Escola Superior de Sade Egas Moniz

Estudo do DNA mitocondrial de um grupo de

imigrantes oriundos de Cabo Verde residente s

em Lisboa

Contributo para o conhecimento da origem e evoluo da populao de um

territrio integrado no ex-Imprio Colonial Portugus durante 500 anos

Paulo Jorge Sampaio Morais

Dissertao de Mestrado Lisboa, 2013

Mestrado em Biologia Molecular em Sade

Ttulo : Estudo do DNA mitocondrial de um grupo de imigrantes

oriundos de Cabo Verde residentes em Lisboa: Contributo para o

conhecimento da origem e evoluo da populao de um territrio

integrado no ex-Imprio Colonial Portugus durante 500 anos

Dissertaco apresentada Escola Superior de Sade Egas Moniz com

vista obtenco do grau de Mestre em Biologia Molecular em Sade

Autor : Paulo Jorge Sampaio Morais

Orientadores: Especialista Superior de Medicina Legal Antnio

Amorim e Especialista Superior de Medicina Legal Helosa Afonso

Costa

Investigaco laboratorial realizada no Servio de Gentica e Biologia

Forenses da Delegaco do Sul do Instituto Nacional de Medicina Legal e

Cincias Forenses, I.P.

Data: Setembro 2013

1

Agradecimentos

Ao meu orientador, Professor Antnio Amorim, por ter aceite a

orientao da presente Dissertao de Mestrado, por estar sempre disponvel

para qualquer assunto, dvida e correo, e pela enorme ajuda na elaborao

da tese.

minha orientadora, Mestre Helosa Afonso Costa, por ter aceite a

coorientao da presente Dissertao de Mestrado, por me ter transmitido todo

o conhecimento da rea e por contribuir sempre com uma boa dose de apoio e

otimismo.

Ao Rodolfo Santos, por me ter ambientado ao contexto laboratorial e

auxiliado nos primeiros passos a nvel tcnico. Dr. Manuela Marques, pela

ajuda na obteno de muitos dos artigos utilizados na elaborao da tese.

Ao Sr. Prof. Doutor Jorge Costa Santos, por permitir que realizasse o

meu projeto nas instalaes do INMLCF.

Dr. Rosa Espinheira e a todo o pessoal do servio de Gentica e

Biologia Forense do INMLCF, por toda a ajuda tcnica, simpatia e

disponibilidade.

coordenao do Mestrado em Biologia Molecular em Sade, Prof.

Dr. Alexandra Maia e Silva, por ter aceite este projeto.

Sara, por me fazer acreditar e lutar pelos meus objetivos, obrigada

pelo amor e carinho!

Aos meus pais, pelo incentivo e apoio constante, pelo suporte

financeiro e emocional.

Aos restantes colegas da 3 Edio do Mestrado de Biologia Molecular

em Sade, pelo convvio e amizade.

2

Resumo

O DNA mitocondrial apresenta caractersticas particulares, tais como um

elevado nmero de cpias por clula, herana uniparental materna, elevada taxa de

mutao e ausncia de recombinao, que permitem a sua utilizao na clarificao

da origem e evoluo das populaes humanas. O objetivo deste estudo foi obter

informao sobre a origem, em termos genticos, da populao imigrante de Cabo

Verde residente atualmente em Lisboa. Para tal procedeu-se construo de uma

base de dados de DNA mitocondrial de forma a caracterizar a diversidade gentica

de 103 imigrantes oriundos de Cabo Verde, residentes em Lisboa.

A regio controlo do DNA mitocondrial foi amplificada e sequenciada, entre

as posies 16024 e 576, utilizando dois pares de primers (L15997/H016 e

L1655/H599). As sequncias obtidas foram inseridas na base de dados de DNA

mitocondrial com maior relevncia na rea das Cincias Forenses, a EDNAP

Forensic mtDNA Population Database - EMPOP.

A anlise da regio controlo revelou elevada variabilidade gentica, com

elevada frequncia de hapltipos nicos. A maioria das sequncias de DNA

mitocondrial corresponde a haplogrupos caractersticos de populaes africanas.

Uma pequena minoria corresponde a haplogrupos euroasiticos. Os resultados

obtidos so semelhantes aos resultados alcanados em estudos anteriores sobre a

origem e evoluo da populao de Cabo Verde, o que sugere que a composio

gentica da populao imigrante de Cabo Verde a residir atualmente em Lisboa

representativa da composio gentica do arquiplago. Os resultados obtidos no

contradizem a verso histrica da colonizao do arquiplago de Cabo Verde,

segundo a qual a referida colonizao envolveu escravas africanas e indivduos

portugueses do sexo masculino, mobilizados altura para a ex-colnia.

Palavras chave: DNA Mitocondrial; Cabo Verde; Lisboa; Gentica

populacional

3

Abstract

Mitochondrial DNA presents peculiar characteristics that promote its use in

the clarification of the origin and evolution of human populations, such as maternal

inheritance, high mutation rate and absence of recombination. The aim of this study

was to obtain information about the origin of the immigrant population of Cabo

Verde currently living in Lisbon. As such, a database for mtDNA was built to

analyze the genetic diversity of 103 immigrants from Cabo Verde, living in Lisboa.

Mitochondrial DNA control region was amplified and sequenced between

positions 16024 and 576, using two sets of primers (L15997/H016 and

L16555/H599). Obtained haplotypes were submitted to the most important

mitochondrial DNA database in Forensic Sciences, EDNAP Forensic mtDNA

Population Database EMPOP.

The analysis of the control region revealed high genetic diversity, with a high

frequency of unique haplotypes. Most mitochondrial DNA sequences correspond to

African haplogroups. A minority of the sequences were linked to Euroasian

haplogroups. Obtained results are similar to results achieved in previous studies

that the

representative of the genetic makeup of the archipelago. The results do not contradict

the historical version of the colonization of the archipelago, which states the

colonization involved female African slaves and male Portuguese, mobilized by that

time to the ex-colony.

Keywords: Mitochondrial DNA; Cabo Verde; Lisboa; Population genetics

4

ndice Geral

Resumo ............................................................................................................. 2

Abstract ............................................................................................................ 3

ndice Geral ....................................................................................................... 4

ndice de Figuras ............................................................................................... 6

ndice de Tabelas ............................................................................................... 7

Lista de abreviaturas ......................................................................................... 8

Introduo ...................................................................................................... 10

1. Cabo Verde .................................................................................................. 10

1.1. Generalidades....................................................................................... 10

1.2. O Imprio Colonial Portugus e a descoberta de Cabo Verde ............... 12

1.3. Colonizao e crescimento de Cabo Verde ............................................ 12

1.4. Destabilizao do estado econmico e Independncia de Cabo Verde . 13

1.5. Migrao em Cabo Verde...................................................................... 14

1.6. Atualidade de Cabo Verde .................................................................... 15

2. Mitocndria ................................................................................................. 16

2.1. Estrutura e funes ............................................................................... 16

2.2. Origem da mitocndria e semi-autonomia ............................................ 17

3. DNA Mitocondrial ........................................................................................ 18

3.1. Genoma mitocondrial ........................................................................... 19

3.2. Caractersticas do genoma mitocondrial ............................................... 20

3.2.1. Cdigo gentico ............................................................................. 21

3.2.2. Nmero de cpias.......................................................................... 21

3.2.3. Taxa de mutao ........................................................................... 21

3.2.4. Herana materna ........................................................................... 23

3.2.5. Ausncia de recombinao ............................................................ 24

3.2.6. Heteroplasmia ............................................................................... 25

4. Estudo do genoma mitocondrial .................................................................. 27

4.1. DNA mitocondrial e Gentica Populacional ........................................... 29

4.1.1. Origem do homem moderno ......................................................... 30

5

4.1.2. Migraes humanas e disperso da populao africana................. 31

4.2. DNA mitocondrial e Cincias Forenses .................................................. 33

4.3. Outras aplicaes do genoma mitocondrial .......................................... 34

5. Bases de dados genticos de DNA mitocondrial ........................................... 35

6. Cabo Verde composio gentica atual ..................................................... 35

Objetivos ......................................................................................................... 36

Materiais e Mtodos ....................................................................................... 37

7. Procedimento experimental ........................................................................ 37

7.1. Tcnicas utilizadas ................................................................................ 37

7.2. Seleo de amostras ............................................................................. 38

7.3. Extrao de DNA ................................................................................... 38

7.4. Amplificao ......................................................................................... 39

7.5. Purificao dos produtos da reao de amplificao ............................. 40

7.6. Sequenciao........................................................................................ 41

7.7. Purificao dos produtos da reao de sequenciao ........................... 43

7.8. Deteo dos produtos sequenciados .................................................... 44

7.9. Anlise dos produtos sequenciados ...................................................... 45

7.10. Anlise estatstica e filogentica ........................................................ 47

Resultados e Discusso .................................................................................... 48

8. Resultados ................................................................................................... 48

8.1. Estudo dos hapltipos representados ................................................... 48

8.2. Estudo de heteroplasmias ..................................................................... 55

8.3. Clculo dos parmetros de diversidade................................................. 56

8.4. Estudo dos haplogrupos representados ................................................ 60

8.5. Anlise filogentica ............................................................................... 62

9. Discusso ..................................................................................................... 64

9.1. Estudo da totalidade da regio controlo do genoma mitocondrial ........ 64

9.2. Anlise dos resultados obtidos.............................................................. 69

9.3. Significado filogentico ......................................................................... 77

Concluses ...................................................................................................... 79

Bibliografia ...................................................................................................... 81

6

ndice de Figuras Pgina

Figura 1. Mapa com a localizao das ilhas pertencentes ao grupo da Macaronsia ........................... 12

Figura 2. Mapa de Cabo Verde ............................................................................................................. 13

Figura 3. Fotografia da esttua de Diogo Gomes, um dos navegadores envolvidos na descoberta de

Cabo Verde, em Praia ..................................................................................................................................... 14

Figura 4. Representao esquemtica referente aos emigrantes cabo-verdianos por pas, em %, segundo

dados do Censo de 2000 ................................................................................................................................. 17

Figura 5. Representao esquemtica da estrutura da mitocndria ...................................................... 18

Figura 6. Representao esquemtica do genoma mitocondrial ........................................................... 21

Figura 7. Demonstrao esquemtica de um exemplo de herana materna de mtDNA para 18

indivduos ........................................................................................................................................................ 25

Figura 8. Mapa com uma representao esquemtica da expanso do ser humano pelas diversas regies

do globo e respetiva distribuio geogrfica de haplogrupos ........................................................................ 32

