estudo de fatores de virulÊncia e de estresse...
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ESTUDO DE FATORES DE VIRULNCIA E DE ESTRESSE
OXIDATIVO NA PRODUO DE BIOSSURFACTANTE DO TIPO
RAMNOLIPDEO POR Pseudomonas aeruginosa PA1
Ana Carolina Loureiro Brito Fernandes
Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de
Ps-graduao em Bioqumica, Instituto de Qumica,
Centro de Cincias Matemticas e da Natureza, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessrios obteno do ttulo de Mestre em
Bioqumica.
Orientadores: Denise Maria Guimares Freire
Marcos Dias Pereira
Essa dissertao de Mestrado foi realizada
com o apoio financeiro da ANP - Agncia
Nacional do Petrleo, Gs Natural e
Biocombustveis.
Rio de Janeiro
Maio de 2010
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ESTUDO DE FATORES DE VIRULNCIA E DE ESTRESSE
OXIDATIVO NA PRODUO DE BIOSSURFACTANTE DO TIPO
RAMNOLIPDEO POR Pseudomonas aeruginosa PA1
Ana Carolina Loureiro Brito Fernandes
Orientadores: Denise Maria Guimares Freire
Marcos Dias Pereira
Dissertao de Mestrado submetida ao Programa de Ps-graduao em Bioqumica,
Instituto de Qumica, Centro de Cincias Matemticas e da Natureza, da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Mestre em
Bioqumica.
Aprovada por:
_________________________________________________________
Presidente, Profa. Denise Maria Guimares Freire, D. Sc. (IQ/UFRJ)
_________________________________________
Prof. Rodrigo Volcan Almeida, D. Sc. (IQ/UFRJ)
__________________________________________
Srgio Cant Mannarino, D. Sc. (IQ/UFRJ)
Rio de Janeiro
Maio de 2010
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Fernandes, Ana Carolina Loureiro Brito
Estudo de fatores de virulncia e de estresse oxidativo na
produo de biossurfactante do tipo ramnolipdeo por
Pseudomonas aeruginosa PA1/ Ana Carolina Loureiro Brito
Fernandes. Rio de Janeiro: UFRJ/IQ, 2010.
xiii, 110f : 29,7cm
Orientadores: Denise Maria Guimares Freire e
Marcos Dias Pereira
Dissertao (mestrado) UFRJ/ IQ/ Programa de
Ps-graduao em Bioqumica, 2010.
Referncias Bibliogrficas: f. 92-110.
1. Biossurfactante. 2. Fatores de virulncia. I. Freire,
Denise Maria Guimares. II.Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Instituto de Qumica. III. Ttulo.
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Dedico este trabalho aos meus pais,
Mrcia e Marco.
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Agradecimentos
Meus sinceros agradecimentos a todos que contriburam de algum modo para a realizao
deste trabalho e em especial:
A minha orientadora Denise Maria Guimares Freire pela orientao, dedicao, confiana e
pacincia fundamentais para realizao deste trabalho.
Aos meus pais pelo amor incondicional, por estarem ao meu lado em todos os momentos e
por serem os responsveis por tudo que eu sou.
As minhas irms pela amizade, cumplicidade, alegria e carinho.
minha amiga Roberta pelos nossos 10 anos de amizade e convivncia.
Ao amigo Rodrigo Mineiro (o mais eficiente do leste ou oeste, dependendo do caminho...)
pela amizade, sugestes, companhia, ajuda nos momentos necessrios e pela grande
contribuio para realizao deste trabalho.
Ao amigo Fred pela presena constante nos experimentos em biorreator, pelas sugestes,
orientao e ajuda essenciais para realizao deste trabalho.
Aos colegas do grupo dos Biossurfactante L, Lvia, Luiz Fernando e Rmulo pela
contribuio neste trabalho.
A todos os amigos do LaBiM/IQ principalmente Val, Elisa, Mel, Bruno, Joab, Jaque Velha,
Jaque Nova, Mateus, Fernanda, Ale, Antnio, Thas e Anglica por terem tornado os dias
difceis mais divertidos e os dias bons melhores ainda. Pessoas maravilhosas que tive a
oportunidade de conhecer e que fazem do LaBiM um timo ambiente de trabalho.
secretria Aline pelo carinho e dedicao a todos os alunos do LaBiM.
Aos professores do LaMMP, Bianca e Rodrigo, por terem me emprestado seu laboratrio para
realizao de experimentos.
tia Sonia por me ajudar a resolver todos os problemas com toda eficincia e carinho do
mundo.
A todos os meus amigos que sempre estiveram ao meu lado, em especial Su, Marcella,
Leandro, Thiago e Karen.
A ANP pela concesso da bolsa de estudos e as professoras Maria Regina e Jussara
responsveis pelo programa Qumico de Petrleo.
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Resumo da Dissertao de Mestrado submetida ao IQ/UFRJ como parte dos requisitos necessrios
obteno do ttulo de Mestre em Bioqumica.
Estudo de fatores de virulncia e de estresse oxidativo na produo de biossurfactante do tipo
ramnolipdeo por Pseudomonas aeruginosa PA1
Ana Carolina Loureiro Brito Fernandes
Maio/2010
Orientadores:Denise Maria Guimares Freire
Marcos Dias Pereira
A grande demanda por energia e o aumento no consumo e produo de derivados de petrleo
leva a um maior risco de acidentes ambientais. A ocorrncia de inmeros acidentes
ocasionados por derramamento de leo, tem resultado em uma legislao ambiental mais
rigorosa, e por esse motivo, na procura de tcnicas eficientes no controle e reparo dos danos
resultantes. A cepa Pseudomonas aeruginosa PA1, isolada de poos de petrleo, produz
elevadas concentraes de ramnolipdeo, um surfactante biodegradvel com aplicaes em
diversas reas industrial e ambiental, como na remoo e lavagem de leos em ambientes
impactados com derramamento de petrleo. Nesse contexto, objetivo deste trabalho foi
investigar os fatores de virulncia e os de estresse oxidativo na cepa Pseudomonas aeruginosa
PA1, com vistas reduo da toxicidade do processo fermentativo, em biorreatores com
oxigenao controlada, para produo de biossurfactante do tipo ramnolipdeo. Visando uma
futura aplicao do meio de cultivo bruto livre de clulas na biorremediao, vrios
parmetros cinticos foram investigados em duas condies de oxigenao distintas (6 mg
O2/L e de 1 mg O2/L ). Para anlise de fatores extracelulares o meio de cultivo bruto livre de
clulas foi utilizado, e para anlise dos fatores relacionados ao estresse oxidativo, protenas
foram extradas do pellet celular e analisadas na fase estacionria e exponencial de
crescimento. A quantidade absoluta de ramnolipdeo produzida no foi significativamente
afetada pela concentrao de oxignio dissolvido. No entanto a produo de fatores de
virulncia extracelulares foi maior nas condies de maior concentrao de oxignio
dissolvido, sendo que os mesmos no foram encontrados nos meios de cultivo centrifugados e
autoclavados. Em relao ao estresse oxidativo, a presena de oxignio desencadeou reaes
na P. aeruginosa com produtos com atividades anti-oxidante, tornando assim suas clulas
resistentes a diferentes condies de oxigenao.
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Abstract of Dissertation presented to IQ/UFRJ as a partial fulfillment of the requirements for
the degree of Master in Biochemistry.
Virulence factors and oxidative stress in rhamnolipid biosurfactant production by Pseudomonas
aeruginosa PA1
Ana Carolina Loureiro Brito Fernandes
May/2010
Research Supervisor: Denise Maria Guimares Freire Marcos Dias Pereira
The high demand for energy and the increasing consumption and production of oil leads to an
increased risk of environmental accidents. The occurrence of numerous accidents caused by
oil spills, has resulted in a stricter environmental legislation, and therefore, the search for
efficient techniques to control and repair the harm caused. The strain of Pseudomonas
aeruginosa PA1, isolated from oil waste, produces high amounts of rhamnolipid, a
biodegradable surfactant with applications in several industrial and environmental fields, as
removal and cleaning of oils from similar environments to oil spill. In this context, the aim of
this work was to investigate the virulence factors and oxidative stress in rhamnolipid
biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa PA1 in order to reduce the toxicity of
fermentation in a bench scale bioreactor with controlled oxygenation, for production of
biosurfactant rhamnolipid type. Aiming at a future application of crude culture medium free
of cells in bioremediation, several kinetic parameters were investigated in two different
oxygenation conditions (6 mg O2/L e de 1 mg O2/L). For analysis of extra cellular factors, the
crude culture medium free of cells was used and for the analysis of factors related to oxidative
stress, proteins were extracted from the cell pellet and analyzed in the stationary phase and
exponential growth. The absolute amount of rhamnolipid produced was not significantly
affected by the concentration of dissolved oxygen. However the production of extra cellular
virulence factors were higher under conditions of high dissolved oxygen concentration, and
they were not found in centrifuged and autoclaved culture media. In relation to oxidative
stress, the presence of oxygen triggered reactions in P.aeruginosa products with antioxidant
activity, making their cells resistant to different oxygenation conditions.
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Lista de Abreviaes
3O-C12-HSL - N-(3-oxododecanoil) homoserina lactona
AHL homoseina lactona
BSA- soro albumina bovina
CMC- concentrao micelar crtica
C4-HSL - N-butiril homoserina lactona
DNPH -2,4-dinitrofenilhidrazina
GPS- General Secretion Pathway
kDa- Quilodalton
LasI- acil-HSL sintase
LasR- regulador transcricional
LPS- lipopolissacardeo
MEOR microbial enhanced oil recovery
OD- oxignio dissolvido no meio
OUR taxa de consumo de oxignio bruto
SOUR- taxa de consumo especfico de oxignio bruto
RhlAB- Ramnosiltransferase I
RhlC- Ramnosiltransferase II
RhlG- -cetoacil-redutase
RhlI- acil-HSL- sintase
RhlR- regulador transcricional
QS- quorun sensing
Sec- General secretory pathway
SOD- Superxido dismutase
Vf/Vm- relao volume de frasco/ volume de meio
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ix
Lista de Quadros, Tabelas e Figuras
Quadro 1 Alguns acidentes envolvendo derramamento de leo no Brasil e no
mundo
1
Quadro 2 Leis e resolues ambientais 2
Tabela 1 Principais classes de biossurfactantes e sua origem microbiana 5
Figura 1 Sistema de quorum sensing em Pseudomonas aeruginosa e sua
regulao gnica de rhlA e rhlB
11
Figura 2 Sistema Sec de secreo 15
Figura 3 Sistema Tat de secreo 17
Figura 4 Esquema de transporte do sistema de secreo do tipo II 18
Figura 5 Esquema de transporte do sistema de secreo do tipo V 19
Figura 6 Esquema de transporte do sistema de secreo do tipo I, a protena
secretada passa para o meio externo sendo transportada pela ABC
transportadora
22
Figura 7 Esquema de transporte do sistema de secreo do tipo III 24
Figura 8 Esquema de transporte do sistema de secreo do tipo VI 26
Figura 9 Estrutura da piocianina em dois estados: em pH perto do neutro ou
alcalino o pigmento existe na forma de zwitterion e possui a
colorao azul, enquanto que em pH cido sua colorao
vermelha
27
Figura 10 Formao de O2.-
e H2O2 pela reao do NAD(P)H com a
piocianina e a interao subseqente do H2O2 com GSH. GPx,
glutationa peroxidase
28
Figura 11 Rota biossinttica da piocianina 29
Figura 12 Estrutura dos ramnolipdeos 32
Figura 13 Via metablica de biossntese de ramnolipdeo 33
Tabela 2 Caracterizao de algumas das principais Eros formadas in vivo 35
Figura 14 Estados do O2 segundo a teoria do orbital molecular 37
Figura15 Formao das EROs a partir do oxignio 37
Figura 16 Reao de dismutao catalisada pelas enzimas superxido
dismutases
38
Figura 17 Fotografia do fermentador inserido na capela de exausto,
acoplado ao sistema de oxigenao utilizando o contactor de
membranas
44
Figura 18 Controlador Lgico Programvel utilizado para implementao de
uma malha de controle da concentrao de oxignio dissolvido nas
fermentaes para a produo de ramnolipdeos por Pseudomonas
aeruginosa PA1
45
Figura 19 Fluxograma simplificado do sistema de oxigenao 46
Tabela 3 Composio de uma soluo de ramnolipdeos produzidos por
Pseudomonas aeruginosa PA1
49
Figura 20 Crescimento celular (g/L) e consumo de oxignio (SOUR)
(mg/g.h) em funo do tempo da fermentao. Dados da obtidos da
Ferm3, com condio de oxigenao de 6 mg O2/L
60
Figura 21 Perfil do crescimento de biomassa (A), consumo de glicerol (B) e
produo de ramnolipdeo (C) por Pseudomonas aeruginosa.
