez que o meio

pobre em nutrientes se faz necessário apenas para as condições de isquemia.

Em relação aos tratamentos farmacológicos, foram feitos dois grupos: o pré-

condicionamento, para as células tratadas antes da exposição ao nitrogênio, e o grupo pós-

condicionamento, para as células tratadas no ato da “reperfusão”. Dessa forma, foi preparada

uma placa para cada grupo exposto a condições de isquemia e as células do grupo normóxia,

também receberam os tratamentos respeitando os grupos de tratamento pré- e pós-

condicionamento para controle.

3.5.1. Preparo das placas

Após 48 horas de incubação (conforme sessão 3.2), os cardiomiócitos foram soltos das

placas utilizando-se TrypLE™ Express (tríplex - tripsina sintética). Para tanto, todo o meio de

cultura foi retirado e em seguida foi acrescentado 350μL de tríplex em cada poço para que as

células perdessem a adesão com a placa. Esse tríplex contendo células foi, então, retirado e

centrifugado a 1020rpm/10min, o sobrenadante foi descartado e as células do grupo normóxia

Metodologia

41

foram ressuspendidas em meio de cultura normal enquanto as do grupo isquemia foram

ressuspendidas em meio de cultura próprio para isquemia.

As células foram contadas em câmara de Neubauer e distribuído o equivalente a 105 células

em cada poço em duas placas de 96 poços. As placas foram acondicionadas em estufa de CO2

(5%) a temperatura constante de 37ºC por 24 horas para adesão completa das células.

3.5.2. Tratamentos

As células do grupo pré-condicionamento (tanto das placas isquemia quanto normóxia)

receberam o tratamento com espironolactona 10-9 M e eplerenona 10-8 M, cujas concentrações

foram definidas em ensaio de curva de concentração previamente realizado, e foram incubadas

por 2h para ação dos fármacos.

Após esse período, as placas isquemia foram colocadas em câmara de hipóxia por 2h em

estufa contendo uma mistura de N2 (95%) e CO2 (5%) a 37ºC. As placas normóxia foram

mantidas em estufa a 37ºC e 5% de CO2.

Em seguida, para a reperfusão as células foram expostas a condições normais de oxigênio.

Imediatamente, o grupo pós-condicionamento foi tratado com os fármacos espironolactona 10-9

M e eplerenona 10-8 M. As células do grupo pré-condicionamento tiveram o meio de cultura

substituído por meio de cultura normal (DMEM enriquecido de 10% de soro de cavalo e 5%

SFB). As placas foram incubadas em estufa a 37ºC e 5% de CO2 por 2 horas para ação dos

fármacos.

Para que ambos os grupos fossem expostos pelo mesmo tempo ao tratamento, passadas as

duas horas de tratamento, o meio de cultura contendo os fármacos do grupo Pós-

condicionamento foi removido e substituído por meio normal. Essa troca de meio ocorreu para

todos os grupos (normóxia e isquemia) para evitar diferença devido à renovação do meio. As

células foram incubadas em estufa a 37ºC e 5% de CO2 por 16 horas e posteriormente prosseguiu-

se com os experimentos.

3.6. Validação do método de isquemia in vitro

Para comprovar se a metodologia de indução das células a isquemia é eficiente, realizou-

se a caracterização do dano isquêmico feita por meio de kit de Detecção de Citotoxicidade (LDH)

(Roche – Catálogo: 11.644.793.001). Trata-se de um ensaio colorimétrico para quantificação de

lise e morte celular, baseado na medida da atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH)

Metodologia

42

liberada do citosol no sobrenadante pelas células danificadas. A lactato desidrogenase é uma

enzima que atua em condições de anaerobiose, quando catalisa a redução do piruvato em lactato,

utilizando o NADH produzido na fase oxidativa, regenerando o NAD+ necessário para a glicólise

na ausência de oxigênio (Lehninger et al., 2005). Dessa forma, quanto maior o dano celular

promovido pelo ensaio de isquemia in vitro, maior a quantidade de LDH liberado.

Após o tratamento das células conforme citado na sessão 3.5.2, procedeu-se o ensaio de

detecção de citotoxicidade por LDH conforme recomendações do fabricante do kit.

