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2.1 – Identificar os mecanismos de virulência dos microrganismos: fatores e proteínas de

adesão, capsula, toxina (endo e exotocinas), esporos, resistência aos agentes

antimicrobianos.

Poder Patogénico:

O poder patogénico de microrganismos está associado à capacidade que este tem de

se implantar num hospedeiro e deste modo causar transtornos a este. Deste modo, o poder

patogénico está essencialmente ligado a:

Produções de lesões nos tecidos – alguns constituintes do microrganismo como por

exemplo enzimas que esta excreta podem atacar os tecidos vizinhos. Outro exemplo pode ser

a libertação de produtos tóxicos provenientes do metabolismo bacteriano.

Produção de toxinas – toxinas proteicas (exotoxinas) ou toxinas glicoproteicas

(endotoxinas).

O efeito patogénico varia tanto em função do tipo de microrganismo como das

condições de saúde do hospedeiro.

Existem várias etapas no processo infeccioso como a transmissão, aderência,

colonização, invasão, multiplicação, formação de lesões no hospedeiro e libertação do

hospedeiro com vista à entrada num novo hospedeiro.

As etapas que o patogenéo segue com vista a provocar a doença são a aderência,

colonização e libertação de moléculas efectoras.

1) Aderência

Utilizam adesinas para aderir às células do hospedeiro. As adesinas localizam-se

habitualmente nas extremidades das pili ou fimbriae. A ligação das adesinas aos receptores

das células do hospedeiro são altamente especificas.

2) Colonização

Para ocorrer a colonização o microrganismo tem que se multiplicar para colonizar.

Ocorre competição com a flora saprófita por espaço e nutrientes.

3) Libertação de moléculas efectoras

A libertação de moléculas efectoras induz alterações nas células do hospedeiro que

incluem a perda das microvilosidades, destruição da superfície celular e degradação dos

complexos proteínas-glúcidos existentes entre as células.

b) Factores de virulência

Factores de virulência – produtos ou enzimas que promovem a disseminação da bactéria

patogénica através do corpo do hospedeiro. Os factores de virulência incluem os factores de

aderência, factores de disseminação e toxinas bacterianas (endotoxinas e exotoxinas).

Factores e proteínas de adesão

Fimbriae – Estruturas filamentosas que permitem que as bactérias se fixem a

superfícies sólidas e outras células, estando assim envolvidas no estabelecimento de infecções.

Pequenos apêndices de origem proteica com origem na membrana citoplasmática. Atravessam

a parede e estendem-se para o exterior.

Filamentos de hemaglutinina – causam a agregação dos eritrócitos.

Cápsulas e glicocalixes – Geramente compostas de polissacarideos. Bem organizada e

dificilmente é removida da célula. Têm a função de proteger contra as defesas do hospedeiro

(inibindo a fagocitose), ajuda na ligação a superfícies (formação de biofilmes) e facilita a

mobilidade ou deslizamento das bactérias.

Ácidos teicóicos e lipoteicóicos – componentes das paredes celulares das bactérias

Gram + e ajudam à aderência. São polímeros de glicerol ou ribitol ligados por grupos fosfato.

Conferem carga negativa à superfície celular. Estimula a resposta imunitária específica.

S-Layer e Slime Layer – Promovem a aderência a superfícies. As slime layers são

constituídas por polissacarideos, desorganizadas e facilmente removidas. As S-layer são

estruturas proteicas ou glicoproteicas. Ambas têm uma função idêntica à das cápsulas.

Toxinas bacterianas

Toxinas bacterianas – produzem a doença, mesmo na ausência do organismo que as

produziu. Podem ser exotoxinas ou endotoxinas.

Há 2 tipos de toxinas:

Endotoxinas – estas toxinas são unicamente produzidas por bactérias Gram-

negativas. Podemos encontrá-las nas suas membranas externas ou podem ser também

libertadas aquando da destruição da célula Gram-negativa que as contém. Algumas das suas

características:

Comuns a todas as bactérias Gram-negativas;

Com padrões moleculares (PAMPs – padrões moleculares associados a patogéneo)

que se ligam a receptores (TRL) os macrófagos (células do sistema imunitário).