Figura 9. Tcnica de sequenciao com ddNTPs marcados com fluorocromos de diferentes cores ... 42

Figura 10. Esquema de purificao por Xterminator e aspirao automtica pelo capilar .................... 46

Figura 11. Imagem de electroferograma obtido aps a eletroforese capilar no 3130 Genetic Analyzer

......................................................................................................................................................................... 48

Figura 12. Imagem de um electroferograma de sequncia da regio controlo do mtDNA com

heteroplasmia de comprimento ....................................................................................................................... 50

Figura 13. Representao esquemtica das percentagens observadas por cada haplogrupo para os 103

indivduos com ascendncia cabo-verdiana .................................................................................................... 64

Figura 14. rvore resultante da anlise das distncias genticas obtidas entre as populaes referidas na

tabela 18 .......................................................................................................................................................... 66

7

ndice de Tabelas Pgina

Tabela 1. Caractersticas discriminantes entre o DNA nuclear e o DNA mitocondrial ........................ 20

Tabela 2. Primers utilizados na amplificao da regio controlo total do DNA mitocondrial humano

......................................................................................................................................................................... 42

Tabela 3. Reagentes da reao de amplificao da regio controlo total do DNA mitocondrial humano e

respetivo volume por amostra ......................................................................................................................... 43

Tabela 4. Condies da reao em cadeia da polimerase para a regio controlo total do DNA

mitocondrial humano, efetuada no termociclador GeneAmp PCR system 9700............................................. 43

Tabela 5. Reagentes da reao de sequenciao e volume por amostra ............................................... 45

Tabela 6. Condies da reao de sequenciao efetuada no termociclador GeneAmp PCR system 9700

......................................................................................................................................................................... 45

Tabela 7. Condies da corrida electrofortica realizada no 3130 Genetic Analyzer ........................... 47

Tabela 8. Nomenclatura de bases nucleotdicas de acordo com os cdigos da IUPAC ....................... 50

Tabela 9. Cdigo do hapltipo, haplogrupo a que pertence, nmero de indivduos que apresentam o

hapltipo, nmero de alteraes polimrficas em relao rCRS e hapltipo .............................................. 52

Tabela 10. Nmero de hapltipos nicos, repetidos e diferentes, considerando a regio controlo total do

mtDNA dos 103 indivduos estudados ........................................................................................................... 54

Tabela 11. Nmero e tipo de alteraes polimrficas da regio controlo total do mtDNA detetadas nas

103 sequncias de mtDNA analisadas ............................................................................................................ 54

Tabela 12. Diferentes polimorfismos observados na zona de poli-C da regio HV1 do mtDNA, entre as

posies 16183 e 16193 e nmero de sequncias onde ocorreu heteroplasmia de comprimento .................. 56

Tabela 13. Frequncia absoluta de cada nucletido na regio controlo do mtDNA, considerando as

alteraes polimrficas relativamente rCRS ................................................................................................ 57

Tabela 14. Frequncia de hapltipos homoplsmicos e heteroplsmicos nas 103 sequncias analisadas e

regio hipervarivel de ocorrncia .................................................................................................................. 59

Tabela 15. Frequncia absoluta e frequncia relativa de cada nucletido nas posies polimrficas da

regio controlo do mtDNA, considerando as alteraes relativamente rCRS, apresentadas na tabela 9 .... 60

Tabela 16. Parmetros de diversidade da regio HV1 do mtDNA de populaes africanas e portuguesas

......................................................................................................................................................................... 62

Tabela 17. Parmetros de diversidade da regio controlo do mtDNA de populaes africanas ............. 62

Tabela 18. Populao do presente estudo e populaes selecionadas da literatura, utilizadas no estudo

filogentico ..................................................................................................................................................... 65

Tabela 19. Valores de Fsts entre as populaes do estudo filogentico ................................................... 65

Tabela 20. Valores de p relativos s populaes comparadas no estudo ................................................ 66

8

Lista de abreviaturas

C: Graus Celsius

: Microampere

: Micrometro

: Microlitro

A: Adenina

ATP: Adenosina trifosfato

C: Citosina

CA: California

CRS: Cambridge Reference Sequence (Sequncia de Referncia de Cambridge)

dNTP: Desoxinucletidos trifosfatados

ddATP: Didesoxiadenina trifosfatada

ddCTP: Didesoxicitosina trifosfatada

ddGTP: Didesoxiguanina trifosfatada

ddNTP: Didesoxinucletidos trifosfatados

ddTTP: Didesoxitimina trifosfatada

D-loop: Displacement Loop (Lao de deslocamento)

Da: Dalton

DNA: cido desoxirribonucleco

EDNAP: European DNA Profiling Group

EDTA: cido etilenodiaminotetractico

EMPOP: EDNAP Forensic mtDNA Population Database

FST: Fixation index (ndice de fixao)

g: Fora gravitacional

G: Guanina

H: Heavy (pesado)

HV1: Hipervarivel 1

9

HV2: Hipervarivel 2

HV3: Hipervarivel 3

INE: Instituto Nacional de Estatstica

IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry

Km: Quilmetro

L: Light (leve)

LHON: Leber hereditary optic neuropathy (Neuropatia optica hereditria de Leber)

mL: Mililitro

mtDNA: DNA mitocondrial

N: North (Norte)

nDNA: DNA nuclear

NUMT: Nuclear mitochondrial DNA (Pseudogene mitocondrial no genoma nuclear)

OH: Origem de replicao

Pb: Pares de bases

PCR: Polymerase Chain Reaction (Reao em cadeia da polimerase)

rCRS: Revised Cambridge Reference Sequence (Sequncia de Referncia de Cambridge revista)

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

ROI: Intermedirio reativo de oxignio

rSAP: Recombinant Shrimp Alkaline Phosphatase (Fosfatase Alcalina Recombinante de Camaro)

SNP: Single nucleotide polymorphism (Polimorfismo de nucletido nico)

T: Timina

tRNA: RNA de transferncia

UK: United Kingdom (Reino Unido)

VNTR: Repeties em tandem de variado nmero

W: West (oeste)

http://en.wikipedia.org/wiki/Mitochondrionhttps://www.google.pt/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad=rja&ved=0CD4QFjAB&url=http%3A%2F%2Fwww.tataa.com%2Fproducts-page%2Fquality-control%2Frecombinant-shrimp-alkaline-phosphatase-rsap%2F&ei=_sDyUcGuIpS7hAfcuIGYBA&usg=AFQjCNHz2SElZUlfTdmPJW6T5FuXq20jKQ&bvm=bv.49784469,d.ZG4

10

Introduo

1. Cabo Verde

1.1. Generalidades

Cabo Verde um pas insular africano que em 2010 tinha 491,683 habitantes

(Instituto Nacional de Estatstica de Cabo Verde, 2010). Est situado ao largo da

costa Africana Ocidental, a 450-600 N

e na O seu nome tem origem na pennsula de Cabo

Verde, no Senegal, o ponto mais oeste do continente Africano. Est integrado na

Macaronsia (Figura 1), um grupo de 4 arquiplagos situados no Oceano Atlntico

(Aores, Madeira, Ilhas Canrias e Cabo Verde). Cabo Verde consttuido por dez

ilhas e oito ilhus de origem vulcnica. Atualmente no h registo de erupes,

exceto na ilha do Fogo, onde o seu vulco, altamente ativo, teve a sua ltima erupo

em 1955 (Ramalho, 2011).

Figura 1 Mapa com a localizao das ilhas pertencentes ao grupo da Macaronsia

Adaptado de http://www3.uma.pt/cem/aegro.ecpgr.symp/macaronesia.html

11

As dez ilhas do arquiplago de Cabo Verde esto divididas, consoante a sua

localizao, em dois grupos. A norte situa-se o grupo Barlavento, consttuido pelas

ilhas de Santo Anto, So Vicente, Santa Luzia, So Nicolau, Sal e Boa Vista. O

grupo Sotavento, consttuido pelas ilhas Maio, Santiago, Fogo e Brava, situa-se a sul

do arquiplago (Figura 2). A capital, Praia, localiza-se na ilha de Santiago e

representa o maior aglomerado populacional do pas (Willie , 2001). O arquiplago

tem uma rea total de 4068 km2, sendo a maior ilha Santiago (rea de 991 km

2) e a

menor ilha Santa Luzia (rea de 35 km2). A distncia entre as ilhas varia de 8 km

(entre So Vicente e Santa Luzia) a 270 km (entre Santo Anto e Maio) (Ramalho,

2011).

O clima em Cabo Verde tropical seco com influncia ocenica, com chuvas

de caractr torrencial, particulamente nas ilhas de relevo acentuado. O territrio , na

sua maioria, montanhoso, rido e pobre em terreno frtil. As temperaturas so mais

elevadas em setembro (mdia de 26,7C) e mais baixas em janeiro e fevereiro

(mdias de 18,4C) (Ramalho, 2011). Foi em condies algo rduas, para os

navegadores, que Cabo Verde foi descoberto no sc. XV por portugueses que

exploravam a costa Africana Ocidental. A quando da sua descoberta, as ilhas no se

encontravam habitadas.

Figura 2 - Mapa de Cabo Verde;

Adaptado de Brehm et al. (2002)

12

1.2. O Imprio Colonial Portugus e a descoberta de Cabo Verde

A descoberta de Cabo Verde resultou da expanso do Imprio Colonial

Portugus, que se iniciou em 1415 com a conquista de Ceuta e que se estendeu por

frica, sia e Amrica do Sul. A descoberta de uma rota martima atravs do Cabo

Bojador pelo marinheiro portugus Gil Eanes permitiu a exploradores e mercadores

Europeus partirem descoberta de novas rotas na costa de frica e, mais tarde, na

ndia.

O Infante Dom Henrique, uma eminente

personalidade histrica do Portugal quatrocentista,

lanou navegadores lusos para alm do Cabo

Bojador. Entre eles estava um grupo de

navegadores que contribuiu para a descoberta de

Cabo Verde. Lus Cadamosto, explorador italiano,

descobriu as primeiras ilhas do arquiplago, entre

elas Santiago, em 1458. Diogo Gomes (Figura 3),

Antnio de Noli e Diogo Afonso (1461)

descobriram as restantes ilhas. As ilhas de Cabo

Verde foram descobertas, por portugueses, sem

indcios de presena humana anterior. Acredita-se,

contudo, que os Mouros tenham procurado sal nestas

mesmas ilhas, nos sculos que se antecederam

(Carreira, 1983).

