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UNIVERSIDADE CEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
São Luís
2012
PATRÍCIA VALÉRIA GOMES CASTELO BRANCO
Fatores e propriedades de virulência de espécies de Candida provenientes da mucosa oral de pacientes com
AIDS e de indivíduos imunocompetentes
PATRÍCIA VALÉRIA GOMES CASTELO BRANCO
Fatores e propriedades de virulência de espécies de Candida provenientes
da mucosa oral de pacientes com AIDS e de indivíduos imunocompetentes
Dissertação apresentada ao do Curso Mestrado
em Biologia Parasitária da Universidade
CEUMA, linha de pesquisa em Patogenicidade
Celular e Molecular de Micro-organismos, para
obtenção do título de Mestre.
Orientadora:
Profa. Dr
a. Cristina de Andrade Monteiro
Coorientadora:
Profa. Dr
a. Patrícia de Maria Silva Figueiredo
São Luís
2012
C348f Castelo-Branco, Patrícia Valéria Gomes
Fatores e propriedades de virulência de espécies de Candida provenientes
da mucosa oral de pacientes com AIDS e de indivíduos imunocompetentes
– São Luís-MA / Patrícia Valéria Gomes Castelo Branco. São Luís:
UNICEUMA, 2012.
111 f.
Orientadora: Profa. Dr
a. Cristina de Andrade Monteiro
Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) – Universidade CEUMA,
2012.
1. Candida 2. Exoenzimas 3. AIDS 4. Fatores de virulência. II. Título.
CDU 57:616.934
PATRÍCIA VALÉRIA GOMES CASTELO BRANCO
Fatores e propriedades de virulência de espécies de Candida provenientes
da mucosa oral de pacientes com AIDS e de indivíduos imunocompetentes
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em
Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / , considerou a
candidata:
( ) APROVADO ( ) REPROVADO
1. Examinador ________________________________________________
2. Examinador ________________________________________________
3. Examinador ________________________________________________
4. Presidente (Orientador)________________________________________
Dedico este trabalho a todos que ajudaram a concretizá-lo.
Agradeço
A Deus,
- sempre, por tudo.
Aos meus pais,
- pelo apoio e torcida.
Ao meu marido,
- pelo companheirismo, incentivo, apoio, compreensão e cooperação.
Ao meu irmão,
- por estar sempre disposto a me ajudar.
Aos orientadores,
- pelo incentivo, dedicação e estímulo.
Aos colaboradores,
- pela imensa cooperação.
Aos amigos,
- pela troca, apoio, auxílio, companhia e amizade.
Aos professores,
- pela imensa contribuição.
Ao Coordenador do Curso,
- pela paciência e compreensão.
Ao Ceuma,
- pelas várias oportunidades.
À Fapema,
- pelo apoio financeiro.
Que os nossos esforços desafiem as impossibilidades”
Charles Chaplin
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Diferentes espécies de Candida isoladas em meio cromogênico CHROMagar com
a identificação prévia realizada pelo VITEK YBC...................................................................37
Figura 2 - Produção de proteinases ácidas por amostras de C. tropicalis e C. albicans isoladas
da mucosa oral de pacientes com AIDS – grupo teste..............................................................40
Figura 3 - Intensidade da produção de proteinase entre as amostras positivas dos grupos teste
e controle...................................................................................................................................41
Figura 4 - Intensidade da produção de fosfolipase entre as cepas positivas dos grupos teste e
controle......................................................................................................................................44
Figura 5 - Produção de fosfolipase por amostras de Candida provenientes da mucosa oral de
pacientes com AIDS..................................................................................................................45
Figura 6 - Teste para produção de gelatinase em amostras proveniente da mucosa oral de
pacientes com AIDS..................................................................................................................47
Figura 7 - Classificação das amostras positivas para atividade hemolítica em meio sólido....49
Figura 8 - Formação de halos de hemólise em placa, acrescido de glicose (3%), após 48 horas
em estufa a 37 oC.......................................................................................................................50
Figura 9 - Atividade hemolítica em sobrenadante de cultura com íons e quelantes por
amostras de Candida provenientes da mucosa oral de pacientes com AIDS...........................52
Figura 10 - Relação entre grau/intensidade e padrão de aderência entre amostras de Candida
isoladas de pacientes dos grupos teste e controle.....................................................................55
Figura 11 - Aderência a material inerte de células de Candida spp de pacientes com AIDS.
Aumento de 1000x ao microscópio óptico...............................................................................56
Figura 12 - Aderência de Candida spp a células HEp-2. Aumento de 1000x ao microscópio
óptico.........................................................................................................................................60
Figura 13 - Intensidade da produção de biofilme por amostras dos grupos teste e controle...61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Frequência e distribuição das amostras clínicas de Candida isoladas de pacientes
com AIDS (grupo teste) e de indivíduos imunocompetentes (grupo controle)........................36
Tabela 2 - Produção de proteinase por diferentes espécies de Candida de pacientes com
AIDS (grupo teste) e de indivíduos imunocompetentes (grupo controle)................................39
Tabela 3 - Produção de fosfolipase por diferentes espécies de Candida de pacientes com
AIDS (grupo teste) e de indivíduos imunocompetentes (grupo controle)................................43
Tabela 4 - Produção de gelatinase por diferentes espécies de Candida de pacientes com AIDS
(grupo teste) e de indivíduos imunocompetentes (grupo controle)...........................................46
Tabela 5 - Produção de hemólise em meio sólido por diferentes espécies de Candida de
pacientes com AIDS (grupo teste) e de indivíduos imunocompetentes (grupo controle)........48
Tabela 6 - Produção de hemolisinas no sobrenadante da cultura por diferentes espécies de
Candida de pacientes com AIDS (Grupo teste) e indivíduos imunocompetentes (Grupo
controle)....................................................................................................................................51
Tabela 7 - Resultado dos testes de adesão em material inerte por diferentes espécies de
Candida de pacientes com AIDS (grupo teste) e de indivíduos imunocompetentes (grupo
controle)....................................................................................................................................53
Tabela 8 - Intensidade e padrão da aderência em material inerte por diferentes espécies de
Candida isoladas da mucosa oral de pacientes com AIDS (grupo teste) e de indivíduos
imunocompetentes (grupo controle).........................................................................................54
Tabela 9 - Porcentagem de aderência em células HEp-2 por diferentes espécies de Candida
da mucosa oral de pacientes com AIDS (grupo teste) e indivíduos imunocompetentes (grupo
controle)....................................................................................................................................57
Tabela 10 - Intensidade e padrão da aderência em células HEp-2 por diferentes espécies de
Candida da mucosa oral de pacientes com AIDS (grupo teste) e indivíduos imunocompetentes
(grupo controle).........................................................................................................................58
Tabela 11 - Formação de biofilme in vitro por diferentes espécies de Candida de pacientes
com AIDS (grupo teste) e indivíduos imunocompetentes (grupo controle).............................61
Tabela 12 - Teste de resistência ao soro com espécies de Candida provenientes de pacientes
com AIDS (grupo teste) e imunocompetentes (grupo controle)...............................................65
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ATCC - American Type Culture Collection
AIDS - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
BHI – Infusão de cérebro e coração (Brain Heart Infusion)
BSA - Albumina de Soro Bovino
CEB - Célula Epitelial Bucal
CVC - Catéter Venoso Central
EDTA - Etilenodiamina-tetra ácido acético
ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay
et al – et alli, e outros
ITU - Infecção do Trato Urinário
NCCLS - Clinical and Laboratory Standards Institute
NCAC - espécies de Candida não-Candida albicans (non-Candida albicans Candida)
PBS – tampão salina fosfato (phosphate buffered saline)
pH – potencial hidrogeniônico
Pz – zona de precipitação
RBC - Células Vermelhas do Sangue (Red Blood Cells)
SAP - Secreted aspartyl proteinases
SDA - Sabouraud Dextrose Agar
SFB - Soro fetal bovino
UNAIDS - Programa Conjunto das Nações Unidas sobre o HIV/AIDS
μg - microgramas
μl – microlitros
rpm – rotações por minuto
ºC – graus Celsius
RESUMO
Nas últimas décadas a importância clínica das espécies de leveduras do gênero Candida tem
crescido significativamente devido ao aumento da incidência de infecções oportunistas
causadas por estes micro-organismos. Tais infecções têm gerado elevados índices de
morbidade, longos períodos de permanência em hospitais, dificuldade e alto custo de
tratamento, assim como altas taxas de mortalidade. Indivíduos imunossuprimidos como os
portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) apresentam grande
suscetibilidade a desenvolver infecções fúngicas devido ao baixo número de linfócitos-T
CD4, menor que 200 cel/mm3. Nestes pacientes, a candidíase ocorre com uma prevalência de
80 a 90%. A habilidade de C. albicans ser a espécie mais relacionada com os processos de
colonização e patogenicidade na boca do homem é decorrente da acentuada capacidade de
dimorfismo morfológico e produção de exoenzimas facilitadoras da interação do fungo às
células do hospedeiro, propiciando a aderência e a penetração ao tecido afetado. Todas essas
etapas são consideradas relevantes na patogênese da candidíase em mucosa. A capacidade de
adesão e a formação de biofilme são consideradas propriedades de virulência primárias nas
infecções por Candida. É também fator de virulência a habilidade em produzir enzimas
hidrolíticas, dentre estas, as proteinases, que hidrolisam ligações peptídicas, e as fosfolipases,
que hidrolisam os fosfoglicerídeos. Estas exoenzimas parecem exercer papel importante na
invasão da célula do hospedeiro. Em particular, a secreção de outra enzima, a hemolisina,
seguida por aquisição férrea, que facilita a invasão de hifas numa candidíase disseminada. Os
fatos supracitados e o aumento no número de infecções oportunistas causadas por fungos,
principalmente em indivíduos infectados pelo HIV, têm estimulado novas pesquisas para
esclarecer os fatores de virulência e as circunstâncias da patogenicidade das várias espécies.
Assim, este estudo trabalhou com 75 (setenta e cinco) amostras de Candida, sendo 49
(quarenta e nove) isoladas da cavidade bucal de pacientes com AIDS (grupo teste) e 26 (vinte
e seis) de voluntários sem evidências clínicas de imunossupressão (grupo controle). Essas
amostras foram avaliadas em nove testes laboratoriais usando metodologias distintas,
previamente já descritos na literatura. Os testes foram: proteinase, fosfolipase, gelatinase,
hemólise em placa, hemólise com sobrenadante, aderência a material inerte, aderência a
células HEp-2, formação de biofilme e resistência ao soro. C. albicans (59,2%) foi a espécie
mais prevalente do grupo teste e C. parapsilosis (53,8%) do grupo controle. C. albicans
também teve resultados significativos para produção de proteinase (ambos os grupos) e
fosfolipase (grupo teste). Já as espécies de Candida não-Candida albicans (NCAC) tiveram
resultados altamente significativos para biofilme (ambos os grupos) e fosfolipase (grupo
controle). Para os testes de gelatinase, hemólise em placa e com sobrenadante, adesão a
material inerte e a células HEp-2 e resistência ao soro não foi encontrada diferença estatística
entre a produção por C. albicans e espécies NCAC. Por fim, não houve diferença estatística
em nenhum dos testes estudados quando comparados o grupo teste com o grupo controle.
PALAVRAS-CHAVE: Candida, exoenzimas, adesão, biofilme, resistência ao soro.
ABSTRACT
In recent decades the clinical importance of the Candida species has grown significantly due
to the increased incidence of opportunistic infections caused by these micro-organisms. Such
infections have generated high rates of morbidity, long periods of stay in hospitals, difficulty
and high cost of treatment as well as high mortality rates. Immunosuppressed individuals such
as those with Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) have a high susceptibility to
develop fungal infections due to the low number of CD4 T-lymphocytes, less than 200
cells/mm3. In these patients, the candidiasis prevalence with 80-90%. The ability of C.
albicans being the species most related to the processes of colonization and pathogenicity in
mouth of man is due to the marked morphological dimorphism capacity and production of
exoenzymes which facilitate the interaction of the fungus to host cells, allowing the adhesion
and penetration to the affected tissue. All these steps are considered relevant to the
pathogenesis of mucosal candidiasis. The adhesion and biofilm formation are considered
virulence properties in primary Candida infections. It is also virulence factor the ability to
produce hydrolytic enzymes, among these proteinases, which hydrolyze peptide bonds, and
phospholipases that hydrolyze phosphoglycerides. These exoenzymes appear to play an
important role in the invasion of the host cell. In particular, the secretion of another enzyme,
the hemolysin, followed by acquisition rails, which facilitates invasion of hyphae in a
disseminated candidiasis. The above facts and the increase in the number of opportunistic
infections caused by fungi, especially in HIV-infected individuals, have stimulated further
research to clarify the virulence factors and circumstances of the pathogenicity of various
species. This study worked with 75 (seventy five) samples of Candida, 49 (forty nine)
isolated from the oral cavity of AIDS patients (test group) and 26 (twenty six) volunteers
without clinical evidence of immunosuppression (control group). These samples were
evaluated in laboratory tests using nine different methodologies, as described in the literature.
The tests were: protease, phospholipase, gelatinase, hemolysis plate and hemolysis with
supernatant, adherence to material inert and HEp-2 cells, formation of biofilm and resistance
to serum. We observed that C. albicans (59.2%) was the most prevalent species in the test
group and C. parapsilosis (53.8%) in the control group. C. albicans was also significant
results for the production of protease (both groups) and phospholipase (test group). Since the
Candida non-albicans Candida (NCAC) species had highly significant results for biofilm
(both groups) and phospholipase (control group). For testing gelatinase, plate and supernatant
hemolysis, adhesion to inert material and HEp-2 cells and serum resistance, no was found
difference between C. albicans and NCAC species. Finally, we no found statistical difference
in any of the tests studied when compared the test group with the control group.
KEYWORDS: Candida, exoenzymes, adhesion, biofilm, serum resistance.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................................................. 12
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................................................... 14
2.1 Prevalência de Candida na mucosa oral ..................................................................................................... 14
2.2 Colonização e Patogenicidade .................................................................................................................... 14
2.3 Epidemiologia ............................................................................................................................................. 16
2.4 AIDS e colonização por Candida ............................................................................................................... 20
2.5 Enzimas hidrolíticas.................................................................................................................................... 21
2.6 Aderência e formação de biofilme .............................................................................................................. 22
2.7 Sistema complemento ................................................................................................................................. 24
3 OBJETIVOS ....................................................................................................................................................... 26
3.1 Geral ........................................................................................................................................................... 26
3.2 Específicos .................................................................................................................................................. 26
4 METODOLOGIA .............................................................................................................................................. 27
4.1 População e Amostra .................................................................................................................................. 27
4.1.1 Pacientes imunodeprimidos (Grupo teste) .......................................................................................... 27
4.1.2 Pacientes Imunocompetentes (Grupo controle) .................................................................................. 27
4.2 Análise dos Fatores de Virulência .............................................................................................................. 28
4.2.1 Produção de proteinase e fosfolipase .................................................................................................. 28
4.2.2 Produção de gelatinases ...................................................................................................................... 29
4.2.3 Produção de hemolisinas ..................................................................................................................... 29
Preparação de Células Vermelhas do Sangue de Carneiro - Red Blood Cells (RBCs)................................29
Análise da Atividade Hemolítica em Placas..................................................................................................29
Análise da Atividade Hemolítica com Sobrenadante das Colônias..............................................................30
4.3 Análise das Propriedades de Virulência ..................................................................................................... 30
4.3.1 Testes de Aderência ............................................................................................................................ 30
Adesão a material inerte................................................................................................................................31
Adesão em células HEp-2 (células epiteliais)................................................................................................32
4.3.2 Formação de Biofilme ......................................................................................................................... 32
4.3.3 Resistência ao Soro ............................................................................................................................. 33
4.4 Análise Estatística ....................................................................................................................................... 33
4.5 Aspectos Éticos da Pesquisa ....................................................................................................................... 34
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................................................ 35
5.1 Frequência e distribuição das amostras ....................................................................................................... 35
5.2 Atividade proteolítica em placa .................................................................................................................. 38
5.3 Teste de fosfolipase em placa ..................................................................................................................... 42
5.4 Testes de gelatinase .................................................................................................................................... 45
5.5 Atividade hemolítica em meio sólido ......................................................................................................... 47
5.6 Atividade hemolítica com sobrenadante ..................................................................................................... 50
5.7 Testes de aderência em lamínulas ............................................................................................................... 52
5.8 Testes de aderência em células HEp-2 ........................................................................................................ 56
5.9 Formação de biofilme ................................................................................................................................. 60
5.10 Resistência ao Soro ................................................................................................................................... 63
6 CONCLUSÃO.................................................................................................................................................... 65
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................................... 66
APÊNDICE A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.............................................................................79
APÊNDICE B - Protocolos de submissão do artigo...............................................................................................81
APÊNDICE C - Normas para Publicação da Revista de Patologia Tropical.........................................................82
APÊNDICE D - Artigo submetido à Revista de Patologia Tropical.......................................................................84
ANEXO A - Parecer de Aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa do UNICEUMA...........................................99
ANEXO B - Parecer de Aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa da UFMA....................................................103
ANEXO C - Certificado de apresentação de trabalho na VI Jornada Científica do HUUFMA...........................106
ANEXO D - Certificado de apresentação de trabalho na Semana Nacional de Ciência e Tecnologia.................107
ANEXO E - Certificado de apresentação de trabalho no Congresso Brasileiro dos Conselhos de Enfermagem.108
ANEXO F - Certificado de apresentação de trabalho no Congresso Brasileiro dos Conselhos de Enfermagem.109
ANEXO G - Certificado de apresentação de trabalho na XI Semana de Enfermagem do UNICEUMA.............110
ANEXO H - Certificado de apresentação de trabalho na 64ª Sociedade Brasileira para o Progresso da
Ciência...................................................................................................................................................................111
12
1 INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas a importância clínica das espécies de leveduras do gênero
Candida tem crescido significativamente devido ao aumento da incidência de infecções
oportunistas causadas por estes micro-organismos. Tais infecções têm gerado elevados índices
de morbidade, longo período de permanência em hospitais, dificuldade e alto custo de
tratamento, assim como altas taxas de mortalidade (FAVERO, 2008).
O aumento no número de infecções oportunistas causadas por fungos,
principalmente em indivíduos infectados pelo HIV, tem estimulado novas pesquisas para
esclarecer os fatores de virulência e as circunstâncias da patogenicidade das várias espécies
(WALMSLEY et al., 2001; VILLAÇA; MACHADO, 2004; SANTOS; SOARES, 2005).
A virulência do micro-organismo é o resultado de uma multiplicidade de fatores que
agem simultaneamente para vencer as defesas do hospedeiro. No caso da infecção por
Candida, estes fatores podem estar correlacionados com a aderência à célula epitelial, ao
dimorfismo, à capacidade de crescimento como formação de blastósporos, pseudo-hifas e
hifas, à produção de enzimas hidrolíticas (proteases e fosfolipases) (NAGLIK;
CHALLACONBE; HUBE, 2003), à produção de endotoxinas de baixa e alta massa
molecular, bem como a composição da parede celular, que facilita a adesão e a penetração
através do tecido infectado (SCHALLER et al., 2005).
Acredita-se que, na maioria das vezes, a candidíase tenha origem endógena, sendo
que a capacidade que as leveduras do gênero Candida têm para colonizar, penetrar e fazer
danos ao tecido do hospedeiro depende de um equilíbrio entre fatores de virulência deste
micro-organismo e fatores específicos ligados ao hospedeiro (COSTA, 2009).
O vírus HIV, além de destruir o principal linfócito, o T-CD4, produz uma série de
outros distúrbios causados por micro-organismos tidos como comensais, como são os casos
das leveduras do gênero Candida, que causam muito comumente nos pacientes portadores
desse vírus, a chamada candidíase oral (MACHADO et al., 2004).
A candidíase oral não é uma enfermidade mortal, mesmo que, ao provocar moléstias
de diferentes níveis comprometa o paladar e a deglutição, levando a uma diminuição do
apetite, principalmente nos casos de pacientes HIV-positivo ou de pacientes hospitalizados e
idosos. Entretanto, é a porta de entrada para complicações da candidíase do tipo orofaríngea,
esofágica, laríngea e sistêmica (BARBEDO; SGARBI, 2010).
13
Na última década, vários estudos mostraram uma correlação positiva significante
entre a ocorrência de candidíase e imunossupressão grave (SOARES et al., 2002; VARGAS;
JOLY, 2002; DE REPENTIGNY et al., 2004). Outros estudos investigaram a produção de
enzimas hidrolíticas - proteases, gelatinases, lipases e fosfolipases – por esses micro-
organismos (HUBE; NAGLIK, 2001; SILVA, 2006; MARDEGAN et al., 2006;
VERMELHO et al., 2006; OMBRELLA; RACCA; RAMOS, 2008). Entretanto, a maioria
desses estudos, além de serem grande parte somente sobre C. albicans, não mostra uma
correlação mais abrangente, com uma análise simultânea de diversos fatores e propriedades de
virulência.