Estimulam produção de prostaglandinas e citocinas.

A acção das endotoxinas de bactérias Gram-negativas ocorre durante a infeção e

provocam efeitos sistémicos no hospedeiro.

o Baixas concentrações: estimulação do início de respostas defensivas

(febre, vasodilatação, activação de respostas imunes e respostas

inflamatórias).

o Altas concentrações: podem estimular resposta excessiva do sistema

imunitário. Esta situação pode ter efeitos seriamente devastadores no

organismo do hospedeiro e, por vezes, podem mesmo resultar na sua

morte. Altas concentrações também podem activar via alternativa do

sistema de complemento (febre, hipotensão e choque devido à

vasodilatação, derrame capilar e coagulação intravascular).

As bactérias Gram-negativas possuem lipopolissacarídeos (LPS) que desencadeiam

respostas inflamatórias. A porção A (lípido) do LPS é que é responsável pela actividade

endotóxica.

Exotoxinas – são proteínas que podem ser produzidas por bactérias Gram-

negativas e Gram-positivas. Incluem enzimas citolíticas (α-toxinas) e proteínas que se ligam a

receptores que alteram a função da célula ou a destroem.

Estas toxinas, quando produzidas por bactérias Gram-negativas têm tendência a apresentar

efeitos limitados e mais específicos. Incluem mecanismos de transporte, sinalização

intracelular e ribossomas que apresentam efeitos variados. Alguns exemplos são a toxina da

difteria, a toxina do tétano e a do botulismo.

As principais características das exotoxinas são:

Associadas principalmente a bactérias Gram-positivas;

A sua produção e libertação é feita por bactérias vivas;

São específicas para alvos celulares específicos (sendo que o tipo de toxina varia

com a espécie bacteriana);

Algumas provocam a destruição do hospedeiro e ajudam na propagação da bactéria

nos tecidos (enzimas que destroem componentes bioquímicos-chave dos tecidos

ou especializados na destruição de membranas celulares do hospedeiro);

Determinadas exotoxinas interferem ou inativam atividades intracelulares

específicas (por exemplo, interrompem a síntese proteica, sinais intracelulares ou

o sistema neuromuscular).

Por outro lado, quando as exotoxinas são produzidas pelas bactérias Gram-positivas,

ocorre a libertação de peptidoglicano e respetivos produtos de degradação, assim como de

ácidos teicóico e lipoteicóico. Assim, ocorre uma estimulação de respostas pirogénicas de fase

aguda.

Esporos

O endósporo é produzido por certas bactérias Gram + quando estas estão sujeitas a

condições ambientais extremas (ausência de nutrientes, desidratação, temperaturas elevadas,

entre outros). É uma estrutura dormente resistente a agressões ambientais adversas. Assim os

esporos são um mecanismo de virulência visto que as espécies produtoras de esporos são

altamente resistentes.

Resistência aos agentes antimicrobianos

Capacidade adquirida de um microrganismo patogénico para resistir aos efeitos de um

agente quimioterapêutico ao qual era suscetível. Ocorre uma diminuição ou perda da

eficiência do agente antimicrobiano no tratamento da doença infeciosa causada pelo

microrganismo. Trata-se de um problema de saúde pública.

Esta resistência tem sido acelerada pelo uso indiscriminado de agentes

antimicrobianos.

Mecanismos de resistência a agentes antimicrobianos em estirpes microbianas resistentes:

- Redução da permeabilidade da parede e membrana plasmática ao fármaco.

- Inactivação da molécula devido a modificação enzimática ou quebra da mesma.

- Modificação química do alvo biológico.

- Desenvolvimento de via bioquímica alternativa.

- Expulsão do fármaco para fora da célula por sistema de transporte activo (efluxo).