Fermentao em shaker a 30OC e 170 rpm utilizando frasco de 1 L
e diferentes relaes Vf/Vm
62
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x
Tabela 4 Comparao entre as variveis x (variao na concentrao de
biomassa), P (concentrao de ramnolipdeos), Yp/x (rendimento
de produto por biomassa produzida), Yp/s (rendimento de
produto por substrato consumido), Yx/s (rendimento de
biomassa por substrato consumido) e Qp (produtividade de
ramnolipdeos) para as diferentes relaes Vf/Vm (6 dias de
fermentao)
63
Figura 22 Perfil da produo de elastases (A) e proteases (B) por
Pseudomomas aeruginosa. Fermentao em shaker a 30OC e 170
rpm utilizando frasco de 1 L e diferentes relaes Vf/Vm
65
Figura 23 Oxignio dissolvido no meio (mg/L) ao longo das fermentaes 3
(6 mg O2/L) e 5 (1 mg O2/L)
67
Figura 24 Taxa de consumo de oxignio bruto (OUR) (mg/L.h) ao longo das
fermentaes 3 (6 mg O2/L) e 5 (1 mg O2/L)
67
Figura 25 Taxa especfica de consumo de oxignio (mg/g.h) ao longo das
fermentaes 3 (6 mg O2/L) e 5 (1 mg O2/L)
68
Figura 26 Perfil do crescimento de biomassa (A e B) e consumo de glicerol
(C e D) e produo de ramnolipdeo (E e F) em biorreator com
condio de oxigenao de 6 mg O2/L e 1 mg O2/L,
respectivamente por Pseudomonas aeruginosa. Fermentaes em
biorreator, a 30C e 100 rpm utilizando frasco de 5 L com volume
til de 3,2 L
70
Tabela 5 Produo de ramnolipdeos por Pseudomonas aeruginosa com a
variao da concentrao de oxignio dissolvido (biomassa e
concentrao de produto)
71
Tabela 6 Comparao entre as variveis x (variao na concentrao de
biomassa), P (concentrao de ramnolipdeos), Yp/x (rendimento
de produto por biomassa produzida), Yp/s (rendimento de
produto por substrato consumido), Yx/s (rendimento de
biomassa por substrato consumido) e Qp (produtividade de
ramnolipdeos) para as diferentes condies de oxigenao (6 dias
de fermentao)
72
Figura 27 Perfil da produo de elastases (A e B) e proteases (C e D) em
biorreator com condio de oxigenao de 6 mg O2/L e 1 mg O2/L,
respectivamente por Pseudomonas aeruginosa. Fermentaes em
biorreator, a 30C e 100 rpm utilizando frasco de 5 L com volume
til de 3,2 L
73
Figura 28 Teste de hemlise realizado com ramnolipdeo purificado 75
Figura 29 Inculos de com 72h de crescimento, crescido em meio de cultura
para maximizar a produo de biossurfactante, e para maximizar a
produo de piocianina, respectivamente
77
Tabela 7 Valores de razo de absorbncia e concentrao do DNA 79
Figura 30 Gel de agarose 1%. 1,2,3- amostras autoclavadas, 4,5,6-amostras
centrifugadas, 7,8,9- amostras centrifugadas e autoclavadas,
10,11,12- amostras filtradas em membrana de 0,22m, 13,14-
padro de peso molecular 1Kb DNA Ladder, 15,16,17- amostras
centrifugadas e filtradas em membrana de 5kda
80
Figura 31 Gel de agarose 1%. 14 - padro de peso molecular 1Kb DNA
Ladder, 15,16,17- amostras centrifugadas e filtradas em membrana
de 5kda
80
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xi
Figura 32 Gel nativo de poliacrilamida marcado pela atividade Sod para as
fermentaes controle sem H2O2
82
Figura 33 Gel nativo de poliacrilamida marcado pela atividade Sod para as
fermentaes com oxigenao de 6 mg O2/L ( F1, F2 e F3) nas
fases exponencial e estacionria de crescimento em biorreator
83
Figura 34 Gel nativo de poliacrilamida marcado pela atividade Sod para as
fermentaes de oxigenao de 1 mg O2/L (F4, F5 e F6) nas fases
exponencial e estacionria de crescimento em biorreator
85
Figura 35 Anlise da carbonilao de protenas em frascos agitados aps
adio de H2O2(10 mM) por 1h nos controles de 10h e 36h
86
Figura 36 Anlise da carbonilao de protenas em biorreator nas fases
exponencial e estacionria de crescimento nas condies de
oxigenao de 6 mg O2/L (F2 e F3) e 1 mg O2/L (F5 e F6)
87
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xii
ndice
Agradecimentos v Resumo vi
Lista de Quadros, Tabelas e Figuras ix
ndice xii
1 Introduo 1 2 Objetivos 8 2.1 Objetivo Geral 8
2.2 Objetivos Especficos 8
3 Reviso Bibliogrfica 9 3.1 Pseudomonas aeruginosa 9
3.2 Sistema de Quorun sensing 9
3.3 Virulncia 11
3.4 Fatores de virulncia de superfcie 12
3.4.1 Flagelos 12
3.4.2 Pili 12
3.4.3 Lipopolissacardeo 13
3.4.4 Alginato 13
3.5 Sistema de secreo de protenas 13
3.5.1 O sistema Sec 14
3.5.2 O sistema Tat 15
3.5.3 Sistemas Sec-dependentes 17
3.5.3.1 Sistema de secreo do tipo II 17
3.5.3.2 Sistema de secreo do tipo V 18
3.5.4 Sistemas Sec-independentes 21
3.5.4.1 Sistema de secreo do tipo I 21
3.5.4.2 Sistema de secreo do tipo III 22
3.5.4.3 Sistema de secreo do tipo VI 24
3.6 Fatores de virulncia secretados 26
3.6.1 Piocianina 26
3.6.2 Proteases 30
3.6.3 Lpases 30
3.6.4 Hemlise 31
3.6.5 Ramnolipdeo 31
3.6.6 DNA extracelular 34
3.7 Estresse oxidativo 34
3.7.1 Espcies reativas de oxignio (Eros) 35
3.7.2 Superxido Dismutase (Sod) 38
3.7.3 Oxidao de protenas 39
4 Materiais e Mtodos 41 4.1 Microrganismo e condies de cultivo 41
4.2 Preparo do inoculo 42
4.3 Esterilizao 42
4.4 Frascos agitados 42
4.5 Biorreator 43
4.5.1 Controle da concentrao de oxignio no biorreator 44
4.6 Biomassa 47
4.7 Quantificao de glicerol 47
4.8 Quantificao de ramnolipdeos 48
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xiii
4.9 Quantificao de proteases 49
4.10 Quantificao de elastases 50
4.11 Quantificao de lipases 51
4.12 Quantificao de protenas totais 51
4.13 Purificao do ramnolipdeo 52
4.14 Quantificao de hemlise 52
4.15 Precipitao do alginato 54
4.16 Quantificao de piocianina 54
4.17 Precipitao de DNA 55
4.18 Verificao de extrao de DNA em gel de agarose 55
4.19 Deteco de DNA por mtodo espectrofotomtrico 56
4.20 Condies de estresse oxidativo 56
4.21 Extrao de protenas 57
4.21.1 Determinao da atividade de superxido dismutase (Sod) 57
4.21.2 Protena carbonilada 58
4.3 Anlise estatstica dos resultados 59
5 Resultados e Discusso 60
5.1 Cintica da produo de ramnolipdeos em frascos agitados 61
5.2 Perfil da produo de elastases e proteases em frascos agitados 64
5.3 Cintica da produo de ramnolipdeos em biorreator acoplado a
contactores de membrana
66
5.4 Perfil da produo de elastases e proteases em biorreator 72
5.5 Lipases 74
5.6 Hemlise 75
5.7 Alginato 76
5.8 Piocianina 77
5.9 DNA 78
5.10 Secreo de protenas relacionadas ao estresse oxidativo 81
5.10.1 Sod 81
5.10.2 Protena Carbonilada 85
6 Concluso 88
7 Publicaes 91
8 Referncias 92
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1
1. Introduo
O petrleo um recurso natural de grande importncia nas nossas vidas. A grande
demanda por energia e o aumento no consumo e produo de derivados de petrleo leva a um
maior risco de acidentes ambientais. Por ser extrado em locais distantes do seu consumo,
normal que este seja transportado em grandes quantidades. Considerando que as operaes de
transporte e armazenamento envolvem a movimentao constante de petrleo e seus
derivados, a ocorrncia de inmeros acidentes ambientais ocasionados por derramamento de
leo conforme ilustrado no quadro 1, tem resultado em uma legislao ambiental mais
rigorosa como demonstrada no quadro 2, e por esse motivo, na procura de tcnicas eficientes
no controle e reparo dos danos resultantes.
2000 - Baa de Guanabara/RJ, derramamento de 1,3 milhes de litros de leo;
2001 - Derramamento causado pelo naufrgio do navio tanque Windy Bay,
transportando 35 mil gales de leo diesel, no Alaska;
2001 - Acidente na plataforma P-7 na Bacia de Campos ocasionou vazamento de 110
mil litros de leo;
2002 - O navio Prestige de bandeira das Bahamas, partiu-se ao meio. O navio
carregava 77 mil toneladas de leo, e foi avariado a 250 km da costa espanhola;
2003 - Acidente com balsa derrama 20 mil litros de leo diesel no Rio Par;
2006 - Um navio carregado com 70 toneladas afunda no Paquisto;
2007 - Uma forte tempestade castigou o Mar Negro, partindo em dois o navio russo
"Volganeft-139", que verteu no mar, no Estreito de Kertch, as 2.000 toneladas de leo;
2007 - Derramamento de 10,5 mil toneladas de petrleo aps o acidente entre um
cargueiro e um navio petrolfero na Coria do Sul;
2010 Uma exploso seguida de um incndio causaram o afundamento da plataforma
Deepwater Horizon, com vazamento de mais de 72 milhes de litros de petrleo no Golfo do
Mxico.