Assim, há uma carência de estudos que analisem concomitante diferentes espécies
de Candida - especialmente espécies de Candida isoladas de pacientes imunodeprimidos,
como os portadores de AIDS, comparados a linhagens oriundas de indivíduos
imunocompetentes - com vários fatores de virulência, como proteinase, fosfolipase,
gelatinase, hemólise, resistência ao soro, adesão a material inerte e a células e formação de
biofilme, que é a proposta deste trabalho.
Portanto, estudos correlacionando a produção de fatores e propriedades de
virulência dessas leveduras entre esses dois grupos é relevante para uma melhor análise e
compreensão das manifestações clínicas provocadas por estes micro-organismos.
14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Prevalência de Candida na mucosa oral
Espécies de Candida encontram-se presentes como comensais em superfícies de
mucosas, na pele do homem e de outros animais. Estima-se que 20 a 50% da população
convivam com esta levedura na boca, sendo C. albicans prevalente entre 60 a 90% dos
isolados, C. tropicalis em 7% e em menor frequência C. krusei, C. guillermondii, C. glabrata,
C. parapsilosis, C. dubliniensis, C. kefyr e C. lusitaneae (MARDEGAN, 2003; BARROS,
2005).
Segundo Akpan e Morgan (2002), a incidência de C. albicans isoladas da cavidade
oral tem sido encontrada em 45% dos neonatos, 45-65% das crianças saudáveis, 30-45% dos
adultos saudáveis, 50-65% das pessoas com dentaduras removíveis, 65-88% das pessoas
internadas por longo período, 90% dos pacientes com leucemia aguda submetidos à
quimioterapia e 95% dos pacientes com o vírus HIV.
Estudos já comprovaram que um único hospedeiro pode ser colonizado tanto por
uma como por várias espécies de Candida ou ainda por diferentes genótipos da mesma
espécie, no mesmo ou em diferentes sítios do organismo (MARDEGAN, 2003; BARROS,
2005). Entretanto, há uma relação de equilíbrio entre Candida e o hospedeiro, que é
propiciada pela manutenção da integridade das barreiras teciduais, relação harmônica da
microbiota autóctone e funcionamento adequado do sistema imunológico humano. Em
contrapartida, há por parte da levedura um equilíbrio na capacidade de aderência e produção
de enzimas e toxinas (VIEIRA et al., 2005).
2.2 Colonização e Patogenicidade
As leveduras do gênero Candida podem ser espécies comensais ou oportunistas.
Como comensais vivem normalmente na pele e nos tratos gastrointestinal e genitourinário
(ENOCH et al., 2006). Como oportunista, aproveitam-se de fatores como rompimento das
barreiras cutânea e mucosa, disfunção dos neutrófilos, defeito na imunidade mediada por
células, desordem metabólica, exposição direta aos fungos, extremos de idade (recém-
nascidos e idosos), desnutrição aguda, longo tratamento com antibióticos, quimioterapia,
transplantes, resistência a antifúngicos, dentre outros (BARBEDO; SGARBI, 2010).
15
A colonização é o maior fator de risco à infecção fúngica. Ocorre inicialmente na
cavidade oral seguida da intestinal (MANZONI et al., 2007; CATE et al., 2009). C. albicans é
a espécie mais relacionada com os processos de colonização e patogenicidade na boca do
homem. Essa habilidade é decorrente da: 1) acentuada capacidade de dimorfismo morfológico
e 2) produção de exoenzimas facilitadoras da interação do fungo às células do hospedeiro,
propiciando a 3) aderência e 4) a penetração ao tecido afetado. Ainda, a formação de tubo
germinativo e hifas aumentam a resistência aos fagócitos devido às dimensões físicas
(SAMARANAYAKE; SAMARANAYAKE, 2001). Todas essas etapas são consideradas
relevantes na patogênese da candidíase em mucosa (XU et al., 2000).
O crescimento e multiplicação das espécies de Candida ocorre de forma endógena e
exógena. Como fonte endógena, esses micro-organismos tem como nutrientes a saliva, que
fornece aminoácidos, peptídeos, vitaminas, gases e glicopeptídeos, e estabelecem cadeias
alimentares com o propósito de melhor aproveitar os nutrientes presentes na boca. Já a fonte
exógena de nutrientes é a dieta, sendo os carboidratos substâncias orgânicas que influenciam
diretamente na microbiota bucal (PIMENTA et al., 2001). Por outro lado, importantes
enzimas salivares como a lactoferrina, lisozima e outras exercem ação inibidora sobre a
multiplicação de C. albicans, por exercer ação quelante sobre o ferro, que é um elemento
essencial para a multiplicação dessa levedura (URIZAR, 2002).
O pH da boca, regulado pela saliva, oscila entre 6,75 a 7,25. O consumo frequente de
carboidratos leva a uma diminuição dessa pH devido à produção de ácidos e, posteriormente,
retorna aos valores fisiológicos - capacidade tampão da saliva (SIMMONDS; TOMPKINS;
GEORGE, 2002). C. albicans suporta um amplo espectro de variação de pH entre 2,5 a 7,5
(PARDI; CARDOZO, 2002) e sua virulência é favorecida pela temperatura corporal de 37 C
(SIDRIM; ROCHA, 2004).
C. albicans pode causar uma ampla gama de doenças como aftas, estomatite crônica
atrófica, candidíase mucocutânea crônica, vulvovaginite e candidíase invasiva, que é a mais
grave (EGGIMANN; GARBINO; PITTET, 2003).
Um estudo em pacientes com candidíase oral e controles saudáveis mostrou que a
candidíase oral está associada à hipofunção de glândulas salivares que excretam proteínas e
peptídeos microbianos, ou seja, indivíduos com hipofunção nessas glândulas estariam mais
propensos a apresentar candidíase oral (TANIDA et al., 2003).
16
2.3 Epidemiologia
A história das infecções por Candida é relativamente recente: apenas em 1861 foi
descrito o primeiro caso de infecção invasiva por Candida, embora relatos escritos de lesões
orais compatíveis com candidíase datem da época de Hipócrates e Galeno (PASQUALOTTO.
2004).
Há ainda poucos dados sobre a incidência de infecções fúngicas no Brasil e em
países da América Latina em geral. Mas, segundo Colombo et al. (2007), as infecções por
Candida respondem por 80% de todas as infecções fúngicas documentadas no ambiente
hospitalar, incluindo infecções de corrente sanguínea, do trato urinário e do sítio cirúrgico.
Em um de seus estudos, conduzido em 11 Centros Médicos do Brasil, das regiões sul e
sudeste, observou-se uma taxa de incidência de candidemia da ordem de 2,49 casos por 1.000
admissões hospitalares, sendo Candida spp o quarto agente mais frequente entre as infecções
de corrente sanguínea (COLOMBO et al., 2007). Ainda segundo Colombo, nossas taxas de
infecção de corrente sanguínea por Candida spp são muitas vezes superiores àquelas relatadas
pela maioria dos hospitais terciários dos EUA e Europa, onde se observa 1 episódio de
candidemia para cada 1.000 admissões hospitalares, relatadas na maior parte das séries já
publicadas.
No Brasil, Colombo (2000) conduziu um estudo para identificar as características
epidemiológicas de pacientes que desenvolvem candidemia em hospitais brasileiros. O estudo
ocorreu durante um período de 22 meses em seis Hospitais Universitários do Rio de Janeiro e
São Paulo. Houve 145 episódios de fungemia, com a prevalência das seguintes espécies C.
albicans (37%), C. parapsilosis (25%), C. tropicalis (24%), C. rugosa (5%) e C. glabrata
(4%). A distribuição por sexo foi semelhante, sendo a média e mediana de idade dos pacientes
32 e 34,3 anos, respectivamente. O tempo decorrido entre a internação e a primeira cultura de
sangue positiva para Candida spp foi de 14 dias.
Novamente um estudo epidemiológico conduzido por Colombo e colaboradores
(2003) reuniram dados sobre infecções da corrente sanguínea, em quatro hospitais da cidade
de São Paulo. Durante um período de 12 meses (março-2002 a fevereiro-2003), um total de
7038 episódios de bacteremias e fungemias foram avaliados, sendo que Candida spp
respondeu por 4,3% do total das infecções de corrente sanguínea.
17
Em um estudo realizado por Passos et al. (2007), em Goiânia, foi verificado 33 casos
de candidemia (9,6%) em 345 pacientes da UTI, durante o período de abril de 2003 a março
de 2005, em um Hospital Universitário.
Em 2006, Sandven et al., em um estudo entre 1991 e 2003, na Noruega, com um total
de 1415 casos de candidemia, encontraram C. albicans em 69,8% dos casos; C. glabrata em
13,2%; C. tropicalis em 6,7%; C. parapsilosis em 5,8%; C. krusei em 1,6%; C. dubliniensis,
C. guilliermondii e C. norvegensis em 0,6% dos casos, cada; C. kefyr em 0,5% dos casos e
outras espécies (C. blankii, C. inconspícua, C. lusitaniae, C. sake e C. sphaerica) que juntas
alcançaram 0,5%. O estudo ainda mostrou que os pacientes mais acometidos eram os com
menos de 1 ano de vida e aqueles com mais de 60 anos.
Diekema et al. (2002), no estado de Lowa (EUA), identificaram uma taxa de
incidência anual de candidemia de 6 casos para cada 100.000 mil habitantes, bem inferior ao
observado no Brasil por Colombo et al. (2007), citado anteriormente. Nos Estados Unidos,
Candida spp são a quarta maior causa de infecções hospitalares, responsáveis por 35% da
mortalidade por infecções sistêmicas (CALDERONE; GOW, 2002).
O gênero Candida é constituído por cerca de 200 espécies, sendo que apenas 17
delas têm sido relacionadas a casos de micoses humanas. Em relação aos aspectos
epidemiológicos, a identificação de leveduras ao nível de espécie é etapa fundamental para
monitorização das taxas de infecção hospitalar bem como para a identificação precoce de
surtos de infecções por Candida. Entretanto, a maioria destas leveduras não apresenta forma
sexuada conhecida, sendo sua identificação ao nível de espécie obtida através da análise de
suas características micromorfológicas e perfil bioquímico (COLOMBO, 2007).
As principais espécies de interesse clínico são: C. albicans, C. parapsilosis, C.
tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. guilliermondii e C. lusitaniae. Entretanto, um número
progressivo de casos de doenças superficiais e invasivas relacionados a espécies emergentes
de Candida tem sido descrito, envolvendo isolamentos de C. dubliniensis, C. kefyr, C. rugosa,
C. famata, C. utilis, C. lipolytica, C. norvegensis, C. inconspicua, entre outras (COLOMBO,
2007). Abaixo, uma breve descrição sobre cada uma delas.
C. albicans é a espécie mais frequentemente isolada de infecções superficiais e
invasivas em diversos sítios anatômicos e como causa de candidíase em todas as partes do
mundo. É a espécie de Candida com maior conhecimento patogênico, devido à diversidade de
fatores de virulência descobertos. Habitualmente se considera que a origem de C. albicans
18
causadora de infecções seja a microbiota do trato digestivo humano (organismo comensal),
porém diversos casos têm sido relatados de forma horizontal (BARBEDO; SGARBI, 2010).
C. tropicalis, nos países da América Latina, é a segunda ou terceira na causa de
candidemias em adultos, especialmente em pacientes com linfoma, leucemia, complicações
hematológicas malignas, diabetes mellitus e câncer. Em contraste, é raro encontrar esta
espécie em neonatos (colonização mucocutânea), porém o potencial de transmissão
nosocomial é considerado. Diferentemente de C. albicans, que está associada à microbiota, a
detecção de C. tropicalis é associada à infecção. C. tropicalis apresenta-se mais virulenta que
C. albicans em pacientes com complicações hematológicas malignas e infecções
disseminadas, portanto, com uma alta taxa de mortalidade (COLOMBO; GUIMARÃES,
2003; COLOMBO, 2007; BARBEDO; SGARBI, 2010).
C. glabrata, nas duas últimas décadas, aumentou significativamente como agente de
infecções em seres humanos em consequência do uso indiscriminado de drogas
imunodepressoras e com o advento da AIDS, chegando a ser o segundo ou terceiro patógeno
em casos de candidíases, principalmente em ambientes hospitalares. Comparando-se a
mortalidade entre outras espécies de Candida não-Candida albicans (NCAC, do inglês non-
Candida albicans Candida), a mortalidade por C. glabrata é relativamente alta. Mais
especificamente, a mortalidade é em torno de 50% em pacientes com câncer e 100% quando
em complicações de transplante de medula óssea. C. glabrata emerge como um notável
agente patogênico de mucosa oral e pode promover infecção concomitante com C. albicans e,
em paciente com câncer ou com o vírus HIV, associada à infecção orofaríngea, pode ser mais
severa e mais difícil de ser tratada que infecções por C. albicans. Outro aspecto interessante
sobre a epidemiologia deste patógeno é sua maior ocorrência em pacientes idosos
(COLOMBO; GUIMARÃES, 2003; BARBEDO; SGARBI, 2010).
Candida parapsilosis aparece, desde os anos 80, como um importante patógeno
hospitalar em fungemias, sendo responsável por 7% a 10% das candidemias nos EUA.
Caracteristicamente, esta levedura prolifera-se em soluções contendo glicose e
frequentemente coloniza a pele, sendo, portanto causa comum de fungemias em pacientes
submetidos à cateterização venosa central, uso de alimentação parenteral, pacientes
transplantados e prévia terapia antifúngica. Em alguns hospitais infantis, C. parapsilosis
torna-se predominante em candidemias, chegando a prevalecer em 17 a 50% dos casos. A
habilidade de produção de biofilmes está intimamente ligada à doença e é morfologicamente
19
diferente de C. albicans (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003; COLOMBO, 2007; BARBEDO;
SGARBI, 2010).
Candida krusei tem-se mostrado como um patógeno hospitalar ocasional,
particularmente em pacientes portadores de doenças hematológicas malignas ou expostas a
transplante de medula óssea. C. krusei apresenta uma plasticidade com respeito a desenvolver
resistência a antifúngicos, e assim como a C. glabrata, é considerada uma importante espécie
a ser monitorada com relação à resistência antifúngica (COLOMBO, 2007; BARBEDO;
SGARBI, 2010).
Infecções por C. guilliermondii ainda não são frequentes, porém é um agente de
candidíase que vem sendo descrito como emergente. Muitos casos de infecção por esta
espécie estão associados a onicomicoses, pacientes com câncer, neutropênicos, pacientes
acometidos de cirurgias, transplantes, e em pacientes em tratamento intensivo. Muitas
linhagens de C. guilliermondii são morfológica e bioquimicamente semelhantes à C. famata, e
métodos baseados em ácido nucleico são utilizados para distinguir as duas espécies.
Globalmente, C. guilliermondii ocorre em 2% dos casos de candidemia, todavia em
determinadas regiões geográficas como Itália, Índia e Brasil, este índice pode chegar a 10%
dos casos (MEDEIROS, 2007; BARBEDO; SGARBI, 2010).
C. inconspicua é relatada em pacientes imunodeprimidos com infecções virais,
infecções orais ou esofágicas, infecções vaginais e em pacientes com diabetes mellitus
(BARBEDO; SGARBI, 2010).
Infecções por C. norvegensis não são comuns. O primeiro isolado foi na Noruega,
em três pacientes com asma, aproximadamente há 70 anos. O primeiro caso verificado de
infecção clínica ocorreu em 1990, quando um quadro de doença invasiva, em paciente
imunodeprimido devido a transplante renal, culminou em peritonite. Esta espécie de Candida
pode ser de difícil identificação quando em presença de C. inconspicua e C. krusei. De acordo
com a bioquímica, C. norvegensis hidrolisa a esculina, enquanto a C. inconspicua e a C.
krusei, não. A identificação por métodos tradicionais pode ser contraditória, salvo por análise
de DNA (BARBEDO; SGARBI, 2010).
C. dubliniensis é uma espécie similar fenotipicamente, porém, geneticamente distinta
de C. albicans (MARIANO et al., 2003). Essa espécie demonstra maior frequência de
alterações fenotípicas, com produção significativamente menor de proteinases e fosfolipases
que isolados de C. albicans. A espécie C. dubliniensis tem demonstrado grande capacidade de
20
aderir-se às mucinas, células do epitélio oral. Na maioria dos casos é isolada da mucosa de
pacientes infectados pelo HIV (MILAN; SANTANA; MELO, 2001; PEREA; LÓPEZ-
RIBOT; WICKES, 2002).
Candida lusitaneae é uma levedura raramente isolada, provavelmente de aquisição
endógena, que tem sido relatada como agente de candidemia em pacientes
imunocomprometidos ou admitidos em Unidades de Terapia Intensiva – UTI – com múltiplos
procedimentos invasivos. É isolada em menos de 1% das amostras nosocomiais, chegando a
2% das fungemias (COLOMBO, 2007; BARBEDO; SGARBI, 2010).
2.4 AIDS e colonização por Candida
Desde a identificação do primeiro caso, em 1980, até novembro de 2011, foram
notificados 608.230 casos de AIDS no Brasil, segundo informações do último Boletim
Epidemiológico do Programa Conjunto das Nações Unidas sobre o HIV/AIDS - UNAIDS.
Atualmente estima-se que 630 mil pessoas convivam com o HIV/AIDS no nosso país, mas
parte delas, algo em torno de 255 mil, não sabe disso ou nunca fez o teste do HIV (BRASIL,
2010; BRASIL, 2011). Ainda de acordo com esse Boletim houve 2,6 milhões (de 2,3 a 2,8
milhões) de novas infecções pelo HIV no mundo, totalizando 33,3 milhões de pessoas
infectadas e 1,8 milhões (de 1,6 a 2,1 milhões) de óbitos relacionados à AIDS.
A principal causa da progressão da AIDS é o declínio dos linfócitos TCD4+,
responsável pela resposta imunológica específica humoral e mediada por células. Com a
depleção do sistema imune, o indivíduo infectado torna-se susceptível a infecções
oportunistas e outras doenças que podem levar a morte (SIERRA; KUPFER; KAISER, 2005).
Dentre as infecções oportunistas, as manifestações orais são as mais comuns e
constituem indício de que o estado geral de saúde encontra-se debilitado, sugerindo um pior
diagnóstico da doença. As doenças bucais associadas a esta infecção também podem
funcionar como parâmetro para o status imunológico do paciente, sendo a contagem de
linfócitos TCD4+ e a carga viral os melhores parâmetros laboratoriais para se avaliar a
progressão da doença (BRAVO et al., 2006).
Os fatores que predispõem o surgimento de lesões orais relacionadas ao HIV incluem
a contagem de células TCD4+ abaixo de 200 cel/mm3 e níveis de RNA do HIV no plasma
acima de 300 cópias/μl, além de xerostomia, higiene oral deficiente e fumo (REZNIK, 2006,
BRAVO, 2006). As lesões bucais mais comuns são: candidíase, leucoplasia pilosa, gengivite,
21
periodontite e sarcoma de Kaposi. Dessas, a candidíase e as doenças periodontais são as mais
frequentes (SOUZA et al., 2000; PORTELA, 2000).
De forma geral, os indivíduos com AIDS apresentam grande susceptibilidade em
desenvolver infecções fúngicas devido ao baixo número dos linfócitos TCD4+. Nesses
pacientes, a candidíase ocorre com uma prevalência de 80 a 95% (AKPAN; MORGAN, 2002;
CLARK; HAJJEH, 2002).
Em um estudo transversal, do tipo caso-controle, com 50 crianças infectadas pelo
HIV e 44 crianças sem evidências clínicas de imunossupressão, Portela (2004) demonstraram
uma frequencia de isolamento de Candida spp maior no grupo HIV positivo.
Sant´ana et al. (2002) isolaram amostras de Candida de 130 pacientes portadores de
AIDS, cuja média de linfócitos T era de 42 cel/mm3. Metade dos pacientes (50%) apresentou
candidíase oral pela primeira vez, 35% já tinham tido cinco episódios e 15%, mais de cinco
ocorrências. C. albicans foi isolada em 91% dos pacientes.
2.5 Enzimas hidrolíticas
A habilidade em produzir enzimas hidrolíticas é considerada um importante fator de
virulência, sendo as principais enzimas produzidas pelo gênero Candida, as proteinases, que
hidrolisam ligações peptídicas e as fosfolipases, que hidrolisam os fosfoglicerídeos. Estas
exoenzimas parecem exercer papel importante na invasão da célula do hospedeiro.