A resistência resulta da selecção e expressão de genes específicos, presentes em

plasmidios (plasmidios R) ou no genoma bacteriano

2.2 Identificar a capacidade de evasão aos mecanismos de defesa do hospedeiro.

Os mecanismos usados pelas bactérias para fugir das respostas protectoras do

hospedeiro são considerados como factores de virulência, por exemplo, a cápsula é um dos

factores de virulência mais importante, um biofilme, composto de material capsular pode

impedir que anticorpos e complemento tenham acesso à bactéria. Estes mecanismos incluem:

- inibição da fagocitose e da morte intracelular no fagócito;

- inactivação da função do complemento(bloqueio da c5a que fomenta a quimiotaxia);

-Produção de proteases anti imunoglobulina A – produção, por parte dos

microorganismos, de uma protease (enzima que quebra ligações peptídicas) que degrada a

imunoglobulina A

-Crescimento intracelular – crescimento celular do microorganismo no interior das

células hospedeiras (normalmente no interior dos fagócitos quando resistem à fagocitose).

Não ocorre resposta imunológica uma vez que a superfície celular pertence ao hospedeiro,

podendo assim disseminar-se pelo organismo.

-Mudança na aparência antigénica bacteriana-

modificação dos antigénios da superfície dos

microrganismos de modo a mimetizar componentes da

superfície das células hospedeiras (o organismo não

ataca o que reconhece como próprio).

Alguns microrganismos sobrevivem e

multiplicam-se dentro de macrófagos e usam-nos

como reservatório protector ou sistema de transporte

para ajudar a espalhar os microrganismos pelo corpo.

Contudo os macrófagos activados podem matar os

patogénios intracelulares.

2.3 Identificar os mecanismos de defesa do hospedeiro: Barreiras naturais; Mecanismos de

defesa não específicos (resposta inflamatória, resposta celular e interferão);

mecanismos de defesa específicos (imunidade celular, imunidade humoral)

Mecanismos de defesa

1. Barreiras naturais

2. Defesas não específicas

3. Defesas específicas

Barreiras naturais:

São defesas de primeira linha que constituem uma proteção composta por barreiras

físicas, químicas e genéticas, que impem os micróbios de penetrarem nos compartimentos

estéreis do corpo.

Estas incluem a pele, membranas mucosas (tratos respiratório, urogenital, digestivo e

olhos) e as chamadas “defesas químicas” , tais como o ácido clorídrico no estômago, secreção

sebácea, pH ácido da pele, lisozima entre outros.

Todos estes exemplos apresentam condições desfavoráveis para a

sobrevivência/desenvolvimento da maior parte dos microrganismos.

Defesas não específicas:

Constam da segunda linha de defesa, que atua rapidamente caso os agentes infeciosos

atravessem as barreiras superficiais, Tratando-se assim de um conjunto de estratégias de

reconhecimento de estruturas moleculares típicas, comuns a diferentes agentes patogénicos,

que engloba. a resposta inflamatória, a fagocitose, a atuação de interferões e o complemento.

A resposta é igual independentemente do número de vezes que o organismo

patogénico já entrou em contacto com o hospedeiro, não há memória, ao contrário da

imunidade específica.

A inflamação é um mecanismo de defesa para conter uma infeção impedindo que esta

se espalhe além do foco inicial e serve para sinalizar as respostas imunes específicas seguintes.

Primeiramente, há uma expansão dos capilares para aumentar o fluxo sanguíneo e um

aumento da permeabilidade da estrutura microvascular para permitir a saída dos leucócitos da

circulação. Por fim, há uma acumulação de leucócitos como resposta à infeção, atraídos por

fatores quimiotáticos, como por exemplo, componentes do complemento e produtos

bacterianos.

Como resposta celular, os fagócitos são os primeiros a chegar ao sítio da inflamação.

Entre eles, destacam-se os neutrófilos (infeção bacteriana), os eosinófilos (infeção parasitária)

e os monócitos. Estes fagocitam e depois matam as bactérias internalizadas.

Os macrófagos, quando ativados, libertam citocinas - proteínas solúveis, segregadas

por células do sistema imunitário e que atuam como mensageiros para ajudar a regular a

resposta imune (ex: TNF e interferão α). Entre elas podem encontrar-se os interferões –

glicoproteinas que atuam sobre as células e que impedem a replicação viral.