Quadro 1 : Alguns acidentes envolvendo derramamento de leo no Brasil e no mundo
(Modificado de REIS, 2008).
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2
Resoluo Conama n 398/2008- "Dispe sobre o contedo mnimo do plano de
emergncia individual para incidentes de poluio por leo em guas sob jurisdio nacional,
originados em portos organizados, instalaes porturias, terminais, dutos, sondas terrestres,
plataformas e suas instalaes de apoio, refinarias, estaleiros, marinas, clubes nuticos e
instalaes similares, e orienta a sua elaborao.";
Resoluo Conama n 393/2007- "Dispe sobre o descarte contnuo de gua de
processo ou de produo em plataformas martimas de petrleo e gs natural, e d outras
providncias";
Resoluo Conama n 269/2000- "Regulamenta o uso de dispersantes qumicos em
derrames de leo no mar";
Lei n 9.966, de 28 de abril de 2000- dispe sobre a preveno, o controle e a
fiscalizao da poluio causada por lanamento de leo e outras substncias nocivas ou
perigosas em guas sob jurisdio nacional (sendo o valor da multa por descumprimento
desta no mnimo de R$ 7.000,00 no mximo R$ 50.000.000,00);
Conveno internacional sobre o preparo, resposta e cooperao em caso de poluio
por leo, promulgada pelo Brasil por meio do decreto n 2.870, de 10 de dezembro de 1998,
define como um dos seus compromissos o estabelecimento de um sistema nacional para
responder aos incidentes de poluio por leo, incluindo a preparao do plano nacional de
contingncia.
Quadro 2: Leis e resolues ambientais. Disponvel em:
www.mma.gov.br/port/conama/legi.cfm
A remediao, ou seja, restaurao das condies ambientais a nveis aceitveis, uma
das maiores preocupaes e um dos maiores desafios da comunidade tcnico-cientfica na
rea petroqumica. A degradao completa de petrleo cru requer a ao simultnea de
diferentes grupos microbianos (RAHMAN et al., 2002). O principal fator que limita a
biodegradao destes poluentes a sua limitada disponibilidade aos microorganismos.
Hidrocarbonetos geralmente se agregam a componentes do solo, sendo de difcil remoo ou
degradao. Compostos tensoativos reduzem as tenses superficial e interfacial atravs de seu
acmulo na interface de fluidos imiscveis ou de um fluido e um slido, aumentando a rea de
http://www.mma.gov.br/port/conama/legi.cfm
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3
compostos insolveis, levando ao aumento de sua disponibilidade e subseqente
biodegradao. Estes compostos podem ser produzidos por via qumica ou bioqumica e so
denominados surfactantes, RAHMAN et al. (2003)
Em funo da presena de grupos hidroflicos e hidrofbicos na mesma molcula, os
surfactantes tendem a se distribuir nas interfaces entre fases fluidas com diferentes graus de
polaridade (leo/gua e gua/leo) (BANAT, 1995). A formao de um filme molecular,
ordenado nas interfaces, reduz a tenso interfacial e superficial, sendo responsvel pelas
propriedades nicas dos surfactantes. Estas propriedades fazem os surfactantes serem
adequados para uma ampla gama de aplicaes industriais envolvendo: detergncia,
emulsificao, lubrificao, capacidade espumante, capacidade molhante, solubilizao e
disperso de fases. A maior utilizao dos surfactantes se concentra na indstria de produtos
de limpeza (sabes e detergentes), na indstria de petrleo e na indstria de cosmticos e
produtos de higiene. A produo mundial de surfactantes excede 3 milhes de toneladas por
ano2, sendo a maioria utilizada como matria-prima para fabricao de detergentes de uso
domstico (NITSCHKLE e PASTORE, 2002; SINGH et al., 2007).
Surfactantes qumicos sintticos vem sendo utilizados pela indstria de petrleo para
auxiliar na limpeza de derrames de leo, bem como para aumentar a recuperao de leo em
reservatrios. Estes compostos no so biodegradveis e podem ser txicos ao meio ambiente,
trazendo novos problemas de carter ambiental as reas afetadas (BORDOLOI e KONWAR,
2008).
Recentemente, devido ao aumento na preocupao com a proteo do ambiente, os
biossurfactantes passaram a ser considerados como alternativas ambientalmente corretas
comparativamente aos surfactantes sintticos (SARACHAT, 2010). Ademais,
regulamentaes ambientais mais severas e uma maior sensibilizao para a necessidade de
proteger o ecossistema resultaram em um interesse crescente nos biossurfactantes como
-
4
possveis alternativas aos surfactantes qumicos. Biossurfactantes so compostos anfiflicos de
origem microbiana com potencial considervel em aplicaes comerciais de diversos setores.
Eles tm vantagens sobre os surfactantes qumicos na biodegradabilidade, possuem baixa
toxicidade e so eficazes a temperaturas e pH extremos (BANAT et al. 2000). Em muitos
casos os biossurfactantes tm propriedades de emulsificao equivalentes aos surfactantes
qumicos. Assim, h um crescente interesse na possvel utilizao de biossurfactantes na
mobilizao de petrleo bruto pesado, transporte de petrleo em oleodutos, gesto
derramamentos de leo, controle de poluio de leo, limpeza de resduos de hidrocarbonetos
provenientes de instalaes de armazenamento, biorremediao de solo/areia e recuperao
microbiana melhorada de petrleo (MEOR microbial enhanced oil recovery) (BORDOLOI
e KONWAR, 2008).
Estes compostos possuem um domnio hidroflico e outro hidrofbico. A poro
hidrofbica da molcula baseia-se em cidos graxos de cadeia longa saturados, insaturados ou
hidroxilados. A poro hidroflica pode ser de carboidratos, aminocidos, peptdeos cclicos,
fosfato, cido carboxlico ou lcool (MULLIGAN, 2004). Uma ampla variedade de
microorganismos pode produzir estes compostos como pode ser observado na tabela 1
(NITSCHKLE e PASTORE, 2002).
H trs principais estratgias adotadas para a utilizao de biossurfactantes na
recuperao aprimorada de petrleo ou mobilizao de leos pesados: (i) injeo de
microrganismos produtores de biossurfactante no reservatrio atravs do poo, com posterior
multiplicao dos microrganismos in situ nas rochas reservatrios; (ii) injeo de nutrientes
selecionados em um reservatrio, estimulando o crescimento de microrganismos endgenos
produtores de biossurfactantes; (iii) produo de biossurfactantes ex situ e sua posterior
injeo no reservatrio (BANAT, 1995).
-
5
TABELA1: Principais classes de biossurfactantes e sua origem microbiana
Tipo de surfactante Microorganismo
Glicolipdios:
- ramnolipdeos
- soforolipdios
- trehalolipdios
Pseudomonas aeruginosa
Torulopsis bombicola, T. apicola
Rhodococcus erythropolis, Mycobacterium
sp.
Lipopeptdios e lipoprotenas
- Peptdio-lipdio
- Viscosina
- Serrawetina
- Surfactina
- Subtilisina
- Gramicidina
- Polimixina
Bacillus licheniformis
Pseudomonas fluorescens
Serratia marcescens
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus brevis
Bacillus polymyxa
cidos graxos, lipdios neutros
e fosfolipdios
- cidos graxos
- Lipdios neutros
- Fosfolipdios
Corynebacterium lepus
Nocardia erythropolis
Thiobacillus thiooxidans
Surfactantes polimricos
- emulsan
- biodispersan
- liposan
- carboidrato-lipdio-protena
- manana-lipdio-protena
Acinetobacter calcoaceticus
Acinetobacter calcoaceticus
Candida lipolytica
Pseudomonas fluorescens
Candida tropicalis
Surfactantes particulados
- vesculas
- clulas
Acinetobacter calcoaceticus
Vrias bactrias
-
6
O custo de produo de biossurfactantes aproximadamente de 3 a 10 vezes maior do
que o de surfactantes qumicos restringindo bastante sua utilizao em larga escala. A sua
biossntese, concentrao e purificao compreendem cerca de 60% do custo do produto,
devido ao fato do mesmo ser secretado em uma soluo diluda (SARACHAT, 2010). Muitas
vezes os biossurfactantes so produzidos durante o crescimento dos microorganismos em
hidrocarbonetos e/ou fontes de carbono de elevado custo, aumentando assim o custo total do
processo. Contudo, a utilizao de substratos mais baratos como resduos (soap stock,
glicerina bruta) e/ou substratos solveis em gua (glicose, glicerol e etanol) so alternativas
interessantes (KRONEMBERGER, 2007; KRONEMBERGER et al., 2008).
Nos ltimos dez anos o Laboratrio de Biotecnologia Microbiana (LaBiM) vem
desenvolvendo, em cooperao com a Petrobras, diversos projetos com o objetivo aumentar a
produo de biossurfactante do tipo ramnolipdeo utilizando uma cepa de Pseudomonas
aeruginosa isolada de poos de petrleo. Foram desenvolvidas estratgias metablicas de
aumento da produo de ramnolipdeo em detrimento da produo de outros fatores de
virulncia (SANTOS et al., 2002), estratgias de modo de conduo do processo fermentativo
como utilizao de resduos industrias, como o glicerol (rejeito da produo de biodiesel)
como fonte carbono (SANTA ANNA et al., 2001, 2002), e desenho de novos reatores
utilizando contactores de membranas capazes de suplantar o crtico problema operacional de
formao de espuma (KRONEMBERGER et al., 2008). Ademais, esta biomolcula
apresentou excelentes resultados quando aplicada na biorremediao e lavagem de solos
contaminados com derramamento de leo (SANTA ANNA et al., 2007).
Sabra et al. (2002) props que P. aeruginosa produz ramnolipdeos para reduzir a taxa
de transferncia de oxignio contra o estresse oxidativo, e parece que este mecanismo
ativado pela deficincia de ferro (KIM et al., 2003). Segundo Kronemberger (2007), uma
hiperoxigenao resulta em uma queda de biomassa e este fato pode estar relacionado a algum
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tipo de estresse oxidativo. Deste modo investigao dos fatores de estresse oxidativo e sua
relao com a produo do biosurfactante poderia ser uma estratgia interessante para a
otimizao do meio de cultivo. Por outro lado, a investigao dos fatores de virulncia
secretados no meio de cultivo tambm uma estratgia a ser considerada, uma vez que, para
diminuio do custo de produo do biossurfactante, a aplicao do meio bruto sem prvia
purificao pode ser uma alternativa interessante.
Neste contexto, o presente trabalho visa investigar os fatores de virulncia e os fatores
de estresse oxidativo na produo de ramnolipdeos, em biorreator acoplado a um contactor
de membranas, que permite o controle da concentrao de oxignio dissolvido no meio de
cultura, com vistas reduo da toxicidade do meio de cultivo bruto, para futura aplicao do
meio de cultivo bruto livre de clulas na remediao e/ou biorremediao de solos
contaminados por petrleo.
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2. Objetivos
2.1 Objetivo Geral
.