3.7. Determinação da adenosina em cardiomiócitos ventriculares de ratos

neonatos sob condições de isquemia

3.7.1. Preparo das amostras

Para determinar se há presença de adenosina nos cardiomiócitos ventriculares, procedeu-

se normalmente o ensaio de indução à isquemia como descrito na seção 3.5. Imediatamente após

as duas horas de exposição das células ao gás nitrogênio, coletou-se o meio sobrenadante das

células do grupo pré-condicionamento. As amostras do pós-condicionamento foram tratadas

conforme descrição na seção 3.5 e sua coleta foi realizada imediatamente após as 2h de incubação

da espironolactona e eplerenona.

Um total de 300 µL de amostra foi coletado para cada tratamento e adicionadas em tubos

de vidro contendo 150 µL de solução de parada (descrita na tabela 5) para evitar a degradação

da adenosina. Posteriormente, adicionou-se 900 µL de acetona P.A. para precipitação de

proteínas, agitou-se em vórtex e, em seguida, centrifugou-se por 10’ a 5.000 rpm. O sobrenadante

foi retirado e transferido para um novo tubo de vidro. A acetona presente nas amostras foi retirada

por evaporação com auxílio de fluxo de gás nitrogênio.

As amostras foram então concentradas em liofilizador (BenchTop ™ “K” Series – VirTis).

O precipitado obtido foi ressuspendido na solução da fase móvel, composta por água e metanol

com ácido fórmico 0,1%. Posteriormente, procedeu-se a leitura.

3.7.2. Análise por espectrometria de massa

O ensaio foi realizado no equipamento LC-MS Shimadzu 8040, coluna C18 (150 x 2 mm)

3µ, Phenomenex. A fase móvel utilizada foi composta por água e metanol com ácido fórmico

0,1% e a eluição por gradiente de 5% a 70% de metanol.

Metodologia

43

Observação: Foi separado um tubo apenas com solução de parada para ser lido juntamente com

as amostras para avaliar sua interferência na detecção e subtraí-la.

3.8. Avaliação da possível ação da espironolactona e eplerenona mediada pelos

receptores da adenosina (A1R, A2AR, A2BR e A3R) em condições de isquemia

Para avaliar se a ação protetora da espironolactona e eplerenona é mediada por receptores

da adenosina em condições de isquemia, realizou-se a determinação da viabilidade celular pós-

exposição com MTT (Sigma-Aldrich – Catálogo: 298-3-1).

O MTT (brometo de 3-4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5-difeniltetrazólio) é um sal tetrazólio de

cor amarela que, quando metabolizado forma cristais de formazan de cor azul. Esse processo

ocorre na cadeia respiratória mitocondrial de células metabolicamente ativas, dessa forma, a

quantidade de formazan formado é proporcional à quantidade de células viáveis. A análise é feita

por espectrofotometria.

Para o ensaio de viabilidade, as células devem estar aderidas em microplaca, sendo assim,

a indução da isquemia foi feita diretamente nas placas de ensaio. Após o preparo das células

conforme citado na sessão 3.2, os tratamentos foram realizados (sessão 3.5.2), com o diferencial

da presença dos antagonistas dos receptores da adenosina. As células do grupo pré-

condicionamento foram tratadas com os antagonistas dos receptores A1R e A3R (Zhan et al.,

2011), foram incubadas por 20 min para ligação dos antagonistas a seus receptores, em seguida

adicionou-se adenosina, espironolactona ou eplerenona conforme desenho experimental pré-

estabelecido (sessão 3.4). O tratamento do grupo pós-condicionamento seguiu o mesmo padrão

realizado no grupo pré-condicionamento, contudo, foram utilizados antagonistas para os

receptores A2AR e A2BR da adenosina (Zhan et al., 2011).

Após o tratamento, o meio de cultura foi retirado e adicionou-se 100µL de solução MTT

aos poços e incubou-se por 2h conforme protocolo. Após esse período, o MTT foi removido e

adicionou-se 100µL de DMSO aos poços. As placas foram agitadas em agitador orbital por 5min,

e mantidas sem agitação por mais 5min para estabilização da cor. Em seguida, as placas foram

lidas em leitor de placa (Victor™ X3 - Multimode Plate Reader – PerkinElmer) no comprimento

de onda de 530nm.

Metodologia

44

3.9. Análise estatística

A análise estatística dos resultados foi realizada por meio do software GraphPad Prism®

(versão 6.01). Utilizou-se ANOVA para testar as diferenças entre os grupos e entre os

tratamentos, seguido de pós-teste de Tukey para determinação das diferenças significativas entre

os grupos. Adotou-se o nível de significância p < 0,05 para todas as análises.