(CANDIDO; AZEVEDO; KOMESU, 2000).
O estudo destas enzimas é mais frequentemente descrito em C. albicans, onde se
sabe que elas desempenham um papel central na patogenicidade da candidíase
(SANDOVSKY-LOSICA; SEGAL, 2006). Entretanto, pouco se sabe sobre a produção e
secreção dessas exoenzimas por espécies NCAC e seu subsequente papel na patogenicidade.
Dentre os determinantes de virulência, tem-se a secreção de proteases ácidas, pelos
genes denominados Secreted aspartyl proteinases (Saps), muito importante e bem conhecido
em C. albicans, que facilita a invasão e colonização de tecidos hospedeiros pela ruptura das
mucosas e degrada importantes proteínas de defesa imunológica e estrutural (SÓNIA SILVA,
2010). As proteinases são capazes de degradar proteínas como albumina, hemoglobina,
queratina, colágeno, mucina, lactoferrina, lactoperoxidase e imunoglobulinas como as da
classe IgA (NAGLICK et al., 2003; DA COSTA, 2009). Já foram identificados dez genes
22
Saps em C. albicans (HUBE; NAGLIK, 2001), quatro em C. tropicalis (ZAUGG et al., 2001)
três em C. parapsilosis (MERKEROVA et al., 2006) e nenhum em C. glabrata (SÓNIA
SILVA, 2010).
Semelhantes às SAPs, as enzimas categorizadas como fosfolipases (PLs, do inglês
phospholipases) também são consideradas fatores de patogenicidade em Candida. PLs são
enzimas que hidrolisam os fosfolipídios e os ácidos graxos e são classificadas em PLs A, B, C
e D (MUKHERJEE et al., 2001). Vários estudos já mostraram que espécies NCAC são
capazes de produzir fosfolipases extracelular (BORST; FLUIT, 2003; MOHAN; BALLAL,
2008; D’EÇA JÚNIOR et al., 2011). Além disso, a produção de fosfolipases em grandes
quantidades está relacionada a um alto grau de patogenicidade, aumento da aderência às
células do hospedeiro e elevado percentual de mortalidade em modelos animais
(IVANOVSKA, 2003).
A enzima gelatinase, também chamada de metaloendopeptidase extracelular é
codificada pelo gene gelE, e hidrolisa a gelatina, colágeno, caseína, hemoglobina e outros
compostos bioativos (VERGIS et al., 2002). Porém, este gene também já foi encontrado em
amostras que não apresentavam a atividade de gelatinase, ou seja, havia os genes, mas eles
não eram expressos (genes silenciosos ou dormentes). Em contrapartida, a liquefação da
gelatina também já ocorreu por linhagens de bactérias que não continham esses genes,
sugerindo que existam outros genes responsáveis por essa atividade (CAMARGO, 2005).
Sobre esta enzima não foram encontrado resultados publicados relacionados a espécies de
Candida.
A atividade hemolítica é outro fator de virulência que contribui para a patogênese da
candidíase. A hemolisina é usada pelas espécies de Candida para degradar a hemoglobina ou
hemina e extrair o ferro das células do hospedeiro, facilitando, assim, a invasão de hifas numa
candidíase disseminada (LUO; SAMARANAYAKE; YAU, 2001; SÓNIA SILVA, 2010).
2.6 Aderência e Formação de Biofilme
A aderência às células epiteliais do hospedeiro é o primeiro passo para a colonização
da levedura. Isso ocorre devido à capacidade deste micro-organismo reconhecer proteínas
extracelulares, tais como laminina, colágeno e fibrina, presente na superfície das células da
mucosa do hospedeiro (BIASOLI et al., 2002).
23
São múltiplos os mecanismos usados pelas espécies de Candida para aderir (SAN et
al., 2000). Um desses mecanismos é através das adesinas de uma família do gene ALS
(agglutinin-like sequence), conhecida em C. albicans, que codifica diferentes glicoproteínas
de superfície celular implicadas no processo de adesão em superfícies do hospedeiro
(BARBEDO; SGARBI, 2010). Em C. glabrata, uma grande parte das adesinas é codificada
por genes da família EPA (epithelial adhesin), com estrutura global semelhante à família do
gene ALS (SÓNIA SILVA, 2010).
Quando aderidas à superfície de mucosas da boca, Candida spp tornam-se um
importante fator de virulência para candidíase oral. Estudos relatam que a capacidade de
aderência apresentada por várias espécies de Candida é diferente entre elas. Este fato poderia
explicar porque a colonização da superfície de mucosas é mais comum por algumas espécies
do que em outras (JABRA-RIZK, 2001; DE REPENTIGNY, 2000).
Estudos sobre a influência da saliva na aderência de Candida são contraditórios. Para
alguns autores, a saliva e seus componentes salivares como lisozima, histatina, lactoferrina,
calprotectina e sIgA interagem com essas leveduras, diminuindo a aderência das mesmas à
superfícies bucais (TANIDA et al., 2001; DODDS; JOHNSON; YEH, 2004), enquanto
componentes como mucina (DODDS; JOHNSON; YEH, 2004) e estaterina (JOHANSSON et
al., 2000) facilitam a adsorção de C. albicans em resina acrílica e materiais resilientes. Já,
Koseki et al. (2004) encontraram maior prevalência de C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis
e C. krusei em pacientes com diminuição do fluxo salivar, incluindo pacientes com Síndrome
de Sjögren e Síndrome de Stevens-Johnson.
Quando em dispositivos médicos, a aderência de Candida facilita o aparecimento de
candidemia e a formação de uma massa de micro-organismos denominada de biofilme. A
formação de biofilme nesses dispositivos tem sido descrito como uma importante fonte de
infecção. Dentre esses dispositivos, os relativos ao trato urinário são os mais comuns, como
os catéteres, causando as chamadas Infecções do Trato Urinário - ITU (TAMURA;
GASPARETTO; SVIDZINSKI, 2003; FALLEIROS DE PÁDUA et al., 2008; UPPULURI et
al., 2009).
Para Silva et al. (2010), o maior fator de virulência é a capacidade do micro-
organismo de adaptar-se a uma variedade de diferentes habitats e, posteriormente formar uma
comunidade microbiana aderida à superfície, conhecido como biofilme.
24
Nos biofilmes são encontrados leveduras, pseudo-hifas e hifas verdadeiras. A
habilidade de formar biofilmes está intimamente associada à capacidade de causar infecções,
podendo ser considerada um importante fator de virulência, pois biofilmes estão associados à
resistência contra o sistema imune do hospedeiro e a antifúngicos (CHANDRA et al., 2001;
RAMAGE et al, 2005; AULER et al., 2009).
A formação de biofilme ocorre em três etapas. A primeira fase consiste na aderência
do micro-organismo na superfície; a segunda é caracterizada pela formação da matriz, onde
ocorre a mudança da levedura para a forma de pseudo-hifa; e a terceira por um aumento da
matriz, com a formação de uma estrutura tridimensional (fase de maturação). Espécies de
Candida que formam biofilme apresentam maior resistência às defesas do hospedeiro e
também à terapia antifúngica, devido à limitada penetração dessas drogas através da matriz.
C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. glabrata são espécies que têm capacidade de
formar biofilme e nesses casos tem sido associados com altos índices de morbidade e
mortalidade (KOJIC; DAROUICHE, 2004; TROFA; GÁCSR; NOSANCHUCK, 2008).
2.7 Sistema complemento
O sistema complemento surgiu há cerca de 600 a 700 milhões de anos e é uma das
pontes entre a imunidade inata e a imunidade adaptativa. O termo complemento foi dado por
Ehrlich no final do século XIX, referindo-se a algo evidenciado por um conjunto de
experimentos realizados por ele mesmo e outros pesquisadores, como Pfeiffer, Mentchikoff e,
de modo especial, Bordet. Nesses experimentos, ao se colocar vibriões coléricos vivos em
contato com o soro fresco de camundongos infectados com essa bactéria, observou-se a morte
dos vibriões por meio de lise. Quando se utilizou o soro dos camundongos infectados
aquecidos até 56 °C, não houve lise das bactérias. A lise, entretanto, era recuperada quando se
adicionava novo soro fresco ao experimento. Assim, no soro fresco havia uma substância
termolábil que complementava a destruição das bactérias e que, por tal razão, foi chamada de
complemento (LEVY; CHIOCCOLA, 2007).
O complemento é um sistema composto de cerca de 30 proteínas que circulam
livremente no organismo de forma inativa. Por ocasião de diferentes mecanismos imunes,
essas proteínas são convenientemente ativadas formando um sistema de cascata, no qual o
produto de uma reação age como uma enzima sobre o outro. As proteínas do complemento
25
surgem durante o desenvolvimento fetal e são detectadas antes mesmo do surgimento de IgM.
São sintetizadas em diferentes células e órgãos, como nos macrófagos (C1q), hepatócitos
(C1r, C1s) no fígado (C2, C3, C4, C5, C6, C9), monócitos (properdina), epidídimo
(clusterina), entre outros. (WOLFGANG et al., 2003; LEVY; CHIOCCOLA, 2007).
Embora o sistema complemento seja responsável por diversas funções no sistema
imune, tais como aumento de fagocitose, quimiotaxia e desgranulação de mastócitos, a função
mais conhecida é a lise, que pode ocorrer por três vias diferentes: a via clássica, a alternativa e
a via das lectinas (WOLFGANG et al., 2003; LEVY; CHIOCCOLA, 2007).
C. albicans é um potente ativador do sistema complemento. As opsoninas
termolábeis produzidas pela ativação de C3 (C3b e iC3b) melhoram a fagocitose desta
levedura mediada pelos receptores do complemento (SANTOS et al., 2002).
26
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Analisar os fatores e propriedades de virulência de espécies de Candida provenientes
da mucosa oral de pacientes com AIDS e de indivíduos imunocompetentes.
3.2 Específicos
Identificar as amostras de Candida provenientes dos pacientes com AIDS e dos
indivíduos imunocompetentes;
Analisar a expressão das exoenzimas pelos diferentes isolados de Candida;
Verificar a capacidade de adesão em material inerte e em células HEp-2 pelas espécies
de Candida;
Avaliar a formação de biofilme entre as amostras;
Identificar as cepas resistentes ao soro;
Comparar os fatores e propriedades de virulência entre C. albicans e espécies NCAC;
Comparar a produção de fatores de virulência de espécies de Candida isoladas de
pacientes com AIDS e de pacientes sem evidências clínicas de imunossupressão;
Relacionar a produção das exoenzimas, capacidade de adesão celular, formação de
biofilme e resistência ao soro com patogenicidade;
Identificar possíveis associações entre os fatores e propriedades de virulência
estudados.
27
4 METODOLOGIA
4.1 População e Amostra
4.1.1 Pacientes imunodeprimidos (Grupo teste)
Para o grupo teste, participaram da pesquisa 42 (quarenta e dois) pacientes com
AIDS – 17 mulheres e 25 homens – com idade entre 22 e 61 anos, sob condições de terapia
anti-viral e antifúngica, internados no Hospital Presidente Vargas, na cidade de São Luís -
MA.
As leveduras foram coletadas com o auxílio de “swabs” estéreis e posteriormente
crescidas em Ágar Sabouraud Dextrose (SDA) com cloranfenicol. Para o estoque, as cepas
foram mantidas em caldo BHI (infusão de cérebro e coração), acrescido de 15% de glicerol a -
20 ºC (SAMBROOK; FRTSCH; MANIATIS, 2002).
As amostras foram coletadas durante a realização da primeira parte da Tese de
Doutorado da Msc. Analúcia Guerra Terças (Projeto Avaliação do Extrato da Folha da
Goiabeira no Tratamento da Candidíase Oral em Ratos Imunossuprimidos; nº processo CEP
23115006540/2009-40 UFMA) e gentilmente cedidas pela mesma para a Coleção de Isolados
Fúngicos do Laboratório de Micologia da Universidade Ceuma.
Os isolados foram previamente identificados pelo meio cromogênico CHROMagar
Candida® (BioMerieux, França), um método presuntivo de identificação de Candida, e,
posteriormente, pelo método automatizado VITEK YBC (BioMerieux, França).
4.1.2 Pacientes Imunocompetentes (Grupo controle)
Cento e nove voluntários sem evidências clínicas de imunossupressão e negativos
para o vírus HIV e outras patologias imunossupressoras participaram da busca de Candida
spp de amostras bucais (PARECER CEP 226/2010). Destes, 67 eram mulheres e 42 homens,
com idades entre 15 e 64 anos.
A coleta consistiu no uso de “swabs” estéreis para retirada de saliva da região
retromolar do aparelho bucal e inoculação imediata em tubos de ensaio estéreis contendo
28
BHI. As amostras foram incubadas a 37 ºC por 24 horas para crescimento e posterior
isolamento em SDA acrescido de cloranfenicol.
Para o estoque e identificação das cepas, fez-se o mesmo procedimento do citado no
item 4.1.1. Na comparação de dados foi incluída nos experimentos a linhagem padrão C.
albicans ATCC 18804 (Rockville, Md).
4.2 Análise dos Fatores de Virulência
4.2.1 Produção de Proteinase e Fosfolipase
A determinação da produção de proteinases foi realizada de acordo com Aoki et al.
(1990). O meio teste consistiu de placas com ágar contendo BSA. Foram utilizados 60 ml de
solução contendo 0,04 g de MgSO4, 0,5 g de K2HPO4, 1 g NaCl, 0,2 g de extrato de levedura,
4 g de glicose e 0,5 g de BSA (fração V Sigma Aldrich Brasil), completado o volume com
água destilada estéril. O pH foi ajustado para 4,0 e a solução esterilizada por filtração em
fluxo laminar. Posteriormente essa solução foi misturada a 140 ml de ágar bacteriológico e
distribuídos em placas estéreis.
A produção de fosfolipases foi analisada de acordo com o método em placa com
gema de ovo descrito por Price, Wilkinson e Gentry (1982). O meio consistiu de SDA
acrescido de 17,19 g de cloreto de sódio, 0,16 g de cloreto de cálcio e 9 g de glicose. O meio
foi autoclavado e posteriormente, 30% de emulsão de gema de ovo foi adicionado de forma
asséptica.
Para ambos os testes, as amostras foram isoladas em solução salina (NaCl 0,85%)
estéril para preparo da solução de inóculo equivalente à escala 0,5 de McFarland. Dessa
suspensão foram retirados 3 μl e inoculadas na superfície do meio, sendo incubadas por 7 dias
a 37 ºC. A produção das enzimas foi observada pela formação de um halo transparente - para
proteinase - e opaco - para fosfolipase - ao redor da colônia da levedura.
Os testes foram feitos em triplicatas e o valor da zona de precipitação (Pz) foi dado
como a média dos diâmetros avaliados (colônia / halo + colônia). A produção foi classificada
de acordo com o valor do Pz em muito forte ++++ (Pz ≤ 0,69), forte +++ (Pz entre 0,70 –
0,79), média ++ (Pz entre 0,80 – 0,89) ou fraca + (Pz entre 0,90 – 0,99).
29
4.2.2 Produção de gelatinases
Para os testes de produção de gelatinase, as amostras de Candida foram previamente
crescidas em SDA por 24 horas e inoculadas em tubos (semeadas em profundidade) contendo
1 ml de uma solução de gelatina a 12%, preparados em PBS (tampão salina fosfato) (pH 7,4)
e armazenados por 24 horas em geladeira. Após as amostras serem semeadas nos tubos com a
solução de gelatinase e incubadas a 37 ºC por 24 horas foram novamente colocadas em
geladeira por um período de 4 horas. Decorrido esse tempo, a atividade da gelatinase foi
observada quando ocorreu a liquefação da gelatina (WILSON, 1930, com adaptações).
4.2.3 Produção de hemolisinas
Preparação de Células Vermelhas do Sangue de Carneiro - Red Blood Cells (RBCs)
Sangue de carneiro desfibrinado (7 ml) foi centrifugado a 3200 rpms por 5 minutos e
o sobrenadante descartado. As células vermelhas foram ressuspendidas em 10 ml de PBS e
lavadas por centrifugação, sendo este processo repetido três vezes. Por fim, as RBCs foram
ressuspendidas em 5 ml de PBS e adicionadas a 100 ml de SDA, acrescido de cloranfenicol e
3% de glicose.
Análise da Atividade Hemolítica em Placas
A produção do fator hemolítico em placa foi avaliada pelo método descrito por Luo,
Samaranayake e Yau (2001) considerando algumas adaptações de Manns, Mosser e Buckley
(1994) e outras. Os isolados, mantidos em BHI-glicerol a -20 ºC foram pré-cultivados por
estrias em placas de SDA acrescidas de cloranfenicol por 24 horas a 37 ºC. As colônias foram
isoladas em solução salina (NaCl 0,85%) estéril para preparo de solução de inóculo
equivalente a escala 0,5 de McFarland. Dessa suspensão foram retirados 3 μl e inoculados em
ágar-hemácias (5%).
As placas foram incubadas por 48 horas a 37 ºC. A presença de um halo transparente
ao redor da colônia indicou atividade hemolítica positiva. A intensidade da produção do fator
hemolítico foi estimada dividindo-se o diâmetro da zona do halo mais a colônia pelo tamanho
da colônia. Os experimentos foram feitos em triplicatas e o resultado uma média dos valores
30
obtidos. A classificação foi feita de acordo com o Índice Hemolítico (IH): positiva (IH: 1,00 a
1,5); fortemente positiva (IH>1,5).
Análise da Atividade Hemolítica com Sobrenadante da Cultura
Para análise da produção de fator hemolítico no sobrenadante, utilizou-se o método
descrito por Bhakdi et al. (1986), com algumas modificações. As amostras foram previamente
incubadas em estufa a 37 ºC por 48 horas, nos seguintes meios: BHI, BHI acrescido de FeCl3
(cloreto férrico - 10 mM), BHI acrescido de 12,5 μg/ml de EDDA (ácido etileno diamino di-
orto- hidroxifenil acético), BHI acrescido de CaCl2 (cloreto de cálcio - 10 mM), BHI
acrescido de 10 mM de EDTA (ácido etileno diamina tetra acético).
Das culturas de leveduras crescidas nesses diferentes meios, foram retirados 1000 μL
do sobrenadante e centrifugados três vezes (3200 rpm), retirando sempre o sobrenadante e
desprezando o pellet. Por fim, uma alíquota de 100 μL da suspensão de hemácias de sangue
de carneiro a 1%, previamente lavadas três vezes em tampão PBS (pH 7,4) foi adicionada a
100 μL (proporção 1:1) do sobrenadante dos cultivos leveduriformes em microplacas de 96
poços de fundo redondo. Para o controle positivo foi usado hemácias acrescidas de água e
para o controle negativo, usou-se hemácias com cada um dos cinco meios analisados na
mesma proporção (1:1). As microplacas foram incubadas em estufa a 37 °C por 1 hora para
posterior leitura visual. O resultado para hemólise com sobrenadante foi considerado negativo
quando ocorreu formação de um botão de hemácias no fundo da microplaca; e, positivo na
ausência desse botão. O experimento foi realizado em triplicata.
4.3 Análise das Propriedades de Virulência
4.3.1 Testes de Aderência
Adesão a material inerte
Seguimos o protocolo de Kneipp et al. (2005), com algumas modificações. Os
inóculos das leveduras foram diluídos em salina, padronizados para aproximadamente 106
UFC/ml de acordo com a turbidez do tubo 0,5 da escala de McFarland (CLSI – NCCLS,
2002). Lamínulas redondas de vidro foram dispostas nos poços de microplacas - 24 poços,
31
acrescidos dessa solução de salina mais BHI suplementado com glicose a 6% e incubadas por
18 horas a 37 ºC. Após esse tempo a microplaca foi lavada com água destilada estéril por três
vezes. Colocou-se ainda corante violeta cristal por 5 minutos, para melhor visualização em
microscópio das células aderentes, e repetiu-se o processo de lavagem da placa. As lamínulas
foram fixadas em lâminas.
A classificação da capacidade de aderência a material inerte foi feita de acordo com a
quantidade de células aderidas nas lamínulas por campo, em um microscópio óptico, com
aumento de 1000 vezes (BIASOLI; TOSELLO; MAGARÓ, 2002, com adaptações). Foram
contadas as leveduras aderidas em cada lamínula, num máximo de 70 campos, escolhidos
aleatoriamente e em sentido unidirecional. Considerou-se negativo quando houve menos de
01 levedura por campo, num total de 70 campos; fraco (+), quando houve de 01 a 10
leveduras aderidas às lamínulas num total de 50 campos; moderado (++) quando houve mais
que 10 leveduras aderidas em 30 campos; e, forte (+++) quando houve mais de 25 leveduras
aderidas em 20 campos analisados. As leituras foram realizadas por dois observadores para
melhor certificação dos resultados.