O objetivo deste trabalho foi investigar os fatores de virulncia secretados e os de
estresse oxidativo na cepa Pseudomonas aeruginosa PA1, com vistas reduo da toxicidade
do processo fermentativo, em biorreatores com oxigenao controlada, para produo de
biossurfactantes do tipo ramnolipdeo.
2.2 Objetivos Especficos
Padronizar os protocolos de anlise de fatores de virulncia secretados e relacionados
ao estresse oxidativo como ramnolipdeo, proteases, elastases, lipases, alginato, piocianina e
superxido dismutase, por Pseudomonas aeruginosa em diferentes concentraes de
oxigenao.
Avaliar o meio bruto contendo biosurfactante em relao aos fatores de virulncia.
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3. Reviso Bibliogrfica
3.1 Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa uma bactria gram-negativa, pertencente classe gama-
proteobactria e famlia Pseudomonadaceae, encapsulada e mvel (HARDALO e EDBERG,
1997). um patgeno oportunista, podendo ser encontrada em amostras de solo, gua e
plantas (RAHME et al, 1997). capaz de provocar infeces locais em pacientes com fibrose
cstica, cncer, pneumonia, queimaduras e imunodeficientes (HAHN, 1997; WILSON,
DOWLING, 2006). As infeces causadas por P. aeruginosa so muito difceis de serem
tratadas porque bactrias gram-negativas formam biofilmes e apresentam alta resistncia a
antibiticos (NIKAIDO, 1998). Sua patogenicidade est associada a um nico grande genoma
que contm genes para muitos fatores de virulncia e mecanismos regulatrios que permitem
sua adaptao a ambientes hostis (KIPNIS et al. 2006).
3.2 Sistema de Quorun sensing
A adaptao da bactria a um novo ambiente e sua capacidade de perceber e reagir a
este ambiente so essenciais para sua patogenia. Estas so afetadas por muitas condies
ambientais, tais como pH, osmolaridade, disponibilidade de nutrientes e densidade
populacional. Quando as bactrias detectam uma alterao no ambiente elas alteram a
produo de vrios fatores que lhes permitem prosperar nesses novos ambientes. Sistema de
Quorun sensing (QS) o mecanismo que permite que as bactrias modifiquem seu
metabolismo de acordo com a densidade da populao bacteriana ao redor e coordenadamente
responder a essas informaes pela co-regulao de vrios genes (SMITH e IGLEWSKI,
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2003). QS um sistema de regulao gentica presente em diversas bactrias, onde
responsvel por regular virulncia, produo de metablitos secundrios, simbiose, formao
de biofilme, bem como induo de respostas da fase estacionria e mobilidade. A sinalizao
celular no s ocorre em altas densidades celulares, pois o termo est agora sendo aplicado
para descrever qualquer comunicao intercelular bacteriana que envolva pequenas molculas
sinalizadoras (WINTERS et al., 2001).
P. aeruginosa possui dois sistemas distintos que interagem, las e rhl, caracterizando o
QS. Estes sistemas so hierarquicamente arranjados, sendo que o sistema las controla o
sistema rhl conforme demonstrado na Figura 1 (LATIFI et al., 1996). Com o aumento da
populao bacteriana, as molculas sinais autoindutoras produzidas pela Pseudomonas
aeruginosa, N-(3-oxododecanoil) homoserina lactona (3O-C12-HSL) e N-butiril homoserina
lactona (C4-HSL), se acumulam, e assim que um limiar de concentrao intracelular obtido
essas molculas se ligam a seus reguladores transcricionais e os ativam. Ambos os sistemas
las e rhl foram encontrados como reguladores na produo de mltiplos fatores de virulncia
(SMITH e IGLEWSKI, 2003).
Em adio a lasA, lasB e rhlAB, genes da protease alcalina (aprA), exotoxina A
(toxA), piocianina, pioverdina, cido ciandrico, lipase, rpoS, alginato, secreo de protenas,
catalases, ramnolipdeo, lectinas, homoserina lactonas aciladas e superxido desmutase (katA,
sodA e sodB), todos so controlados por quorun sensing (SMITH, IGLEWSKI, 2003;
RUMBAUGH, GRISWOLD, HAMOOD, 2000). No sistema las, a enzima LasI produz a
molcula sinal 3O-C12-HSL, que complexa com LasR para ativar um nmero de genes
virulentos, incluindo lasB, lasA, apr, toxA e o prprio lasI. A enzima RhlI catalisa a sntese da
molcula sinal C4-HSL, que em conjunto com RhlR ativa a expresso do rhlAB , gene da
sntese do ramnolipdeo, rhlI e lasB. Outros fatores de virulncia e metablitos secundrios,
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incluindo piocianina, cido ciandrico so positivamente regulados pelo sistema
rhl.(WHITELEY et al. 1999).
Figura 1- Sistema de quorum sensing em Pseudomonas aeruginosa e sua regulao gnica de
rhlA e rhlB. Os tringulos correspondem ao autoindutor 3OC12-HSL, e os losangos
correspondem ao autoindutor C4-HSL, que, ao atingirem um limiar de concentrao
intracelular, se ligam aos seus reguladores transcricionais, LasR e RhlR respectivamente, e os
ativam. As regies em azul correspondem aos promotores dos respectivos genes e as setas
direcionadas a essas regies indicam a ativao gnica (REIS, 2008).
3.3 Virulncia
Segundo Ryan e colaboradores (2004) muitas propriedades so necessrias para que
uma clula bacteriana obtenha acesso a um hospedeiro, invada seu sistema imunolgico e
estabelea uma infeco. Elas incluem:
Adeso e penetrao as superfcies da clula hospedeira
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Evaso fagocitose e ataque ao sistema imunolgico
Secreo de protenas txicas para enfraquecimento do hospedeiro e promover a ao
do agente patognico
Aquisio de nutrientes, incluindo ferro, para permitir seu crescimento dentro do
hospedeiro.
Sobrevivncia tanto dentro como fora do hospedeiro.
3.4 Fatores de virulncia de superfcie
3.4.1 Flagelos
So estruturas proticas complexas formando um apndice filamentoso polar na
superfcie da P. aeruginosa que permitem o movimento chamado de swimming. Tem um
papel patognico importante na aderncia clulas epiteliais, ligando-se a membrana
(FELDMAN et al., 1998).
3.4.2 Pili
So filamentos pequenos, encontrados na superfcie da bactria. O pili da
Pseudomonas aeruginosa est envolvido em sua motilidade. O movimento chamado
twiching responsvel pelas propriedades retrteis permitindo que a bactria se espalhe ao
longo de superfcies hidratadas, ao invs de usar o movimento swim. O pili crucial na fase
de adeso na colonizao de clulas epiteliais (KIPNIS et al., 2006).
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3.4.3 Lipopolissacardeo
A face externa da membrana externa composta por lipopolissacardeo (LPS), que
extremamente txica a humanos e outros animais, e chamada de endotoxina. Mesmo em
quantidades mnimas, o montante liberado durante uma infeco por bactrias gram-negativas
pode causar febre. LPS composta por lipdeo A (um fosfolipdio txico composto por
glicosamina), o core polissacardeo (que contm resduos de carboidratos) e a cadeia lateral de
polissacardeo, chamada de antgeno O. Molculas hidrofbicas como os antibiticos podem
ser bloqueados pelo antgeno O. Como o flagelo e o pili, LPS tambm se adere membrana
(RYAN e RAY, 2004; KIPNIS et al., 2006).
3.4.4 Alginato
um polissacardeo extracelular composto de polmeros repetidos de cido
manurnico e glucurnico. Protege a bactria de antibiticos, da fagocitose e aumenta a
resistncia da bactria ao sistema imune do hospedeiro. Participa no processo de formao do
biofilme (GACESA, 1998; KIPNIS et al., 2006). A formao de alginato representa um
importante mecanismo contra o estresse oxidativo. (SABRA et al., 2002).
3.5 Sistema de secreo de protenas
A secreo de toxinas e outras protenas contribui bastante para a virulncia da
bactria, Esta secreo ocorre por diversas vias e algumas utilizam componentes de GSP
(mecanismo geral de secreo, do ingls General Secretion Pathway). Nas espcies gram-
negativas, a secreo deve deslocar a protena atravs de duas membranas: a membrana
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citoplasmtica e a membrana externa. Foram descobertas cinco vias em diferentes patgenos
gram-negativos que exportam protenas para o ambiente (RYAN e RAY, 2004).
Pseudomonas aeruginosa possui um grande arsenal de fatores de virulncia que para serem
secretados dependem de sistemas especializados de exportao, incluindo os sistemas de
secreo do tipo I, II, III, V e o tipo VI, que foi recentemente descoberto (ENGEL e
BALACHANDRAN, 2009). Os sistemas II e V utilizam o sistema de secreo Sec ou Tat
conforme descrito a seguir (SAIER, 2006).
3.5.1 O sistema Sec
O sistema Sec (general secretory pathway), ou via secretora geral, exporta as protenas
atravs da membrana citoplasmtica. Nas bactrias este sistema inclui vrias protenas
conservadas entre diversas espcies (SecY, SecE, SecG, YidC, FtsY e Ffh) e protenas
adicionais encontradas apenas em alguns organismos (SecA, SecB, SecD, SecF e YajC). A
transferncia atravs da membrana interna envolve o reconhecimento da pr-protena, que
ainda no est na conformao final, pela SecB (que uma protena chaperona ATP-
independente) e uma posterior associao com a protena SecA (que uma ATPase) que
impulsiona a exportao da cadeia do polipeptdeo substrato atravs do canal condutor
SecYEG (formado pelas protenas SecY, SecE e SecG), formando o que chamamos de
translocase. A protena passa para o espao periplasmtico atravs da translocase (MA et al,
2003).
Conforme ilustrado na Figura 2, a exportao da protena pelo sistema Sec ocorre em
3 fases: na fase 1 a protena pr-secretada (linha laranja) com peptdeo sinal amino terminal
(retngulo laranja) se liga a translocase pelo signal recognition particle, (SRP: azul) ou pela
chaperona SecB (lils) e enviada para a translocase SecYEG ou para SecYEG complexada
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com a SecA (caso a pr-protena tenha seqncias hidroflicas). FtsY (lils) e SecA atuam
como receptores para a SRP e SecB, respectivamente. Na fase 2 a pr-protena translocada
pelo canal SecYEG ,integra-se bicamada lipdica e perde o peptdeo sinal pela peptidase
seguindo para fase 3 onde translocada para o espao periplasmtico (PAPANIKOU et al.,
2007).
Figura 2: Sistema Sec de secreo. A exportao da protena ocorre em 3 fases; na fase 1, a
protena pr-secretada (laranja) com peptdeo sinal amino-terminal (retngulo laranja) se liga
translocase pelo sinal de reconhecimento (SRP) ou pela chaperona SecB (lils), sendo
enviada translocase SecYEG ou translocase SecYEG complexada com a SecA. As
protenas FtsS e SecA atuam como receptoras do SRP e da SecB. Na fase 2, a pr-protena
est sendo translocada pelo canal SecYEG e se integra a bicamada lipdica, perdendo o
peptdeo sinal e na fase 3 ela segue para o espao periplasmtico (PAPANIKOU et al.,2007)
3.5.2 O sistema Tat
A via Tat (twin-arginine translocator) opera em paralelo ao sistema Sec na exportao
de protenas periplasmticas. Em uma bactria, a via Tat distinta do sistema Sec em termos
da sua notvel capacidade de transporte de enzimas enoveladas, utilizando apenas gradiente
de prtons como fonte de energia. O sistema Tat se encontra na membrana citoplasmtica da
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maioria das bactrias e consiste em trs protenas integrais de membrana: TatA, TatB e TatC
(CLINE e MCCAFFERY, 2007). O peptdeo sinal das protenas Tat-dependentes se
assemelham ao peptdeo sinal das protenas Sec-dependentes considerando suas estruturas
globais, mas possuem um motivo de argininas geminadas na regio positivamente carregada.