45

4- RESULTADOS

Resultados

46

4.1. Validação do método de Isquemia in vitro Nos ensaios de validação do método de indução dos cardiomiócitos a isquemia,

observamos que a técnica utilizada foi eficaz uma vez que a liberação de LDH foi elevada de

maneira significativa no grupo isquemia em relação ao controle normóxia (Gráfico 1).

G r u p o s

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- S ig n if ic a tiv a m e n te d ife re n te d o C o n tro le Is q u e m ia

Gráfico 1: Análise do dano isquêmico mediante exposição dos cardiomiócitos a condições de isquemia. Percentual

de LDH liberado em cardiomiócitos expostos a isquemia comparados a células em condições ideais (controle

normóxia). Resultado de três experimentos independentes realizados em triplicatas, n = 3 e expressos em média ±

SEM, p<0,05.

4.2. Determinação da adenosina em cardiomiócitos ventriculares de ratos

neonatos sob condições de isquemia

Para investigar a presença da adenosina em cardiomiócitos ventriculares submetidos a

isquemia, amostras dos seguintes tratamentos foram analisadas: controle, espironolactona,

eplerenona e adenosina, dos grupos normóxia, pré-condicionamento e pós-condicionamento. A

fim de simplificação, estão representados os cromatogramas apenas dos controles de cada grupo

e uma tabela geral (Tabela 6) demonstrando a área dos picos obtidos para todos os tratamentos.

Na figura 10 são apresentados um cromatograma e um espectro obtidos para confirmar a

presença da adenosina ou de algum outro composto de massa molecular semelhante ao da

adenosina que pudesse gerar falso positivo na análise da amostra. Para tanto, foi selecionada uma

das amostras aleatoriamente (espironolactona – pré-condicionamento) e a ela adicionou-se 10µL

de solução padrão de adenosina [1 mg/L] à amostra para separar os picos. O resultado está

demonstrado abaixo e foi usado para comparar com os espectros das demais amostras.

Resultados

47

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

0

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.

Resultados

48

Na figura 11 estão representados o cromatograma e o espectro obtidos da amostra controle

do grupo pré-condicionamento. Ao comparar aos espectros demonstrados na figura 10 é possível

comprovar a presença de adenosina pelo padrão dos picos semelhantes aos demonstrados no

espectro de detecção do nucleosídeo de interesse.

Figura 12: Cromatograma e espectro de massas obtidos da amostra “controle” do pré-condicionamento. Os picos

destacados apresentam a relação massa/carga (m/z) referente à adenosina com os fragmentos iônicos esperados Entre

parênteses, é demonstrada a carga positiva adquirida durante a ionização.

De forma semelhante ao resultado encontrado no controle do grupo pré-condicionamento,

no controle do pós-condicionamento também foi detectada presença de adenosina (Figura 12).

Figura 13: Cromatograma e espectro de massas obtidos da amostra “controle” do pós-condicionamento. Os picos

destacados apresentam a relação massa/carga (m/z) referente à adenosina com a massa molecular esperada. Entre

parênteses, é demonstrada a carga positiva adquirida durante a ionização.

60,0 65,0 70,0 75,0 80,0 85,0 90,0 95,0 100,0 105,0 110,0 115,0 120,0 125,0 130,0 m/z

0,00

0,25

0,50

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2,00

Inten. (x10,000)

136,1

119,1

57,1

60,0 65,0 70,0 75,0 80,0 85,0 90,0 95,0 100,0 105,0 110,0 115,0 120,0 125,0 130,0 m/z

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Inten. (x10,000)

136,1

119,1

57,1

Resultados

49

Em oposição aos resultados encontrados nos grupos submetidos a isquemia, o controle

normóxia não apresentou presença de adenosina (Figura 13).

Figura 14: Cromatograma e espectro de massas obtidos da amostra “controle” normóxia. Os picos destacados

apresentam a relação massa/carga (m/z) referente ao contaminante com a massa molecular semelhante à esperada

para a adenosina. Entre parênteses, é demonstrada a carga positiva adquirida durante a ionização.

A tabela 6 mostra as concentrações de adenosina detectadas em cada amostra. É possível

observar diferenças significativas nos valores. A amostra tratada com espironolactona no pré-

condicionamento apresentou maior concentração de adenosina em relação ao tratamento com

eplerenona e ao controle. Em oposição, no pós-condicionamento a maior concentração ocorreu

no tratamento com eplerenona em relação à espironolactona e ao controle.

