Mecanismos de virulência em bactérias

Bactérias patogênicas possuem um vasto arsenal de organelas de superfície e de moléculas com atividade tóxica para o hospedeiro

conquista e ocupação de diferentes nichos, no curso da infecção

Ferramentas para a aderência, colonização e invasão :

moléculas proteicas monoméricas e complexos multiméricos que realizam funções altamente sofisticadas – verdadeiras nanomáquinas...

1. Aderência às mucosas > colonização > elaboração de toxinas Aderência;multiplicação local e colonização – microcolonias, biofilmes, quorum-sensing;elaboração de toxinas;

2. Aderência às mucosas > penetração > multiplicação local ou invasão sistêmica

invasão de superfícies epiteliais, endoteliais ou tecidos;sobrevivência intracelular

Aderência bacteriana a células – observação por microscopia de imunofluorescência

Estratégias bacterianas para aderir a células do hospedeiro

Pili e fímbrias –organelas proteicas, projetam-se da superfície bacteriana

inicialmente descritas em bactérias Gram-negativas

distinção sutil entre pili e fímbrias – organelas dedicadas exclusivamente a aderência

organização geral : haste cilíndrica ancorada a membrana externa, com região diferenciada na extremidade distal, a adesina, dedicada a ligação com um receptor celular

Fimbria P ou Pap (pyelonephritis-associated pilus)

Escherichia coli uropatogenicas envolvidas em lesão renal (pielonefrite)

Aderência bacteriana via fímbrias – etapas do processo

Codificação dos genes da fímbria Pap - cluster gênico

conjunto de genes regulatórios e biossintéticos:coordenam a síntese das subunidades da fimbria,

chaperoninas e proteinas de ancoragem (usher) na membrana externa

biogênese pela via “chaperonina-usher”

a chaperonina periplasmica PapD transporta as subunidades da plataforma de montagem situada

na membrana externa (PapC)esta plataforma facilita a translocação para a

superfície bacteriana das subunidades formadoras da fimbria

(haste e adesina distal – PapG)

biogênese da fimbria Pap

Fimbria tipo 1 – outra fimbria encontrada em E. coli saprófitas e em cepas patogênicas, inclusive UPEC

associadas a infecções urinárias baixas

Adesinas não fimbriais

são produzidas por bactérias Gram-negativas e Gram-positivas

Pili tipo IV

apresentam grande interesse - encontrados em bactérias Gram–negativas patogênicas

Escherichia coli enteropatogenica, Salmonella Typhi, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila,

Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio cholerae

Pili tipo IV de Vibrio cholerae (TCP) – apresenta-se como feixes de fibrilas; permite ligações laterais,

formando agregados bacterianos nas mucosas

Escherichia coli enteropatogênicas também produzem pili tipo IV (BFP) - microcolônias sobre

células epiteliais cultivadas in vitro , observadas em microscopia convencional e eletrônica

Adesinas em bactérias Gram-positivas predominam adesinas não-fimbriais:Clostridium perfringens, Actinomyces,

Streptococcus agalactiae, S. mutans, S. pneumoniae, Staphylococcus aureus

interações com proteinas da matriz extracelular (colágenos, lamininas, elastina, hialuranos) e

glicoproteinas (fibronectina, vitronectina, fibrinogênio)

ligação direta às proteínas

exploração da capacidade de ligação da proteina (especialmente fibronectina) a outros substratos (células, tecidos)

enorme capacidade de modulação da atividade adesiva

Estratégias de bloqueio da aderência bacteriana

Quorum-sensingsistemas que regulam a expressão de genes em função da densidade bacteriana local

mecanismo geral das bactérias

em patógenos – opera na regulação da expressão de genes de virulência:

produção de toxinas, enzimas líticas, biofilmes, estruturas de superfície etc.

molécula autoindutora, secretada pela bactéria e receptor intracelularo receptor intracelular, ativado pela ligação com a molécula autoindutora, atua sobre o gene promotor do gene de virulência, levando à sua expressão

Com o aumento da densidade bacteriana, aumenta a concentração do autoindutor e a saturação dos

receptores; estes se ativam totalmente e induzem a regulação positiva (transcrição) de genes de

virulência – proteases, toxinas, fimbrias, biofilme etc.

Mecanismos de quorum-sensing em Pseudomonas aeruginosa

Produção de toxinas

Estratégias de bloqueio do QS – (i) inibidores da ligação autoindutor-receptor ou (ii) inibição da síntese

do autoindutor

Toxinas bacterianas

1880 – filtrados de culturas de Corynebacterium diphteriae reproduziam a doença em animaisexotoxinas – proteínas ou peptídeos, são secretadas e interagem com receptores específicos, nas células-alvo

exotoxinas AB – região catalítica (A) e região de ligação ao receptor celular (B)em alguns casos, a toxina secretada requer digestão proteolítica no ambiente, para ser ativa – botulismo

alvos das exotoxinas AB: inibição de síntese protéica, interferência na

transdução de sinais, ação sobre a polimerização de actina, ação sobre o

tráfego de vesículas endossomicas

Exemplo de exotoxina AB – toxina Shiga de Escherichia coli enterohemorrágica

Interrupção da síntese protéica na célula-alvo pela clivagem enzimática e remoção de um nucleotídeo

(adenina) do RNA 28S do ribossoma, impedindo a sua interação com os fatores de alongamento 1 e 2

Outras exotoxinas:toxinas ativas em membranas:

não penetram nas células ou possuem domínios catalíticos

principais famílias: formadoras de poros – citolisinas termo-estáveis – ligam-se a receptores e estimulam cascatas de transdução de sinais superantígenos – ligam um componente do complexo principal de histocompatibilidade a receptores de linfócitos T, promovendo interação independente do antígeno e determinando a estimulação policlonal dos linfócitos.