1.3. Colonizao e crescimento de Cabo Verde

Os primeiros colonizadores do arquiplago de Cabo Verde chegaram em

1462 ilha de Santiago e alguns anos depois ilha vizinha de Fogo. Foi em Santiago

que surgiu a primeira povoao, Ribeira Grande (atualmente denominada Cidade

Velha, de forma a evitar confuso com a cidade Ribeira Grande na ilha de Santo

Anto). Ribeira Grande foi a primeira povoao Europeia permanente nos trpicos

(Willie , 2001). Inicialmente, a colonizao decorreu lentamente devido ao clima

rduo da regio. S no sc. XVII as ilhas a norte, Santo Anto e So Nicolau,

receberam os primeiros habitantes (Brehm et al., 2002).

Figura 3 Fotografia da esttua de

Diogo Gomes, um dos navegadores

envolvidos na descoberta de Cabo

Verde, em Praia

Adaptado de

http://old.enciclopedia.com.pt/articles

.php?article_id=1184

http://en.wikipedia.org/wiki/Ribeira_Grande,_Cape_Verdehttp://en.wikipedia.org/wiki/Santo_Ant%C3%A3o,_Cape_Verdehttp://en.wikipedia.org/wiki/Santo_Ant%C3%A3o,_Cape_Verde

13

Em 1466 os colonizadores portugueses em Cabo Verde foram autorizados

pelo Rei Afonso V a negociar livremente com as cidades da costa da Guin, do

Senegal e da Serra Leoa (Brehm et al., 2002). Aps estabelecerem postos de

comrcio nas ilhas j povoadas, comearam a estabelecer postos em pleno continente

africano, o que fortaleceu uma relao comercial entre os colonizadores e as

sociedades africanas com as quais comercializavam. Fruto desta relao teve incio o

comrcio de escravos, que levou a um rpido aumento da populao em Cabo Verde

(Willie , 2001). Alguns dos primeiros escravos eram originrios do Senegal e da

Mauritnia e entre eles existiam tambm Guanches das Ilhas Canrias (Barry, 1998).

Santiago tornou-se uma paragem obrigatria para barcos a caminho do Golfo da

Guin, Angola, So Tom e Princpe e Brasil e a regio rapidamente se tornou numa

estao para comrcio transatlntico de escravos, atividade que permitiu a Cabo

Verde prosperar durante o sc. XVI (Russell-Wood, 1998).

Cabo Verde no servia apenas para as atividades costeiras de Portugal no

Oceano Atlntico. Serviu tambm como local de exilo para marginais e indivduos

acusados de crimes civs e polticos em territrio portugus. O arquiplago seria

tambm inicialmente povoado por judeus e nobres, de Portugal e de outros pases da

Europa, que se mobilizaram para Cabo Verde sem as respetivas famlias.

As primeiras povoaes de Cabo Verde eram, portanto, consttuidas na sua

maioria, por escravas africanas provenientes da costa Africana Ocidental e homens

de diversas classes provenientes da Europa. Os homens acabariam por se cruzar com

as mulheres indgenas, o que deu origem a uma nova classe mista de indivduos, os

mulatos ou crioulos. Indivduos desta nova gerao facilmente se tornaram

intermedirios de comrcio, graas sua familiarizao com ambas as culturas, a

Europeia e a Africana (Willie , 2001).

1.4. Destabilizao do estado econmico e Independncia de

Cabo Verde

A localizao de Cabo Verde no Atlntico e a prosperidade do comrcio

tornaram o arquiplago vulnervel a ataques de piratas provenientes de vrios pases

Europeus, entre eles a Frana e a Holanda, o que acabaria por afetar o comrcio de

14

escravos. A influncia portuguesa na regio diminuiu ao longo dos scs. XVII e

XVII I e o comrcio de escravos terminou em 1876.

A opresso portuguesa que mantinha Cabo Verde com o estatuto de colnia

comeou a sofrer resistncia na segunda metade do sc. XX. Em 1956, um

movimento nacionalista de libertao liderado por Amlcar Cabral, designado Partido

Africano da Independncia da Guin e Cabo Verde, permitiu estabelecer uma

resistncia anticolonial que viria a dar origem a uma insurreio armada e sustentada

e uma cerimnia para declarao da independncia a 5 de julho de 1975 (Willie ,

2001). Cabo Verde tornava-se independente depois de 500 anos de controlo colonial.

Foi instalado um regime de partido nico aps a independncia, substtuido por um

modelo de multipartidarismo em 1990 (Carvalho, 2010).

A abolio do comrcio de escravos no sc. XIX perturbou o estado

econmico do arquiplago, j agravado por secas e escassez de alimentos. Contudo, a

posio do arquiplago no Atlntico tornou-o na localizao ideal para

abastecimento e reparao de navios, o que permitiu atenuar a crise econmica que

Cabo Verde atravessava (Willie , 2001). Esta situao promoveu, contudo, um forte

movimento migratrio, que se viria a estabelecer como uma forte tradio no pas.

1.5. Migrao em Cabo Verde

A migrao est presente na realidade histrica e social de Cabo Verde desde

o estabelecimento da sociedade cabo-verdiana. Os primeiros sinais de expresso

migratria dos cabo-verdianos deram-se no final do sc. XVII e incio do sc. XVIII,

sendo a Amrica o principal destino. Desde ento e at atualidade a emigrao tem

levado os cabo-verdianos a mais de 25 pases em todo o globo (Carling & Akesson,

2009).

Na histria de Cabo Verde so conhecidos trs perodos distintos de grande

fluxo migratrio ao longo do sc. XX. O primeiro ocorreu de 1900 a 1926 para os

Estados Unidos da Amrica. De 1927 a 1945 foram vrios os destinos escolhidos

pelos cabo-verdianos, entre eles a Amrica Latina (Brasil e Argentina), frica

(Senegal, Guin, So Tom e Princpe e Angola) e Portugal. De 1946 a 1973 os

emigrantes escolheram como principal destino a Europa, nomeadamente a Holanda,

Frana, Luxemburgo, Itlia e Sua (Carvalho, 2010).

15

Portugal; 54%

Estados Unidos da Amrica; 19%

Espanha; 2%

Suca; 1,3% Holanda; 5%

Itlia; 2,2%

Frana; 8%

Outros; 8,5%

Segundo o Censo de 2000 (INE de Cabo Verde), no perodo compreendido

entre 1995 e 2000 emigraram 12.206 cabo-verdianos, a maioria do sexo masculino

(54%). Nesse periodo, o principal pas de destino foi Portugal com cerca de 6,590

emigrantes, seguido dos Estados Unidos da Amrica, Frana, Holanda, Itlia,

Espanha e Suca (Carvalho, 2010) (Figura 4). De acordo com os dados mais recentes

do INE de Portugal, o nosso pas tinha, em 2011, 38,895 emigrantes provenientes de

Cabo Verde.

Este elevado fluxo migratrio que se iniciou h 500 anos e que atingiu o seu

auge no sc. XX permite caracterizar o carter cultural atual do pas.

1.6. Atual idade de Cabo Verde

Devido ao seu papel, como centro de comrcio no Oceano Atlntico, Cabo

Verde assimila, atualmente, impresses culturais no s de Portugal e oeste de frica

mas tambm de outras regies do globo. A lngua oficial a Portuguesa mas o

Crioulo a linguagem falada mais comum. A religio dominante a Catlica, mas

outras religies africanas tradicionais tambm so comuns. A maioria dos Cabo-

verdianos so hoje de ascendncia mista, Europeia e Africana (Willie , 2001).

Atualmente, a histria da populao de Cabo Verde poder ser corroborada

pela anlise de variaes no DNA mitocondrial (mtDNA), que permitir estimar o

Figura 4 - Representao esquemtica referente aos emigrantes Cabo-verdianos entre 1995 e

2000 por pas, em %, segundo dados do Censo de 2000; Fonte: Carvalho (2010)

16

impacto das populaes que estiveram na origem da populao cabo-verdiana e na

formao da sua linhagem materna atual.

2. Mitocndria

2.1. Estrutura e funes

O DNA mitocondrial localiza-se num dos compartimentos subcelulares das

clulas eucariotas, a mitocndria. As mitocndrias so organelos pleomrficos (com

1 a 2 m de comprimento) e altamente dinmicos, presentes em elevado nmero no

citoplasma, em todos os organismos que utilizem oxignio como fonte de energia

(Logan, 2006). So consttuidas por duas membranas fosfolipdicas, uma externa,

mais densa e uma interna, mais fina, que se dobra formando vilosidades,

denominadas cristas, que lhe conferem uma rea de superfcie mais extensa. Na

matriz mitocondrial, limitada pela membrana interna, onde esto presentes cpias

de DNA mitocondrial, RNA de transferncia (tRNA), ribossomas mitocondriais e

enzimas (Figura 5). A membrana externa contm poros que a tornam permevel a

molculas com massa molecular superior a 10 mil daltons (Da) e enzimas envolvidas

na sntese de lpidos da mitocndria e na sua respetiva converso para metabolizao

Figura 5 Representao esquemtica da estrutura da mitocndria; Adaptado de Logan (2006)

17

na matriz. A membrana interna consttuida por protenas responsveis por reaes

de oxidao envolvidas no transporte de eletres, ATP sintetases para produo de

ATP na matriz e protenas de transporte que permitem a entrada e sada de

metabolitos da matriz (Alberts et al., 2006).

O principal papel deste organelo consiste, enquanto centro de produo de

energia da clula, na sntese de ATP durante o metabolismo aerbio (Lodish, 2004).

Est envolvida, adicionalmente, noutros processos metablicos, entre eles a

biossntese de cidos gordos, o Ciclo de Krebs e a biossntese de aminocidos

(Logan, 2006). Provou-se tambm, ao longo do tempo, que a mitocndria est

envolvida na fotorrespirao (Douce & Neuburger, 1999), na sinalizao celular para

transporte de Ca2+

(Vandecasteele et al., 2001) e na apoptose (Youle & Karbowski,

2005). O envolvimento da mitocndria com o processo de envelhecimento est bem

descrito e est associado ao aumento da produo de intermedirios reativos de

oxignio (ROIs) e danos no DNA mitocondrial (Peterson et al., 2012).

A mitocndria possui o seu prprio DNA e maquinaria de sntese de protenas

sendo, no entanto, semiautnomas.