A maioria das protenas Tat-dependentes conhecidas possuem fatores redox, e so
componentes de vrias cadeias respiratrias que ajudam no crescimento anaerbico da
bactria. Em Pseudomonas aeruginosa, o sistema Tat usado na secreo de pelo menos duas
fosfolipases C (VOULHOUX et al., 2001; BUCK, et al., 2008).
Um esquema do sistema Tat de secreo pode ser visto na Figura 3: (a) quando no
existem substratos presentes protena TatA (verde) e o complexo TatBC (amarelo e
vermelho) esto presentes, mas separados na membrana interna (IM), (b) o ciclo Tat-
transporte comea quando o motivo de argininas geminadas do peptdeo sinal do substrato Tat
reconhecido pelas TatB e TatC, (c) o complexo TatA se associa ao complexo substrato
TatBC, sendo dependente de uma fora motriz de prtons, (d) o substrato translocado do
citoplasma (CP) para o periplasma (PP) pelo canal formado pela protena TatA, (e) os dois
complexos se dissociam novamente (BUCK et al., 2008).
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Figura 3: Sistema Tat de secreo. (BUCK et al., 2008).
3.5.3 Sistemas Sec-dependentes
3.5.3.1 Sistema de secreo tipo II
O sistema de secreo do tipo II um sistema Sec-dependente e ocorre em duas
etapas. A primeira etapa corresponde na passagem da protena para fora da membrana interna
pela vias Sec ou Tat, enquanto que a segunda etapa consiste em um perodo extremamente
curto, onde a protena transportada do periplasma para fora da membrana externa como
ilustrado na Figura 4 (CIANCIOTTO, 2005). Na primeira etapa, a protena a ser secretada
produzida com um peptdeo sinal N-terminal, o que permite a sua translocao Sec-
dependente atravs da membrana citoplasmtica. Isto seguido pela remoo do peptdeo
sinal, enovelamento e liberao das protenas maduras no espao periplasmtico. Neste
compartimento, pode sofrer modificaes como formao de ligao dissulfeto, antes de
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serem translocadas atravs da membrana externa pela mquina Xcp ou secreton. Este aparato
composto de 12 a 16 protenas extremamente especfico, podendo distinguir as protenas a
serem excretadas das protenas periplasmticas residentes (SANDKVIST, 2001; DESVAUX
et al., 2004).
Figura 4: Esquema de transporte do sistema de secreo do tipo II (RYAN e RAY, 2004).
Dentre as protenas secretadas por este sistema esto a elastase, a lipase, a fosfolipase C e a
Exotoxina A (KIPNIS et al., 2006).
3.5.3.2 Sistema de secreo tipo V
O sistema de secreo do tipo V ocorre em duas etapas e Sec dependente, sendo
considerado o sistema mais simples de secreo (RYAN e RAY, 2004). Neste sistema esto
includas as famlias de protenas que so secretadas pelo sistema de autotransporte (tipo Va
ou AT-1), o sistema de secreo de dois componentes (tipo Vb) e o sistema tipo Vc. As
protenas secretadas por essas vias apresentam semelhanas em suas estruturas primrias. Na
Figura 5 possvel ver um esquema do sistema de secreo do tipo V.
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Figura 5: Esquema de transporte do sistema de secreo do tipo V. No sistema de secreo do
tipo Va, as protenas so chamadas de autotransportadoras por no necessitarem de
acoplamentos de energia, nem de protenas acessrio. Aps a passagem para o periplasma
pelo sistema Sec, o domnio localizado na extremidade C-terminal adota uma estrutura em
forma de barril, facilitando a passagem da molcula efetora pela membrana externa. No
sistema do tipo Vb o peptdeo sinal orienta a passagem atravs da membrana interna. Aps
passar para o periplasma, o domnio de passagem se insere na membrana externa, formando a
estrutura -barril. Uma vez na superfcie, o domnio de passagem pode sofrer um processo
proteoltico para atingir sua funo fisiolgica. O sistema do tipo Vc um sistema alternativo
ao tipo Va, onde ocorre a formao de vrios barris (HENDERSON et al., 2004).
a) Tipo Va
As protenas secretadas por este sistema so chamadas de autotransportadoras por no
necessitar de acoplamentos de energia nem de protenas acessrio para sua translocao.
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Possuem os seguintes domnios: a sequncia sinal (ou peptdeo sinal), o domnio de passagem
(ou domnio ) e a unidade de translocao que dividida em duas regies: uma regio curta
de ligao -helicoidal e um domnio . A sequncia sinal est presente na extremidade N-
terminal da protena e permite a sua ligao com a membrana interna para sua posterior
passagem para o periplasma. O domnio , localizado na extremidade C-terminal adota uma
estrutura em forma de barril quando embebido na membrana externa, facilitando a
translocao do domnio de passagem a pela membrana externa. O domnio de passagem
corresponde molcula efetora, uma vez que executa a funo extracelular da protena. Os
domnios de passagem so muito diferentes em sequncia e funo, mas tem sido
relacionados virulncia bacteriana. Eles podem apresentar atividade enzimtica (proteases,
peptidases, esterases e lipases), mediar a motilidade bacteriana, ou agir como adesinas,
toxinas, citotoxinas ou ainda permitir a maturao de uma outra protena de virulncia.
(DESVAUX et al, 2004; HENDERSON et al, 2004).
b) Tipo Vb
No sistema de secreo de dois componentes ou TPS (Two-partner secretion), como
no sistema Va, o domnio de passagem possui uma sequncia sinal que orienta a translocao
atravs da membrana interna. Aps a exportao para o periplasma, o domnio de passagem
se insere no poro da membrana externa formado pela estrutura -barril. Uma vez na superfcie
da bactria, o domnio de passagem pode sofrer um processo proteoltico para atingir sua
funo fisiolgica. Contudo, em contraste com a via autotransportadora, onde a protena
produzida como um polipeptdeo nico, o domnio de passagem (tambm chamado de
exoprotena) e o domnio que forma os poros so chamados respectivamente de TpsA eTpsB.
(JACOB-DUBUISSON et al., 2001).
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c) Tipo Vc
Este tipo de sistema de secreo tem sido proposto como um sistema alternativo ao
sistema autotransportador, devido secreo de protenas tercirias autotransportadoras de
forma diferente do sistema Va. A famlia das adesinas oligomricas tem sido descrita como
subfamlia de autotransportadoras oligomricas de ligao de superfcie. A protena YadA de
Y. pestis a adesina prototpica deste sistema. (HENDERSON et al, 2004).
Dentre as protenas autotransportadoras em Pseudomonas aeruginosa est a esterase
EstA (WILHELM et al, 2007).
3.5.4 Sistemas Sec-independentes
Em contraste com os sistemas de secreo dos tipos II e V, os sistemas do tipo I, III,
VI exportam protenas atravs das membranas internas e externas por um processo contnuo
sem a necessidade de um sistema acessrio (HUECK, 1998).
3.5.4.1 Sistema de secreo tipo I
O sistema de secreo do tipo I consiste de trs protenas que formam o canal
transmembrana, atravs do qual a protena secretada se move, sendo transportada por uma das
protenas, uma transportadora ABC (ATP- binding cassete). Em apenas uma etapa, a protena
secretada que apresenta um sinal clssico de secreo, passa do citosol para o meio externo,
sem necessitar de um intermedirio citoplasmtico (Figura 6). Segundo Guzzo e
colaboradores (1991), a protease alcalina secretada por esse sistema. A AprA exibe um sinal
de secreo C-terminal bem caracterstico, localizado nos ltimos 60 aminocidos (DUONG
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et al, 1996). As trs protenas da membrana necessrias para a secreo so AprD (protena
transportadora ABC), AprE (protena de fuso de membrana) e AprF ( protena de membrana
externa). (DUONG et al., 2001).
Figura 6: Esquema de transporte do sistema de secreo do tipo I, a protena secretada passa
para o meio externo sendo transportada pela ABC transportadora (RYAN e RAY, 2004).
3.5.4.2 Sistema de secreo tipo III
O sistema de secreo do tipo III, o qual responsvel pela secreo de muitos fatores
de virulncia na espcie Pseudomonas, formado por aproximadamente 20 protenas. Estas
protenas associam-se em uma estrutura supramolecular que lembra uma seringa com uma
agulha denominada injectissoma (CORNELIS, 2006). Este sistema dependente de contato,
onde a secreo das protenas virulentas (ou efetores) ativada pelo contato entre clula
bacteriana e a clula hospedeira, resultando na injeo direta da protena secretada no
citoplasma da clula eucaritica (Figura 7). O sistema de secreo do tipo III consiste em trs
complexos de protenas distintos, mas que operam coordenadamente: o aparato de secreo, o
aparato de translocao, efetores e chaperonas. um sistema Sec-independente, formando um
canal de translocao dos efetores bacterianos para a clula. Apenas quatro molculas efetoras
foram identificadas em Pseudomonas aeruginosa: ExoU, ExoS, ExoT e ExoY. ExoS uma
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toxina bifuncional com dois domnios ativos, um domnio C-terminal ADP- ribosiltransferase,
cuja atividade depende de um cofator da clula eucaritica, e um domnio N- terminal GTPase
ativador de protena (GAP). Sua patogenicidade atribuda a atividade da ADP-
ribosiltransferase, levando ao estabelecimento da infeco e danos ao tecido (FU et al.,1993).
ExoT similar a ExoS, com atividades ADP- ribosiltransferase e GAP, porm considerada
uma citotoxina minoritria, no sendo considerada como responsvel a patogenicidade da
Pseudomonas aeruginosa (KIPNIS et al.,2006). ExoY uma adenilato ciclase injetada
diretamente no citosol do hospedeiro, Sua toxicidade ainda incerta, embora seja txica
quando expressa em leveduras (ENGEL e BALACHANDRAN, 2009). ExoU uma potente
fosfolipase sendo considerada a principal citotoxina secretada pelo sistema de secreo do
tipo III, podendo matar rapidamente os macrfagos, clulas epiteliais e fibroblastos (JAIN t
al., 2008). Efetores adicionais devero ser revelados medida que novas cepas so
seqenciadas e posteriormente analizadas. ExoT e ExoY so codificadas por quase todas as
cepas, embora nem todas produzam ExoY funcional, devido a mutaes. ExoS e ExoU so
genes variavelmente codificados e quase nunca so encontrados na mesma cepa (ENGEL e
BALACHANDRAN, 2009).
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24
Figura 7: Esquema de transporte do sistema de secreo do tipo III (RYAN e RAY, 2004).