Tabela 8: Concentração de adenosina detectada nos cromatogramas para amostras dos grupos normóxia, pré-

condicionamento e pós-condicionamento.

Amostra Concentração de Adenosina (mg/L)

Pré-condicionamento Pós-condicionamento Normóxia

Controle 0,00332 0,00180 n.d.

Adenosina 0,00744 0,00129 n.d.

Espironolactona 0,00478 0,00096 n.d.

Eplerenona 0,00317 0,00223 n.d.

Legenda: n.d. = não detectado

60,0 65,0 70,0 75,0 80,0 85,0 90,0 95,0 100,0 105,0 110,0 115,0 120,0 125,0 130,0 m/z

0,0

2,5

5,0

7,5

Inten. (x10,000)

119,1

136,1

57,1

Resultados

50

4.3. Espironolactona e eplerenona x Antagonistas da adenosina em condições de

isquemia

Para testar nossa hipótese de interação dos antagonistas do receptor mineralocorticoide

com receptores da adenosina no condicionamento isquêmico, tratamos os cardiomiócitos

ventriculares com espironolactona, eplerenona, adenosina e fizemos associações dos mesmos aos

antagonistas dos quatro receptores, A1R, A2AR, A2BR e A3R, da adenosina. Os tratamentos foram

realizados para os grupos pré- e pós-condicionamento.

Conforme demonstrado no gráfico 2, os tratamentos com espironolactona, eplerenona e

adenosina foram capazes de proteger as células submetidas a isquemia, mantendo a viabilidade

estatisticamente igual ao controle não tratado sob normóxia. Esse resultado foi mantido tanto no

pré-condicionamento quanto no pós-condicionamento.

G r u p o s

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Gráfico 2: Ação da espironolactona, eplerenona e adenosina no pré- e no pós-condicionamento farmacológico.

Percentual de cardiomiócitos viáveis após isquemia, tratados com espironolactona [10-9 M], eplerenona [10-8 M] e

adenosina [10-8 M] como agentes de pré- e pós-condicionamento farmacológico comparados a cardiomiócitos não

tratados expostos a isquemia (controle isquemia) e a células em condições ideais (controle normóxia). Resultado de

três experimentos independentes realizados em triplicatas, n = 3 e expressos em média ± SEM, p<0,05.

4.3.1. Adenosina

Pré-condicionamento – Adenosina

Os receptores A1R e A3R da adenosina são conhecidos por atuar predominantemente no

pré-condicionamento. Ao tratar as células com os antagonistas dos receptores A1R e A3R,

Resultados

51

DPCPX [10-6 M] e MRS 1523 [10-6 M] respectivamente, associados à adenosina não houve

diferença com relação às células tratadas apenas com o referido nucleosídeo (Gráfico 3).

T r a ta m e n to s

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A D O + A n t. A 1 R + A n t. A 3 R

Gráfico 3: Análise da ação dos antagonistas dos receptores A1R e A3R da adenosina no pré-condicionamento

farmacológico. Percentual de cardiomiócitos viáveis após isquemia, tratados com Adenosina [10-8 M], ant. A1R [10-

6 M] e ant. A3R [10-6 M] comparados a cardiomiócitos não tratados expostos a isquemia (controle). Resultado de

dois experimentos independentes realizados em duplicatas, n = 2 e expressos em média ± SEM, p<0,05.

Pós-condicionamento – Adenosina

Os receptores A2AR e A2BR da adenosina são conhecidos por atuar predominantemente no

pós-condicionamento. Ao tratar as células com os antagonistas dos receptores A2AR e A2BR, ZM

241385 [10-9 M] e MRS 1754 [10-6 M] respectivamente, e associá-los à adenosina não houve

diferença com relação às células tratadas apenas com o referido nucleosídeo (Gráfico 4).

T r a ta m e n to s

Via

bil

ida

de

ce

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0

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A D O + A n t. A 2 A R + A n t. A 2 B R

Gráfico 4: Análise da ação dos antagonistas dos receptores A2AR e A2BR da adenosina no pós-condicionamento

farmacológico. Percentual de cardiomiócitos viáveis após isquemia, tratados com adenosina [10-8 M], ant. A2AR [10-

9 M] e ant. A2BR [10-6 M] comparados a cardiomiócitos não tratados expostos a isquemia (controle). Resultado de

dois experimentos independentes realizados em duplicatas, n = 2 e expressos em média ± SEM, p<0,05.