2.2. Origem da mitocndria e semi-autonomia

A origem da mitocndria ter ocorrido algures durante a evoluo e reflete

uma endossimbiose acompanhada por transferncia de genes do endossimbionte ao

hospedeiro. Existem, atualmente, duas teorias sobre a origem das mitocndrias. A

primeira, a tradicional teoria endossimbitica, refere que as mitocndrias seriam

procariotas aerbios estritos incorporados por um hospedeiro eucariota com

caractersticas anaerbias, dando origem a uma relao de simbiose. Uma teoria

alternativa indica que o hospedeiro que incorporou a mitocndria era um procariota.

A mitocndria ancestral serviria como uma fonte verstil de energia e eletres. O

hospedeiro, fruto desta relao de simbiose, viria a adquirir mais tarde caractersticas

de um organismo eucariota (Gray, 2012; Martin & Mentel, 2010).

O antepassado da mitocndria perdeu, eventualmente, a capacidade de se

duplicar sozinho e, atualmente, a maioria das protenas mitocondriais so codificadas

no ncleo da clula, sintetizadas no citosol e depois importadas para a mitocndria

(Duby & Boutry, 2002). No entanto, a mitocndria conserva uma semiautonomia

18

gentica em relao restante clula, j que possuiu um genoma prprio, o genoma

mitocondrial.

3. DNA Mitocondrial

Designamos por genoma humano a totalidade da informao gentica contida

nas nossas clulas. consttuido pelo genoma nuclear, organizado em 23 pares de

cromossomas e presente no ncleo das clulas (Makalowski, 2001) e pelo genoma

mitocondrial, contido nas mitocndrias presentes no citoplasma das clulas. So

vrias as diferenas existentes entre o DNA nuclear e o DNA mitocondrial (Tabela

1), adiante exploradas detalhadamente. No so, contudo, entidades isoladas. A forte

interao entre ambos os genomas demonstrada pela necessidade de sntese de

polipptidos pelos dois genomas para posterior produo de ATP na mitocndria

(Pinheiro, 2009). O genoma mitocondrial representa cerca de 0,00055% do total do

genoma humano (Ballard & Whitlock, 2004).

Caractersticas DNA Nuclear DNA Mitocondrial

Localizao Ncleo Mitocndria (Citoplasma)

Nmero de cpias por clula 2 (1 de cada progenitor) Podem ser superior a 1000

% de DNA 99,75% 0,25% (por clula)

Genoma Diploide Haploide

Estrutura Linear, dupla hlice Circular, cadeia dupla

Herana Paterna e materna Materna

Funcionamento Autnomo Semiautnomo, cooperao do

DNA nuclear

Recombinao Sim No

Reparao Sim No

Taxa de mutao Baixa Elevada (5 a 10 vezes superior)

Poder de individualizao nico para cada indivduo,

expecto gmeos monozigticos

No individualiza (partilhado por todos os indivduos da mesma

linhagem materna)

Sequncia de referncia 2001 (projeto do genoma

humano) 1981 (Anderson e colaboradores)

Tabela 1 Caractersticas discriminantes entre o DNA nuclear e o DNA mitocondrial; Adaptado

de Butler (2011)

19

3.1. Genoma mitocondrial

O DNA mitocondrial um tipo de DNA extranuclear circular de dupla

cadeia, com uma cadeia pesada (H heavy) rica em purinas e uma cadeia leve (L

light) rica em pirimidinas (Figura 6). consttuido por aproximadamente 16569

pares de bases (pb), nmero que varia de acordo com possveis inseres e deleces

que possam ocorrer. Apresenta-se compacto, sem intres, com uma utilizao

bastante econmica do genoma, j que possui poucas ou nenhumas bases entre genes

no interior da sua regio codificante (Butler, 2011). A estrutura circular sem histonas

associadas torna-o estvel e resistente degradao j que no permite a ao de

exonucleases. A sua localizao (encerrada no interior das 2 membranas da

mitocndria) tambm favorece a sua estabilidade (Budowle et al., 2003).

A sequncia completa do genoma mitocondrial foi publicada pela primeira

vez em 1981 por Anderson e colaboradores (1981), viria a ser considerada a

sequncia de referncia e designada por Cambridge Reference Sequence (CRS). A

CRS acabaria por ser revista por Andrews e colaboradores em 1999, que corrigiram

11 nucletidos sendo, atualmente, denominada de Revised Cambridge Reference

Sequence (rCRS), com o nmero de acesso, no GenBank, J01415.2. Nesta sequncia

Figura 6 Representao esquemtica do genoma mitocondrial; Adaptado de Butler (2011)

20

foi atribudo um nmero a cada uma das bases nucleotdicas. Um perfil de mtDNA

apresentado, somente, como o conjunto de alteraes encontradas na cadeia leve da

amostra em estudo, relativamente rCRS (Budowle et al., 2003).

A regio codificante constitui cerca de 90% do genoma mitocondrial e

contm 37 genes, entre eles 13 que codificam para polipptidos envolvidos na

fosforilao oxidativa, 2 que codificam para RNA ribossmico e 22 que codificam

para RNA de transferncia (Butler, 2011).

A regio no codificante, tambm designada de lao de deslocamento

(displacement loop ou D-loop), corresponde a uma poro de 1122 pb (cerca de 10%

do genoma mitocondrial) e onde se inclui a origem de replicao (OH). A

replicao do mtDNA inicia-se na cadeia pesada e bidirecional e assincrnica, ou

seja, realizada por deslocamento de uma cadeia em relao outra. Esta regio

tambm recebe a designao de regio controlo j que est envolvida na regulao da

replicao e transcrio do genoma mitocondrial, por possuir os promotores da

transcrio de ambas as cadeias (PI e PII) e sequncias conservadas associadas

iniciao da replicao e respetiva terminao (Coskun et al., 2003).

Foi convenciado por Anderson e colaboradores (1981) que a numerao das

cadeias desta molcula se inicia na regio controlo prxima da origem de replicao.

A regio controlo vai da posio 16024 16569 e da posio 1 576, e nesta

regio que se encontram 3 segmentos hipervariveis (HV1, HV2 e HV3), altamente

polimrficos e por isso alvo de numerosos estudos. A regio HV1 estende-se da

posio 16024 16365, a HV2 da posio 73 340 e a HV3 da posio 430 576.

No presente estudo toda a regio controlo, ou seja, todas as regies hipervariveis

foram estudadas.

3.2. Caractersticas do genoma mitocondrial

O DNA mitocondrial apresenta caractersticas particulares, designadamente

um elevado nmero de cpias por clula, herana uniparental materna, elevada taxa

de mutao e ausncia de recombinao. Este conjunto de caractersticas conferem

ao mtDNA a qualidade de marcador de eleio em estudos de gentica populacional

(Alves-Silva et al., 2000; Salas et al., 2002; Harich et al., 2010; Afonso Costa et al.,

2010; Batini et al., 2011; Castro et al., 2012) e em diversas outras reas como a

21

antropologia (Pbo et al., 1988; Krings et al., 1997), a gentica mdica (Oikawa et

al., 2002; Herrnstadt & Howell, 2004; Van der Walt et al., 2004) e as cincias

forenses (Allen & Engstrm, 1998; Cerri et al., 2004; Cruz et al., 2004; Edson et al.,

2004; Seo et al., 2012).

3.2.1. Cdigo gentico

semelhana do que acontece no genoma nuclear, a informao contida no

mtDNA est organizada em sequncias de 3 bases cada (codes), que codificam para

determinadas estruturas e funes. No entanto, no mtDNA determinados codes

codificam estruturas e funes diferentes das que esses mesmos codes codificam no

DNA nuclear (Scheffler, 1999). O codo para transcrio do aminocido triptofano

o UGA no genoma mitocondrial, enquanto no genoma nuclear esse codo funciona

como um codo STOP. Entre outros exemplos, no mtDNA o codo AUA codifica

para uma metionina em vez de uma isoleucina e os codes AGA e AGG funcionam

como codes STOP, enquanto no genoma nuclear codificam para uma arginina.

3.2.2. Nmero de cpias

O mtDNA est representado por 2 a 10 cpias na mitocndria e cerca de 103 a

104 cpias por clula, ao contrrio do DNA nuclear que est representado por apenas

2 cpias por clula humana (Iborra et al., 2004; Torrini et al., 2006). O elevado

nmero de cpias de mtDNA vantajoso em aplicaes forenses para estudo de

amostras altamente degradadas ou com pouca quantidade de DNA nuclear como

ossos, dentes ou cabelos onde no seja possvel obter um perfil gentico com

marcadores presentes no DNA nuclear (Budowle et al., 2003).

3.2.3. Taxa de mutao

O mtDNA uma molcula altamente polimrfica. Apresenta uma elevada

taxa de mutao em comparao ao DNA nuclear, associada a uma baixa fidelidade

da polimerase do mtDNA que permite um maior nmero de mutaes

durante o processo de replicao. Estudos sobre a fidelidade de polimerizao pela

s (Johnson &

Johnson, 2001). Por outro lado, o mtDNA particularmente suscetvel a danos

oxidativos j que est prximo do principal local de produo de ROI, no est

22

associado a histonas e possui mecanismos de reparao pouco eficazes. A

diminuio do nmero de cpias de mtDNA medida que se envelhece

acompanhada por um aumento de danos no mtDNA e, consequentemente, mutaes

(Peterson et al., 2012).

O mtDNA apresenta uma maior frequncia de substituies pontuais do que

de inseres ou deleces (Carvalho et al., 2003). A maioria das substituies na

regio controlo so substituies por transies, mais frequentemente, entre

pirimidinas (Malyarchuk et al., 2002).

A taxa de mutao varia entre diferentes regies do mtDNA e vai desde

0,075x10-6 a 0,0165x10

-6 substituies/posio/ano (Pakendorf & Stoneking, 2005).

Esta variao pode ser explicada pela existncia de 3 regies especficas, os

segmentos hipervariveis (HV1, HV2 e HV3) presentes na regio no codificante do

mtDNA, que apresentam elevada heterogenidade e parecem possuir posies com

maior incidncia de mutaces que evoluem 5 a 10 vezes mais rpido que os genes

nucleares de cpia nica e do que o restante genoma mitocondrial (Malyarchuk et al.,

2002; Galtier et al., 2006; Howell et al., 2007; Van Oven & Kayser, 2009).