Adesão em células HEp-2 (células epiteliais)
Para o teste de aderência em células HEp-2, as amostras de Candida foram
previamente cultivadas em BHI por 24 horas a 37 °C. Depois, foram lavadas três vezes com
tampão PBS (pH 7,4) e ressuspendidas no mesmo tampão com o volume inicial. Desse
volume, foi retirado 40 μL e adicionados em microplacas de 24 poços, contendo
monocamadas celulares semi-confluentes de células HEp-2 contidas em Meio Essencial
Mínimo (MEM), acrescido de Soro Fetal Bovino a 2%. Após 3 horas de incubação a 37 °C, as
placas foram lavadas com PBS (0,01M, pH 7,2) e fixadas com metanol por um período
mínimo de 12 horas. As preparações foram coradas com May-Grunwald e Giemsa e
analisadas quanto ao padrão de aderência em microscópio óptico (SCALETSKY; SILVA;
TRABULSI, 1984).
A aderência de Candida às células HEp-2 foram analisadas quanto à intensidade
(negativo, fraco, forte e moderado) e ao padrão de adesão (difuso, localizado, agregativo e
pseudo hifal).
32
Para a intensidade da adesão, foram contadas a quantidade de colônias de Candida
aderidas em 100 células HEp-2, através de um microscópio óptico comum, com aumento de
1000 vezes (BIASOLI; TOSELLO; MAGARÓ, 2002, com adaptações). Considerou-se
negativo quando houve menos de 10 colônias aderidas em 100 células visualizadas; fraco
quando houve até 150 colônias aderidas; moderado até 300 colônias aderidas; e, forte com
mais de 300 colônias aderidas às células HEp-2 (SILVA et al., 2007, com adaptações).
Para o padrão de adesão, considerou-se adesão do tipo difuso quando as colônias de
Candida encontravam-se aderidas de forma isoladas às células HEp-2; localizado quando
encontravam-se agrupadas em pequenos grumos em torno da célula; agregativo quando as
colônias formavam uma massa ou emaranhado em torno das células; e, pseudo hifal, quando
essas leveduras produziram pseudo hifas (SILVA et al., 2007, com adaptações).
4.3.2 Formação de Biofilme
A formação de biofilme foi avaliada em microplacas de 96 poços pelo método de
Cristal Violeta, segundo Shin et al. (2002), com algumas modificações. Primeiramente, as
amostras foram semeadas em SDA e incubadas em estufa a 37 °C por 24 horas. Em seguida,
as cepas foram diluídas em salina de acordo com a turbidez do tubo 0,5 da escala de
McFarland. Os poços das placas foram preenchidos sequencialmente em triplicatas. No
controle negativo, transferiram-se somente 200 μL do preparado de BHI com 6% de glicose e
no restante dos poços, 180 μL de BHI com 6% de glicose mais 20 μL da suspensão fúngica
em salina. As placas foram incubadas a 37 °C por 24 horas em estufa. Posteriormente foram
lavadas três vezes com água destilada estéril e adicionado em cada poço 200 μL de corante
Cristal Violeta, por cinco minutos. Por fim, as placas foram lavadas com água destilada estéril
por três vezes e acrescentado 200 μL de água destilada estéril para leitura no ELISA. O
comprimento de onda usado foi de 450 ηm.
Após leitura pelo ELISA, fez-se a média de absorbância das triplicatas e multiplicado
o resultado por 100. Foi considerado negativo quando a absorbância foi menor ou igual a 5;
fraco (1+) quando maior que 5 e menor ou igual a 20; moderado (2+), quando maior que 20 e
menor ou igual a 35; forte (3+), quando maior que 35 e menor ou igual a 50; e muito forte
(4+), quando maior que 50 (SHIN et al., 2002).
33
4.3.3 Resistência ao Soro
Para identificar os isolados de Candida resistentes ao soro foi seguida a metodologia
de Pelkonen e Finne (1987), com algumas modificações. Primeiro, obteve-se soro humano a
partir da coleta de sangue de adultos imunocompetentes. Esse soro foi tratado para ser testado
de três formas:
1) soro inativado, considerado sem atividade no sistema complemento, obtido por
incubação em banho-maria, por 30 minutos a 56 ºC;
2) soro com EDTA (10 mM), para inibir a atividade do complemento pela via
clássica e alternativa;
3) soro normal, sem quaisquer tratamento.
A resistência ao soro foi analisada em triplicata usando microplacas de 96 poços de
fundo chato. As cepas, previamente semeadas em SDA e incubadas em estufa a 37 °C por 24
horas foram diluídas em salina de acordo com a turbidez do tubo 1 da escala de McFarland.
Para o controle negativo, colocou-se 120 µL de cada um dos três tipos de soro nos primeiros
nove poços da microplaca. Nos poços subsequentes foram adicionados 120 µL de cada tipo de
soro e 60 µl da suspensão fúngica, sendo incubados em estufa a 37 ºC.
A absorbância em comprimento de onda de 450 ηm em ELISA foi mensurada nos
seguintes tempos: 0, 6, 12, 24 e 48 horas. O isolado que reduziu a absorbância inicial para
valores inferiores a 50% foi considerado sensível. Foram considerados resistentes os isolados
que apresentaram fração sobrevivente superior a 90%, e os que ficaram entre estes dois
valores foram considerados intermediários.
4.4 Análise Estatística
Os dados foram avaliados pelo programa BioEstat 5.0 (2007). Inicialmente, a
associação das variáveis classificatórias com o tipo de pacientes (grupo teste e grupo controle)
e com o grupo (C. albicans e NCAC) foi feita pelo teste não paramétrico de qui-quadrado de
independência (2). O efeito do tipo de pacientes (com ou sem o vírus HIV) com as demais
variáveis foi feito pelo teste de Mann Whitney. O nível de significância para se rejeitar a
34
hipótese de nulidade foi de 5%, ou seja, considerou-se como estatisticamente significante um
valor de p<0,05.
4.5 Aspectos Éticos da Pesquisa
A coleta das amostras de Candida da mucosa oral de pacientes com AIDS foi
permitida e executada de acordo com o parecer emitido pelo Comitê de Ética e Pesquisa da
Universidade Federal do Maranhão (CEP: 23115006540/2009-40 – ANEXO B), seguindo
rigorosamente as normas da Resolução CNS 196/96. A pesquisa foi delineada e executada de
acordo com as Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres
Humanos – Resolução do Conselho Nacional de Saúde – CNS, no. 196/96.
Para as amostras bucais de Candida de pacientes imunocompetentes o projeto foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade CEUMA, segundo emissão do
parecer consubstanciado 226/2010 (ANEXO A). Os indivíduos participantes da pesquisa
foram previamente elucidados quanto ao estudo desenvolvido e aqueles que concordaram em
participar, assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE – APÊNDICE
A).
Os procedimentos de coleta foram realizados com material esterilizado e descartável,
sem qualquer uso de técnicas invasivas ou cirúrgicas ou quaisquer procedimentos que
causassem danos biológicos ao paciente. A coleta foi completamente indolor e os
participantes não foram expostos a nenhum tipo de situação constrangedora.
As amostras foram processadas, isoladas e analisadas no Laboratório de Micologia
da Universidade CEUMA do Núcleo de Doenças Endêmicas e Parasitárias, seguindo as
Normas de Biossegurança para manipulação de micro-organismos.
35
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Frequência e distribuição das amostras
Dos 42 (quarenta e dois) pacientes com AIDS, em 6 (seis) foram identificados mais
de uma espécie de Candida, o que resultou em 49 (quarenta e nove) amostras para o grupo
teste.
Para o grupo controle, foram positivos para leveduras do gênero Candida vinte e
cinco indivíduos – 14 mulheres e 11 homens –, equivalente a 23% dos voluntários. Em um
mesmo indivíduo foram identificadas duas espécies, totalizando assim, 26 amostras de
Candida spp para o grupo controle (Tabela 1).
Tabela 1 - Frequência e distribuição das amostras de Candida isoladas da mucosa oral de pacientes com AIDS
(grupo teste) e de indivíduos imunocompetentes (grupo controle).
Um total de nove espécies distintas de leveduras do gênero Candida foram
identificadas. O grupo teste apresentou sete espécies, prevalecendo C. albicans (59,2%),
seguida de C. tropicalis (12,2%) e C. krusei (12,2%); e o grupo controle apresentou cinco
espécies, prevalecendo C. parapsilosis (53,8%), seguida de C. albicans (30,8%).
Espécies Grupo teste Grupo controle
C. albicans 29 (59,2%) 8 (30,8%)
C. tropicalis 6 (12,2%) 1 (3,9%)
C. krusei 6 (12,2%) -
C. glabrata 4 (8,2%) -
C. famata 2 (4,1%) -
C. parapsilosis 1 (2,0%) 14 (53,8%)
C. sake - 2 (7,6%)
C. guilliermondii 1 (2,0%) -
C. incons/norveg - 1 (3,9%)
TOTAL 49 26
36
Figura 1 - Diferentes espécies de Candida isoladas em meio cromogênico CHROMagar com a identificação
prévia realizada pelo método automatizado VITEK YBC.
FONTE: O autor.
Para Candido, Azevedo e Komesu (2000) em estudo com espécies de Candida
provenientes da mucosa oral de pacientes com lesões bucais características de candidíase e
indivíduos com a boca clinicamente normal, os autores encontraram maior prevalência de C.
albicans em ambos os grupos. Diferindo desses e de outros autores, onde C. albicans é
encontrada em maiores proporções também em grupos de indivíduos saudáveis (RAMAGE et
al., 2002; BASU et al., 2003; NETO, 2004; GASPARETTO et al., 2005), no presente estudo
C. parapsilosis foi a espécie mais prevalente no grupo controle. Porém, este resultado foi
corroborado por Bonassoli, Bertoli e Svidzinski (2005), que também encontraram maior
prevalência de C. parapsilosis (51,0%) em uma pesquisa de amostras de Candida coletadas
das mãos de profissionais que trabalham em um determinado hospital do Paraná e de
indivíduos da comunidade. A proporção de C. parapsilosis foi ainda maior quando se
considerou só os indivíduos da comunidade (58,3%).
Enquanto neste estudo foram isoladas seis amostras de C. tropicalis no grupo de
pacientes com AIDS (12,2%), só se isolou uma única amostra dessa espécie no grupo de
indivíduos saudáveis (3,9%). Para Barbedo e Sgarbi (2010), a detecção desta espécie está
normalmente associada à infecção, diferente de C. albicans que está associada à microbiota
C. albicans
C. krusei
C. tropicalis
C. guillermondii
C. famata
C. parapsilosis
CHROMAGAR C. glabrata
C. glabrata
37
normal. Todavia em diversos trabalhos (CANDIDO; AZEVEDO; KOMESU, 2000; BASU et
al., 2003; NETO, 2004), C. tropicalis foi a segunda espécie mais isolada de pacientes
saudáveis, perdendo somente para C. albicans, resultado esse observado neste estudo para o
grupo teste e não para o grupo controle, como encontrado por estes autores.
C. glabrata não foi encontrada no grupo de indivíduos sadios. A literatura relata
maior prevalência dessa espécie em pacientes com complicações de transplante de medula
óssea, pacientes com câncer e com o vírus HIV, além de pacientes idosos (COLOMBO;
GUIMARÃES, 2003), grupos esses que não foram objeto desse estudo para o grupo controle.
Entretanto, para Kaur et al. (2005), C. glabrata é uma espécie comensal, podendo ser isolada
em indivíduos saudáveis. A ausência de C. glabrata em amostras bucais de indivíduos
saudáveis também foi observada por Basu et al. (2003), Neto (2004) e Costa (2006).
Infecções por C. sake são raramente publicadas na literatura. Alguns episódios já
relatados são casos de peritonite (GUCLU et al., 2009), endocardite (AGGARWAL et al.,
2008), candidemias (JUNEJA et al., 2011; PARMELAND et al., 2012) e colonização na
mucosa oral em pacientes infectados com o vírus HIV (HOEGL et al., 1998). Outras espécies
NCAC, tais como C. rugosa, C. kefyr, C. stellatoidea, C. norvegensis e C. famata são mais
raras ainda, com menos de 1% dos casos de fungemias em homens (KRCMERY; BARNES,
2002).
O aumento da frequência de espécies NCAC isoladas de diversos sítios do corpo e de
dispositivos hospitalares é um fato que deve ser ressaltado, tendo em vista que muitos estudos
tendem a centrar a preocupação exclusivamente em C. albicans e menos importância tem sido
dada a outras espécies. Segundo El-Azizi et al. (2004), na candidíase bucal, por exemplo, é
cada vez mais frequente o isolamento de C. tropicalis, C. krusei e C. guilliermondii. No
Brasil, C. albicans continua sendo o principal agente de candidemia, mas cresce os casos por
C. parapsilosis e C. tropicalis (PASQUALOTTO, 2004).
38
5.2 Atividade proteolítica em placa
Nos testes de produção de proteinase, das 75 amostras de Candida testadas, 57
(76,0%) foram positivas para a enzima proteinase. Destas, 35 (71,42%) eram provenientes de
pacientes com AIDS e 22 (84,61%) de pacientes imunocompetentes, diferença
estatisticamente não relevante (p=0,1072; U=525,50).
Do grupo teste, todas as amostras de C. albicans e C. tropicalis apresentaram
positividade para proteinase, entretanto foram as únicas produtoras. No grupo controle,
também, todas as amostras de C. albicans foram positivas, enquanto a única cepa de C.
tropicalis, não; outras que também apresentaram atividade proteolítica desse grupo foram as
duas amostras de C. sake e doze das quatorze (12/14) amostras de C. parapsilosis (85,71%).
As demais espécies não apresentaram a enzima proteinase, conforme dados apresentados na
Tabela 2. Analisando estatisticamente, C. albicans teve sobremaneira maior atividade
proteolítica quando comparado às espécies NCAC, em ambos os grupos (p<0,001) (Figura 2).
Tabela 2 - Produção de proteinase por diferentes espécies de Candida de pacientes com AIDS (grupo teste) e de
indivíduos imunocompetentes (grupo controle).
Espécies
Grupo teste Grupo controle
Positivas Negativas Positivas Negativas
C. albicans 29 0 8 0
C. tropicalis 6 0 0 1
C. krusei 0 6 - -
C. glabrata 0 4 - -
C. famata 0 2 - -
C. parapsilosis 0 1 12 2
C. guilliermondii 0 1 - -
C. sake - - 2 0
C. incons/norvegen - - 0 1
TOTAL (%) 35 (71,43%) 14 (28,57%) 22 (84,62%) 4 (15,38%)
39
Figura 2 - Produção de proteinases ácidas por amostras de C. tropicalis e C. albicans isoladas da mucosa oral de
pacientes com AIDS – grupo teste.
FONTE: O autor
Quanto à classificação da intensidade da atividade proteolítica, as amostras de C.
albicans do grupo teste apresentaram produção de proteinase dos tipos forte +++ (48,3%),
muito forte ++++ (31,0%) e média ++ (20,7%). C. albicans do grupo controle tiveram
produção dessa enzima parecida às do grupo teste, na ordem: forte +++ (50%), média ++
(37,5%) e muito forte ++++ (12,5%). Não houve amostra de C. albicans em nenhum dos dois
grupos apresentado produção de proteinase do tipo fraca. Já para C. tropicalis, a maioria das
amostras do grupo teste teve produção do tipo média ++ (50,0%); no grupo controle, a única
cepa dessa espécie não produziu essa enzima. Quanto a C. parapsilosis, a única amostra do
grupo teste não foi produtora de proteinase; enquanto no grupo controle, 75% apresentaram
proteinase do tipo forte (+++) e os 25% restantes, proteinase do tipo muito forte (++++). As
duas amostras de C. sake do grupo controle apresentaram proteinase forte +++ (Figura 3).
A produção de proteinase é considerada um importante fator de virulência porque
aumenta a capacidade do micro-organismo em colonizar e penetrar o tecido do hospedeiro,
além de enganar o sistema imune, quebrando um número significativo de importantes
proteínas da imunidade, como imunoglobulinas, proteínas do sistema complemento e
citocinas (HUBE, 1996). Assim, a virulência de espécies de Candida diminui quando
inibidores de proteinase são usados no tratamento de candidíase, como já observado em C.
albicans, sugerindo que o uso do inibidor pode atuar como fungicida, diminuindo a presença
de candidíase oral em pacientes com AIDS (SCHALLER et al., 1999).
40
Figura 3 - Intensidade da produção de proteinase entre as amostras positivas dos grupos teste e controle.
LEGENDA: +, fraca; ++ média; +++ forte; ++++ muito forte.
FONTE: O autor
Corroborando este trabalho, Rörig, Colacite e Abegg (2009) também encontraram
100% de positividade para produção de proteinase pelos isolados de C. albicans provenientes
de amostras clínicas. Já para Basu et al. (2003), foram positivos somente 66,6% dos isolados
clínicos dessa espécie – oriundos de diversos sítios como trato respiratório, sangue, urina,
dispositivos hospitalares e outros – e 13,3% das amostras do grupo de indivíduos sadios.
Costa (2009) também encontrou alta atividade proteolítica em seus isolados clínicos.
As amostras de C. albicans foram as maiores produtoras (88,1%) comparadas às espécies
NCAC (69,8%), porém essa diferença não foi importante estatisticamente. Também foi
observado no presente estudo maior atividade proteolítica em C. albicans, comparado às
espécies NCAC, em ambos os grupos, entretanto os resultados foram considerados altamente
significantes (p<0,001). Costa (2009) ainda relata a alta produção de proteinase por C.
parapsilosis e C. guillermondii (81,8% e 85,7%, respectivamente).
Batista (2009) encontrou 91% de positividade para produção de proteinase por
amostras de C. parapsilosis provenientes de catéter e do sangue de neonatos, o que corrobora
em parte os resultados encontrados neste trabalho, onde se obteve 85,71% de positividade
para esta espécie, porém nas amostras do grupo controle. Já Bonassoli, Bertoli e Svidzinski
(2005) encontraram 100% de positividade para produção de proteinase em amostras de C.
parapsilosis coletadas das mãos de indivíduos saudáveis.
0
2
4
6
8
10
12
14
+ ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++
nú
me
ro d
e a
mo
stra
s
Grupo teste Grupo controle
Intensidade da proteinase
C. albicans
C. tropicalis
C. parapsilosis
C. sake
41
Matsumoto et al. (2002) verificaram que 96,4% das amostras de C. parapsilosis
isoladas de sangue e catéter produziram proteinase fortemente positivas. Neste trabalho foi
verificado que 75% (9/12) das amostras dessa espécie apresentaram-se como forte e 25%
(3/12) como muito forte. Dados esses para o grupo controle, uma vez que a única amostra
dessa espécie do grupo teste foi negativa para esta enzima.
Em relação a C. glabrata, os resultados aqui encontrados concordam com alguns
trabalhos já publicados, em que nenhuma amostra dessa espécie mostrou atividade
proteolítica (YAMAMOTO et al., 1992; CANDIDO; AZEVEDO; KOMESU, 2000; OZCAN
et al., 2006). Esses resultados são corroborados por Kaur et al. (2005), quando compara a
virulência de C. albicans com C. glabrata e afirma que a diferença da primeira para a
segunda, além da formação de hifas, é a produção de proteinases por C. albicans. Interessante
é que até o momento na literatura, há somente dois trabalhos publicados que relataram a
produção de proteinase por esta espécie: o primeiro é o de Chakrabarti et al. (1991) e o
segundo é o trabalho de Deça Júnior et al. (2011).
Santos e Soares (2005) demonstraram que a espécie C. guillermondii, isolada de um
indivíduo soropositivo para o HIV, era capaz de secretar uma serina protease que hidrolisava
proteínas presentes no soro humano e componentes da matriz extracelular. Neste estudo a
única amostra de C. guillermondii, de paciente com AIDS, não produziu proteinase.
Silva (1999) fez um trabalho semelhante ao aqui desenvolvido, com leveduras
isoladas de pacientes com AIDS e de indivíduos imunocompetentes, e observou que,
independente do grupo, todas as amostras apresentaram forte atividade proteolítica, sem
diferenças estatísticas entre os grupos. O mesmo foi observado neste trabalho, em que a
frequência de positividade para esta enzima no grupo teste foi de 71,43% e no grupo controle
de 84,62%, porém sem diferença estatística.
Interessante ressaltar é que apesar dos diversos estudos tentando relacionar a
atividade proteolítica com invasão e danos ao tecido do hospedeiro, Naglik et al. (2008) e
Lerman e Morschhauser (2008) relataram em seus trabalhos que não ter encontrado relação
entre a expressão do gene SAP com esses danos, o que talvez possa explicar o fato de
linhagens de Candida de pacientes sem quaisquer imunodepressão apresentar atividade
proteolítica na mesma proporção que cepas de pacientes com HIV/AIDS, por exemplo, como
mostrado neste estudo.