3.5.4.3 Sistema de secreo tipo VI
Este sistema foi inicialmente descrito por Pukatzki et al. (2006), que usando
Dictyostellium discoideum como modelo de hospedeiro identificou um mecanismo de
virulncia em V. cholerae que envolvia a translocao de protenas extracelulares que no
possuam uma seqncia lder na regio N-terminal hidrofbica. Estes genes foram nomeados
de VAS (virulence associated secreton) e foram propostos como sendo os codificadores do
sistema de secreo do tipo VI. A funo do sistema de secreo do tipo VI seria mediar a
exportao extracelular de fatores de virulncia e transloc-los para clulas eucariticas.
O sistema do tipo VI um sistema dependente de energia, e usa uma ATPase
hexamrica da famlia AAA+, ClpV. As protenas Hcp (hemolisina A co-regulada) estudadas
em V. cholerae e confirmadas em P. aeruginosa no possuem um peptdeo sinal cannico,
indicando que elas no so secretadas por um sistema Sec ou Tat dependentes, e
provavelmente atravessam o envelope celular bacteriano de uma s vez (PUKATZKI et al
-
25
2006, MOUGOUS et al 2006). A protena VgrG de V. cholerae pode formar um dispositivo
similar a cauda de um bacterifago. Este dispositivo pode ser usado para perfurar o envelope
bacteriano e ainda a membrana da clula hospedeira para o transporte de efetores. J as
protenas Hcp formam anis hexamricos, que formam um duto extracelular que envolve o
tubo formado pelas protenas VgrG.
Conforme ilustrado na figura 8, a ATPase ClpV (laranja) ajuda a transportar Hcp
(amarelo) e VgrG (verde escuro) atravs do envelope celular. A Lip (rosa) uma lipoprotena
putativa de membrana externa, sendo improvvel que esta forme um poro na membrana uma
vez que est ancorada na mesma por modificao lipdica. As protenas IcmF (azul) e DotU
(vermelho) so protenas de membrana interna. O nvel de fosforilao da protena Fha
(marrom) que regula a atividade do sistema (FILLOUX et al., 2008).
-
26
Figura 8: Esquema de transporte do sistema de secreo do tipo VI, C-citoplasma bacteriano,
IM- membrana interna bacteriana, P-periplasma bacteriano, OM- membrana externa
bacteriana, ECM- meio extracelular e PM- membrana do hospedeiro. (FILLOUX et al. ,
2008).
3.6 Fatores de virulncia secretados
3.6.1 Piocianina
A piocianina (1-hidrxi-5-metil-fenazina) (Figura 9), em modelos animais de infeco
pulmonar aguda e crnica, mostrou-se essencial para a virulncia da Pseudomonas
aeruginosa. Por ser um zwitterion pode penetrar facilmente nas membranas biolgicas. Na
maioria dos casos, a citotoxicidade da piocianina tem sido fortemente ligada ao seu potencial
ciclo redox podendo aceitar eltrons diretamente dos agentes redutores celulares NADH ou
-
27
NADPH. Sob condies aerbias, ela transfere os eltrons para o O2 levando a um aumento
do estresse oxidativo dos sistemas celulares pela gerao de espcies reativas de oxignio
como radical superxido (O2.-) e perxido de hidrognio (H2O2) (OMALLEY et al, 2004;
(LIU e NIZET, 2009 ).
N+
N+
O-
CH3
H
- H+
+ H+
pKa=4.9
N+
N
O-
CH3
Vermelho Azul
Piocianina
Figura 9: Estrutura da piocianina em dois estados: em pH perto do neutro ou alcalino o
pigmento existe na forma de zwitterion e possui a colorao azul, enquanto que em pH cido
sua colorao vermelha.
A maioria das clulas possui vrios mecanismos essenciais para limitar sua exposio
a espcies reativas de oxignio. Um dos principais componentes da defesa antioxidante o
composto tiol glutationa. Quando as clulas so expostas a espcies oxidantes como H2O2, a
glutationa reduzida (GSH) oxidada a sua forma dimerizada, (GSSG) pela ao da enzima
glutationa peroxidase. GSSG reduzida novamente a GSH pela ao da glutationa redutase
(Figura 10). Esse ciclo da GSH um importante mecanismo de limitar a exposio celular aos
efeitos citotxicos do H2O2. O consumo e a perda de GSH conseqncia da exposio
celular a agentes oxidantes e contribui para leso celular. (OMALLEY et al, 2004).
-
28
NADPH
2H+
NADP+
2O2
NAD(P)H
Piocianina
NAD(P)+
2O2.-
H2O2 + O2
2GSH GSSG
GPx
GSH
redutase
Figura 10: Formao de O2.-
e H2O2 pela reao do NAD(P)H com a piocianina e a interao
subseqente do H2O2 com GSH. GPx, glutationa peroxidase.
Este pigmento possui atividade antibitica contra uma grande variedade de
microorganismos, o que beneficia a P. aeruginosa na eliminao de microrganismos
competidores, inibindo a fagocitose e induzindo a apoptose do hospedeiro. Alm disso,
tambm participa na reduo do ferro e funciona como um tampo redox intracelular.
Recentemente a piocianina mostrou ter funo de sinalizao, sendo responsvel pela
regulao de genes especficos, Omo genes envolvidos na aquisio de Fe+3
(PRICE-
WHELAN et al, 2006; PRICE-WHELAN et al, 2007; KIPNIS et al., 2006; RESKA et al. ,
2006).
A sntese da piocianina regulada por quorum sensing. As molculas sinais N-(3-
oxododecanoil) homoserina lactona e N-butiril homoserina lactona so sintetizadas pelos
genes lasI e rhlI respectivamente. A uma alta densidade celular, o ativador transcricional
LasR se liga a N-butiril homoserina lactona (C4-HSL) para ativar a transcrio de genes de
virulncia, alguns deles envolvidos na produo da piocianina (Figura 11) (LAU t al., 2004).
-
29
PAI-1 PAI-2
Quinolones
LasR-LasI RhlR-Rhll
+ +
phzA1B1C1D1E1F1G1
e phzA2B2C2D2E2F2G2
Chorismic acid Phenazine-1-carboxylic acid
PhzM
S-adenosyl-L-
methionine
S-adenosyl-L-
homocysteine
5-methylphenazine-1-carboxylic acid betaine
Pyocyanin
NADH + O2
NAD+ + H2O
Figura 11: Rota biossinttica da piocianina. (LAU t al., 2004)
-
30
3.6.2 Proteases
Vrias proteases de P. aeruginosa que tem sido isoladas mostraram estar envolvidas
em sua patognese. Grande parte do dano tecidual causado por infeces por P. aeruginosa
pode ser atribudo a zinco-dependente metaloendopeptidase LasB (elastase), LasA e proteases
alcalinas. Embora o nome sugira especificidade elastina, a LasB pode degradar uma gama
de substratos como fibrinognio, colgeno, lamimina, transferrina e imunoglobinas. Esta
protease uma das mais bem caracterizadas, sendo secretada pelo sistema de secreo do tipo
II. A LasA ativa contra uma pequena gama de substratos e potencializa a ao da LasB.
Semelhante a LasB, a protease alcalina demonstra ampla especificidade a fibrina,
fibrinognio, lamimina e secretada pelo sistema de secreo do tipo I. (MARQUART et al,
2005; KIPNIS et al., 2006).
3.6.3 Lipases
Lipases, triacilglicerol hidrolases, so um importante grupo de enzimas
biotecnologicamente relevantes que possuem muitas aplicaes nas indstrias de alimentos,
de detergentes e farmacuticas. Lipases so em geral produzidas a partir de microorganismos
e, especificamente as lipases bacterianas desempenham um papel vital em empreendimentos
comerciais (GUPTA et al., 2004). Lipases tambm so definidas como glicerol ster
hidrolases que catalisam a hidrlise de triglicerdeos a cidos graxos livres e glicerol. Estas
enzimas podem catalisar reaes de esterificao, interesterificao, acidlise e alcolise.
Novas aplicaes biotecnolgicas tem sido estabelecidas com sucesso usando lipases para a
sntese de biopolmeros e biodiesel, na produo de frmacos enantiopuros e compostos
agroqumicos (HASAN et al., 2009).
-
31
Pseudomonas aeruginosa capaz de infectar pacientes imunocomprometidos. Este
patgeno possui um sistema lipoltico extracelular complexo, com pelo menos duas
fosfolipases C, uma esterase ligada a membrana externa e uma lipase. Konig et al. (1996)
descobriram que a ao combinada das enzimas lipase e fosfolipase levam a um aumento das
substncias reativas cido 12-hidroxieicosatetranoico das plaquetas humanas e leucotrieno B4
dos neutrfilos. Essas reaes podem levar a distrbios de respostas imunes, que poderia
iniciar dano tecidual e estimular processos inflamatrios (STEHR et al.,2003).
A lipase produzida por Pseudomonas aeruginosa secretada pela via de secreo do
tipo II (LIEBETON et al., 2000).
3.6.4 Hemlise
O poder hemoltico um fator de virulncia para muitas bactrias patognicas. Pode
ser relacionado a vrios fatores: toxinas formadoras de poros, citolisinas dependentes de tiol,
fosfolipases, biossurfactantes, componentes do sistema de secreo do tipo III, ou pela ao
concomitante destas molculas (ROWE e WELCH, 1994).
3.6.5 Ramnolipdeo
Em condies ambientais especficas, Pseudomonas aeruginosa produz
biossurfactante do tipo glicolipdeo contendo ramnose. A produo de ramnolipdeos pela
bactria foi relatada pela primeira vez por Jarvis et al. (1949). Em cultura lquida,
P.aeruginosa produz, principalmente, duas formas de ramnolipdeo: ramnosil--
hidroxidecanoil--hidroxidecanoato (monoramnolipdeo) e ramnosil-ramnosil--
hidroxidecanoil--hidroxidecanoato (diramnolipdeo) (Figura 12) (RENDELL et al., 1990).
-
32
A biossntese dessas molculas tenso-ativas ocorre atravs de duas reaes seqenciais
de transferncia de grupamento ramnosil, catalisada pelo complexo enzimtico
ramnosiltransferase I (RhlA/RhlB) (BURGER et al., 1963) e ramnosiltransferase II (RhlC)
(Rahim et al., 2001), respectivamente, tendo a molcula de deoxi-timidina-difosfato-
Lramnose (dTDP-L-ramnose) como doadora do ramnosil em ambas as reaes e a molcula
de -hidroxidecanoil--hidroxidecanoato ou ramnosil--hidroxidecanoil--hidroxidecanoato
atuando como os respectivos receptores (BURGER, 1966). A figura 13 ilustra a via
biossinttica destas molculas, (SOBERN-CHAVZ et al., 2005).
Figura 12: Estrutura dos ramnolipdeos (SOBERN-CHVEZ et al., 2005)
P. aeruginosa pode produzir ramnolipdios a partir de uma grande variedade de
substratos incluindo alcanos C11 e C12, succinato, piruvato, citrato, frutose, glicerol, leo de
oliva, glicose e manitol. A composio e os rendimentos dependem do tipo de fermentador,
pH, composio de nutrientes, substrato e temperatura (MULLIGAN, 2009).