Verificou-se que mutaes no mtDNA de amostras antigas, estudadas por Gilbert e

colaboradores em 2003, ocorrem preferencialmente em determinadas posies

definidas filogeneticamente na regio controlo, sugerindo que tais posies so

hipermutveis. A taxa de mutao da regio HV1 superior das restantes regies

hipervariveis (Meyer et al., 1999). Contudo, tambm j foram descritas posies

com maior incidncia de mutaces ao longo da regio codificante, o que revela que

existem zonas para alm da regio controlo com taxa de mutao significativa

(Freitas & Pereira, 2008). As mutaes podem traduzir-se em situaes associadas a

patologias quando ocorrem em sequncias de genes altamente conservadas, alterando

a sua funo (Coskun et al., 2003).

A taxa de fixao de uma mutao na populao pode variar devido ao efeito

(bottleneck), onde o nmero efetivo de molculas de mtDNA

transmitidas descendncia significativamente reduzida em relao ao seu nmero

presente em ocitos maduros (mais de 100 mil). Esto envolvidas 1 a 27 molculas

de mtDNA por fenmeno de bottleneck (Bendall et al., 1997). Isto favorece uma

rpida deriva gentica na proporo de mtDNA que contenha a mutao dentro de

23

uma determinada populao, podendo um indivduo herdar um conjunto homogneo

de molculas ou um conjunto heterogneo de molculas de mtDNA, com algumas

dessas molculas a possuir a mutao (Jenuth et al., 1996; Howell & Smejkal, 2000).

3.2.4. Herana materna

Foi demonstrado pela primeira vez por Giles e colaboradores (1980) que o

genoma mitocondrial, um genoma haploide, herdado estritamente da me (Figura

7).

Quando o zigoto se divide e o blastcito se desenvolve, o citoplasma e

restantes componentes celulares so consistentes com o ocito original da me. O

ocito possui cerca de 100 mil molculas de mtDNA, criando um cenrio de diluio

extrema para qualquer molcula de mtDNA do espermatezide que possa existir no

zigoto (Chen et al., 1995; Holland & Parsons, 1999). Para reforar a teoria da

herana materna, qualquer mitocndria do espermatezide que entre num ovo em

fertilizao seletivamente destruda pela maquinaria celular do embrio recm

formado (Sutovsky et al., 2004). Thompson e colaboradores (2003) verificaram que

as mitocndrias dos espermatezides sofrem ubiquitinao durante a

espermatognese, promovendo a sua degradao no ovo.

Figura 7 Demonstrao esquemtica de um exemplo de transmisso materna de mtDNA para

18 indivduos.

(Adaptado de Butler, 2011)

24

Schwartz e Vissing (2002) descreveram um caso de herana paterna de

mtDNA num homem de 28 anos com miopatia mitocondrial resultante de uma

deleco de 2 pb no gene ND2. O mtDNA com a mutao tinha origem paterna e

constituia 90% de mtDNA do msculo do paciente. Isto suscitou o interesse de toda a

comunidade cientfica em determinar com exatido se ocorre contribuio ou no de

mtDNA paterno para a respetiva descendncia. No entanto, no foram detetados

indcios de herana paterna em estudos posteriores (Marchington et al., 2002;

Sutovsky et al., 2004). Oikawa e colaboradores (2002) afirmaram que ocorrem

distrbios na herana materna em casos de sndrome de Klinefelter, contudo,

mltiplos artefactos foram encontrados nas sequncias dos 8 indivduos em estudo e

o caso anteriormente descrito de miopatia mitocondrial com herana paterna acabou

por ser considerado uma exceo regra (Bandelt et al., 2005), regressando-se

teoria de herana estritamente materna do genoma mitocondrial.

3.2.5. Ausncia de recombinao

A no recombinao uma das caractersticas essenciais do mtDNA. As

variaes encontradas no genoma mitocondrial resultam exclusivamente de mutaes

adquiridas ao longo das geraes. A ausncia de recombinao biparental facilita o

estabelecimento de relaes filogenticas com aplicao em gentica populacional.

Paralelamente, no DNA nuclear apenas uma poro do cromossoma Y recombina

(Underhill & Kivisild, 2007).

A observao de um caso de herana paterna levantou a hiptese de que a

recombinao no mtDNA seria possvel (Schwartz & Vissing, 2002). A mitocndria

possui, de facto, um sistema de recombinao funcional (Thyagarajan et al., 1996).

Foi tambm colocada a hiptese de que a ocorrncia de recombinao no genoma

mitocondrial poderia estar na causa das variaes encontradas em determinadas

posies entre indivduos (Hagelberg et al., 1999; Eyre-Walker & Awadalla, 2001).

Este tema suscitou o interesse de diversos investigadores, que no detetaram

qualquer evidncia de recombinao no mtDNA (Inman & Nordborg, 2002;

Herrnstadt et al., 2002; Piganeau & Evre-Walker, 2004). A heterogenidade no

genoma mitocondrial pode ser explicada pela existncia de regies com maior

incidncia de mutaes, e constitui a teoria mais aceite atualmente.

25

A no recombinao caracterstica do mtDNA, em conjunto com a sua

herana materna, permite a utilizao de familiares de uma mesma linhagem materna

para resoluo de casos de investigao da identidade, em indivduos desaparecidos

ou vtimas de desastres em massa, j que, excluindo mutaes pontuais que possam

ocorrer e ser adquiridas, a me passa para os filhos o seu mtDNA na ntegra, ou seja,

o seu hapltipo. O hapltipo o conjunto de variaes na sequncia de mtDNA de

um indivduo em comparao com a rCRS. No nico, partilhado por todos os

indivduos da mesma linhagem materna (Budowle et al., 2003), pelo que o resultado

obtido no um perfil gentico individualizante. No entanto, apesar de no ser

individualizante o mtDNA permite, desde logo, a excluso, caso o hapltipo no seja

idntico (exceto heteroplasmias) ao dos alegados parentes maternos.

3.2.6. Heteroplasmia

Considerado um genoma monoclonal, expectvel que cada indivduo possua

uma nica sequncia de mtDNA em todas as suas clulas, condio denominada de

homoplasmia. Ocorre por vezes, contudo, heteroplasmia, que corresponde

coexistncia de diferentes sequncias de mtDNA no mesmo indivduo com pequenas

variaes na sua composio nucleotdica (Howell & Smejkal, 2000; Alonso et al.,

2002; Brandsttter & Parson, 2003).

Existem dois tipos de heteroplasmia, a de comprimento e a de posio. A

heteroplasmia de comprimento est associada a mutaes envolvendo inseres ou

deleces, e observada com maior frequncia nas regies de poli-citosinas (poli-C)

em HV1 (Bendall & Skyes, 1995; Tully et al., 2000) e em HV2 (Prieto et al., 2004).

Na regio HV1 a regio poli-C estende-se da posio 16184 posio 16193.

Ocorrem variaes no comprimento entre sequncias quando se observa uma

transio na posio 16189 (T-C). Na regio HV2 a regio poli-C vai da posio 303

posio 315, com uma timina na posio 310. Essa timina pode ser substituda por

uma citosina, dando origem heteroplasmia. Heteroplasmia de comprimento

causada durante o processo de replicao por erros da polimerase do mtDNA, que

sintetiza uma cadeia complementar com variao no tamanho em relao sequncia

principal, num processo denominado de (replication

slippage). Este fenmeno dificulta a anlise do genoma mitocondrial (Butler, 2011).

As heteroplasmias de posio so mutaes pontuais no genoma mitocondrial, com

26

substituio de uma base nucleotdica por outra numa determinada posio, apenas

em algumas molculas de mtDNA. Numa mesma posio do mtDNA umas cadeias

apresentam uma base nucleotdica e outras cadeias apresentam uma outra base

nucleotdica diferente.

A heteroplasmia observada, geralmente, numa nica posio. Ocorre,

contudo e com muita raridade, em duas ou at trs posies - triplasmia (Tully et al.,

2000). Estudos associados a um maior nmero de amostras e a metodologias de

sequenciao com maior sensibilidade, confirmaram que a heteroplasmia um

fenmeno comum, mesmo que em alguns casos no seja detetvel (Tully et al., 2000;

Lutz et al., 2004; Roberts & Calloway, 2011).

Calloway e colaboradores (2000) defendem que a frequncia de

heteroplasmia aumenta com a idade, podendo ser uma condio hereditria ou um

fenmeno de natureza somtica. Contudo, Lagerstrm-Fermr e colaboradores

(2001) realizaram um estudo retrospetivo em 4 mulheres com heteroplasmia durante

uma dcada e demonstraram que a heteroplasmia na regio controlo do mtDNA

herdada e mantm-se em nveis estveis ao longo do tempo, no havendo relao

com o aumento da idade. Estes resultados foram confirmados por Roberts e

Calloway (2011) que no encontraram correlao significativa entre heteroplasmia,

idade e/ou gnero.

Pode ocorrer a coexistncia de duas ou mais populaes de mtDNA numa

simples mitocndria, clula ou tecido. frequente encontrar diferentes nveis de

heteroplasmia em diferentes partes de uma mesma amostra de cabelo, e os nveis so

mais acentuados nesse tipo de amostra quando comparados com amostras de sangue

ou saliva (Alonso et al., 2002; Roberts & Calloway, 2011). Diferentes nveis de

heteroplasmia entre tecidos podem ser explicados por um processo de replicao

segregativa. No surgimento de uma nova mutao e aps diviso de uma clula

heteroplsmica, as mitocndrias so distribudas aleatoriamente pelas clulas filhas

(Dimauro & Davidzon, 2005).

Em investigaes forenses necessrio um cuidado especial na anlise de

heteroplamias. No possvel excluir ligao entre dois indivduos que no possuam

heteroplasmia na mesma regio se a restante sequncia for idntica. A presena de

27

heteroplasmia permitir apenas reforar a relao j identificada (Br et al., 2000).

As heteroplasmias no so consideradas para a determinao de haplogrupos em

estudos de gentica populacional (Prieto et al., 2004).