Desta forma, as citocinas:

- Promovem a resposta de fase aguda que inclui febre, sonolência e produção de

proteínas que vão facilitar a remoção dos microrganismos através de uma fagocitose maior;

-ativam as células NK (matam as células infetadas por vírus);

-ativam as respostas específicas.

*Interferão

Os interferões induzem um estado de resistência antiviral em células teciduais não

infetadas. O vírus, ao replicar-se, vai ativar o gene codificante do interferão. Após a síntese

proteica, a proteína sai da célula e entra na corrente sanguínea, até chegar às células vizinhas

que ainda não foram atacadas. A proteína liga-se à membrana celular dessas células e ativa

o gene codificante de proteínas antivirais. Estas proteínas antivirais, por sua vez, vão impedir a

replicação do vírus, quando este tentar replicar-se nessas células.

Mecanismo de defesa específicos:

A terceira linha de defesa inclui as defesas específicas do hospedeiro, desenvolvidas

unicamente para cada micróbio, através da atuação especializada das células. É uma defesa

centrada na atividade específica contra cada organismo patogénico e na criação de uma

memória imunológica (quando ocorre uma infeção recorrente, tem respostas mais rápidas

eficazes).

A imunidade humoral (mediada por anticorpos) inclui os linfócitos B (desenvolvidos na

medula óssea), produtoras de anticorpos. Os anticorpos são a proteção primária contra

bactérias e promovem:

A ativação do sistema de complemento*;

O bloqueio da adesão bateriana;

A neutralização das exotoxinas;

A opsonização das bactérias para serem fagocitadas.

A imunidade celular (mediada por células) inclui os linfócitos T (maturados no Timo)

que promovem:

A ativação de macrófagos e linfócitos B;

A destruição de células infetadas.

*Sistema de Complemento

O sistema de complemento atua tanto de modo de alarme como de arma frente a uma

infeção. O sistema de complemento é ativado diretamente pelas bactérias ou produtos

bacterianos, pela união de lectina a açucares presentes na superfície da célula bacteriana ou

por complementos formados por antigénios e anticorpos.

Seja qual a via, a ativação do sistema do complemento inicia uma cascada de

processos proteolíticos com as seguintes características:

- Produção de fatores quimiotáticos com capacidade de atracão das células

inflamatórias e fagocíticas do foco infecioso

- Aumento da permeabilidade vascular (para permitir um fácil acesso ao sítio

da infeção)

- União ao agente para facilitar a sua fagocitose (opsonização) e eliminação

- Destruição direta do agente infecioso.

As 3 vias de ativação do sistema do complemento têm um ponto em comum, a

ativação do componente C3.

• Actividades biológicas dos componentes do complemento

A divisão dos componentes C3 e C5 gera factores importantes que facilitam a

eliminação do agente infeccioso e favorecem o acesso ao foco da infecção ao atrair as células

mediadoras das reacções inflamatórias do tipo protector.

O componente C3b é uma opsonina que favorece a eliminação das bactérias ao unir-se

directamente à membrana celular para fazer a célula mais atractiva para as células fagociticas

como os neutrófilos e os macrófagos (possuem receptores para o componente C3b).

Posteriormente, é degradado para produzir C3d, uma molécula activadora dos

linfócitos B. Os fragmentos dos complementos C3a e C3b actuam como potentes

anafilotoxinas que estimulam nos mastócitos a libertação de histamina, substância que

favorece a permeabilidade vascular e a contracção do músculo liso.

• Complexo de ataque à membrana

O estado terminal da via clássica do complemento implica a criação do complexo,

também conhecido como unidade lítica. As cinco proteínas terminais do complemento (C5-C9)

associam-se formando um complexo de ataque à membrana. O começo é feito com a divisão

de C5 em fragmentos que forma um complexo que perfura a membrana e produz a lise celular.

O componente C9 é semelhante à perforina produzida pelos linfócitos T citolíticos e linfócitos

NK.