Os quatro principais grupos de exotoxinas bacterianas

Endotoxinasnatureza lipopolissacarídica – LPS (porção lipídica)são liberadas pela lise bacterianainteragem com receptores em inúmeras células:

macrófagos, linfócitos B, células endoteliais etc.determinam a liberação de citocinas pró-inflamatórias como IL-1, TNF-alfa, IL-6, prostaglandinas

A liberação maciça de LPS:ativa o complemento, causa hipotensão,

vasodilatação e choque, determina hemorragias nos capilares, ativa a cascata da coagulação -

coagulação intravascular disseminada

Produção de toxinas

exotoxinas e endotoxinas

Invasinas1) associação com integrinas e internalização

integrinas e caderinas – transmitem sinais bioquímicos e força mecânica entre a membrana celular e o citoesqueleto de actinamicrorganismos que ligam-se a estas moléculas podem explorar as suas propriedades – internalização

alvo mais comum – integrinas da classe alfa5 beta 1

embebidas na membrana celular, estas proteínas transmembrana estabelecem ligações com a matriz

extracelular, ligando-se a fibronectina

Integrina – molécula transmembrana, conecta o citoesqueleto a matriz extracelular

Matriz extracelular

citoplasma

tração

invasina de Yersinia enterocoliticaintimina de Escherichia coli enteropatogênica

possuem alta afinidade por integrinas - simulam a estrutura das fibronectinasocorrendo a interação invasina-integrina, a região citoplasmática da integrina recruta componentes que operam como sítios de ligação para proteínas associadas ao citoesqueletoa) ativação da cinase FAKb) ativação de proteínas reguladoras de actina:

GTPases como Rac1 e Arf6c) produção local de fosfatidilinositol 4,5 difosfato, mensageiro secundário que determina a ativação e localização de moléculas reguladoras de actina

Integrina – molécula transmembrana, conecta o citoesqueleto a matriz extracelular

Bactéria com invasina

citoplasma

tração

bactériainvasina

Invasão de célula epitelial por Yersinia enterocolitica – ligação entre invasina e integrinas; a força mecânica

gerada promove a entrada da bactéria

E-caderina – ligação entre células vizinhas (junções oclusivas)

Listeria monocytogenes interage com a caderina e sofre internalização

tração

2) Sistema de secreção tipo 3 e invasãoa montagem do SST3 é estimulada pelo contato com

a membrana da célula-alvocluster de genes responsáveis pela síntese de:

a) cerca de 20 proteínas estruturais participam da formação de uma agulha (ou injetissoma) que atravessa a parede celular bacteriana e a membrana plasmática da célula-alvo;

b) chaperoninas – proteínas especializadas, servem como molde para a dobradura de subunidades proteicas, protegendo-as da degradação ou oligomerização prematura;

c) proteínas efetoras, injetadas na célula-alvo;

d) proteínas reguladoras da atividade do SST3

Diagrama e imagens ao microscopio eletrônico do SST3 ; organização dos genes em uma ilha de patogenicidade

Proteinas efetoras são translocadas por um SST3 e exercem várias funções: ativação de GTPases, modulação do

metabolismo do inositol-polifosfato, despolimerização da cofilina – resulta em mobilização local da membrana (ruffling) e

internalização bacteriana

Estudos in vitro empregando a infecção de células epiteliais vem decifrando a dinâmica em tempo real da atividade das moléculas efetoras translocadas pelo SST3

em Salmonella enterica, a translocação é muito rápida;ocorre a partir de um “pool” de SipA pré-formado;todo o “pool” pode ser injetado entre 100-600 segundos

em Shigella flexneri, os efetores IpaB e IpaC pré-sintetizados são mantidos em associação com chaperoninas;disponíveis para injeção imediatamente após o contato com a célula-alvo

Estratégias bacterianas para assegurar a infecção intracelular: intralisossomal – em compartimentos acídicos e hidrolíticos que interagem com a rede endossomica da célulaCoxiella

intravacuolar – em vacúolos não acídicos que interagem pouco ou não interagem com a rede endossomicaSalmonella – remodela o fagossomo > ilha de patogenicidadeMycobacterium – bloqueia a maturação do fagossomo

citoplasmática – o patógeno liberta-se do fagossoma e passa a residir no citoplasma Shigella, Listeria, Riquétsias

Destino das bactérias intracelulares – sobrevivência e replicação

Espalhamento célula-célula de patógenos intracelulares:

Shigella flexneri - microscopia eletrônica e microscopia de imunofluorescência

Motilidade intracelular e passagem entre células através das membranas adjacentes