4. Estudo do genoma mitocondrial

O mtDNA constitui, em conjunto com a poro no recombinante do

cromossoma Y, que herdado exclusivamente pela linhagem paterna, um sistema

gentico haploide com importantes aplicaes em estudos de evoluo e tambm em

gentica mdica, antropologia e cincias forenses. A evoluo das metodologias de

anlise e respetiva progresso da qualidade e confiana nos resultados obtidos, alm

da capacidade de discriminao entre amostras possivelmente relacionadas, foi

bastante evidente ao longo dos ltimos 30 anos. A sua aplicao gentica

populacional iniciou-se quando Brown e colaboradores (1980) analisaram o mtDNA

de 21 indivduos recorrendo tcnica Restriction Fragment Length Polymorphism

(RFLP) de baixa resoluo. Estudos posteriores desenvolveram a mesma tcnica

(Giles et al., 1980; Scozzari et al., 1988) at que, perto do final da dcada de 80,

surgem RFLP de alta resoluo (Cann et al., 1987; Chen et al., 1995; Torroni et al.,

1996). A partir da anlise de RFLP na regio codificante do mtDNA ficou

demonstrado que existem locais polimrficos estveis entre as populaes que

definem grupos de mtDNA designados por haplogrupos. Haplogrupo definido por

um conjunto de invidduos que partilham variaes e que normalmente so restrictos

a determinada rea geogrfica, possuindo um ancestral comum. Na dcada de 90

surge o recurso a mtodos de sequenciao com anlise da sequncia da regio

controlo, no codificante, que , ainda hoje, o mtodo mais utilizado.

At muito recentemente apenas as primeiras duas regies hipervariveis, HV1

e HV2, foram alvo de anlise (Oota et al., 1999; Crespillo et al., 2000; Alonso et al.,

2002; Carvalho et al., 2003; Afonso Costa et al., 2010), j que a maioria das

alteraes polimrficas se encontra nestes segmentos (Galtier et al., 2006). Em

alguns estudos tem-se, inclusiv, analisado apenas a regio HV1 (Brandsttter &

Parson, 2003; Nagai et al., 2003; Tavares, 2007). Tambm bastante frequente o

recurso a um estudo misto, com anlise das regies hipervariveis da regio controlo

e RFLP de determinados locais na regio codificante (Alves-Silva et al., 2000; Chen

et al., 2000; Salas et al., 2002). A anlise de apenas 2 regies hipervariveis (HV1 e

28

HV2) pode resultar na no anlise de posies nucleotdicas caractersticas de vrios

haplogrupos, como por exemplo a posio 461, caracterstica do haplogrupo M6, ou

da posio 462, caracterstica do haplogrupo J1 (Parson & Bandelt, 2007). A

introduo do estudo do segmento HV3 permitiu aumentar a discriminao entre

amostras analisadas para o genoma mitocondrial. , atualmente, consensual na

comunidade cientfica que mais eficiente efetuar a amplificao da totalidade da

regio controlo, adotada em estudos recentes (Brandsttter et al., 2008; Fendt et al.,

2012a; Gmez-Carballa et al., 2012) e aplicada no presente estudo. O estudo da

totalidade da regio controlo garante um aumento do poder de discriminao entre

amostras e uma maior confiana na determinao dos haplogrupos a que pertencem.

A sequncia da regio controlo pode no ser suficiente para determinar o seu

haplogrupo. Determinadas posies na regio codificante podem contribuir para um

aumento da discriminao individual no estudo de mtDNA (Ingman et al., 2006).

Tm sido desenvolvidos mtodos baseados na amplificao mltipla de single

nucleotide polymorphisms (SNP) por todo o genoma mitocondrial (Coble et al.,

2006; Alvarez et al., 2007; Drio et al., 2009). Esta tcnica apresenta-se como uma

tcnica de baixo custo e com elevada eficcia. bastante utilizada atualmente em

rastreio para identificao humana e em estudos antropolgicos, procedendo-se

depois, se necessrio, sequenciao do genoma mitocondrial. Na gentica

populacional esta tcnica tem tambm sido aplicada como reforo ao estudo das

regies hipervariveis da regio controlo do mtDNA (Hill et al., 2006; Brandsttter

et al., 2008; lvarez-Iglesias et al., 2009; Afonso Costa et al., 2011).

Herrnstadt e colaboradores (2002) desenvolveram uma metodologia para

sequenciar grandes extenses da regio codificante. Vrios investigadores tm, nos

ltimos anos, recorrido anlise de todo o genoma mitocondrial (Behar et al., 2006;

Ingman et al., 2006; Malyarchuk et al., 2008; Soares et al., 2008; Gmez-Carballa et

al., 2012), garantindo uma eficcia total na anlise das variaes caractersticas de

cada haplogrupo. A anlise de mltiplos SNP da regio codificante e/ou a

sequenciao da totalidade do genoma mitocondrial podero ser abordagens a aplicar

em projetos futuros para estudo da origem da populao imigrante de Cabo Verde

residente em Lisboa.

29

4.1. DNA mitocondrial e Gentica Populacional

Caractersticas como a herana estritamente materna e a ausncia de

recombinao do mtDNA permitem reconstruir a origem e evoluo das populaes.

Uma vez que refletem a partilha de um ancestral comum, a distribuio geogrfica

dos haplogrupos e as suas respetivas ramificaes permitem determinar a

composio gentica da linhagem materna de uma populao e os eventos

migratrios do passado, acompanhando a evoluo do ser humano desde a sua

origem, em frica, e medida que se dispersava por todos os continentes (Figura 8).

A acumulao de mutaes na sequncia de mtDNA de indivduos de uma mesma

linhagem materna ao longo de geraes contnuas reflete a sua evoluo. As

variaes na sequncia de mtDNA e a idade do respetivo haplogrupo so importantes

na determinao do tempo e processo a partir do qual os diversos eventos migratrios

tenham ocorrido. A idade do haplogrupo reflete o momento em que ocorreu a

mutao pontual que define o haplogrupo e no quando ocorreu a migrao

(Pakendorf & Stoneking, 2005). tambm importante calcular as distncias

genticas entre as populaes e criar rvores filogenticas que as relacionem para se

percecionar melhor a forma e via de migrao.

A classificao atual dos principais haplogrupos efetuada com letras

maisculas, de A a Z. O mtDNA das populaes africanas est posicionado na base

da rvore filogentica, correspondendo ao macrohaplogrupo L. Este ramifica-se nos

Figura 8 Mapa com uma representao esquemtica da expanso do ser humano pelas diversas

regies do globo e respectiva distribuio geogrfica de haplogrupos; Adaptado de

http://www.familytreedna.com/

30

haplogrupos L0, L1, L2, L3, L4, L5 e L6, caractersticos de populaes afrianas

(Chen et al., 2000; Salas et al., 2002; All ard et al., 2005; Behar et al., 2008; Rosa &

Brehem, 2011)

todos os seres humanos. O haplogrupo L3 ramificou-se aps mobilizao de

populaes para fora de frica h cerca de 60 a 70 mil anos em 2 macrohaplogrupos,

o M e o N, presentes na sia e na Europa (Quintana-Murci et al., 1999; Mishmar et

al., 2003). O macrohaplogrupo N ramificou-se nos haplogrupos H, I, J, K, T, U, V,

W e X (Torroni et al., 1996; Finnil et al., 2001; Behar et al., 2012), que consttuem

98% da populao europeia. Os haplogrupos A, B, F e Y, que ramificaram do

macrohaplogrupo N e os haplogrupos C, D, E, G e Z, que ramificaram do

macrohaplogrupo M, so caractersticos da sia e Ocenia (Fucharoen et al., 2001;

Kivisild et al., 2002; Kong et al., 2011). O continente americano consttuido por,

na sua grande maioria, haplogrupos asiticos A, B, C, D e X, o que sugere que

populaes asiticas entraram no continente americano antes da colonizao

Europeia (Bolnick & Smith, 2003; Kumar et al., 2011).

Estudos de evoluo tm identificado os loci polimrficos caractersticos de

cada haplogrupo, quer da regio codificante, quer da regio controlo do mtDNA e

esto hoje em dia, devidamente organizados numa rvore filogentica concebida por

Van Oven e Kayser (2009). Como exemplo e recorrendo apenas a polimorfismos da

regio controlo, o haplogrupo T caracterizado pela presena da substituio por

transio C-T na posio 16294 do mtDNA. Sofre depois ramificao em 2

subhaplogrupos: T1, com uma substituio por transio G-A na posio 16163 e

uma substituio por transio T-C na posio 16189; e T2, com uma substituio

por transio C-T na posio 16296 (Kivisild et al., 2006).

4.1.1. Origem do homem moderno

Os antroplogos tm sido incansveis na procura da resposta questo de

qual a origem do homem moderno. A antropologia e a gentica atuam em conjunto

numa relao de complementaridade a favor da gentica populacional. Quanto

origem do homem moderno, atualmente, existem duas teorias, a hiptese

multirregional e a hiptese Out of Africa. A hiptese multirregional indica que no

h uma origem geogrfica nica para a espcie Homo sapiens subespcie Homo

sapiens sapiens e que esta evoluiu de forma simultnea a partir do Homo erectus em

31

diferentes regies do Globo, h cerca de um milho de anos. No entanto, a hiptese

que prevalece atualmente a hiptese Out of Africa, onde se afirma que o homem

moderno tem origem recente em frica (Ingman et al., 2000; Forster, 2004), tendo

posteriormente migrado para a Euro-sia e foi substituindo gradualmente a

populao de Homo erectus (Stringer, 2003).

As caractersticas nicas do mtDNA permitem afirmar que todas as linhagens

matrilineares possuem uma raiz comum, situada no ancestral comum mais recente,

denominado et al., 1987). Esta seria, teoricamente, a

primeira mulher. Nascida no sul ou este de frica h mais de 130 mil anos, esteve na

origem da transio para o homem moderno e na origem de todas as linhagens

maternas atuais (Forster, 2004; Torroni et al., 2006; Behar et al., 2008). Estudos

sobre variabilidade gentica corroboram a hiptese de que o mtDNA ancestral

humano se localiza em frica, com origem h cerca de 125 a 165 mil anos e com

posterior fluxo migratrio para os restantes continentes, j que as populaes

africanas apresentam o mtDNA com maior variabilidade (Chen et al., 2000).

Ocorrem em mdia no mtDNA 8 variaes nucleotdicas em Caucasianos e 15

variaes nucleotdicas em indivduos de descendncia africana, em relao rCRS

(Budowle et al., 1999). Estudos de polimorfismos da poro no recombinante do

cromossoma Y corroboram tambm a hiptese de uma origem do homem moderno

recente em frica (Cruciani et al., 2011).