• Regulação da activação do complemento

Os mecanismos que activam são:

- Inibidor da C1

- Proteína de fixação C4

- Factor H

- Factor I

- Proteínas da superfície celular (factor de acelaração da degradação – DAF).

Resposta celular:

A resposta imunitária celular é mediada por:

Monócitos-macrófagos

Grandes linfócitos granulares (NK)

Células T

Monócitos-macrófagos:

Têm marcadores de superfície para apresentação às células T (MHC classe II)

Têm moléculas de adesão

Têm elevado poder fagocítico

Células Natural Killer (NK):

Resposta primária, inata

Libertam citocinas e interferão*

Os grânulos libertam perforina e grazima

Células T:

Há dois tipos de células T, as helpers (CD4) e as citolíticas (CD8).

Para serem ativadas, as células T necessitam de uma célula que os apresente aos

antigénios (MHC). Existem 2 tipos de MHC, o de classe I e o de classe II.

O MHC classe I é um péptido antigénico endógeno que se irá ligar ao CD8 e estimular a

ativação das células citolíticas. Os grânulos destas células têm duas enzimas as

grazimas e as perforinas. As perforinas criam poros na superfície da célula alvo de

modo a que as grazimas (que são tóxicas) entrem e provoquem apoptose.

O MHC classe II é um péptido antigénico exógeno que se irá ligar ao CD4 e estimular a

ativação das células auxiliares (helper). A ativação destas células leva à ativação de

cascatas específicas de proteínas cinase.

o Há vários tipos de células T helper:

TH0 – maturam para TH1 ou TH2

TH1 – estimulam a resposta inflamatória e podem levar à apoptose

TH2 – promovem a resposta humoral através da estimulação das

células B e produção de células B de memória.

TH3 – promovem diferenciação das células B para produzirem

anticorpos.

Resposta humoral:

O principal componente molecular da resposta imune humoral é o anticorpo.

As moléculas de anticorpo são sintetizadas pelos linfócitos B e as células plasmáticas

em resposta à exposição a um antigénio.

Os anticorpos conferem proteção contra um novo contacto de um agente infecioso,

impedem a propagação deste e facilitam a sua eliminação.

Para isto, os anticorpos interagem com as células e os sistemas do organismo (por

exemplo, o sistema de complemento, os macrófagos) com o objetivo da eliminação do

antigénio e ativação das respostas imunitárias posteriores (quadro).

• Imunogénios, antigénios e epitopes

Imunogénio – qualquer proteína ou hidrato de carbono capaz de desafiar o sistema

imunitário e iniciar uma resposta imunitária. Os imunogénios podem conter mais que um

antigénio (por exemplo, as bactérias).

Antigénio – é uma molécula reconhecida por anticorpos específicos ou pelos linfócitos

Epitopo – define-se como a estrutura molecular real que interage com uma única

molécula do anticorpo. É a parte determinante do antigénio.

Durante a imunização artificial, utilizam-se coadjuvantes para reforçar a resposta

porque estes prolongam a presença do antigénio nos tecidos e ativam ou promovem a

captação do imunogénio pelas células dendríticas (CD), pelos macrófagos e pelos linfócios.

O tipo de resposta imunitária iniciada por um imunogénio depende da sua estrutura

molecular.

Pode dar lugar a uma resposta humoral primitiva com antigénios independentes dos

linfócitos T e possuem uma grande estrutura repetida que provoca uma ativação direta dos

linfócitos B e a produção de anticorpos sem a participação dos linfócitos T. Nestes casos, a

resposta consiste na produção de anticorpos IgM sem a estimulação de uma resposta de

memória.

A transição de uma resposta de IgM para IgG, IgE e IgA constitui uma alteração

importante para os linfócitos B e equivale a um processo de diferenciação celular coadjuvado

pelo linfócito T. Regra geral, os antigénios dependentes dos linfócitos T são proteínas e

estimulam as cinco classes existentes de imunoglobulinas, provocando uma resposta de

memória.