-
33
NADPH
NADP+
CoA
ACP
NADPH
NADP+
OH
CH3
O
O P O
O
O-
P O
O
O-
Timidine
HOHC
(CH2)6
CH3
CH2
C O
O
HC
(CH2)6
CH3
CH2
CO-S-CoA
OH OH
TDP
OH OO
HC
(CH2)6
CH3
CH2
C O
OHC
(CH2)6
CH3
CH2
COOH
CH3
OH OH
TDP
OH OO
HC
(CH2)6
CH3
CH2
C O
OHC
(CH2)6
CH3
CH2
COOH
CH3
OH O
OHCH3
O
OH OH
dTDP-L-rhamnose
LPS
LPS
FATTY ACID BIOSYNTHESIS
-Ketodecanoylester
-Hydroxydecanoyl-ACP
-Hydroxydecanoyl-S-CoA
PhaC
+
-Hydroxydecanoyl-B-hydroxydecanoyl-S-CoA
RhlAB
RhlC
TDP-L-rha
D-glucose-6-phosphate
D-glucose-1-phosphate
dTDP-D-glucose
dTDP-4-keto-6-
deoxy-L-mannose
AlgC
RmlA
RmlB
RmlD
L-Rhamnosyl--hydroxydecanoyl--hydro
xydecanoate
L-RhamnosylL-Rhamnosyl--
hydroxydecanoyl--hydroxydecanoate
RhlA
Figura 13: Via metablica de biossntese de ramnolipdeo (SOBERN-CHVEZ et al.,2005;
ZHU e ROCK, 2008)
-
34
3.6.6 DNA extracelular
O patgeno oportunista P. aeruginosa tornou-se um organismo modelo na pesquisa de
biofilmes. possvel portanto, que a liberao do DNA, em alguns casos, permita a troca de
material gentico para dar lugar e induzir a formao da estrutura do biofilme e sua
estabilizao. A relativamente longa durao da proximidade fsica de bactrias em biofilmes
permite que as clulas constituintes estabeleam relacionamentos de longo prazo uns com os
outros, e biofilmes parecem ser ambientes ideais para que transferncia de genes ocorra
atravs do processo de transformao (ALLESEN-HOLM et al, 2006).
3.7 Estresse oxidativo
O estresse oxidativo caracterizado quando a concentrao de pr-oxidantes gerados
por fatores de origem endgena e/ou exgena supera as defesas antioxidantes das clulas. A
oxidao parte fundamental da vida aerbica, e assim os radicais livres so produzidos
naturalmente. Radicais livre, cujo eltron desemparelhado encontra-se centrado no tomo de
oxignio so denominados espcies reativas de oxignio (EROs). As EROs tem sido
caracterizadas como causadoras de danos no DNA, RNA, protenas e lipdeos. Estas
molculas so produzidas como um subproduto inevitvel do metabolismo aerbico normal, e
sua produo ainda exacerbada pela exposio a certos ambientes (BARREIROS et al.,
2006; KOGOMA et al.,1991).
-
35
3.7.1 Espcies reativas de oxignio (EROs)
As principais EROs distribuem-se em dois grandes grupos, os radicalares: hidroxila
(HO.), superxido (O2
.-), peroxila (ROO
.) e alcoxila (RO
.); e os no radicalares: oxignio
singlete (O2), perxido de hidrognio (H2O2), cido hipocloroso (HOCl) e oznio (O3).
Algumas destas espcies esto relacionadas na Tabela 2 (BARREIROS e DAVID, 2006).
Tabela 2: Caracterizao de algumas das principais EROs formadas in vivo (RIBEIRO et al,
2005)
Intermedirio Comentrio Stio de formao
(O2.-) Formado a partir da reduo
parcial do oxignio molecular
por 1 eltron
Reaes de autoxidao envolvendo
flavoprotenas e ciclos redox
H2O2 Formado a partir da reduo
parcial do oxignio molecular
por 2 eltrons
Vias catalisadas por oxidases e pela
superxido dismutase
OH. Formado a partir da reduo
parcial do oxignio molecular
por 3 eltrons e nas reaes de
Fenton e Haber-Weiss,
catalisada por metais
Locais adjacentes formao de nion
superxido/perxido de hidrognio na
presena de metais, principalmente Fe2+
;
produto da reao de xido ntrico com o
radical superxido
RO. Radical orgnico centrado no
oxignio
Intermedirio na peroxidao de lipdeos
de membrana
ROO. Formado a partir de
hidroperxidos orgnicos
Intermedirio na peroxidao de lipdeos
de membrana
1g O2 Primeiro estado excitado do
oxignio molecular
Sem stios metablicos definidos
Segundo a teoria do orbital molecular, a molcula do oxignio diatmico (O2=
oxignio molecular ou tripleto), em seu estado fundamental (Figura 14a), possui dois eltrons
-
36
desemparelhados no orbital antiligante *. Nota-se que os dois eltrons apresentam spins
paralelos e este fato restringe a reatividade da molcula, porque quando a mesma tenta oxidar
outro tomo ou molcula, os eltrons que sero aceitos pelo oxignio devem tambm ter spins
paralelos para permanecerem nos orbitais vazios. Entretanto possvel eliminar a restrio de
spin da molcula de oxignio movendo um dos eltrons desemparelhados, o qual sofre uma
inverso de spin, e assim os dois eltrons passam a emparelhar-se (Figura 14b). Isto requer
energia e forma o oxignio singlete. Existem duas formas do oxignio singlete: uma com os
dois eltrons em orbitais diferentes (Figura 14d) e outra, na qual os dois eltrons ocupam o
mesmo orbital (Figura 14b). A primeira forma, (1gO2), considerada muito instvel e antes
de reagir com outras molculas ela se converte no estado (1g O2) (Figura 14b), o qual mais
estvel (RIBEIRO et al, 2005). Como conseqncia, a reatividade do oxignio com
biomolculas restrita por spin. A reatividade do oxignio aumenta pela adio de um, dois
ou trs eltrons para formar, respectivamente o radical superxido (O2.-) (Figura 14c),
perxido de hidrognio (H2O2) e radical hidroxila (HO.) ou quando ocorre a inverso de spin
para formar o oxignio singlete (1gO2). Em condies cidas, O2
- pode ser protonado para
formar o radical peridroxila (HOO.) (Figura 15) (KOGOMA, e FARR, 1991).
-
37
Figura 14: Estados do O2 segundo a teoria do orbital molecular (RIBEIRO et al, 2005)
H2O2O2 O2- H2O
e- e
-, 2H
+ e-, H
+
OH.
e-, H
+
(pKa4,8)
HOO.
Figura 15: Formao das EROs a partir do oxignio (KOGOMA, e FARR, 1991).
Quanto ao potencial de reatividade das EROs no meio biolgico, o radical hidroxila
o mais reativo, podendo oxidar qualquer biomolcula presente em clulas vivas. O perxido
de hidrognio mais estvel que o radical hidroxila e pouco reativo, porm pode atravessar
membranas com facilidade. O oxignio singlete pode reagir com lipdeos de membrana,
protenas, aminocidos, cidos nuclicos, carboidratos e tiis (RIBEIRO et al, 2005; BAYIR,
-
38
2005). A caracterizao de algumas das principais EROs formadas in vivo pode ser vista na
tabela 2.
3.7.2 Superxido dismutase (Sod)
Durante a respirao aerbia o desvio de corrente de eltrons da cadeia de transporte
de eltrons pode levar a produo de O2.-. A produo deste radical contida pelas enzimas
superxido dismutases (Sod) que catalisam a dismutao de dois radicais superxidos em
oxignio molecular e perxido de hidrognio (Figura 16) (HASSETT et al., 1995).
SOD
2O2.-
+ 2H+ O2 + H2O2
Figura 16: Reao de dismutao catalisada pelas enzimas superxido dismutases (BAYIR,
2005).
O radical superxido gerado em organismos aerbios espontaneamente e tambm
como produto de processos metablicos. A Sod considerada de grande importncia na
proteo contra os danos causados pelo oxignio, e o aumento da tolerncia ao estresse
oxidativo est relacionado ativao desta enzima (SCOTT et al.,1987).
Pseudomonas aeruginosa possui duas superxido dismutases, Mn-Sod codificada pelo
gene sodA e Fe-Sod codificada por sua vez pelo gene sodB. A Mn-Sod apresenta atividade
mxima quando o organismo est privado de ferro, enquanto que a Fe-Sod apresenta atividade
mxima quando o ferro abundante. No entanto, a regulao destes genes e o impacto
relativo dos seus produtos gnicos sobre metabolismo de P. aeruginosa em condies de
aerobiose so desconhecidos (HASSETT et al, 1992; HASSETT et al, 1999).
-
39
Os regulons moduladores de resposta ao estresse oxidativo em E. coli so SoxR e
OxyR, sendo ambos ativados a nveis postranslacionais. O nion superxido O2- ativa SoxR
pela oxidao de seus centros[2Fe-2S] e o SoxR oxidado induz a expresso do segundo fator
transcripcional SoxS, que ativa diretamente a transcrio de alguns genes, incluindo sodA em
Escherichia coli (OCHSNER et al., 2000). J a bactria Pseudomonas aeruginosa tem uma
ORF que codifica uma protena homloga a E. coli SoxR mas no para SoxS (KOBAYASHI,
TAGAWA, 2004). Ela possui duas superxido dismutases (SodA e SodB) que representam a
primeira linha de defesa contra O2-, transformando-o em H2O2 e trs catalases (KatA, KatB e
KatE) protegem a clula contra o H2O2. Finalmente quatro alquilhidroperxido redutases
(AhpA, AhpB, AhpCF e Ohr) detoxificam o H2O2 e vrios perxidos orgnicos. O regulador
transcricional-LysR de 34kDa, OxyR, crucial para a regulao dos genes antioxidantes katB,
aphB e ahpCF aps contato com H2O2. (OCHSNER et al, 2000).
3.7.3 Oxidao de protenas
As protenas podem ser diretamente oxidadas por todas as EROs ou tambm ser alvo
dos produtos da peroxidao lipdica.
As modificaes das protenas basicamente so iniciadas pelo radical OH., contudo a
continuidade do processo de oxidao determinada pela disponibilidade de oxignio (O2) ou
de sua forma protonada (.HO2). Coletivamente, estas EROs conduzem a oxidao de resduos
de aminocidos (Pro, Asp e Glu), o que pode resultar na inativao e at mesmo fragmentao
das protenas (BARLETT e STADTMAN, 1997). Em geral, a oxidao dos aminocidos se
d na cadeia lateral. Grupos carbonlicos (CO) podem ser formados nas cadeias laterais de
aminocidos livres ou em cadeias polipeptdicas (especialmente His, Pro, Arg, Lys e Thr)
quando oxidadas. Os produtos formados so quimicamente estveis, podendo ser facilmente
-
40
usado como biomarcador de estresse oxidativo (DALLE-DONNE et al, 2003; STADTMAN,
1993; LEVINE et al, 1994 ).
A carbonilao de protenas pode afetar diretamente o metabolismo celular ao alterar a
atividade das protenas. Atualmente, a anlise de carbonilao em protenas o biomarcador
mais utilizado para a determinao dos nveis de oxidao protica. O acmulo de protenas
carboniladas tem sido observado em clulas de S. cerevisiae durante diversos processos
biotecnolgicos, em especial o processo fermentativo para produo de etanol (LANDOLFO
et al.,2008). Um exemplo de utilizao deste biomarcador em bactrias pode ser visto em
Dukan e colaboradores (2000), onde em E.coli foi observado que protenas danificadas
oxidativamente so mais suscetveis a protelise, e o acmulo destas protenas foi
acompanhado pelo aumento de protenas carboniladas.