4.1.2. Migraes humanas e disperso da populao africana

A anlise das variaes no mtDNA tem sido usada para reconstruir as

migraes do homem moderno. A maioria das sequncias de mtDNA de africanos

subsarianos encaixa numa das ramificaes do macrohaplogrupo L, de L0 a L6

(excluindo os haplogrupos M e N, que derivaram do haplogrupo L3 e que

representam toda a diversidade mitocondrial no subsariana). Os sub-haplogrupos do

haplogrupo L encontram-se dispersos entre diversas populaes do continente

africano e surgiram atravs de um processo evolutivo que durou 80 a 120 mil anos,

de acordo com a hiptese Out of Africa. O haplogrupo L0 consttui um dos grupos

mais antigos com origem h cerca de 140 a 160 mil anos (Soares et al., 2008). O

primeiro grande evento migratrio registou-se com o surgir do haplogrupo L1 h

cerca de 130 mil anos, encontrado-se disperso pelo oeste e centro de frica, inclusiv

32

pela costa para o Atlntico (Brehm at al., 2002; Behar et al., 2008). O haplogrupo L5

considerado um haplogrupo intermdio, com 120 a 140 mil anos, entre os

haplogrupos L1 e L2 a L6 e encontrado essencialmente no este africano

(Brandsttter et al., 2004; Kivisild et al., 2004). O haplogrupo L2 corresponde, em

conjunto com o haplogrupo L3, a 70% da variao materna subsariana (Chen et al.,

2000). Surgiu h 90 mil anos e est presente em elevadas frequncias no oeste e

centro de frica. Sequncias de mtDNA com origem no este africano, h 60 a 75 mil

anos, so geralmente atrbudas ao haplogrupo L3, que eventualmente se dispersou

por todo o continente africano (Salas et al., 2002; Behar et al., 2008). Ramificaes

do haplogrupo so encontradas por todas as populaes africanas. Os haplogrupos L2

e L3 dispersaram do este de frica para a Euro-sia, e o haplogrupo L3

considerado o percursor mais provvel dos hapltipos asiticos e europeus. Os

haplogrupos L4 e L6 tm origem no este de frica e remontam h cerca de 100 mil e

22 mil anos, respetivamente (Kivisild et al., 2004; Behar et al., 2008).

Estudos anteriores demonstraram que, na Europa, os haplogrupos L esto

presentes em quantidades inferiores a 1% (Salas et al., 2004). A anlise de

sequncias da regio controlo de populaes europeias indica que linhagens dos

haplogrupos L no tero evoludo no continente Europeu, cenrio compatvel com

uma chegada recente, a partir do continente Africano (Malyarchuk & Czarny 2005).

Um estudo de 69 genomas mitocondriais de linhagens dos haplogrupos L inseridas

em populaes europeias demonstrou que 65% dessas linhagens tm, sem qualquer

dvida, origem subsariana, o que confirma uma migrao recente de populaes

africanas para a Europa. Os restantes 35% correspondem a ramificaes do

macrohaplogrupo L especficos do continente europeu, revelando um fluxo gentico

desde a frica subsariana at Europa, estimando-se que tenha ocorrido h cerca de

11 mil anos (Cerezo et al., 2012). Os investigadores desta matria tm tentado

determinar a origem das linhagens L na Europa, concluindo que estas chegaram

recentemente ao continente europeu, provavelmente durante o perodo do domnio

Romano, na conquista Ibrica dos rabes ou no comrcio de escravos no Atlntico

(Pereira et al., 2000; lvarez-Iglesias et al., 2009).

33

4.2. DNA mitocondrial e Cincias Forenses

So vrios os mtodos de Biologia Molecular, desde a anlise de repeties

em tandem de variado nmero (VNTR) por RFLP (Budowle et al., 1991), a anlise

de SNPs (Comey et al., 1991) e a sequenciao direta de mtDNA (Cerri et al., 2004;

Cruz et al., 2004; Seo et al., 2012), que tm sido aplicados ao longo dos tempos nas

cincias forenses.

A utilidade, aplicao e validao do mtDNA nas cincias forenses est bem

documentada (Wilson et al., 1995; Budowle et al., 2003; Parson & Bandelt, 2007;

Pinheiro, 2009). Tal utilidade justificada pelas caractersticas nicas do genoma

mitocondrial j exploradas: hereditariedade uniparental, ausncia de recombinao,

elevada taxa de mutao e elevado nmero de cpias por clula. Este ltimo fator

especialmente vantajoso na resoluo de casos onde a quantidade de DNA extrado

muito pequena ou na presena de amostras altamente degradadas. O mtDNA

apresenta-se, de facto, como uma molcula bastante resistente s condies

ambientais (Holland & Parsons, 1999; Cerri et al., 2004).

O mtDNA utilizado, especialmente, em amostras onde exista uma reduzida

probabilidade de obter resultados aplicando o estudo de marcadores polimrficos no

DNA nuclear. Como exemplos temos cabelos (onde s possvel obter resultados de

DNA nuclear se existir bolbo) e em determinadas circunstncias, ossos e dentes

(Budowle et al., 2003). Balogh e colaboradores (2003) demonstraram tambm que

possvel obter perfis de mtDNA a partir de impresses digitais em simples folhas de

papel.

As regies hipervariveis so de elevado interesse na identificao humana

devido sua elevada taxa de mutao. O pequeno tamanho de cada uma das 3

regies permite a amplificao por Polymerase Chain Reaction (PCR) e a

sequenciao, tcnicas de utilizao frequente nos laboratrios de Gentica Forense.

A natureza haploide e monoclonal do mtDNA simplifica a interpretao de

resultados. No entanto, h que ter especial ateno na anlise de heteroplasmias, j

que no servem de critrio de excluso, podendo apenas reforar a relao entre

amostras conhecidas.

34

A utilizao do mtDNA na Gentica Forense tem sido recorrente. Exclundo

mutaes e tendo em ateno que o mtDNA herdado por via exclusivamente

materna, a sequncia do mtDNA idntica entre todos os indivduos aparentados

pela via materna. Esta caracterstca pode auxiliar a anlise de restos cadavricos de

pessoas desaparecidas, onde o mtDNA de qualquer parente materno pode servir de

amostra de referncia para comparao direta com o mtDNA do desconhecido.

Graas ausncia de recombinao, diversas geraes podem igualmente servir

como amostras de referncia. Os marcadores nucleares, exceo da poro no

recombinante do cromossoma Y, no possuem esta caracterstica. Um dos estudos

mais conhecidos utilizando a sequenciao de mtDNA resultou na identificao do

Czar Nicholas II a partir da anlise do mtDNA dos seus ossos. Utilizando o mtDNA

obtido de familiares da mesma linhagem materna, foi efetuada uma comparao com

a sequncia de mtDNA extrada dos seus ossos, suportando a hiptese de que se

tratavam realmente dos ossos do Czar. Os supostos ossos do Czar partilhavam com o

seu irmo Georgij Romanov, inclusiv, heteroplasmia de comprimento na regio

HV1 na posio 16168. De salientar que a amostra do irmo estava mergulhada em

guas profundas h 60 anos (Holland & Parsons, 1999). Allen e Engstrm (1998)

conseguiram estabelecer uma relao entre 3 crimes em locais diferentes ao revelar a

presena de sequncias de mtDNA idnticas em todos os locais a partir de hastes de

cabelo e unhas. Cerri e colaboradores (2004) conseguiram identificar os restos

mortais de um alegado indivduo presumivelmente assassinado e posteriormente

queimado a partir do mtDNA, com recurso amostra de mtDNA da sua me. Cruz e

colaboradores (2004) e Amorim e colaboradores (2011) identificaram cadveres em

avanado estado de decomposio atravs da comparao do mtDNA extrado a

partir de ossos e um dente, com amostras de referncia de familiares maternos.

4.3. Outras aplicaes do genoma mitocondrial

As variaes no mtDNA tm sido extensamente estudadas e aplicadas

gentica mdica, j que diversas patologias esto associadas a mutaes no mtDNA.

Diversos estudos associaram determinados haplogrupos a fentipos clnicos

(Dimauro & Davidzon, 2005; Herrnstadt & Howell, 2004). O haplogrupo J est

associado a um maior risco de desenvolver cegueira em indivduos com neuropatia

optica hereditria de Leber (LHON) (Brown et al., 2002). Ruiz-Pesini e

35

colaboradores (2000) verificaram que a motilidade do esperma se encontra reduzida

em homens pertencentes ao haplogrupo T e aumentada em homens includos no

haplogrupo H. No entanto, alguns haplogrupos conferem resistncia doena de

Alzheimer (Van der Walt et al., 2004) ou doena de Parkinson (Van der Walt et al.,

2003) e outros haplogrupos esto associadas a maior longevidade (Niemi et al.,

2004).

5. Bases de dados genticos de DNA mitocondrial

Existem, mundialmente, bases de dados que possuem hapltipos de mtDNA,

onde possvel comparar os hapltipos e estudar a frequncia dos mesmos na

populao. Entre outras bases de dados existem o MITOMAP (Ruiz-Pesini et al.,

2007), o mtDB (Ingman & Gyllensten, 2006) e a EMPOP (Parson et al., 2004).

A base de dados com maior relevncia na rea a nvel mundial a EMPOP e

est estabelecida no Instituto de Medicina Legal de Innsbruck. A EMPOP tem como

objetivo criar uma base de dados com elevada qualidade e diretamente acessvel a

toda a comunidade cientfica. O principal fundamento da sua criao esteve no facto

de os laboratrios forenses no terem normalmente capacidade de gerar quantidade

significativa de dados relativos a sequncias mitocondriais para as diferentes

populaes. A reunio de dados populacionais obtidos por cada grupo de trabalho

torna-se, portanto, um conjunto relevante. A EMPOP submete as sequncias

estudadas a um rigoroso controlo de qualidade, antes de as integrar na sua base de

dados (http://empop.org). A EMPOP assegura a infraestrutura bioinformtica,

certificando-se da anlise, transcrio, armazenamento de dados e difuso dos

mesmos (Parson et al., 2004).

6. Cabo Verde composio gentica atual

Recorrendo ao estudo do mtDNA -nos permitido estimar o impacto das

populaes que estiveram na origem da populao imigrante cabo-verdiana residente

em Lisboa e na formao da sua atual linhagem materna. A elevada diversidade

gentica da populao de Cabo Verde, caracterstica de populaes africanas, j foi

demonstrada com recurso anlise do genoma mitocondrial, com prevalncia de

haplogrupos L, superior a 90% (Brehm et al., 2002; Tavares, 2007). No entanto,

estes estudos focaram-se apenas na anlise da regio HV1. Estudo de marcadores

http://empop.org/

36

polimrficos do DNA nuclear foram igualmente efetuados para esta populao

(Amorim et al., 2012; Afonso Costa et al., 2012). Gonalves e colaboradores (2003)

obtiveram o perfil do cromossoma Y de 201 indivduos de Cabo Verde, confirmando

a influncia paterna europeia e do Mdio Oriente na origem da populao cabo-

verdiana.