3. Diagnóstico laboratorial: princípios gerais

3.1. Enumerar as diferentes etapas de identificação de microrganismos em amostras

biológicas

1. Colheita

2. Transporte

3. Conservação

4. Armazenamento

5. Etiquetagem

6. Requisição da amostra

3.2. Identificar amostras para isolamento e identificação de microrganismos

O laboratório de Microbiologia é útil para identificar o microrganismo responsável

por determinada infecção/doença. De entre as amostras através das quais é possível o

isolamento e identificação do microrganismo destacam-se:

Urina

Sangue

Líquido pleural

Líquido sinovial

Líquido céfaloraquidiano

Exsudado nasal

Exsudado vaginal/uretral

Exsudado faríngeo

Expectoração

Cabelo, unhas

Fezes

UP1 - Farmacologia de Infecção – Bacteriologia, Análises clínicas e Farmacologia

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3.3. Identificar métodos de colheita e transporte de amostras

Métodos de colheita

Se possível, o produto biológico deve colhido do local que, no momento evolutivo da

infecção/doença (ou entre 2 a 3 dias para infecções virais), oferecer a maior possibilidade de

isolar e/ou caracterizar o agente causal. Na ausência de sintomatologia indicadora de uma

localização particular, é aconselhável que se façam várias colheitas de sangue para a análise

microbiológica.

É aconselhável que a colheita do produto seja feita o mais precocemente possível,

durante a fase aguda da infecção e antes do início de qualquer terapêutica. A colheita deve ser

efectuada utilizando-se material (seringa e agulha, zaragatoa, bisturi) estéril e um recipiente

(tubo de ensaio, frasco) estéril, de modo a impedir a contaminação do produto com

microrganismos alheios ao processo infeccioso, evitando assim resultados falsamente

positivos. O produto deve ser enviado para o laboratório imediatamente após a colheita, em

contentor adequado, rotulado com identificação do doente, o diagnóstico provável da situação

clínica e o nome do médico assistente.

Métodos de transporte

Idealmente todas as amostras devem ser transportadas para o laboratório até 30

minutos após a colheita, em recipientes adequados (bem fechados) dentro de sacos de

plástico selados que apresentem uma secção separada para formulários em papel. Estes sacos

devem ser marcados com um rótulo de risco biológico.

Os meios de transporte fornecem aos microorganismos presentes nos produtos,

condições de pH, de concentração proteica e atmosféricas (% de CO2 e O2) ideais para manter a

sua viabilidade. Para além disso, podem conter substâncias que inibam o crescimento de

microorganismos contaminantes no produto colhido.

Métodos de conservação

As amostras devem ser trabalhadas o mais rapidamente possível após a sua chegada

ao laboratório. Na impossibilidade de o fazer logo, deverão, de um modo geral, ser colocadas

no frigorífico à temperatura de 4 °C, a 22 °C (temperatura ambiente) ou a 37 °C (temperatura

corporal), dependendo das necessidades de conservação de cada amostra.

Amostras que contenham bactérias anaeróbias não devem ser conservadas no

frigorífico.


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3.4. Descrever métodos de diagnóstico em amostras biológicas

Exame microscópico de amostras

A microscopia é utilizada para dois fins: detecção inicial de microrganismos e

identificação preliminar ou definitiva dos mesmos.

Métodos de microscopia

1. Microscopia de campo claro - a amostra é visualizada por transluminação, com

passagem da luz através do condensador, incidindo na amostra. Como os índices de

refracção dos organismos e do fundo são semelhantes, estes devem ser corados com

corantes adequados.

2. Microscopia de campo escuro - Semelhante à anterior. Estruturalmente difere no uso

de um condensador que impede que a luz ilumine directamente a amostra. Apresenta

maior resolução embora não permita o estudo da estrutura interna dos m.o..

3. Microscopia de contraste de fase - Permite a visualização dos detalhes internos dos

m.o..

4. Microscopia de fluorescência - Envolve a coloração dos m.o. com corantes

fluorescentes.