Resultados

52

4.3.2. Espironolactona

Pré-condicionamento – Espironolactona

Ao tratarmos os cardiomiócitos com antagonista dos receptores A1R e A3R associados à

espironolactona não houve diferença com relação às células tratadas apenas com o referido

antagonista do MR ou espironolactona + Adenosina (Gráfico 5).

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E s p iro + A n t. A 1 R + A n t. A 3 R

Gráfico 5: Análise da ação dos antagonistas dos receptores A1R e A3R da adenosina associados à espironolactona

no pré-condicionamento farmacológico. Percentual de cardiomiócitos viáveis após isquemia, tratados com

espironolactona [10-9 M], adenosina [10-8 M], ant. A1R [10-6 M] e ant. A3R [10-6 M] comparados a cardiomiócitos

não tratados expostos a isquemia (controle). Resultado de dois experimentos independentes realizados em

duplicatas, n = 2 e expressos em média ± SEM, p<0,05.

Pós-condicionamento – Espironolactona

Os tratamentos dos cardiomiócitos com os antagonistas dos receptores A2AR e A2BR

associados à espironolactona não mostraram diferença significativa na viabilidade celular no pós-

condicionamento farmacológico, conforme representado no gráfico 6.

Resultados

53

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E s p iro + A n t. A 2 A R + A n t. A 2 B R

Gráfico 6: Análise da ação dos antagonistas dos receptores A2AR e A2BR da adenosina associados à espironolactona

no pós-condicionamento farmacológico. Percentual de cardiomiócitos viáveis após isquemia, tratados com

espironolactona [10-9 M], adenosina [10-8 M], ant. A2AR [10-9 M] e ant. A2BR [10-6 M] comparados a cardiomiócitos

não tratados expostos a isquemia (controle). Resultado de dois experimentos independentes realizados em

duplicatas, n = 2 e expressos em média ± SEM, p<0,05.

4.3.3. Eplerenona

Pré-condicionamento – Eplerenona

Ao tratarmos os cardiomiócitos com antagonistas dos receptores A1R e A3R associados à

eplerenona não houve diferença com relação às células tratadas apenas com o referido fármaco

ou eplerenona + adenosina (Gráfico 7). Observa-se pelo gráfico que houve uma tendência a maior

viabilidade das células tratadas com eplerenona e com eplerenona + adenosina, ainda que não

tenha apresentado diferença estatística dos demais tratamentos.

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E p le + A n t. A 1 R + A n t. A 3 R

Gráfico 7: Análise da ação dos antagonistas dos receptores A1R e A3R da adenosina associados à eplerenona no

pré-condicionamento farmacológico. Percentual de cardiomiócitos viáveis após isquemia, tratados com eplerenona

[10-8 M], adenosina [10-8 M], ant. A1R [10-6 M] e ant. A3R [10-6 M] comparados a cardiomiócitos não tratados

expostos a isquemia (controle). Resultado de dois experimentos independentes realizados em duplicatas, n = 2 e

expressos em média ± SEM, p<0,05.

Resultados

54

Pós-condicionamento – Eplerenona

Eplerenona associada aos antagonistas dos receptores A2AR e A2BR não apresentou

diferença na viabilidade com relação às células tratadas apenas com o referido antagonista do

MR ou com eplerenona + adenosina (Gráfico 8) no pós-condicionamento farmacológico. Assim

como observado no pré-condicionamento, é possível notar uma tendência no gráfico a maior

viabilidade das células tratadas com eplerenona + adenosina comparado aos demais tratamentos,

embora não tenha havido diferença estatística para comprovar se há alguma relação.

T r a ta m e n to s

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E p le + A n t. A 2 A R + A n t. A 2 B R

Gráfico 8: Análise da ação dos antagonistas dos receptores A2AR e A2BR da adenosina associados à eplerenona no

pós-condicionamento farmacológico. Percentual de cardiomiócitos viáveis após isquemia, tratados com eplerenona

[10-8 M], adenosina [10-8 M], ant. A2AR [10-9 M] e ant. A2BR [10-6 M] comparados a cardiomiócitos não tratados

expostos a isquemia (controle). Resultado de dois experimentos independentes realizados em duplicatas, n = 2 e

expressos em média ± SEM, p<0,05.