42
5.3 Teste de fosfolipase em placa
Para a produção de fosfolipase, das 75 amostras de Candida testadas, 39 (52,0%)
foram positivas, sendo 27 (55,1%) provenientes de pacientes com AIDS e 12 (46,2%) de
pacientes imunocompetentes. Tal diferença não foi relevante estatisticamente (p=0,257;
U=726,50).
Do grupo teste, somente C. albicans apresentou esta enzima (93,1%). Do grupo
controle, todas as espécies foram produtoras: C. albicans com 60,0% e C. parapsilosis com
55,5%; C. tropicalis, C. sake e C. incons/norvegen, de menores amostras, apresentaram 100%
de positividade (Tabela 3). A maior atividade de fosfolipase no grupo teste por C. albicans e
no grupo controle por espécies NCAC foi altamente significante (p<0,001).
Quanto à intensidade da fosfolipase, todas as amostras positivas de C. albicans (27),
do grupo teste, tiveram produção do tipo muito forte ++++. Já no grupo controle, todas as
amostras de C. albicans (03) positivas apresentaram intensidade do tipo forte +++, assim
como C. tropicalis (01) e algumas amostras de C. parapsilosis (02/05); somente C.
parapsilosis (02/05) e C. sake (02/02) mostraram atividade muito forte ++++ no grupo
controle (Figura 4).
Grupo teste Grupo controle
Espécies Positivas Negativas Positivas Negativas
C. albicans 27 2 3 5
C. tropicalis 0 6 1 0
C. krusei 0 6 - -
C. glabrata 0 4 - -
C. famata 0 2 - -
C. parapsilosis 0 1 5 9
C. guilliermondii 0 1 - -
C. sake - - 2 0
C. incons/norvegen - - 1 0
TOTAL (%) 27 (55,1%) 22 (44,9%) 12 (46,2%) 14 (53,8%)
Tabela 3 - Produção de fosfolipase por diferentes espécies de Candida de pacientes com AIDS (grupo teste)
e de indivíduos imunocompetentes (grupo controle).
43
Figura 4 - Intensidade da produção de fosfolipase entre as amostras positivas dos grupos teste e controle.
LEGENDA: +, fraca; ++ média; +++ forte; ++++ muito forte.
FONTE: O autor
A fosfolipase está relacionada à maior capacidade de invadir o tecido. Algumas
funções desta enzima durante a infecção têm sido postuladas, dentre elas: penetração à célula
do hospedeiro, adesão às células epiteliais e invasão do epitélio oral humano (SCHALLER et
al., 2005).
Foi verificado neste estudo, maior atividade de fosfolipase em amostras de C.
albicans (Figura 5) isoladas da cavidade bucal de pacientes com AIDS do que em isolados de
indivíduos saudáveis. O mesmo foi observado por Silva (1999), quando comparou esta
enzima entre esses dois grupos de estudo.
Num trabalho sobre a produção de exoenzimas por amostras de Candida
provenientes da mucosa oral de pacientes com e sem lesões bucais característicos de
candidíase, os autores encontraram em ambos os grupos, produção de fosfolipase somente por
C. albicans, o que corrobora os resultados aqui encontrados para o grupo teste (CANDIDO;
AZEVEDO; KOMESU, 2000).
No trabalho de Basu et al. (2003), 48,7% (19/39) dos isolados de C. albicans, de
amostras clínicas, apresentaram atividade de fosfolipase, enquanto somente 6,7% (2/30) das
amostras dessa espécie, provenientes de indivíduos saudáveis, foram positivas. Os resultados
0
5
10
15
20
25
30
+ ++ +++ ++++ + ++ +++ ++++
Grupo teste Grupo controle
Nú
mer
o d
e am
ost
ras
Intensidade da Fosfolipase
C. albicans
C. tropicalis
C. parapsilosis
C. sake
C. incons/norvegen
44
encontrados no presente estudo mostraram 93,1% de positividade para as amostras clínicas de
C. albicans e somente 37,5% para esta espécie no grupo controle.
Figura 5 - Produção de fosfolipase por amostras de Candida provenientes da mucosa oral de pacientes com
AIDS.
Mohan e Ballal (2008) verificaram positividade para produção de fosfolipase em
48,64% (18/37) das espécies de C. albicans, de amostras clínicas do sangue, e 42,85% (33/77)
por espécies NCAC. Costa (2009) também encontrou maior produção de fosfolipase em cepas
de C. albicans (55,9%) comparado às espécies NCAC (37,7%) de amostras provenientes da
mucosa oral de pacientes com o vírus HIV, porém sem diferença estatística (p>0,05). Já para
o presente estudo, a maior prevalência de C. albicans no grupo teste (100%) e espécies NCAC
no grupo controle (75%), foi considerado altamente significante (p<0,001).
Diversos estudos têm relatado a capacidade de espécies NCAC para produzir
fosfolipase extracelular (FURLANETO-MAIA et al., 2007; CAFARCHIA et al., 2008;
GALAN-LADERO et al., 2010) ou uma quantidade relativamente menor quando comparado
com C. albicans (GHANNOUM, 2000). C. tropicalis é conhecida por ter reduzida capacidade
de produção dessa enzima, embora vários autores relatem que a produção de fosfolipase
extracelular é fortemente dependente da linhagem. Já para a produção de fosfolipase por C.
glabrata, só foi encontrado na literatura o trabalho de Deça Júnior et al. (2011), que verificou
70,0% de positividade para amostras provenientes da urina e secreção traqueal.
C. albicans C. albicans
C. guilliermondii
C. glabrata
45
5.4 Testes de gelatinase
Nos testes de gelatinase, das 75 amostras de Candida testadas, 52 (69,3%) foram
positivas, sendo 33 (67,3%) provenientes de pacientes com AIDS e 19 (73,1%) de pacientes
imunocompetentes. Tal diferença não foi relevante estatisticamente (p=0,571; U=549,00).
Com exceção de C. guilliermondii e C. incons/norvegen, com apenas uma amostra,
todas as outras espécies de Candida, de ambos os grupos, mostraram ter capacidade de
liquefazer a gelatina. Comparando a produção de gelatinase entre as amostras de C. albicans
e espécies NCAC, não foi encontrada diferença estatística em nenhum dos grupos (p>0,05),
conforme Tabela 4.
Na literatura não foram encontradas referências sobre a atividade da gelatinase em
amostras de Candida. Os poucos estudos sobre fungos encontrados são relativos a fungos
filamentosos. Dentre eles, tem-se o de Souza et al. (2008), em que estudaram exoenzimas de
agentes de cromoblastomicose e todas as amostras apresentaram a enzima gelatinase. Além do
trabalho de Fischer e Cook (2001), que não encontraram diferenças significativas entre as
amostras positivas para gelatinase de isolados patogênicos e não patogênicos de
Cladosporium carrionii e Exophiala jeanselmei, semelhante aos resultados aqui apresentados,
em que não foi encontrada diferença entre amostras de indivíduos com ou sem o vírus
HIV/AIDS.
Espécies
Grupo teste Grupo controle
Positivas Negativas Positivas Negativas
C. albicans 22 7 7 1
C. tropicalis 3 3 0 1
C. krusei 2 4 - -
C. glabrata 4 0 - -
C. famata 1 1 - -
C. parapsilosis 1 0 11 3
C. guilliermondii 0 1 - -
C. sake - - 1 1
C. incons/norvegen - - 0 1
TOTAL (%) 33 (67,3%) 16 (32,7%) 19 (73,1 %) 7 (26,9%)
Tabela 4 - Produção de gelatinase por diferentes espécies de Candida de pacientes com AIDS (grupo teste)
e de indivíduos imunocompetentes (grupo controle).
46
Através de estudos realizados em diferentes espécies de bactérias, sabe-se que a
gelatinase age degradando a gelatina e proteínas da parede celular de bactérias (CAMARGO,
2005), além do colágeno, caseína, hemoglobina e outros compostos bioativos (VERGIS et al.,
2002), o que confirma ser essa exoenzima um fator de virulência. Entretanto, como já foi
comentado anteriormente, já foi verificado em testes com bactérias que a liquefação da
gelatina também já ocorreu em linhagens que não continham o gene da gelatinase. Em
contrapartida, em algumas amostras que continham esse gene a liquefação não aconteceu.
(CAMARGO, 2005).
Ainda há muito a esclarecer sobre a enzima gelatinase, especialmente em leveduras
do gênero Candida. O que foi observado neste trabalho é que, com exceção de duas espécies
que só continham uma amostra cada - C. guilliermondii e C. incons/norvegen -, todas as
outras espécies de Candida aqui estudadas foram capazes de degradar a gelatina. Um fato
curioso foi que C. glabrata, considerada uma espécie que causa alta mortalidade em pacientes
debilitados (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003), foi 100% negativa para a produção de
proteinase e fosfolipase, porém 100% positiva para a produção de gelatinase (Figura 6).
Figura 6 – Teste para produção de gelatinase em amostras proveniente da mucosa oral de pacientes com AIDS.
LEGENDA: A: a colônia liquefez a gelatina (gelatinase positiva);
B: a colônia não liquefez a gelatina (gelatinase negativa).
FONTE: O autor
A
B
47
5.5 Atividade hemolítica em meio sólido
Todas as espécies deste estudo, de ambos os grupos, apresentaram atividade
hemolítica em meio sólido: o grupo teste com 89,8% e o grupo controle com 76,9%. Pela
análise estatística, essa diferença não foi significante entre os grupos (p=0,1190; U=531).
Somente C. albicans e C. glabrata, do grupo teste, e C. albicans, C. parapsilosis e C. sake, do
grupo controle, tiveram linhagens que não apresentaram o fator hemolítico (Tabela 5).
A espécie que produziu os maiores índices hemolíticos foi C. tropicalis, com 67% e
100% das amostras fortemente positivas (grupo teste e controle, respectivamente). Todas as
outras espécies foram em sua maioria classificadas como positivas. O grupo teste foi quem
mais teve cepas produtoras de hemólise fortemente positivas (40,9%), comparado a 20% das
amostras do grupo controle. Analisando os grupos C. albicans e NCAC para produção do
fator hemolítico, não foi encontrada diferença significativa em nenhum dos grupos (p>0,05)
(Figura 7).
Um estudo realizado por França et al. (2010) com 28 amostras clínicas de C.
tropicalis, 100% apresentaram atividade hemolítica, resultado semelhante ao encontrado
nesse trabalho. O mesmo foi encontrado por Deça Júnior (2010) em suas amostras clínicas de
C. tropicalis, além de 100% de positividade também para C. glabrata, seguida de C. albicans
(93,5%) e C. parapsilosis (28,6%).
Espécies
Grupo teste Grupo controle
Positivas Negativas Positivas Negativas
C. albicans 25 4 7 1
C. tropicalis 6 0 1 0
C. krusei 6 0 - -
C. glabrata 3 1 - -
C. famata 2 0 - -
C. parapsilosis 1 0 10 4
C. guilliermondii 1 0 - -
C. sake - - 1 1
C. incons/norvegen - - 1 0
TOTAL (%) 44 (89,8%) 5 (10,2%) 20 (76,9%) 6 (23,1%)
Tabela 5 - Produção de hemólise em meio sólido por diferentes espécies de Candida de pacientes com AIDS
(grupo teste) e de indivíduos imunocompetentes (grupo controle).
48
Nos trabalhos de Rörig, Colacite e Abegg (2009), somente as amostras clínicas de C.
parapsilosis e C. albicans apresentaram atividade hemolítica. Entretanto os autores usaram
sangue humano.
Figura 7 - Classificação das amostras positivas para atividade hemolítica em meio sólido.
FONTE: O autor
A produção de hemolisinas está relacionada com a maior virulência das linhagens,
segundo alguns autores, em estudo realizado com bactérias (COOKSON et al., 2007; HUNT
et al., 2008). Isso talvez justifique o fato de que, embora todas as cepas deste estudo, de
ambos os grupos, tenham demonstrado capacidade hemolítica (Figura 8), as cepas do grupo
teste foram significativamente mais hemolíticas (p<0,001), tendo mais amostras classificadas
como fortemente positivas (40,9%) em relação às cepas do grupo controle (20%).
Ainda, a hemolisina facilita a invasão de hifas na mucosa do paciente numa
candidíase disseminada e tem capacidade de lisar hemáceas em busca de ferro para favorecer
seu crescimento e disseminação, vindo a causar anemia e déficit de transporte de oxigênio nos
pacientes. Essas consequências tornam os resultados aqui apresentados relevantes, uma vez
que as amostras clínicas foram provenientes de pacientes internados, imunodebilitados e com
AIDS, portanto, susceptíveis a essas manifestações.
Classificação das amostras hemolíticas em meio sólido
porcentagem
59,1%
40,9%
20,0%
80,0%
Gru
po
tes
te
Gru
po
co
ntr
ole
49
Figura 8 - Formação de halos de hemólise em placa por espécies de Candida de amostras bucais provenientes de
pacientes com AIDS.
FONTE: O autor
C. albicans
ATCC C. tropicalis
C. tropicalis
C. tropicalis
50
5.6 Atividade hemolítica com sobrenadante
Das 75 amostras testadas, somente 13 (17,3%) apresentaram atividade hemolítica no
sobrenadante de cultura em pelo menos um dos quatro meios testados: 10 amostras (20,4%)
do grupo teste e 3 (11,5%) do grupo controle. Do grupo teste, somente C. albicans (8/29) e C.
glabrata (2/6) hemolisaram em um dos meios com íons e/ou quelantes, acrescidos de BHI; do
grupo controle somente C. parapsilosis (3/14) apresentou esta atividade. Não houve diferença
estatística entre os dois grupos em nenhum dos meios testados (p>0,05) (Tabela 6).
Tabela 6 - Produção de hemolisinas no sobrenadante da cultura por diferentes espécies de Candida de pacientes
com AIDS (Grupo teste) e indivíduos imunocompetentes (Grupo controle).
Espécie Cálcio EDTA FERRO EDDA CÁLCIO
+ EDTA
CÁLCIO
+ EDDA
GRUPO TESTE
C. albicans (n=29) 3 3 1 1
C. glabrata (n=6) 1 1
GRUPO CONTROLE
C. parapsilosis (n=14) 1 1 1
Ao contrário do teste de hemólise em placas, onde a porcentagem de cepas
hemolíticas foi bastante significante, poucas amostras demonstraram essa atividade quando
analisado somente o sobrenadante da cultura após 48 horas de incubação: somente 20,4% das
amostras do grupo teste e 11,5% das amostras do grupo controle apresentaram positividade
nos meios com íons e/ou quelantes (Figura 9). Além disso, somente três espécies mostraram
essa atividade: C. albicans, C. glabrata e C. parapsilosis. O meio de BHI contendo cálcio foi
o mais hemolítico, estando presente em 7 das 13 amostras positivas.
Para Malcok et al. (2009), C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C. kefyr são as
espécies mais hemolíticas no sobrenadante de cultura, o que corrobora os resultados deste
trabalho em relação às duas primeiras espécies. Interessante ressaltar que C. tropicalis foi a
espécie com maiores halos hemolíticos em placa e 100% de positividade. Entretanto, para este
teste não houve nenhuma amostra positiva.
51
Figura 9 - Atividade hemolítica em sobrenadante de cultura com íons e quelantes por amostras de Candida
provenientes da mucosa oral de pacientes com AIDS.
LEGENDA: A1, A2, A3 hemólise positiva; os botões indicam hemólise negativa.
FONTE: O autor
Em um estudo desenvolvido por Barateia et al. (2001) sobre a síntese de hemolisinas
pela bactéria Plesiomonas shigelloides, os autores concluíram que a produção dessa enzima
pode ser dependente de diversos fatores presentes no meio de cultura. Quando em presença de
quelantes de ferro, a atividade hemolítica em algumas bactérias pode aumentar. Já o cálcio foi
descrito como sendo essencial para estabilização e ativação de α-hemolisina, além de ligar a
toxina às membranas dos eritrócitos.
52
5.7 Testes de aderência em lamínulas
Os ensaios de aderência a material inerte (lamínulas) apresentaram 85,7% de
positividade para as amostras do grupo teste e 100% para as amostras do grupo controle. Com
exceção de C. albicans e C. glabrata, que aderiram 82,7% e 50,0%, respectivamente (grupo
teste), todas as outras espécies de Candida apresentadas neste estudo aderiram 100% a
material inerte (Tabela 7). Não houve diferença significante relacionado à aderência entre os
dois grupos (p=0,1555; U=546,00).
C. albicans apresentou intensidade de aderência fraca em 50,0% das amostras,
moderada em 41,6% e forte em 8,3% das amostras do grupo teste; já no grupo controle, a
aderência foi fraca em 25,0% e moderada em 75,0%, não havendo aderência forte. C.
tropicalis teve 50,0% de aderência fraca, 16,6% do tipo moderada e 33,4% do tipo forte, para
o grupo teste; a única amostra dessa espécie do grupo controle aderiu fracamente. Todo o
restante das amostras do grupo teste que só tinha um representante da espécie também
aderiram de forma fraca - C. guilliermondii, C. incons/norvegens e C. parapsilosis. As duas
amostras de C. sake aderiram fracamente e as duas de C. famata, moderadamente. As
amostras de C. parapsilosis do grupo controle tiveram adesão do tipo fraca (57,1%),
moderada (14,3%) e forte (28,6%), conforme dados apresentados na Tabela 8. A análise
estatística não mostrou diferença significativa entre a intensidade da adesão das espécies do
grupo teste (p=0,0784; H=8,3876), nem do grupo controle (p=0,2640; H=1,2477).
Espécies
Grupo teste Grupo controle
Positivas Negativas Positivas Negativas
C. albicans 24 5 8 0
C. tropicalis 6 0 1 0
C. krusei 6 0 - -
C. glabrata 2 2 - -
C. famata 2 0 - -
C. parapsilosis 1 0 14 0
C. guilliermondii 1 0 - -
C. sake - - 2 0
C. incons/norvegen - - 1 0
TOTAL (%) 42 (85,7%) 7 (14,3%) 26 (100%) 0
Tabela 7 - Resultado dos testes de adesão em material inerte por diferentes espécies de Candida de pacientes
com AIDS (grupo teste) e de indivíduos imunocompetentes (grupo controle).
53
Quanto ao padrão de adesão, no grupo teste não houve diferença estatística entre as
espécies (p=0,5294; H=1,2722). No grupo controle, C. albicans apresentou 25,0% de
aderência do tipo difuso, 62,5% do tipo localizado e 12,5% agregativo; já C. parapsilosis teve
85,7% de aderência do tipo difuso e 14,3% do tipo localizado. O fato de C. parapsilosis ter
padrão mais difuso que C. albicans foi considerado significante (p=0,0169; H=8,0208).
Tabela 8 - Intensidade e padrão da aderência em material inerte por diferentes espécies de Candida isoladas da
mucosa oral de pacientes com AIDS (grupo teste) e de indivíduos imunocompetentes (grupo controle).
ESPÉCIES Intensidade Padrão
fraco moderado forte difuso localizado agregativo pseudo hifal
C. albicans (g. teste=24) 12 (50,0%) 10 (41,6%) 2 (8,3%)
18 (75,0%) 5 (20,8%) 1 (4,2%) 0
(g. controle=8) 2 (25,0%) 6 (75,0%) 0
2 (25,0%) 5 (62,5%) 1 (12,5%) 0
C. tropicalis (g. teste =6) 3 (50,0%) 1 (16,6%) 2 (33,4%)
3 (50,0%) 0 3 (50,0%) 0
(g. controle=1) 1 (100%) 0 0
1 (100%) 0 0 0
C. krusei (g. teste =6) 2 (33,4%) 3 (50,0%) 1 (16,6%)
3 (50,0%) 2 (33,4%) 1 (16,6%) 0
(g. controle=0) - - -
- - - -
C. glabrata (g. teste =2) 2 (100%) 0 0
2 (100%) 0 0 0
(g. controle=0) - - -
- - - -
C. famata (g. teste =2) 0 2 (100%) 0
2 (100%) 0 0 0
(g. controle=0) - - -
- - - -
C. parapsilosis (g. teste =1) 1 (100%) 0 0
1 (100%) 0 0 0
(g. controle=14) 8 (57,1%) 2 (14,3%) 4 (28,6%)
12 (85,7%) 2 (14,3%) 0 0
C. sake (g. teste =0) - - -
- - - -
(g. controle=2) 2 (100%) 0 0
2 (100%) 0 0 0
C. guillermondii (g. teste =1) 1 (100%) 0 0
1 (100%) 0 0 0
(g. controle =0) - - -
- - - -
C. incons/norveg (g. teste =0) - - -
- - - -
(g. controle=1) 1 (100%) 0 0
1 (100%) 0 0 0
TOTAL teste
controle
21 (50,0%)
14 (53,8%)
16 (38,1%)
8 (30,8%)
5 (11,9%)
4 (15,4%)
30 (71,4%)
18 (69,2%)
7 (16,7%)
7 (26,9%)
5 (11,9%)
1 (3,9%)
0
0
No geral, não houve diferença significante entre a intensidade (p=0,1807;
U=555,00), nem ao padrão de adesão (p=0,1609; U=548,00) a material inerte por amostras de
Candida isoladas de pacientes com AIDS e de indivíduos imunocompetentes. As Figuras 10 e
11 ilustram a similaridade de aderência entre os grupos.