5. Microscopia electrónica - Amostras podem ser coradas ou recobertas por iões

metálicos para criar um contraste. Existem dois tipos: de transmissão (electrões

passam através da amostra) e varrimento (electrões passam através da amostra num

determinado ângulo, criando uma imagem tridimensional).

Métodos de análise

1. Exame directo -

2. Colorações diferenciais – coram m.o. específicos ou componentes do material celular.

Coloração de gram – constitui a base da classificação fenotípica das bactérias.

3. Colorações ácido-resistentes – especificamente designadas para um grupo de

bactérias cujas paredes celulares contêm longas cadeias de ácidos gordos (ácidos

micólicos). Os ácidos micólicos tornam as células resistentes à descoloração.

Coloração de Ziehl Neelsen (Ex.: micobacterias tuberculosis)

4. Colorações fluorescentes – utiliza corantes fluorescentes.

Crescimento e características bioquímicas de microrganismos isolados de culturas

Meios de cultura


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1. Selectivos/não selectivos – Ex.: meio ágar MacConkey (distingue bactérias

fermentadoras de lactose).

2. Diferenciais – Ex.: distinguir bactérias α/β/γ-hemolíticas.

3. Enriquecidos

4. Sólidos

5. Líquidos

Identificação bioquímica dos microrganismos isolados

As provas bioquímicas servem para analisar a metabolização de um m.o.

Testes baseados em enzimas

Medem a presença de uma enzima específica ou de uma via metabólica completa.

1. Teste da catálase – a enzima catalisa a seguinte reacção: H2O2 -> H2O + O2. O teste é

positivo quando se observa efervescência após a adição de solução de peróxido de

hidrogénio. Teste importante na identificação de m.o. gram-positivos.

2. Teste da oxidase – a citocromo oxidase participa no transporte de electrões e nas vias

metabólicas do nitrato de algumas bactérias.

3. Teste do índole – as bactérias que produzem a enzima triptofanase são capazes de

degradar o aminoácido triptofano em ácido pirúvico, amónia e índole.

4. Teste da urease – a urease hidrolisa ureia em amónia, água e CO2. A presença da

enzima é determinada pela inoculação de um m.o. em ágar que contenha ureia como

fonte primária de carbono, detectando-se a libertação de amónia pela mudança de cor

de um indicador de pH.

5. Teste PYR – útil na identificação de gram-positivos.

Testes para detectar a presença de vias metabólicas

3 categorias gerais:

- Testes de oxidação e efermentação de hidratos de carbono;

- Testes de degradação de a.a.;

- Utilização de um único substrato.

Técnicas imunológicas (diagnóstico serológico): testes de aglutinação, fixação do

complemento, testes imunoenzimáticos (ELISA), imunofluorescência (directa e

indirecta), RIA, Quimioluminescência


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a) Teste de aglutinação:

Baseia-se no uso de um transportador

artificial ou biológico de anticorpos, que irão

reagir com os antigénios de microrganismos

presumivelmente presentes na amostra,

formando um complexo que está associado a uma

reacção de aglutinação visível. Quanto maior o

transportador, mais visível é a reacção de

aglutinação. A natureza do procedimento implica

uma ligação extremamente específica ao

antigénio.

b) Fixação do complemento:

A amostra de soro do paciente reage

com um antigénio suspeito de causar doença e

com uma quantidade de complemento

definida. Se o soro do paciente tiver o

anticorpo para o antigénio inserido, estes

complexam juntamente com o complemento,

não interagindo com os eritrócitos posteriormente adicionados e, como tal, não ocorre a sua

lise (resultado positivo). Caso o anticorpo não se ligue ao antigénio, ligar-se-á aos eritrócitos

assim como o complemento, provocando a sua lise e provando que o antigénio suspeito não é

o causador da doença.

c) Testes imunoenzimáticos (ELISA):

Utiliza um antigénio imobilizado numa superfície para capturar e segurar um

anticorpo específico presente no soro de um paciente. Posteriormente, este é detectado por

intermédio de um anticorpo (anti-imunoglobulina humana) ligado a uma enzima. Ele é

quantificado espectrofotometricamente de acordo com a intensidade da cor produzida em

resposta à conversão de um substrato apropriado por parte da enzima.