55

5- DISCUSSÃO

Discussão

56

No ano de comemoração de 30 anos da descoberta do pré-condicionamento isquêmico por

Murry e colaboradores (1986), ainda há muito a ser explorado para compreender esse poderoso

mecanismo de cardioproteção. Sabe-se que a adenosina é liberada em condições de isquemia e

atua no pré-condicionamento e no pós-condicionamento via receptores denominados A1R, A2AR,

A2BR e A3R. Adicionalmente, estudos têm demonstrado que todos os receptores da adenosina

são expressos no coração e estão envolvidos na cardioproteção (Zhan et al., 2011). Antagonistas

do MR, como espironolactona e eplerenona, também atuam como agentes de proteção durante

isquemia-reperfusão, sendo descritos como agentes de pré- e pós-condicionamento

farmacológico (Chai, Garrelds, Arulmani, et al., 2005; Chai, Garrelds, De Vries, et al., 2005).

Estas evidências nos motivaram a testar, comparativamente, a ação cardioprotetora da

espironolactona e eplerenona, bem como da adenosina perante seus antagonistas como controle.

Realizamos ensaios onde, inicialmente, foi estabelecida a metodologia de indução da

isquemia in vitro. Para mimetizar a isquemia, o método adotado associou subnutrição e

deslocamento do oxigênio do ambiente das células (Safran et al., 2001), técnica que se mostrou

eficaz, uma vez que, ao testar a citotoxicidade por meio de kit de lactato desidrogenase,

observamos que a atividade da enzima LDH aumentou significativamente nas células do grupo

isquemia em comparação às mantidas em condições normais de nutrição e oxigênio (gráfico 1).

Esse resultado pode ser explicado pelo fato de a lactato desidrogenase ser uma enzima que atua

em condições de anaerobiose, quando catalisa a redução do piruvato em lactato, utilizando o

NADH produzido na fase oxidativa, regenerando o NAD+ necessário para a glicólise na ausência

de oxigênio (Lehninger et al., 2005).

Com a metodologia de isquemia in vitro estabelecida, prosseguimos para a determinação

da presença da adenosina por espectometria de massas nos cardiomiócitos submetidos a isquemia

e tratados com espironolactona e eplerenona. Conforme exposto nas figuras 10, 11, 12 e 13, e na

tabela 6, demonstramos que nosso nucleosídeo de interesse foi detectado em todas as amostras

submetidas a isquemia, e, como esperado, nenhuma amostra do grupo normóxia apresentou

adenosina detectada. Esses resultados corroboram com estudos prévios em que determinaram a

presença da adenosina em cardiomiócitos, endotélio e células intersticiais durante os ciclos de

isquemia-reperfusão no condicionamento isquêmico (Heusch, 2015).

Entretanto, nosso trabalho mostra, pela primeira vez, que o tratamento com espironolactona

como agente de pré-condicionamento farmacológico levou a maior concentração de ADO em

relação ao tratamento com eplerenona e ao controle. Por outro lado, no pós-condicionamento a

Discussão

57

concentração da adenosina foi maior no tratamento com eplerenona quando comparada à

espironolactona e ao controle. Esses dados têm sido confirmados por um estudo do grupo, que

vêm sendo realizado em paralelo e têm demonstrado resultados semelhantes (dados não

mostrados). Adicionalmente, nossos resultados somam-se aos estudos de Schmidt e

colaboradores que, utilizando um modelo de infarto do miocárdio em rato, demonstraram que o

efeito cardioprotetor do canrenoato de potássio (metabólito ativo da espironolactona) foi

completamente abolido quando na ausência da enzima ecto-5’-nucleotidase, responsável pela

catalisação da conversão de AMP em adenosina. O mesmo ocorreu com camundongos knock-

outs para o receptor A2BR. O efeito da eplerenona também foi completamente abolido na

presença do antagonista não específico do receptor de adenosina, 8-p-sulphophenyltheophylline,

em corações perfundidos isolados de ratos (Schmidt et al., 2010). A análise, em conjunto, desses

dados demonstra que tanto espironolactona quanto eplerenona parecem estar relacionadas com o

aumento da disponibilidade de adenosina nos cardiomiócitos tanto no pré- quanto no pós-

condicionamento.

Esses resultados nos motivaram a prosseguir com nossa hipótese, e testar se a ação de

antagonistas do MR sobre o coração pode estar sendo mediada por uma interação com a

adenosina via seus receptores de membrana. Avaliamos então, o efeito cardioprotetor da

espironolactona e eplerenona a curto prazo sobre cardiomiócitos de ratos submetidos à isquemia-

reperfusão in vitro, na presença e na ausência de antagonistas dos receptores A1R, A2AR, A2BR e

A3R da adenosina.