Espécies como C. parapsilosis e C. albicans têm sido constantemente descobertas
como causadoras de candidemia, acreditando-se que esta elevada frequência, principalmente
quando se refere a C. parapsilosis pode ser explicada pela alta capacidade desta espécie em
aderir a superfícies plásticas tais como o catéter (DAGDEVIREN; CERIKCIOGLU;
KARAVUS, 2005).
54
Importante observar é a totalidade (100%) das amostras provenientes de indivíduos
do grupo controle serem aderentes a material inerte. Segundo Calderone e Gow (2002),
mesmo como comensais, Candida spp têm de aderir a superfícies de mucosas, pois não sendo
capaz, será removida do corpo.
Figura 10 - Relação entre grau/intensidade e padrão de aderência entre amostras de Candida isoladas de
pacientes dos grupos teste e controle.
Grupo teste Grupo controle Grupo teste Grupo controle
55
Figura 11 - Aderência a material inerte de células de Candida spp de pacientes com AIDS. Aumento de
1000x ao microscópio óptico.
Grupo teste Grupo controle
C. parapsilosis
DIFUSO
C. albicans
LOCALIZADO
C. albicans
AGREGATIVO
C. albicans
DIFUSO
C. albicans
LOCALIZADO
C. tropicalis
AGREGATIVO
56
5.8 Testes de aderência em células HEp-2
Para os testes de aderência às células HEp-2 foram analisadas 73 amostras, sendo 48
do grupo teste e 24 do grupo controle. Aderiram às células, 41 amostras (85,4%) do grupo
teste e 20 (83,3%), do grupo controle (Tabela 9). Não houve diferença estatística significante
comparando-se a frequência de aderência entre os dois grupos (p=0,3964; U=554,00).
Das amostras isoladas de pacientes com AIDS, C. albicans apresentou elevada taxa
de aderência (96,5%) e somente uma amostra não aderiu às células HEp-2. Das cepas isoladas
dos pacientes imunocompetentes, com exceção de C. parapsilosis, que apresentou 66,6% de
aderência, todas as outras espécies aderiram 100% às células HEp-2.
Comparando somente as amostras de C. albicans entre os dois grupos, não foi
verificada diferença estatística (p=0,0805; U=78,00). Quando comparado C. albicans com
espécies NCAC também não foi encontrada diferença estatística em nenhum dos grupos
(p=0,4622, U=271,00; p=0,1792, U=49,00, grupos teste e controle, respectivamente).
Quanto à intensidade da adesão, no grupo teste o tipo fraco foi o mais encontrado
(51,2%), seguido do tipo moderado (34,2%). No grupo controle, os tipos fracos e moderados
também foram os mais encontrados, totalizando 40% cada. A adesão do tipo forte foi mais
encontrada no grupo controle (20,0%), enquanto no grupo teste foi de 14,6% (Tabela 10).
Tabela 9 - Porcentagem de aderência em células HEp-2 por diferentes
espécies de Candida da mucosa oral de pacientes com AIDS (grupo
teste) e indivíduos imunocompetentes (grupo controle).
Espécies Grupo teste Grupo controle
Positivo Negativo Positivo Negativo
C. albicans 28 1 8 0
C. tropicalis 5 0 1 0
C. krusei 1 5 - -
C. glabrata 4 0 - -
C. famata 1 1 - -
C. parapsilosis 1 0 8 4
C. sake - - 2 0
C. guilliermondii 1 0 - -
C. incons/norvegen - - 1 0
TOTAL (%) 41 (85,4%) 7 (14,6%) 20 (83,3%) 4 (16,7%)
57
Quanto ao padrão de adesão, em ambos os grupos, o tipo difuso foi o mais
encontrado (65,8% e 60,0%, grupos teste e controle, respectivamente), seguido do agregativo
(26,9%) e localizado (7,3%) para o grupo teste e mesma porcentagem para os padrões
localizado e agregativo (20,0%) no grupo controle. Em nenhum deles foi verificado o tipo
pseudo hifal, embora houvesse a formação de tubo germinativo em algumas espécies (Figura
12). Isso porque, para a interação Candida e células HEp-2, foram usados no preparo Soro
Fetal Bovino a 2%. E já se é sabido pela comunidade científica que este meio favorece a
formação de tubo germinativo em espécies de Candida.
A espécie C. glabrata que teve 100% de aderência nas células HEp-2, não
apresentou intensidade de adesão do tipo fraco – foram 50% do tipo moderado e 50% do tipo
forte - e nem padrões do tipo difuso e localizado – foi 100% do tipo agregativo. C. krusei, a
espécie que menos aderiu, sua única amostra positiva apresentou intensidade fraca e padrão
Tabela 10 - Intensidade e padrão da aderência em células HEp-2 por diferentes espécies de Candida da mucosa
oral de pacientes com AIDS (grupo teste) e indivíduos imunocompetentes (grupo controle).
ESPÉCIES Intensidade Padrão
fraco moderado forte difuso localizado agregativo pseudo
hifal
C. albicans (g. teste=28) 17 (60.7%) 9 (32.1%) 2 (7.2%)
22 (78.6%) 1 (3.6%) 5 (17.8%) 0
(g. controle=8) 3 (37.5%) 5 (62.5%) 0
5 (62.5%) 0 3 (37.5%) 0
C. tropicalis (g. teste=5) 2 (40%) 2 (40%) 1 (20%)
3 (60%) 1 (20%) 1 (20%) 0
(g. controle=1) 1 (100%) 0 0
1 (100%) 0 0 0
C. krusei (g. teste=1) 1 (100%) 0 0
1 (100%) 0 0 0
(g. controle=0) - - -
- - - -
C. glabrata (g. teste=4) 0 2 (50%) 2 (50%)
0 0 4 (100%) 0
(g.c ontrole=0) - - -
- - - -
C. famata (g. teste=1) 1 (100%) 0 0
1 (100%) 0 0 0
(g.controle=0) - - -
- - - -
C. parapsilosis (g. teste=1) 0 1 (100%) 0
0 1 (100%) 0 0
(g. controle=8) 3 (37.5%) 2 (25%) 3 (37.5%)
4 (50%) 4 (50%) 0 0
C. sake (g. teste=0) - - -
- - - -
(g. controle=2) 1 (50%) 1 (50%) 0
2 (100%)
0
C. guilliermondii (g. teste=1) 0 0 1 (100%)
0 0 1 (100%) 0
( g. controle =0) - - -
- - - -
C. incons/norveg (g. teste=0) - - -
- - - -
(g. controle=1) 0 0 1 (100%)
- - 1 (100%) 0
TOTAL teste
controle
21 (51,2%)
8 (40%)
14 (34,2%)
8 (40%)
6 (14,6%)
4 (20%)
27 (65,8%)
12 (60%)
3 (7,3%)
4 (20%)
11 (26,9%)
4 (20%)
0
0
58
difuso. A maioria das amostras de C. albicans do grupo teste teve intensidade fraca (60,7%) e
padrão difuso (78,6%), enquanto a maioria das amostras do grupo controle mostrou
intensidade moderada (62,5%) e padrão difuso (62,5%), porém nenhuma de intensidade forte.
C. parapsilosis, com somente uma cepa representante no grupo teste, apresentou intensidade
moderada e padrão localizado; já as do grupo controle, houve equilíbrio entre os tipos fraco
(37,5%), moderado (25%) e forte (37,5%) e também quanto ao padrão de adesão, 50% do tipo
difuso e 50% do tipo localizado.
Emira et al. (2011) testando linhagens de C. albicans, verificaram que 61% delas
foram capazes de aderir às células HEp-2 e 83% às células Caco-2 (células de
adenocarcionoma do cólon humano). Já nos resultados encontrados neste trabalho, C.
albicans aderiu em mais de 80% nas células HEp-2 em ambos os grupos de estudo.
Também semelhante aos resultados aqui apresentados, porém diferenciando quanto
ao tipo de célula, alguns trabalhos já relacionaram a forte aderência de Candida spp às
Células do Epitélio Bucal - CEB (MACURA; BORT, 2001; COSTA, 2009; JAIN et al.,
2010). Ademais, Costa (2009) concluiu que a aderência às CEB foi significativamente maior
em amostras de C. albicans quando comparado com espécies NCAC (p<0,001) e Jain et al.
(2010) concluíram que C. albicans isoladas de pacientes HIV têm maior aderência às CEB do
que o grupo controle de indivíduos saudáveis. Já Pereiro, Losada e Toribio (1997) tiveram
uma conclusão distinta dos outros autores. Eles mostraram que a aderência de C. albicans,
isoladas da mucosa oral de pacientes em estágio inicial de AIDS, foi menor quando
comparado aos isolados de sujeitos sem infecção pelo HIV. Concluíram ainda que a aderência
desta espécie às células aumenta com o desenvolvimento da doença.
A aderência é o passo inicial para o desenvolvimento de outro fator de virulência
expresso por Candida. Após aderida a células ou a biomateriais, essa levedura produz uma
larga quantidade de substâncias extracelulares na presença de glicose. A partir daí, com a
persistência e colonização do tecido hospedeiro, é produzido um outro fator de virulência: o
biofilme (VINITHA; BALLAL, 2007).
59
AGREGATIVO
C. albicans
C. parapsilosis
DIFUSO
C. parapsilosis
AGREGATIVO
Grupo teste Grupo controle
Figura 12 - Aderência de Candida spp a células HEp-2. Aumento de 1000x ao microscópio óptico.
LOCALIZADO
C. parapsilosis
DIFUSO
C. albicans
60
5.9 Formação de biofilme
O biofilme foi formado por 69,4% das amostras do grupo teste e 69,2% das amostras
do grupo controle. C. albicans (55,0% e 37,5%, grupos teste e controle, respectivamente) foi a
espécie com o maior número de amostras não produtoras dessa propriedade de virulência.
Ainda, de quatro cepas de C. glabrata, somente duas foram positivas (50,0%) e C. sake foi a
única espécie não formadora de biofilme in vitro. Não houve diferença significativa entre a
produção de biofilme comparando-se os dois grupos (p=0,4956; U=636,00). Porém,
comparando C. albicans com espécies NCAC, em ambos os grupos foi encontrado diferença
altamente significativa (p<0,0001) para a maior formação deste fator de virulência por
espécies NCAC (Tabela 11).
Tabela 11 - Formação de biofilme in vitro por diferentes espécies de
Candida de pacientes com AIDS (grupo teste) e indivíduos
imunocompetentes (grupo controle).
Espécies Grupo teste Grupo controle
Positivas Negativas Positivas Negativas
C. albicans 16 13 3 5
C. tropicalis 6 0 1 0
C. krusei 6 0 - -
C. glabrata 2 2 - -
C. famata 2 0 - -
C. parapsilosis 1 0 13 1
C. guilliermondii 1 0 - -
C. sake - - 0 2
C. incons/norvegens - - 1 0
TOTAL (%) 34 (69,4%) 15 (30,6%) 18 (69,2%) 8 (30,8%)
Quanto à intensidade da produção de biofilme, em ambos os grupos, só houve
formação do tipo fraco e moderado, não havendo diferença estatística entre os grupos
(p>0,05) (Figura 13).
61
Figura 13 - Intensidade da produção de biofilme por amostras dos grupos teste e controle.
A alta frequência de formação de biofilme entre leveduras isoladas da cavidade bucal
também foram observados por Li et al. (2003). Esta habilidade é especialmente requerida em
pacientes que recebem nutrição parenteral, nos quais a concentração de glicose é geralmente
elevada. Importante salientar que o protocolo usado neste estudo para a formação de biofilme,
foi conforme o descrito por Shin et al. (2002), em que se acrescenta 6% de glicose na solução
final de BHI.
Gasparetto et al. (2005) em estudo com leveduras do gênero Candida isoladas de
pacientes com prótese e sem prótese, verificaram que em pacientes com prótese, C. albicans
foi maior formadora de biofilme e em pacientes sem prótese, prevaleceu as espécies NCAC.
Shin et al. (2002) observaram maior produção de biofilme por espécies NCAC,
principalmente por C. tropicalis (80,0%) e C. parapsilosis (73,0%). C. glabrata teve reduzida
formação de biofilme (28,0%). Para o mesmo autor, a formação de biofilme é implicada como
um fator de virulência potencial principalmente para C. parapsilosis. Também foi encontrado
neste trabalho maior formação de biofilme para espécies NCAC. Com exceção de C. sake que
não houve linhagem positiva (0/2), C. glabrata que formou biofilme em 50% (2/4) e C.
parapsilosis que teve somente uma amostra negativa, do grupo controle, (13/14), todas as
outras espécies NCAC foram 100% formadoras de biofilme, dados esses bastante
significativos.
0
5
10
15
20
25
Grupo teste Grupo controle
Produção de Biofilme
negativo fraco moderado forte muito forte
62
Um estudo realizado entre os anos de 2000 a 2004 com 294 pacientes com
candidemia mostrou a formação de biofilme em 80 amostras, representando 27,2% dos casos.
C. tropicalis foi a espécie que mais formou biofilme (20/28 - 71,4%), seguida de C. glabrata
(6/26 - 23,1%), C. albicans (38/168 - 22,6%) e C. parapsilosis (14/64 - 21,8%). Entretanto,
somente as infecções por C. albicans (p<0,001) e C. parapsilosis (p=0,003) foi associada com
aumento da mortalidade. (TUMBARELLO et al., 2007).
Entretanto para Douglas (2002), isolados de C. parapsilosis, C. tropicalis e C.
glabrata, dentre outros, possuem menor desenvolvimento de biofilme, quando comparados
com C. albicans. O mesmo foi observado por Kuhn et al. (2002), que comparando os
biofilmes de C. albicans e C. parapsilosis, observaram que C. albicans foi maior produtora, e
que, sob microscopia óptica, C. albicans possui uma diferença na morfologia do biofilme em
contraste com outras espécies, consistindo em uma camada basal de blastoconídios com uma
densa matriz composta de exopolissacarídeos e hifas. Em contraste, o biofilme de C.
parapsilosis possuiu menor volume e era composto exclusivamente por grupos de
blastoconídios.
Em se tratando de biofilme, C. albicans é relatada como um dos mais importantes
agentes de infecções hospitalares e são frequentemente isolados em associação com bactérias,
como Pseudomonas aeruginosa, em ITUs associadas a catéteres. A bactéria adere
extensivamente às leveduras, bem como às suas hifas, formando um biofilme misto em
catéteres urinários (EL-AZIZI et al., 2004; PIERCE, 2005; FALLEIROS DE PÁDUA et al.,
2008). A interação entre esses dois micro-organismos in vivo pode aumentar o risco e
severidade das infecções urinárias, contribuindo para a dificuldade do tratamento,
prolongando a hospitalização e os custos do tratamento.
A respeito dos catéteres, Shin et al. (2002) também descreveram em seus trabalhos
que os catéteres venosos centrais (CVC) parecem ser um fator de risco muito comum para o
desenvolvimento de candidemia em pacientes sem neutropenia ou imunodeficiência principal.
Ainda reportaram que C. parapsilosis é um importante colonizador e formador de biofilme
nos CVCs, sendo essa uma forma de o micro-organismo adentrar a corrente sanguínea em
pacientes submetidos à nutrição parenteral. Brito et al. (2006), também confirmaram, em um
relatório de 64 episódios de candidemia por C. parapsilosis em hospitais brasileiros, entre
2002 e 2003, que os fatores de risco primários eram, além do uso CVC, neutropenia e
quimioterapia para o câncer.
63
5.10 Resistência ao Soro
Em ambos os grupos, todas as cepas foram consideradas resistentes ou intermediárias
nos três meios testados (soro normal, soro tratado com EDTA e soro inativado), com exceção
de uma linhagem de C. albicans do grupo teste, que fora sensível ao soro humano (Tabela
12), diferença não relevante estatisticamente (p>0,05). Não houve diferença também para este
teste entre espécie de C. albicans e espécies NCAC.
Na literatura há poucos trabalhos sobre a resistência das leveduras ao soro. Santos et
al. (2002) trataram soro de camundongo com sobrenadantes de culturas de proteases
produzidas por C. albicans e avaliaram a capacidade deste soro no processo de fagocitose de
desta levedura. Os autores concluíram que as proteases secretadas por C. albicans podem ser
um fator de virulência, pois diminuem a atividade de opsonização do soro, e, por conseguinte,
reduz a fagocitose pelos receptores do sistema complemente, facilitando a sobrevivência da
levedura e sua colonização em tecidos e órgãos de hospedeiros, especialmente em pacientes
imunocomprometidos.
Vieira, Koh e Guth (2003) estudando resistência ao soro de Providencia alcalifaciens
comentaram que embora haja uma forte correlação entre resistência ao soro e habilidade de
uma variedade de bactérias para invadir e sobreviver na circulação sanguínea humana, foi
demonstrado também a sobrevivência de bactérias aparentemente suscetíveis ao soro, no
sangue de pacientes com bacteremia. Isto pode ser relacionado à ineficácia do soro de matar o
agente infeccioso.
Fernandes (2008) estudando os fatores de virulência de Escherichia coli de mastite
bovina, também encontraram somente um isolado sensível (3,7%), além de 11 (40,7%)
intermediários e 15 (55,5%) resistentes. Esses resultados sugerem que micro-organismos
como bactérias e especialmente leveduras do gênero Candida já conseguem driblar a
atividade de opsonização do soro, sendo altamente resistentes. No presente trabalho, das 75
amostras testadas, 98,7% foram resistentes (74/75), sendo somente uma amostra de C.
albicans, do grupo teste, sensível.
64
Tabela 12 - Teste de resistência ao soro com espécies de Candida provenientes de pacientes com AIDS (grupo teste) e imunocompetentes (grupo controle).
Grupo teste Grupo controle
Soro normal Soro + EDTA Soro inativado Soro normal Soro + EDTA Soro inativado
Espécies R S I R S I R S I R S I R S I R S I
C. albicans 28 1 0 27 0 1 26 0 2 8 0 0 8 0 0 7 0 1
C. tropicalis 6 0 0 6 0 0 6 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0
C. krusei 4 0 2 4 0 3 4 0 0 - - - - - - - - -
C. glabrata 4 0 0 4 0 0 3 0 1 - - - - - - - - -
C. famata 2 0 0 2 0 1 2 0 0 - - - - - - - - -
C. parapsilosis 1 0 0 1 0 0 1 0 0 14 0 0 13 0 1 14 0 0
C. guilliermondii 1 0 0 1 0 0 1 0 0 - - - - - - - - -
C. sake - - - - - - - - - 2 0 0 2 0 0 2 0 0
C. incons/norvegen - - - - - - - - - 1 0 0 1 0 0 1 0 0
TOTAL (%) 46
(93,8%)
1
(2,0%)
2
(4,2%)
44
(89,8%) 0
5
(10,2%)
46
(93,8%) 0
3
(6,2%)
26
(100%) 0 0
25
(96,1%) 0
1
(3,9%)
25
(96,1%) 0
1
(3,9%)
65
6 CONCLUSÃO
C. albicans foi mais prevalente no grupo de indivíduos com AIDS e C. parapsilosis no
grupo de indivíduos imunocompetentes;
Somente C. albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis foram produtoras de proteinase;
Comparado às espécies NCAC, C. albicans foram as maiores produtoras de proteinase
em ambos os grupos; já para fosfolipase, C. albicans foram maior produtoras no grupo
teste e as espécies NCAC no grupo controle; e para o biofilme, as amostras NCAC
foram maior formadoras em ambos os grupos;
Para os testes de gelatinase, hemólise em placa e com sobrenadante, adesão a material
inerte e a células HEp-2 e resistência ao soro não foram encontradas diferença entre C.
albicans e espécies NCAC;
Todas as espécies testadas têm capacidade hemolítica em placa, porém C. tropicalis
destacou-se pelos maiores índices hemolíticos;
Nos testes de hemólise com sobrenadante de cultura, somente C. albicans, C. glabrata
e C. parapsilosis hemolisaram na presença dos íons e/ou quelantes;
A grande maioria das cepas mostrou resistência ao soro humano, com somente uma
cepa de C. albicans do grupo teste sendo sensível;
Não foram encontradas diferenças significativas na produção de exoenzimas quando
comparados o grupo teste com o grupo controle, o que sugere que a maior prevalência
da manifestação clínica de candidíase oral em pacientes imunodeprimidos deve-se
mais à baixa imunidade do que necessariamente à maior virulência das espécies de
Candida nesses pacientes;
As cepas provenientes de indivíduos sadios podem ser as mesmas que venham a
colonizar a mucosa oral dessas pessoas quando numa situação de baixa imunidade,
tornando-os susceptíveis à manifestações clínicas produzidas pelas exoenzimas dessas
leveduras.