-
41
4. Materiais e Mtodos
Neste captulo, so apresentados os materiais utilizados para o desenvolvimento do
presente trabalho e as metodologias empregadas. So descritas as tcnicas utilizadas para a
conduo e para o acompanhamento das fermentaes e dosagem de alguns fatores de
virulncia, realizadas no Laboratrio de Biotecnologia Microbiana (LaBiM, Instituto de
Qumica/UFRJ). Tambm so apresentadas as tcnicas utilizadas para determinao de
protenas relacionadas ao estresse oxidativo, realizadas no Laboratrio de Investigao de
Fatores de Estresse ( LIFE, Instituto de Qumica/UFRJ).
4.1 Microrganismo e condies de cultivo
A cepa de Pseudomonas aeruginosa PA1 previamente selecionada de
ambientes de petrleo como melhor produtora de biossurfactantes (SANTA ANNA, 2000) foi
preservada em glicerol a 10% em ultrafreezer a -80 C. O pr-inculo foi crescido em placa
com YPDA (extrato de levedura 0,3%, peptona 1,5%, dextrose 0,1%, agar 1,2%) a 30 oC por
48 horas e transferido para frascos de 1000 mL com 300 mL de meio com a seguinte
composio (g/L): NaNO3 1,0; KH2PO4 3,0; K2HPO4 7,0; MgSO4.7H2O 0,2 ; extrato de
levedura 5,0; peptona 5,0 e glicerol 30,0. Aps 24 horas de cultivo, o meio de fermentao
contendo as clulas foi estocado em criotubos na relao glicerol/meio fermentado de 1:3 para
servir como pr-inculo padro em todas as fermentaes.
-
42
4.2 Preparo do inculo
O contedo de 1,0 ml do criotubo foi inoculado em 300ml de meio de fermentao
com a seguinte composio (g/L): glicerol 30,0; NaNO3 1,0; K2HPO4 7,0; KH2PO4 3,0;
MgSO4.7H2O 0,2; extrato de levedura 5,0 e peptona 5,0. Os frascos foram ento incubados
em agitadores rotatrios a 30oC e 170 rpm por 40 horas. Ao final desse perodo, as clulas de
cada frasco foram recuperadas por centrifugao (5000 g por 20 minutos) e utilizadas como
inculo.
4.3 Esterilizao
O fermentador e os frascos, j com o meio de cultura a ser utilizado, foi esterilizado
em autoclave a 121C por 15 minutos antes de cada produo. O sistema de oxigenao foi
esterilizado com a circulao de uma soluo de hipoclorito de sdio a 1,0 % por 1 hora.
Depois deste procedimento, foi circulada gua destilada estril pelo sistema para a eliminao
de vestgios de cloro. S ento foi realizada a inoculao dos microorganismos.
(KRONENBERGER, 2007).
4.4 Frascos agitados
Foram conduzidas fermentaes em frascos agitados de 1000 mL em quatro diferentes
relaes Vf/Vm (volume de frasco / volume de meio) (1:0,15, 1:0,30, 1:0,50 e 1:0,70), com o
objetivo de se avaliar o efeito da aerao superficial na produo do biossurfactante.
-
43
As clulas foram incubadas a 30C e a uma rotao de 5000 g em meio de cultivo
(30,0 g/L de glicerol, 1,38 g/L de NaNO3, 7,0 g/L de K2HPO4, 3,0 g/L de KH2PO4, 0,2 g/L de
MgSO4.7H2O) com uma relao carbono/nitrognio (C/N) igual a 60 (SANTOS et al., 2002).
4.5 Biorreator
O meio de cultura utilizado nas fermentaes apresentava a seguinte composio em
gramas por litro: glicerol 30,0; NaNO3 1,4; K2HPO4 7,0; KH2PO4 3,0 e MgSO4.7H2O 0,2,
resultando em uma relao carbono/nitrognio igual a 60 (SANTOS, 2003).
As fermentaes foram realizadas em um biorreator BioFlo IIc (Batch/Continuous
Fermentor; New Brunswick Scientific; USA) com capacidade nominal de 5,0 litros de
volume, inserido em uma capela com exausto (Figura 17). O volume til mdio utilizado nas
fermentaes foi de 3,0 litros, a temperatura foi mantida em 30C e a agitao, em 100 rpm.
A oxigenao foi conduzida de forma no dispersiva atravs de um contactor gs/lquido. A
oxigenao foi realizada com o auxlio de um cilindro de oxignio puro. As condies de
oxigenao utilizadas foram de 1 mg O2/L e 5 mg O2/L (KRONENBERGER, 2007).
Tambm foram conduzidas fermentaes em frascos agitados para efeito comparativo
com o sistema proposto. A temperatura da fermentao foi mantida em 30,0 oC e a agitao,
em 5000 g, em um agitador rotatrio (C25KC Incubator Shaker, New Brunswick Scientific).
-
44
Figura 17: Fotografia do fermentador inserido na capela de exausto, acoplado ao
sistema de oxigenao utilizando o contactor de membranas
4.5.1 Controle da concentrao de oxignio no biorreator
O sistema de controle da concentrao de oxignio dissolvido foi projetado e
construdo, utilizando-se um Controlador Lgico Programvel (CLP OCS, GE Fanuc). Outro
sistema de controle da concentrao de oxignio dissolvido foi desenvolvido previamente por
SABRA et al. (2000), mas a oxigenao era realizada de forma dispersiva por borbulhamento
de uma mistura dos gases nitrognio e oxignio. Assim, alm de persistir o problema da
formao de espumas, havia perda de oxignio, sendo extremamente complexa a
determinao da exata quantidade consumida deste nutriente. Uma malha simplificada de
controle foi implementada neste controlador com a funo de manter a concentrao de
oxignio dissolvido no meio constante ao longo da fermentao. Isto foi conseguido
-
45
igualando-se a taxa de fornecimento de oxignio taxa de consumo deste nutriente pelas
bactrias. Na Figura 18 esto apresentadas fotos do CLP e de seu painel eltrico.
Figura 18: Controlador Lgico Programvel utilizado para implementao de uma malha de
controle da concentrao de oxignio dissolvido nas fermentaes para a produo de
ramnolipdeos por Pseudomonas aeruginosa.
Pela experincia adquirida atravs da conduo dos experimentos com o controle
manual da oxigenao, a estratgia de controle foi baseada em se alterar primeiramente a
vazo da corrente lquida e, posteriormente, a presso da corrente gasosa para controlar a taxa
de fornecimento de oxignio. Essa taxa diretamente proporcional s duas variveis citadas.
Assim, se o valor da concentrao de oxignio dissolvido fosse reduzido para um valor abaixo
do desejado, a taxa de fornecimento deveria ser elevada pelo aumento na vazo da corrente
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lquida e, se insuficiente, na presso da corrente gasosa. Se a concentrao de oxignio
estivesse acima do estabelecido, a taxa deveria ser reduzida. Um fluxograma simplificado do
sistema de oxigenao apresentado na Figura 19.
Figura 19: Fluxograma simplificado do sistema de oxigenao.
Como observado na figura acima, a vazo da corrente lquida era controlada atravs da
atuao sobre a bomba de engrenagens e sobre a vlvula v1. J a presso da corrente de
alimentao de oxignio era controlada pela atuao sobre as vlvulas de entrada e sada do
contactor, v2 e v3, respectivamente. Assim, a nica entrada do CLP se refere concentrao
de oxignio dissolvido medida no meio de fermentao, enquanto que as sadas so quatro
para a bomba e as vlvulas.
Os dados de operao do controlador eram repassados a um computador acoplado ao
sistema atravs de um programa supervisrio (IFix StandAlone Standard HMI Pack RunTime
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para 75 pontos). Esses dados eram armazenados para anlise posterior (KRONENBERGER,
2007).
4.6 Biomassa
A concentrao celular das suspenses de Pseudomonas aeruginosa PA1 foi
determinada atravs da absorbncia de luz a 600 nm (Espectrofotmetro MultiSpec 1501;
Shimadzu Corporation, Japan). O valor de absorbncia foi convertido no valor de
concentrao (g/L) atravs de uma curva de calibrao (TAVARES, 2007).
Amostras coletadas no fim de uma fermentao foram filtradas em membranas de 0,2
m para a retirada das clulas. Essas clulas foram levadas em estufa a 70 oC at que fosse
atingido massa constante. A curva de calibrao da absorbncia em funo da massa seca foi
construda a partir de uma srie de diluies realizadas com amostras idnticas de meio de
cultivo contendo clulas. Para cada diluio os valores de absorbncia e massa seca foram
determinados e construiu-se assim uma curva de calibrao. O fator de converso de
absorbncia em concentrao, calculado atravs da equao Abs = 2,5437 * X, foi de 0,39
g/L.
4.7 Quantificao de glicerol
O teor de glicerol nas amostras livre de clulas foi avaliado pelo mtodo
enzimtico/colorimtrico para determinao de triglicerdeos (Triglicrides Enzimtico
Bioclin; Quibasa qumica Bsica Ltda.). O mtodo consiste na fosforilao de glicerol a
glicerol-3-fosfato em presena de glicerol quinase e ATP. O glicerol-3-fosfato ento
oxidado pela enzima glicerol-3-fosfato oxidase, liberando perxido de hidrognio que, na
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presena de aminoantipirina, p-clorofenol e peroxidase, produz um composto quinnico de
cor cereja. A intensidade dessa colorao pode ser determinada pela medida de absorbncia
de luz no comprimento de onda correspondente 490 nm e proporcional concentrao
de glicerol, podendo assim ser comparada a um padro (KRONENBERGER, 2007).
4.8 Quantificao de ramnolipdeos
A quantificao dos ramnolipdeos nas amostras livre de clulas foi realizada de modo
indireto, utilizando-se a ramnose como referncia a ramnose um subproduto da hidrlise
cida dos ramnolipdeos. Foi utilizado um mtodo adaptado do descrito por Pham et al.
(2004), onde a etapa de extrao dos ramnolipdeos foi suprimida, sendo o ensaio realizado
diretamente a partir do meio fermentado livre de clulas, j que o biossurfactante um
produto predominantemente extracelular. Para a determinao da concentrao de ramnose
presente na amostra, o valor de absorbncia obtido era comparado com o valor obtido na
dosagem de uma soluo padro de ramnose. Tomando como base 100,0 g de ramnolipdeos,
temos um total de 0,2737 gmol de ramnose. Sabendo-se que a massa molar da ramnose
(C6H12O5) igual a 164,0 g/gmol, calculamos um total de 44,89 g de ramnose. Com isso,
determinado o fator de 2,23 (100,0 g de ramnolipdeos/44,89 g de ramnose) para a converso
de concentrao de ramnose em concentrao total de ramnolipdeos (KRONENBERGER,
2007).
A soluo de biossurfactantes produzida pela cepa PA1 de Pseudomonas aeruginosa
foi caracterizada por HPLC e comparada a cromatogramas obtidos na literatura (SANTA
ANNA, 2005). A composio de ramnolipdeos desta soluo est apresentada na Tabela 3.