Tanto a espironolactona, como a eplerenona e a adenosina foram capazes de prevenir (pré-

condicionamento) como reverter (pós-condicionamento) os danos impostos pela isquemia aos

cardiomiócitos, visto que a viabilidade nas células tratadas por elas foi semelhante ao grupo

controle normóxia (sem tratamento e em condições normais de oxigenação) e maior que o grupo

controle isquemia (sem tratamento, mas em condições isquêmicas), como mostrado pelo ensaio

de viabilidade celular (MTT) no gráfico 4. Esses dados confirmam a efetividade desses fármacos

e da adenosina em proteger as células sob condições isquêmicas conforme já descrito por Chai e

colaboradores (2005) e Schmidt et al., 2010.

Em contraposição, ao associar espironolactona e eplerenona a antagonistas dos receptores

da adenosina A1R, e A3R no pré-condicionamento e A2AR e A2BR no pós-condicionamento, dada

a ação preferencial desses receptores em cada um dos tipos de condicionamento isquêmico (Zhan

et al., 2011), não obtivemos resultados significativos no bloqueio da proteção das células

Discussão

58

(gráficos 5, 6, 7, 8, 9 e 10). A localização dos antagonistas da adenosina no coração ainda é

controversa. Há relatos da presença dos receptores em ventrículos, A1R (Auchampach e Bolli,

1999), A2AR (Norton et al., 1999), A2BR (Liang e Haltiwanger, 1995) e A3R (Strickler et al.,

1996). Entretanto, estudando os receptores a nível molecular, Robin e colaboradores, mostraram

por PCR em tempo real que a expressão dos receptores A1R, A2AR e A2BR foram maiores no

átrio em relação ao ventrículo, enquanto A3R foi igualmente expresso em ambos (Robin et al.,

2011). Koscsó e colaboradores, por sua vez, mostraram que a expressão do receptor A3R no

miocárdio é baixa, apesar de agonistas do A3R terem efeitos cardioprotetores em modelos de

isquemia-reperfusão (Koscsó et al., 2011). Esses estudos nos levam a crer que, provavelmente,

não houve uma resposta mais acentuada em relação ao bloqueio dos receptores em nossos

tratamentos, devido ao fato de usarmos cardiomiócitos ventriculares.

Por outro lado, contrapondo nossos resultados no pós-condicionamento, Grube e

colaboradores comprovaram, também por PCR em tempo real, a presença do receptor A2BR em

cardiomiócitos ventriculares isolados de rato, e demonstraram que a ativação deste receptor

protege fortemente os corações perfundidos da lesão de isquemia-reperfusão e o uso do

antagonista MRS 1754 bloqueou essa proteção (Grube et al., 2011).

Adicionalmente, alguns estudos vêm mostrando grande interação entre os receptores,

apesar da predominância de A1R e A3R no pré-condicionamento e de A2AR e A2BR no pós-

condicionamento. Analisando corações isolados e perfundidos de camundongos selvagens e

knock-outs para A2AR e A2BR, Zhan e colaboradores mostraram que ambos receptores são

necessários na cardioproteção promovida pelo receptor A1R, indicando uma interação entre os

subtipos de receptores da adenosina (Zhan et al., 2011). Essa interação também foi demonstrada

durante isquemia em células H9c2(2-1) (Urmaliya et al., 2009). Múltiplos resultados

consistentes, com diferentes espécies e modelos experimentais indicam interação entre os

receptores A1R e A3R antes da isquemia na proteção e para A2AR e A2BR durante a reperfusão

(Mcintosh e Lasley, 2012). Em nossos experimentos, a associação dos receptores não mostrou

diferença significativa comparada aos demais tratamentos.