66
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78
APÊNDICE
79
APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO -TCLE
Projeto: Aderência e Expressão de Hemolisina e Proteinase por isolados de Candida
provenientes da mucosa oral de pacientes HIV positivos e de indivíduos imunocompetentes.
80
Projeto: Aderência e Expressão de Hemolisina e Proteinase por isolados de Candida
provenientes da mucosa oral de pacientes HIV positivos e de indivíduos imunocompetentes.
Prezado (a) Paciente,
Você está sendo convidado para participar de um estudo de pesquisa que pretende avaliar a
produção de fatores de virulência, como a capacidade de aderência e a produção de enzimas
hemolisinas e proteinases por cepas de leveduras (fungos que comumente existem na cavidade bucal)
coletadas de indivíduos imunossuprimidos (com problemas no sistema imunológico de defesa) e
imunocompetentes (que não manifestam doenças). Os resultados obtidos serão importantes porque
pode detectar diferenças na produção destes fatores entre indivíduos sem doença e os com doença,
buscando-se assim novas opções de diagnóstico e de terapia para essas doenças causadas por fungos
que afetam significativamente os indivíduos imunossuprimidos.
Com sua participação vamos coletar da sua cavidade bucal amostras de fungos (Candida)
para serem utilizadas nos testes. A coleta será feita com materiais descartáveis e estéreis, não durará
mais de alguns poucos segundos e é completamente indolor. Utilizaremos um cotonete de cabo longo
estéril e descartável (swab) para passar pela mucosa e colher amostras. O resultado da coleta será
fornecido a você e será colocado em sua ficha dentária para conhecimento seu. O seu nome não será
revelado para qualquer outro participante da pesquisa bem como seus dados e também não será escrito
ou publicado em nenhum veículo de comunicação. Lembre-se que você é saudável e que suas
amostras irão ser utilizadas na pesquisa como controle.
A pesquisa não lhe trará qualquer dano ou prejuízo e os benefícios obtidos serão muito
importantes para o diagnóstico, prevenção e terapia de infecções por fungos em pacientes que têm o
sistema de defesa deficiente e que têm facilidade em adquirir estas infecções.
Durante a pesquisa você pode fazer qualquer pergunta à doutora dentista que irá atendê-lo e
coletar a sua amostra e também à doutora responsável pela pesquisa. Você pode tirar quaisquer
dúvidas, fazer queixas, reclamações com qualquer um dos pesquisadores envolvidos.
Após todas estas informações, se você quiser colaborar e participar da pesquisa precisa
assinar esta folha concordando em ter entendido tudo o que foi explicado a você e que aceita, de livre
e espontânea vontade, de participar. Você também está ciente que pode sair ou desistir de colaborar a
qualquer momento sem prejuízo algum do seu atendimento regular pelo dentista.
Paciente: ____________________________ Data do aceite: ___/___/___
Nomes dos pesquisadores
Dra. Cristina de Andrade Monteiro Patrícia Valéria Gomes Castelo Branco
Orientadora Aluna do Mestrado em Biologia Parasitária
Laboratório de Micologia do UNICEUMA e-mail: [email protected] Fones: (98) 3214 4381; (98) 3214 4124
Dra. Conceição Pedrozo Dra. Patrícia Figueiredo
Colaboradora Coorientadora
Comitê de Ética em Pesquisa do UNICEUMA - Fone: (98) 3214 4277. End. Rua Josué Montello, Número 01,
Renascenca II, Sao Luis – Ma, Cep: 65075-120.
81
APÊNDICE B – PROTOCOLOS DE SUBMISSÃO DO ARTIGO “Prevalência e produção
de exoenzimas por espécies de Candida provenientes da mucosa oral de pacientes com AIDS
e de indivíduos imunocompetentes”
82
APÊNDICE C – Normas para Publicação da Revista de Patologia Tropical.
NORMAS PARA PUBLICAÇÃO
Escopo e política
A Revista de Patologia Tropical se propõe a difundir o conhecimento no campo das doenças
transmissíveis, incluindo seus agentes e vetores nos seres vivos e suas consequências na saúde pública.
Para isso, aceita artigos originais, comunicações (notas), relato de casos, atualizações e resenhas, tanto
na área humana como animal ou vegetal, sobre temas de interesse da Patologia Tropical e Saúde
Pública em português, espanhol e inglês.
Os manuscritos são submetidos aos consultores e somente são publicados quando recebem parecer
favorável. As opiniões emitidas são de inteira responsabilidade do autor, não refletindo a opinião do
Conselho Editorial. Os autores devem revelar quaisquer conflitos de interesse de ordem financeira,
pessoal ou de relações com pessoas ou organizações que, teoricamente, possam influenciar no teor do
manuscrito.
O encaminhamento do manuscrito deverá ser acompanhado de carta assinada por todos os autores, na
qual conste seus nomes completos e endereços eletrônicos, a reafirmação de que o material não foi
publicado nem está sendo submetido a outro periódico, além da concordância em transferir direitos de
reprodução em todas as mídias e formatos para a Revista de Patologia Tropical. Juntamente com o
manuscrito, devem ser apresentados nomes e endereços de correio electrônico de três revisores em
potencial. Os editores reservam-se o direito de decidir se os revisores sugeridos serão consultados.
As pesquisas que envolvam seres humanos ou animais requerem uma prévia aprovação do Comitê de
Ética correspondente.
Visando à globalização deste periódico, será dada preferência para artigos originais no idioma inglês.
Preparação do manuscrito
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da frase, a formatação é a seguinte: a) com um autor: Dubey (2003), b) com dois autores: Borges &
Mendes (2002), c) com mais de dois autores: Borges et al. (2007).
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entrada pelo último sobrenome do(s) autor(es). Quando houver mais de um trabalho do mesmo autor
citado, deve-se seguir a ordem cronológica das publicações.
Exemplos de referências:
83
a) artigo: Wilson M, Bryan RT, Fried JA, Ware DA, Schantz PM, Pilcher JB, Tsang VCW. Clinical
evaluation of the cysticercosis enzyme-linked immunoelectrotransfer blot in patients with
neurocysticercosis. J Infect Dis 164: 1007-1009, 1991.
b) artigo de revista na internet: Figueredo RM, Leite C. As práticas de precauções/isolamento a partir
do diagnóstico de internação em unidade de moléstias infecciosas. Rev Eletr Enf 8: 358-362, 2006.
Disponível em: http://www.fen.ufg.br/revista/revista8_3/v8n3a06. htm. Acesso em 01/12/2010.
c) dissertação/tese: Spadeto AL. Eficácia do Benzonidazol no tratamento de crianças com infecção
crônica pelo Trypanosoma cruzi após 6 anos de seguimento: Ensaio clínico aleatório, duplo-cego,
placebo controlado. Goiânia [Dissertação de Mestrado em Medicina Tropical - IPTSP/UFG], 1999.
d) livro: Smith PG, Morrow RH. Ensayos de Campo de Intervenciones en Salud em Países en
Desarrollo: Una Caja de Herramientas. OPAS. Washington, 1998.
e) capítulo de livro: Prata A R. Esquistossomose Mansoni. In: Veronesi R. Doenças Infecciosas e
Parasitárias. Guanabara-Koogan. Rio de Janeiro, 1991.
As referências devem estar de acordo com os requisitos para manuscritos em periódicos biomédicos
(Consulte: http://www.nlm.nih.gov/citingmedicine). Para abreviar os títulos dos periódicos, siga o
estilo usado no “Index Medicus”
(Consulte:http://ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=journals&TabCmd=limits). É necessário que as
chamadas numéricas correspondam ao número estabelecido na lista de referências. Notas de rodapé
devem ser evitadas.
Outros tipos de manuscritos que não sejam artigos originais, tais como comunicações (notas), relatos
de caso e atualizações, não precisam, necessariamente, seguir a estrutura descrita acima. As ilustrações
devem apresentar a qualidade necessária para permitir uma boa reprodução gráfica. Imagens digitais
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Aceite do artigo
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Endereço da Revista de Patologia Tropical: Caixa Postal 131, CEP 74001-970 Goiânia, GO, Brasil.
84
APÊNDICE D – Artigo submetido à Revista de Patologia Tropical.
Prevalência e produção de exoenzimas por espécies de Candida provenientes da mucosa oral de pacientes com AIDS e de indivíduos sem evidências clínicas de imunossupressão
Patrícia Valéria Gomes Castelo Branco (e-mail: [email protected] – Núcleo de Doenças
Endêmicas e Parasitárias, Programa de Mestrado em Biologia Parasitária – Universidade
Ceuma)
Dália Cristine Vaz dos Anjos ([email protected])
Fabiana Beserra do Nascimento ([email protected])
Iven Neylla Farias Vale ([email protected])
Conceição de Maria Pedrozo e Silva de Azevedo ([email protected])
Silvio Gomes Monteiro ([email protected])
Patrícia de Maria Silva Figueiredo ([email protected])
Cristina de Andrade Monteiro ([email protected])
RESUMO
Infecções por leveduras do gênero Candida têm gerado elevados índices de morbidade, longo
período de permanência em hospitais, dificuldade e alto custo de tratamento e altas taxas de
mortalidade. Indivíduos imunossuprimidos como os portadores da Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (AIDS) apresentam grande susceptibilidade a desenvolver essas
infecções devido ao baixo número de linfócitos T-CD4, menor que 200 cel/mm3. C. albicans
é a espécie mais estudada e está relacionada com os processos de colonização e
patogenicidade na boca do homem, sendo essa característica decorrente, dentre outros fatores,
da produção de exoenzimas facilitadoras da interação do fungo às células do hospedeiro. Este
estudo verificou a produção das exoenzimas proteinase, fosfolipase, gelatinase e hemólise de
amostras bucais de Candida isoladas de 49 (quarenta e nove) pacientes com AIDS (grupo
teste) e de 26 (vinte e seis) indivíduos sem evidências clínicas de imunossupressão (grupo
controle). C. albicans foi a espécie mais prevalente no grupo teste (59,2%) e C. parapsilosis
(53,8%) no grupo controle. C. albicans teve resultados significativos para produção de
proteinase (ambos os grupos) e fosfolipase, no grupo teste. Já as espécies de Candida não-
Candida albicans (NCAC) tiveram resultados altamente significativos para fosfolipase no
grupo controle. Para as enzimas gelatinase e hemolisina não foram encontradas diferenças
significantes entre C. albicans e espécies NCAC. Por fim, não foi encontrada diferença
estatística na produção de exoenzimas quando comparados o grupo teste com o grupo
controle.
PALAVRAS-CHAVE: Candida, exoenzimas, fatores de virulência, HIV/AIDS.
85
Prevalence and exoenzyme production by Candida species from the oral mucosa of AIDS
patients and individuals without clinical evidence of immunosuppression
ABSTRACT
Infections by Candida species have generated high rates of morbidity, long hospital stay,
difficulty and high cost in treatment and high mortality rates. Immunosuppressed individuals
such as those with Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) have greater susceptibility
to developing these infections due to the low number of CD4 T-lymphocytes, less than 200
cells/mm3. C. albicans is the most studied species and is related to the processes of
colonization and pathogenicity in man's mouth, and this characteristic is due to, among other
factors, production of exoenzymes which facilitate the interaction of the fungus with the’s
host cells. This study examined the production of exoenzymes protease, phospholipase,
gelatinase and hemolysis of samples of oral Candida isolated from 49 (forty nine) AIDS
patients (test group) and 26 (twenty six) individuals without clinical evidence of
immunosuppression (control group). C. albicans was the most prevalent species in the test
group (59.2%) and C. parapsilosis (53.8%) in the control group. C. albicans showed
significant results for the production of protease (both groups) and phospholipase, in the test
group. But the non-Candida albicans Candida (NCAC) species had highly significant results
for phospholipase in the control group. For enzymes gelatinase and hemolysin there were not
significant differences between C. albicans species and NCAC. Finally, there was no
statistical difference in the production of exoenzymes the test group compared with the
control group.
KEY WORDS: Candida, exoenzymes, virulence factors, HIV / AIDS.
INTRODUÇÃO
O aumento no número de infecções oportunistas causadas por fungos,
principalmente em indivíduos infectados pelo vírus HIV, tem estimulado novas pesquisas
para esclarecer os fatores de virulência e as circunstâncias da patogenicidade das várias
espécies desses micro-organismos44, 51
.
O vírus HIV, além de destruir o principal linfócito, o T-CD4, produz uma série de
outros distúrbios causados por micro-organismos tidos como comensais, como são os casos
das leveduras do gênero Candida, que causam muito comumente nos pacientes portadores
desse vírus, a chamada candidíase oral29
. Na última década, vários estudos mostraram uma
correlação positiva significante entre a ocorrência de candidíase e imunossupressão grave14, 46,
49.
A candidíase oral não é uma enfermidade mortal, mesmo que comprometa o paladar
e a deglutição, levando a uma diminuição do apetite, principalmente nos casos de pacientes
HIV-positivos ou de pacientes hospitalizados e idosos. Entretanto, é a porta de entrada para
complicações da candidíase do tipo orofaríngea, esofágicas, laríngeas e sistêmicas3.
A habilidade em produzir enzimas hidrolíticas é considerada um importante fator de
virulência, sendo as principais enzimas produzidas pelo gênero Candida, as proteinases e as
86
fosfolipases. Estas exoenzimas são conhecidas por desempenhar um papel importante na
invasão da célula do hospedeiro10
.
A secreção de proteinases ocorre pelos genes denominados Secreted aspartyl
proteinases (Saps), muito importantes e bem conhecidos em C. albicans. As proteinases
facilitam a invasão e colonização de tecidos hospedeiros pela ruptura das mucosas e degrada
importantes proteínas de defesa imunológica e estrutural47
, como albumina, hemoglobina,
queratina, colágeno, mucina, lactoferrina, lactoperoxidase e imunoglobulinas como as da
classe IgA13, 36
. Já foram identificados dez genes Saps em C. albicans24
, quatro em C.
tropicalis53
, três em C. parapsilosis33
e nenhum em C. glabrata47
e em outras espécies.
As enzimas categorizadas como fosfolipases (PLs, do inglês phospholipases)
também são consideradas fatores de patogenicidade em Candida. PLs são enzimas que
hidrolisam os fosfolipídios e os ácidos graxos e são classificadas em PLs A, B, C e D35
.
Vários estudos já mostraram que espécies de Candida não-Candida albicans (NCAC) são
capazes de produzir fosfolipases extracelular8, 16, 34
.
Outra importante enzima é a gelatinase, também chamada de metaloendopeptidase
extracelular. Ela é codificada pelo gene gelE e hidrolisa a gelatina, colágeno, caseína,
hemoglobina e outros compostos bioativos50
.
Há ainda a hemolisina, outro fator de virulência que contribui para a patogênese da
candidíase. As espécies de Candida usam essa enzima para degradar a hemoglobina ou
hemina e extrair o ferro das células do hospedeiro, facilitando, assim, a invasão de hifas numa
candidíase disseminada28, 47
.
O estudo destas enzimas é mais frequentemente descrito em C. albicans, onde se
sabe que elas desempenham um papel central na patogenicidade da candidíase43
. Assim,
pouco se sabe sobre a produção e secreção dessas exoenzimas por espécies NCAC e seu
subsequente papel na patogenicidade. Por esta razão, a proposta deste trabalho foi verificar a
produção de exoenzimas por espécies de C. albicans e NCAC, analisando a diferença na
produção entre um grupo de pacientes imunodeprimidos e um grupo controle de pacientes
saudáveis.
MATERIAL E MÉTODOS
População e amostra
Para o grupo teste foram usadas amostras de Candida provenientes da mucosa oral
de pacientes com AIDS, sob condições de terapia anti-viral, antifúngica, internados no
Hospital Presidente Vargas, na cidade de São Luís, Maranhão, Brasil. As leveduras foram
coletadas com o auxílio de “swabs” estéreis e posteriormente crescidas em meio BHI (Brain
Heart Infusion).
Essas amostras foram coletadas durante a realização da primeira parte da Tese de
Doutorado da Msc. Analúcia Guerra Terças (Projeto Avaliação do Extrato da Folha da
Goiabeira no Tratamento da Candidíase Oral em Ratos Imunossuprimidos; nº processo CEP
23115006540/2009-40 – Universidade Federal do Maranhão) e gentilmente cedidas pela
mesma para a Coleção de Isolados Fúngicos do Laboratório de Micologia da Universidade
Ceuma.
Para o grupo controle, voluntários sem evidências clínicas de imunossupressão,
negativos para o vírus HIV e outras patologias imunossupressoras, participaram da busca de
87
Candida spp de amostras bucais (nº processo CEP 226/2010 – Universidade do Ceuma). A
coleta consistiu no uso de swabs estéreis para retirada de saliva da região retromolar do
aparelho bucal e inoculação imediata em tubos de ensaio estéreis contendo BHI.
As amostras de ambos os grupos foram incubadas a 37 ºC por 24 horas para
crescimento e posterior isolamento em SDA (Sabouraud Dextrose Ágar) acrescido de
cloranfenicol. A identificação das espécies ocorreu presuntivamente pelo meio cromogênico
CHROMagar Candida® (BioMerieux, França) e posteriormente pelo método automatizado
VITEK YBC (BioMerieux, França).
Produção de exoenzimas
A determinação da produção de proteinases foi realizada de acordo com a
metodologia de Aoki et al. (1990) e a produção de fosfolipases pelo método em placa com
gema de ovo descrito por Price et al. (1982).
Os testes foram feitos em triplicatas e o valor da zona de precipitação (Pz) foi dado
como a média dos diâmetros avaliados (colônia / halo + colônia). A produção das duas
enzimas foi classificada de acordo com Price et al. (1982), por meio do valor da Pz: muito
forte ++++ (Pz≤0,69), forte +++ (Pz entre 0,70-0,79), média ++ (Pz entre 0,80-0,89) ou fraca
+ (Pz entre 0,90-0,99).
Para os testes de produção de gelatinase, seguiu-se o protocolo de Wilson (1930),
com algumas modificações. A atividade da gelatinase foi observada quando ocorreu a
liquefação da gelatina.
Para a produção de hemolisinas, primeiro preparou-se as RBC’s (Red Blood Cells)
por meio da centrifugação de sangue de carneiro desfibrinado com PBS (phosphate buffered
saline). Posteriormente seguiu-se a metodologia de Manns et al. (1994), considerando
algumas adaptações de Luo et al. (2001).
A intensidade da produção do fator hemolítico foi estimada pela razão: halo +
colônia / colônia. Os experimentos foram feitos em triplicatas e o resultado uma média dos
valores obtidos. A classificação foi feita de acordo com o Índice Hemolítico (IH): positiva
(1,00<IH<1,5); fortemente positiva (IH>1,5).
Análise estatística
Os dados foram avaliados pelo programa BioEstat 5.0 (2007). Inicialmente, a relação
dos resultados dos ensaios entre os grupos foi feito pelo teste de Mann Whitney. A relação
entre os grupos C. albicans e espécies de NCAC foi feita pelo teste de qui-quadrado de
independência (2). O nível de significância para se rejeitar a hipótese de nulidade foi de 5%
(p<0,05).
RESULTADOS
Frequência e distribuição das amostras
Quarenta e dois pacientes com AIDS – 17 mulheres e 25 homens – participaram da
pesquisa. Em seis desses pacientes foram identificados mais de uma espécie de Candida, o
que resultou em 49 (quarenta e nove) amostras para o grupo teste.
Para o grupo controle, 109 (cento e nove) voluntários participaram da pesquisa.
Destes, 67 eram mulheres e 42 homens, com idades entre 15 e 64 anos. Foram positivos para
88
leveduras do gênero Candida vinte e cinco indivíduos – 14 mulheres e 11 homens –,
equivalente a 23% dos voluntários. Em um mesmo indivíduo foram identificadas duas
espécies, totalizando assim, 26 amostras de Candida spp para o grupo controle.
Foram identificadas nove espécies distintas de Candida: sete no grupo teste e cinco
no grupo controle, conforme distribuição na Figura 1. A espécie mais prevalente no grupo
teste foi C. albicans e no grupo controle, C. parapsilosis.