Estudos de mtDNA para populaes de Cabo Verde realizados at hoje

basearam-se apenas na sequenciao da regio HV1 (Tavares, 2007) ou na

combinao entre HV1 e anlise da regio codificante por RFLP (Brehm et al.,

2002). No presente estudo reportada pela primeira vez a regio controlo total desta

populao. A introduo desta metodologia, recomendada atualmente como j

referido, permite aumentar o poder de discriminao entre amostras e refora as

determinaes prvias dos respetivos haplogrupos. Indivduos que partilhem as

mesmas variaes na regio HV1 e/ou o mesmo perfil de RFLPs podero apresentar

diferenas quando a restante regio controlo analisada, permitindo diferenciar

sequncias que antes se julgava serem iguais e que seriam, de forma errada,

agrupadas no mesmo hapltipo e, eventualmente, no mesmo haplogrupo.

Objetivos

O objetivo genrico deste projeto caracterizar a diversidade gentica da

populaco de imigrantes oriundos de Cabo Verde, residentes em Lisboa, e respetiva

ascendncia estudando, pela primeira vez nesta populao, a totalidade da regio

controlo do seu DNA mitocondrial. esperado que os resultados se assemelhem

composio gentica de mtDNA caracterstica do oeste de frica, na regio entre o

Senegal e a Serra Leoa. Este estudo pretende acrescentar nova informao sobre a

origem da populao imigrante cabo-verdiana residente em Lisboa, sobre a sua

ascendncia e patrimnio gentico do arquiplago de Cabo Verde.

Outro dos objetivos , aps a definio dos hapltipos de mtDNA dos

indivduos pertencentes populao em estudo, incluir os mesmos na base de dados

de mtDNA com maior relevncia na rea das Cincias Forenses, a EDNAP Forensic

mtDNA Population Database (EMPOP). pretendido diferenciar os haplogrupos em

que os hapltipos se incluem e, posteriormente, realizar uma comparao

interpopulacional, em particular, com populaes africanas, a fim de determinar qual

a sua proximidade. Desta forma, pretendido acrescentar entendimento sobre o

37

Extrao de DNA por Chelex 100

Amplificao da regio controlo do mtDNA no GeneAmp PCR System 2700

Purificao dos produtos amplificados por ExoSap-IT

Sequenciao direta e reversa com Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequence e Better Buffer no GeneAmp PCR System 2700

Purificao dos produtos da reao de sequenciao por BigDye XTerminator Purification Kit

Deteo do produto sequenciado no sequenciador automtico Genetic Analyser 3130

Anlise da sequncia e comparao com a rCRS com o programa SeqScape v.2.5

impacto das migraes das populaes do passado que tero estado na origem do

arquiplago de Cabo Verde, acrescentado-se portanto mais conhecimento acerca da

origem e evoluo do ser humano ao longo dos tempos.

Materiais e Mtodos

7. Procedimento experimental

7.1. Tcnicas utilizadas

As vrias fases laboratoriais do procedimento experimental realizado esto

representadas no seguinte fluxograma.

38

7.2. Seleo de amostras

O estudo foi realizado numa amostra de 103 indivduos aparentemente

saudveis e no aparentados, com ascendncia materna e paterna de Cabo Verde,

atualmente a viver na zona da Grande Lisboa. As amostras estudadas foram manchas

de sangue, colhidas em Bloodstain Card (Whatman), a intervenientes em aes

judiciais de investigao de parentesco biolgico a decorrer no Instituto Nacional de

Medicina Legal e Cincias Forenses, portanto, uma amostra de convenincia.

7.3. Extrao de DNA

A metodologia aplicada neste procedimento consistiu na utilizao de uma

resina quelante adicionada diretamente amostra em suspenso, tcnica introduzida

em 1991 e denominada de Chelex 100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

O Chelex atua como uma substncia quelante que se liga a ies metlicos

polivalentes como o magnsio (Walsh et al., 1991). Aplicando altas temperaturas,

d-se a lise das clulas e a libertao do DNA, e o Chelex agrega os restantes

materiais (Rudin & Inman, 2002). Removendo o magnsio da reao, as enzimas

responsveis pela destruio do DNA, as nucleases, ficam inativas e as molculas de

DNA so, portanto, protegidas. A extrao por Chelex envolve poucos passos e,

consequentemente, a probabilidade de contaminao entre amostras reduzida.

Foi utilizado, de cada indivduo, um fragmento de papel com amostras de

sangue, com a forma de um crculo com cerca de 3 mm2, recortado com um punch,

que foi colocado num tubo de eppendorf de 1,5 mL devidamente rotulado com o

nmero de extrao da amostra. A cada tubo juntou-se 1 mL de gua desionizada e

autoclavada. Aps incubao durante 30 minutos temperatura ambiente, as

amostras foram agitadas num vrtex em rotao baixa durante 5 a 10 segundos e

posteriormente centrifugadas a 15000 x g durante 3 minutos. Desta primeira fase

resultou a separao das clulas, contendo o DNA, do suporte de papel e deposio

das mesmas no fundo do tubo. Foi efetuada, de seguida, a remoo do sobrenadante,

ficand da soluo. Adicionou-se 18 de soluo

de Chelex 100 a 5% a cada amostra. Os tubos foram colocados em banho de gua a

56C durante 15 minutos. Aps uma ligeira agitao foram colocadas em banho de

39

gua em ebulio durante 8 minutos. Por fim, foi efetuada nova agitao no vrtex

durante alguns segundos e centrifugao a 15000 x g durante 5 minutos. O DNA

extrado foi ento armazenado, at ser utilizado para amplificao, a 20C negativos.

7.4. Amplificao

Para amplificar a regio controlo total do mtDNA, foram utilizados 2 pares de

primers (L15997 e H016; L16555 e H599) (Thermo Scientific, Waltham, MA)

(Tabela 2). A nomenclatura dos primers utiliza a cadeia correspondente ao primer, L

para leve e H para pesada, O par de

primers L15997 (direto) e H016 (reverso) permitiu a amplificao dos fragmentos

entre as posies 16024 e 16599, enquanto que o par de primers L16555 (direto) e

H599 (reverso) permitiu a amplificao dos fragmentos entre as posies 1 e 576.

Primers Sequncia Tamanho do produto amplificado

L15997 5' CAC CAT TAG CAC CCA AAG CT 3' 588 pb

H016 5' CCC GTG AGT GGT TAA TAG GGT 3'

L16555 5' CCC ACA CGT TCC CCT TAA AT 3' 590 pb

H599 5' TTG AGG AGG TAA GCT ACA TA 3'

Para a amplificao foi preparada uma soluo com volume final de 10

(Tabela 3), contendo gua ultra pura, Multiplex PCR Master Mix (Qiagen,

Dsseldorf, Germany) - mistura que contem tampo de reao, DNA polimerase,

dNTPs e MgCl2 - primers (utilizados numa concentrao de e DNA de cada

uma das amostras. Cada tubo de PCR foi devidamente rotulado com o nmero da

amostra e fragmento a amplificar. Em cada reao de amplificao foi realizado um

controlo negativo ao qual no foi adicionado DNA de forma a controlar a qualidade

dos reagentes. A reao de amplificao processou-se num termociclador GeneAmp

PCR system 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA), de acordo com as

condies apresentadas na tabela 4. Aps a amplificao as amostras foram

purificadas.

Tabela 2 Primers utilizados na amplificao da regio controlo total do DNA mitocondrial humano

40

7.5. Purificao dos produtos da reao de amplificao

A purificao do produto amplificado permite remover todos os elementos

que possam interferir com a sequenciao e posterior anlise da sequncia. Esta fase

foi realizada recorrendo ao mtodo ExoSap-IT (Affymetrix, Santa Clara, CA), que

utiliza duas enzimas hidrolticas. A Exonuclease I remove primers residuais e

produtos de PCR parcialmente amplificados, enquanto que a rSAP (Fosfatase

Alcalina Recombinante de Camaro) remove dNTPs no incorporados.

A tcnica de purificao por ExoSap-IT de

ExoSap-IT a do produto amplificado. Esta soluo passou por uma incubao

a 37C durante 15 minutos e posterior incubao a 80C durante 15 minutos para

inativao do ExoSap-IT. Ambas as incubaes foram programadas e efetuadas no

termociclador GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Concludo o processo de purificao as amostras ficaram aptas a serem sequenciadas.

Reagentes Volume

gua ultra pura 3

Multiplex PCR Master Mix L

Primers a L

Volume final da Mix 9 L

+ DNA L

1 ciclo 95C 15 min

94C 30 seg

35 ciclos 60C 90 seg

72C 60 seg

1 ciclo 72C 10 min

Hold 4C

Tabela 3 Reagentes da reao de amplificao da regio controlo total do DNA mitocondrial

humano e respetivo volume por amostra

Tabela 4 Condies da reao em cadeia da polimerase para a regio controlo total do DNA

mitocondrial humano, efetuada no termociclador GeneAmp PCR system 9700

41

7.6. Sequenciao

O objetivo desta fase foi determinar para todas as posies da regio controlo

do mtDNA as suas bases nucleotdicas. Para tal foi utilizado o mtodo de Sanger,

descrito h mais de 30 anos e bastante utilizado atualmente para a sequenciao de

DNA (Sanger et al., 1977). Este processo envolve a incorporao de

didesoxinucletidos trifosfatados (ddNTPs) como terminadores do processo de

amplificao. N no existe um grupo hidrxilo, o que

torna impossvel, a partir deles, estabelecer uma ligao fosfodister com um novo

nucletido na cadeia em desenvolvimento. Ou seja, a extenso termina quando a

polimerase incorpora um ddNTP na cadeia sintetizada. No final da reao de

sequenciao so obtidas sequncias de mtDNA que diferem umas das outras em

apenas uma base mas possuindo um ddNTP diferente

(Figura 9).

Os 4 tipos diferentes de ddNTPs (ddCTPs, ddATPs, ddGTPs e ddTTPs)

foram adicionados em conjunto a cada amostra. Quatro marcadores fluroscentes com

diferentes cores esto ligados a cada um dos diferentes ddNTPs, permitindo a

distino de cada tipo de nucletido no momento de anlise da sequncia. O ddTTP

Figura 9 Tcnica de sequenciao com ddNTPs marcados com fluorocromos de diferentes cores;

(Adaptado