Neste ponto, acreditamos que, apesar da comprovada participação da espironolactona e

eplerenona em proteger os cardiomiócitos sob isquemia, e sua evidente influência sobre a

disponibilidade de adenosina, nossos resultados não nos permite afirmar se a cardioproteção por

eles promovida é mediada via receptores da adenosina. É possível que o efeito cardioprotetor da

espironolactona e eplerenona no condicionamento isquêmico venha numa segunda fase, no

Discussão

59

entanto, diante de nossos resultados, admitimos que há possibilidade de o protocolo experimental

escolhido em nosso trabalho não ter sido o ideal para comprovar nossa hipótese. Essas

considerações nos levam a duas possíveis explicações:

1. Pré- e pós-condicionamento compartilham de vias de sinalização (com algumas

particularidades entre elas), que incluem PKC, receptor da aldosterona (MR), PI3K/AKT e ERK

(Schmidt et al., 2010). Sabidamente, espironolactona e eplerenona também atuam por essas vias,

sendo ainda capazes de aumentar a atividade da ERK 1/2 e elevar os níveis de AMPc (Hermidorff

et al., 2015). Adicionalmente, sabendo da ação dos antagonistas de MR sobre a atividade da

enzima ecto-5’-nucleotidase (Schmidt et al., 2010), sugerimos que espironolactona e eplerenona

possam estar atuando na promoção de substrato para formação de adenosina durante a isquemia.

Isto é, ao tratar as células com espironolactona e eplerenona, estimula-se o aumento dos segundos

mensageiros importantes na proteção, entre eles o AMPc. Com maior disponibilidade de AMPc,

a enzima ecto-5’-nucleotidase tem mais substrato para clivar o AMP em adenosina durante a

isquemia (Eckle et al., 2007). A adenosina, por sua vez, pode então atuar via seus receptores para

promover a proteção contra os danos causados por isquemia-reperfusão.

2. Espironolactona e eplerenona possuem ação proliferativa de cardiomiócitos e

antifibrótica, como demonstrado em trabalhos prévios do nosso laboratório. Tanto

espironolactona quanto eplerenona se mostraram capazes de promover proliferação de

cardiomiócitos após 24h e reverter a proliferação de fibroblastos promovida pela aldosterona

após 48h do tratamento (Hermidorff et al., 2015). Por nosso modelo de estudo ser agudo (ensaios

realizados 18h após tratamentos), é possível que nosso método não tenha sido suficiente para

observar os efeitos consequentes de uma possível ação dos antagonistas do MR associados aos

receptores da adenosina.

60

6- CONCLUSÃO

Conclusão

61

A cardioproteção promovida por antagonistas do receptor mineralocorticoide da

aldosterona é bem fundamentada e, estudos vêm demonstrando que espironolactona e eplerenona

atuam também como agentes de condicionamento farmacológico, protegendo o coração contra

lesão de reperfusão. A proteção promovida pela adenosina também é bem estabelecida durante

eventos de isquemia-reperfusão em várias espécies e modelos experimentais. Nosso trabalho

mostrou pela primeira vez, de forma comparativa, a ação da espironolactona e eplerenona

associadas à adenosina e seus receptores.

Com base em nossos resultados concluímos que:

1. Cardiomiócitos ventriculares de ratos são igualmente protegidos contra danos

promovidos por isquemia tanto por espironolactona e eplerenona, quanto por adenosina.

2. Espironolactona e eplerenona aumentam a concentração de adenosina presente em

cardiomiócitos ventriculares de ratos após isquemia, no pré-condicionamento e no pós-

condicionamento farmacológico.

3. Apesar da evidente proteção promovida por espironolactona e eplerenona durante a

isquemia, nossos dados não nos permite afirmar se esta ocorre via ligação aos receptores

da adenosina, uma vez que o tratamento das células com antagonistas dos receptores

A1R, A2AR, A2BR e A3R associados a espironolactona e eplerenona não alterou a

viabilidade celular quando comparado ao tratamento apenas com os fármacos. Outros

experimentos serão necessários para esclarecer essa questão.

A análise conjunta dos nossos resultados nos levam a crer que há relação entre a ação da

espironolactona e da eplerenona com a adenosina, contudo se faz necessário aprofundar ainda

mais no conhecimento desse mecanismo para compreendê-lo. É possível que a cardioproteção

promovida pela espironolactona e eplerenona durante a isquemia ocorra mediada pelos

receptores da adenosina, no entanto, nossos resultados são consequentes de uma análise aguda,

feita 18 horas após os tratamentos, podendo não ter sido tempo suficiente para observar os efeitos

consequentes dessa possível relação. Além disso, não se pode descartar a possibilidade de que a

ação desses cardioprotetores possa ocorrer por outro mecanismo, talvez por propiciar a ação da

enzima ecto-5’-nucleotidase.

62

7- REFERÊNCIAS

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http://www.cardiometro.com.br/

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8- ANEXOS

Anexos

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Anexos

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Anexos

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estudo do envolvimento dos receptores da …‡Ão... · receptores da adenosina e espironolactona...

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