Atividade proteolítica em placa
Para a produção de proteinase, 57 amostras (76,0%) foram positivas. Destas, 35
(71,4%) foram provenientes de pacientes com AIDS e 22 (84,6%) de pacientes
imunocompetentes, diferença estatisticamente não relevante (p=0,1072).
Do grupo teste, todas as amostras de C. albicans e C. tropicalis foram positivas,
entretanto foram as únicas produtoras (Figura 3). Do grupo controle, todas as amostras de C.
albicans também foram positivas, enquanto a única cepa de C. tropicalis, não; outras que
também apresentaram atividade proteolítica desse grupo foram as duas amostras de C. sake e
doze das quatorze amostras de C. parapsilosis (85,71%). As demais espécies não
apresentaram a enzima proteinase (Tabela 1). Assim, analisando estatisticamente, C. albicans
teve sobremaneira maior atividade proteolítica quando comparado às espécies de NCAC, em
ambos os grupos (p<0,001).
Quanto à classificação da intensidade da atividade proteolítica, as amostras de C.
albicans do grupo teste apresentaram produção de proteinase dos tipos média ++ (20,7%),
forte +++ (48,3%) e muito forte ++++ (31,0%); com semelhante produção no grupo controle,
média ++ (37,5%), forte +++ e (50%) muito forte ++++ (12,5%). Não houve amostra de C.
albicans em nenhum dos dois grupos apresentando produção de proteinase do tipo fraca. Já
para C. tropicalis, a maioria das amostras do grupo teste teve produção de proteinase do tipo
média ++ (50,0%); no grupo controle, a única cepa dessa espécie não produziu essa enzima.
Quanto a C. parapsilosis, a única amostra do grupo teste não foi produtora de proteinase;
enquanto no grupo controle, 75% apresentaram proteinase do tipo forte (+++) e os 25%
restantes, proteinase do tipo muito forte (++++). As duas amostras de C. sake do grupo
controle apresentaram proteinase forte +++ (Figura 2).
Teste de fosfolipase em placa
Para a produção de fosfolipase, 39 amostras (52,0%) foram positivas, sendo 27
(55,1%) provenientes de pacientes com AIDS e 12 (46,2%) de pacientes imunocompetentes.
Tal diferença não foi relevante estatisticamente (p=0,257).
Do grupo teste, somente C. albicans (93,1%) apresentou esta enzima (Figura 3). Do
grupo controle, todas as espécies foram produtoras: C. albicans com 60,0% e C. parapsilosis
com 55,5%; C. tropicalis, C. sake e C. incons/norvegen, com menor número de amostras,
apresentaram 100% de positividade (Tabela 1). A maior atividade de fosfolipase no grupo
teste por C. albicans e no grupo controle por espécies NCAC foi altamente significante
(p<0,001).
Quanto à intensidade da atividade de fosfolipase, todas as amostras positivas de C.
albicans do grupo teste, foram consideradas ter produção muito forte ++++. Já no grupo
controle, todas as amostras de C. albicans positivas apresentaram intensidade do tipo forte
89
+++, assim como C. tropicalis e algumas amostras de C. parapsilosis. Somente C.
parapsilosis e C. sake mostraram atividade muito forte ++++ no grupo controle (Figura 2).
Testes de gelatinase
Nos testes de produção de gelatinase, 52 amostras (69,3%) foram positivas, sendo 33
(67,3%) provenientes de pacientes com AIDS e 19 (73,1%) de pacientes imunocompetentes.
Tal diferença não foi relevante estatisticamente (p=0,571).
Com exceção de C. guilliermondii e C. incons/norvegen, com apenas uma amostra,
todas as outras espécies de Candida, de ambos os grupos, mostraram ter capacidade de
liquefazer a gelatina (Tabela 1; Figura 3). Comparando a produção de gelatinase entre as
amostras de C. albicans e espécies NCAC, não foi encontrada diferença estatística em
nenhum dos grupos (p>0,05).
Atividade hemolítica em meio sólido
Todas as espécies deste estudo, de ambos os grupos, apresentaram atividade
hemolítica em meio sólido: o grupo teste com 89,8% e o grupo controle com 76,9%. Pela
análise estatística essa diferença não foi significante entre os grupos (p=0,1190).
Somente C. albicans e C. glabrata do grupo teste, e C. albicans, C. parapsilosis e C.
sake do grupo controle, tiveram linhagens que não apresentaram o fator hemolítico (Tabela 1).
A espécie que produziu os maiores índices hemolíticos foi C. tropicalis (Figura 3),
com 67% e 100% das amostras fortemente positivas (grupo teste e controle, respectivamente).
Todas as outras espécies foram em sua maioria classificadas como positivas. O grupo teste foi
quem mais teve cepas produtoras de hemólise fortemente positivas (40,9%), comparado a
20% das amostras do grupo controle. Analisando os grupos C. albicans e espécies NCAC,
não foi encontrada diferença significativa em nenhum dos grupos para produção de
hemolisinas (p>0,05).
DISCUSSÃO
Espécies de Candida encontram-se presentes como comensais em superfícies de
mucosas, na pele do homem e de outros animais. Estima-se que 20 a 50% da população
convivam com esta levedura na boca, sendo C. albicans prevalente entre 60 a 90% dos
isolados, C. tropicalis em 7% e em menor frequência C. krusei, C. guillermondii, C. glabrata,
C. parapsilosis, C. dubliniensis, C. kefyr e C. lusitaneae4, 31
.
A incidência de C. albicans isoladas da cavidade oral tem sido encontrada em 45%
dos neonatos, 45-65% das crianças saudáveis, 30-45% dos adultos saudáveis, 50-65% das
pessoas com dentaduras removíveis, 65-88% das pessoas internadas por longo período, 90%
dos pacientes com leucemia aguda submetidos à quimioterapia e 95% dos pacientes com o
AIDS2.
Vários estudos buscam esclarecer quais espécies prevalecem mais em determinados
sítios do corpo e em determinados grupos de pessoas, a fim de compreender as circunstâncias
da patogenicidade. Como por exemplo, em estudo com espécies de Candida provenientes da
mucosa oral de pacientes com lesões bucais características de candidíase e indivíduos com a
boca clinicamente normal, Candido et al. (2000) encontraram maior prevalência de C.
albicans em ambos os grupos. C. albicans também esteve em maior porcentagem neste
90
estudo, entretanto, somente no grupo teste. No grupo controle, a espécie que prevaleceu foi C.
parapsilosis, diferindo de vários estudos onde C. albicans está em maiores proporções em
grupos de indivíduos saudáveis5, 22, 38
.
Bonassoli et al. (2005) também encontraram maior prevalência de C. parapsilosis
(51,0%) em indivíduos saudáveis, numa pesquisa com amostras de Candida coletadas de
mãos de profissionais que trabalham em hospital e de indivíduos da comunidade. A proporção
de C. parapsilosis foi ainda maior quando se considerou só os indivíduos da comunidade
(58,3%).
O aumento da frequência de espécies de NCAC isoladas de diversos sítios do corpo e
de dispositivos hospitalares é um fato que deve ser ressaltado, tendo em vista que muitos
estudos tendem a centrar a preocupação exclusivamente em C. albicans e menos importância
tem sido dada a outras espécies. Segundo El-Azizi et al. (2004), na candidíase bucal, por
exemplo, é cada vez mais frequente o isolamento de C. tropicalis, C. krusei e C.
guilliermondii. Para Pasqualotto (2004), C. albicans continua sendo o principal agente de
candidemia no Brasil, mas cresce os casos por C. parapsilosis e C. tropicalis.
Enquanto neste estudo foram isoladas seis amostras de C. tropicalis no grupo teste
(12,2%), só se isolou uma única amostra dessa espécie no grupo controle (3,9%). Para
Barbedo e Sgarbi (2010), a detecção de C. tropicalis está normalmente associada à infecção,
diferente de C. albicans que está associada à microbiota normal. Todavia em diversos
trabalhos5, 10, 38
, C. tropicalis foi a segunda espécie mais isolada de pacientes saudáveis,
perdendo somente para C. albicans. Resultado esse apenas observado para o grupo teste neste
estudo.
C. glabrata não foi encontrada no grupo de indivíduos sadios, corroborando os
trabalhos de Basu et al. (2003) e Neto (2004). A literatura relata maior prevalência dessa
espécie em pacientes com complicações de transplante de medula óssea, pacientes com câncer
e com o vírus HIV, além de pacientes idosos11
, grupos esses que não foram objeto deste
estudo para o grupo controle. Entretanto, para Kaur et al. (2005), C. glabrata é uma espécie
comensal, podendo ser isolada em indivíduos saudáveis.
A produção de proteinase é considerada um importante fator de virulência porque
aumenta a capacidade do micro-organismo colonizar e penetrar o tecido do hospedeiro, além
de enganar o sistema imune, quebrando um número significativo de importantes proteínas da
imunidade, como imunoglobulinas, proteínas do sistema complemento e citocinas23
. Assim, a
virulência de espécies de Candida diminui quando inibidores de proteinase são usados no
tratamento de candidíase, como já observado em C. albicans, sugerindo que o uso do inibidor
pode atuar como fungicida, diminuindo a presença de candidíase oral em pacientes com
AIDS45
.
Batista (2009) encontrou 91,0% de positividade para proteinase por amostras de C.
parapsilosis provenientes de catéter e do sangue de neonatos, o que corrobora em parte os
resultados encontrados neste trabalho, onde se obteve 85,7% de positividade para esta espécie,
porém nas amostras do grupo controle. Já Bonassoli et al. (2005) verificaram 100% de
positividade para proteinase em amostras de C. parapsilosis de indivíduos saudáveis.
Matsumoto et al. (2002) verificaram que 96,4% das amostras de C. parapsilosis
isoladas de sangue e catéter produziram proteinase fortemente positivas. Neste trabalho foi
verificado que 75% (9/12) das amostras dessa espécie apresentaram-se como forte e 25%
91
(3/12) como muito forte. Dados esses para o grupo controle, uma vez que a única amostra
dessa espécie do grupo teste foi negativa para esta enzima.
Em relação a C. glabrata, os resultados encontrados neste estudo concordam com
alguns trabalhos já publicados, em que nenhuma amostra dessa espécie mostrou atividade
proteolítica10, 39
. Esses resultados são corroborados ainda por Kaur et al. (2005), quando
compara a virulência de C. albicans com C. glabrata e afirma que a diferença da primeira
para a segunda, além da formação de hifas, é a produção de proteinases por C. albicans.
Rörig et al. (2009) encontraram resultados semelhantes aos obtidos neste estudo, com
100% de positividade para proteinase pelos isolados de C. albicans provenientes de amostras
clínicas.
Costa (2009) também encontrou alta atividade proteolítica em seus isolados clínicos.
As amostras de C. albicans foram maiores produtoras (88,1%) comparadas às espécies NCAC
(69,8%), porém essa diferença não foi importante estatisticamente. Também foi observado no
presente estudo, maior atividade proteolítica em C. albicans, comparado às espécies NCAC,
em ambos os grupos, entretanto estes resultados foram considerados altamente significantes
(p<0,001).
Interessante ressaltar é que apesar dos diversos estudos tentando relacionar a
atividade proteolítica com invasão e danos ao tecido do hospedeiro, Naglik et al. (2008) e
Lerman & Morschhauser (2008) relataram em seus trabalhos que não foi encontrado relação
entre a expressão do gene SAP com esses danos, o que talvez possa explicar o fato de
linhagens de Candida de pacientes sem quaisquer imunodepressão apresentar atividade
proteolítica na mesma proporção que cepas de pacientes com HIV/AIDS, por exemplo, como
mostrado neste estudo.
A fosfolipase está relacionada à maior capacidade de invadir o tecido. Algumas
funções desta enzima durante a infecção têm sido postuladas, dentre elas: penetração à célula
do hospedeiro, adesão às células epiteliais e invasão do epitélio oral humano45
.
No trabalho de Basu et al. (2003), 48,7% dos isolados de C. albicans, de amostras
clínicas de diversos sítios apresentaram atividade de fosfolipase, enquanto somente 6,7% das
amostras dessa espécie, provenientes de indivíduos saudáveis, foram positivas. Esses
resultados são corroborados pelo presente estudo, pois C. albicans produziu fosfolipase em
93,1% das amostras do grupo teste e somente em 37,5% do grupo controle.
Também semelhante ao observado neste estudo, Costa (2009) encontrou maior
produção de fosfolipase em amostras de C. albicans (55,9%) comparado às espécies NCAC
(37,7%) de amostras provenientes de pacientes com o vírus HIV, entretanto estatisticamente
não houve diferença significativa (p>0,05). Já no presente estudo, essa diferença foi
considerada altamente significante (p<0,001) para o grupo teste. No grupo controle
prevaleceu a produção de fosfolipase por espécies NCAC, o que também foi considerado
bastante significativo (p<0,001).
Diversos estudos têm relatado a capacidade de espécies NCAC para produzir
fosfolipase extracelular9, 20, 21
. C. tropicalis é conhecida por ter reduzida capacidade de
produção dessa enzima, embora vários autores relatem que a produção de fosfolipase
extracelular é fortemente dependente da linhagem. Já para a produção de fosfolipase por C.
glabrata, só foi encontrado na literatura o trabalho de Deça Júnior et al. (2011), que verificou
70,0% de positividade para as amostras clínicas.
92
Sobre a atividade da gelatinase em amostras de Candida não foram encontradas
referências na literatura. Os poucos estudos sobre fungos são relativos a fungos
filamentosos18, 48
. Assim, muito se tem a esclarecer sobre a produção dessa enzima nessas
leveduras. O que foi observado neste estudo é que, com exceção de duas espécies que só
continham uma amostra cada, todas as outras espécies de Candida aqui estudadas foram
capazes de liquefazer a gelatina. Um fato curioso foi que C. glabrata, considerada uma
espécie que causa alta mortalidade em pacientes debilitados11
, foi 100% negativa para a
produção de proteinase e fosfolipase, porém 100% positiva para a produção de gelatinase.
Quanto a hemolisina, sabe-se que ela facilita a invasão de hifas na mucosa do
paciente numa candidíase disseminada e tem capacidade de lisar hemáceas em busca de ferro
para favorecer seu crescimento e disseminação, vindo a causar anemia e déficit de transporte
de oxigênio nos pacientes. Assim, a produção desta enzima está relacionada à maior
virulência das cepas12, 25
. Isso talvez justifique o fato de que, embora todas as amostras deste
estudo de ambos os grupos, tenham demonstrado capacidade hemolítica, as cepas do grupo
teste foram significativamente mais hemolíticas (p<0,001), tendo mais amostras classificadas
como fortemente positivas (40,9%) em relação às cepas do grupo controle (20,0%).
Um estudo realizado por França et al. (2010) com 28 amostras clínicas de C.
tropicalis, 100% apresentaram atividade hemolítica, resultado semelhante ao encontrado
nesse trabalho. O mesmo foi encontrado por Deça Júnior (2010) em suas amostras clínicas de
C. tropicalis, além de 100% de positividade também para C. glabrata, seguida de C. albicans
(93,5%) e C. parapsilosis (28,6%).
CONCLUSÃO
C. albicans foi mais a espécie mais prevalente no grupo teste e C. parapsilosis no
grupo controle;
Somente C. albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis foram produtoras de proteinase;
Comparado às espécies NCAC, C. albicans foram as maiores produtoras de
proteinase em ambos os grupos; já para fosfolipase, C. albicans foram maior produtoras no
grupo teste e as espécies NCAC no grupo controle;
Para as enzimas gelatinase e hemolisina não foram encontradas diferença entre C.
albicans e espécies NCAC;
Todas as espécies testadas têm capacidade hemolítica, porém C. tropicalis destacou-
se pelos maiores índices hemolíticos;
Não foram encontradas diferenças significativas na produção de exoenzimas quando
comparados o grupo teste com o grupo controle, o que sugere que a maior prevalência da
manifestação clínica de candidíase oral em pacientes imunodeprimidos deve-se mais à baixa
imunidade do que necessariamente à maior virulência das Candida spp nesses pacientes;
As cepas provenientes de indivíduos sadios podem ser as mesmas que venham a
colonizar a mucosa oral dessas pessoas quando numa situação de baixa imunidade, tornando-
os susceptíveis às manifestações clínicas produzidas pelas exoenzimas dessas leveduras.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento
Científico do Maranhão – FAPEMA – pelo apoio financeiro.
93
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96
Figura 1 - Frequência e distribuição das amostras de Candida provenientes da mucosa oral de pacientes com
AIDS e de indivíduos imunocompetentes.
Tabela 1 - Produção de exoenzimas por diferentes espécies de Candida de pacientes com AIDS (Grupo teste) e
indivíduos imunocompetentes (Grupo controle).
ESPÉCIES
PROTEINASE FOSFOLIPASE GELATINASE HEMOLISINA
Teste Controle Teste Controle Teste Controle Teste Controle
+ - + - + - + - + - + - + - + -
C. albicans 29 0 8 0 27 2 3 5 22 7 7 1 25 4 7 1
C. tropicalis 6 0 0 1 0 6 1 0 3 3 0 1 6 0 1 0
C. krusei 0 6 - - 0 6 - - 2 4 - - 6 0 - -
C. glabrata 0 4 - - 0 4 - - 4 0 - - 3 1 - -
C. famata 0 2 - - 0 2 - - 1 1 - - 2 0 - -
C. parapsilosis 0 1 12 2 0 1 5 9 1 0 11 3 1 0 10 4
C. guilliermondii 0 1 - - 0 1 - - 0 1 - - 1 0 - -
C. sake - - 2 0 - - 2 0 - - 1 1 - - 1 1
C. incons/norveg - - 0 1 - - 1 0 - - 0 1 - - 1 0
TOTAL
(%) 35
(71,4)
14
(28,6)
22
(84,6)
4
(15,4)
27
(55,1)
22
(44,9)
12
(46,2)
14
(53,8)
33
(67,3)
16
(32,7)
19
(73,1)
7
(26,9)
44
(89,8)
5
(10,2)
20
(76,9)
6
(23,1)
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0
C. albicans
C. famata
C. glabrata
C. guilliermondii
C. inconspicua
C. krusei
C. parapsilosis
C. sake
C. tropicalis
59,2
4,1
8,2
2.0
0.0
12,2
2,0
0,0
12,2
30,8
0.0
0.0
0,0,
3,8
0,0
53,8
7,7
3,8
%
Esp
éci
e
HIV Negativo
HIV Positivo
97
Figura 2 - Intensidade da produção de proteinase e fosfolipase pelas amostras dos grupos teste e controle.
Figura 3 - Produção de exoenzimas por amostras Candida isoladas da mucosa oral de pacientes com AIDS e de
indivíduos imunocompetentes (A – proteinase: formação de halo transparente por todas as amostras de C.
albicans; B – fosfolipase: formação de halo opaco somente por C. albicans; C – gelatinase: a amostra do tubo
superior liquefez a gelatina, a do tubo inferior, não; D – hemólise: formação de halo de hemólise pelas amostras
de C. albicans e C. tropicalis).
C. albicans
ATCC C. tropicalis
C. tropicalis
C. tropicalis
A B
C D
B
98
ANEXOS
99
ANEXO A – PARECER DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA E PESQUISA
DA UNIVERSIDADE CEUMA
Projeto: Aderência e Expressão de Hemolisina e Proteinase por isolados de Candida
provenientes da mucosa oral de pacientes HIV positivos e de indivíduos imunocompetentes.
100
101
102
103
ANEXO B – PARECER DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA E PESQUISA
DA UNIVERSIDE FEDERAL DO MARANHÃO
Projeto: Avaliação do Extrato da Folha da Goiabeira no Tratamento da Candidíase Oral em
Ratos Imunossuprimidos
104
105
106
ANEXO C – CERTIFICADO DE APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NA VI JORNADA
CIENTÍFICA DO HOSPITAL UNIVERSITÁRIO DA UFMA
107
ANEXO D - CERTIFICADO DE APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NA SEMANA
NACIONAL DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA 2011
108
ANEXO E: CERTIFICADO DE APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NO CONGRESSO
BRASILEIRO DOS CONSELHOS DE ENFERMAGEM – 14 CBCENF
109
ANEXO F: CERTIFICADO DE APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NO CONGRESSO
BRASILEIRO DOS CONSELHOS DE ENFERMAGEM – 14 CBCENF
110
ANEXO G: CERTIFICADO DE APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NA XI SEMANA
DE ENFERMAGEM DO UNICEUMA
111
ANEXO H: CERTIFICADO DE APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NA 64ª
SOCIEDADE BRASILEIRA PARA O PROGRESSO DA CIÊNCIA – SBPC