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d) Imunofluorescência

Neste teste fixa-se um antigénio

específico é fixado numa lâmina. O soro do

paciente a ser testado é diluído e colocado

na mesma, cobrindo a área em que o

antigénio foi colocado. Se estiver presente

no soro, os anticorpos ligam-se ao antigénio

específico. E os anticorpos que não

estabelecem ligação são removidos por

lavagem. Numa segunda fase, um conjugado

de imunoglobulina anti-humana e um

corante que fluoresce quando exposto ao UV

é colocada sobre a superfície.

Na imunofluorescência directa, a molécula fluorescente liga-se covalentemente ao

anticorpo. Na imunofluorescência indirecta, um segundo anticorpo fluorescente específico

para o anticorpo primário é usado para detectar o mesmo e localizar o antigénio.

e) RIA (radioimunoensaio)

No RIA, antigénios ou anticorpos marcados radioactivamente são utilizados para

quantificar o complexo antigénio-anticorpo. Pode ser executado com um ensaio de captura

(ELISA) ou como um ensaio de competição.

Num ensaio de competição, os anticorpos no soro do paciente é quantificado de

acordo com a sua capacidade para competir e para substituir um preparado laboratorial de

anticorpos marcados radioactivamente. Os complexos Ag-Ac são precipitados e separados de

anticorpos livres, medindo-se a radioactividade de ambos.

A quantidade de anticorpos do paciente é depois quantificada através de curvas

padrão feitas com quantidades conhecidas do anticorpo competente.

f) Quimioluminescência:

Consiste na emissão de luz não acompanhada da emissão de calor em consequência

de uma reacção química, normalmente uma reacção redox. Um exemplo de reacção deste tipo

é a que ocorre entre o luminol e o peróxido de hidrogénio. É o método mais sensível em

imunoensaios.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Luz

http://pt.wikipedia.org/wiki/Calor

http://pt.wikipedia.org/wiki/Luminol

http://pt.wikipedia.org/wiki/Per%C3%B3xido_de_hidrog%C3%A9nio


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Quando os electrões de um átomo recebem energia saltam para camadas mais

externas e depois voltam para as mesmas camadas mais internas. Quando voltam, emitem

uma certa luz.

Diagnóstico molecular: PCR

A reacção em cadeia da polimerase (PCR)

amplifica copias únicas de DNA viral milhões de vezes.

Nesta técnica, uma amostra é incubada com dois primers

(complementares ao fim de uma sequência genética

conhecida nas cadeias de DNA), uma DNA polimerase

termicamente estável, nucleótidos e tampões.

Mais concretamente, os oligómeros hibridizam

na sequência correcta de DNA e actuam como primers

para a polimerase, que copia aquele segmento de DNA.

O DNA resultante é depois aquecido para que ocorra a

sua desnaturação, de modo a separar as duas cadeias e

permitir a hibridação dos primers do novo DNA. Assim,

cada copia do DNA torna-se num novo modelo, sendo o

processo repetido 20 a 40 vezes para amplificar a

sequência original de DNA de uma forma exponencial.

A técnica de RT-PCR envolve o uso de transcriptase reversa de um retrovírus para

converter um RNA viral ou mRNA em DNA, antes deste ser amplificado por PCR.

4. Conceitos básicos da farmacologia da infeção.

4.1 Conceitos da farmacologia Geral.

Farmacocinética

Biodisponibilidade – fracção da dose de um fármaco que chega ao seu local de acção, tendo

em conta os efeitos de metabolismo.


19

Fármacos farmacológicamente idênticos – têm os mesmos princípios activos e são idênticos

em força ou concentração, forma de dosagem e via de administração.

Bioequivalência – a velocidade e extensão de biodisponibilidade do princípio activo de dois

fármacos não é muito diferente dentro das mesmas condições de teste.

Absorção

Vias de administração:

Oral

o A absorção no tracto gastrointestinal é alterada por:

Área de absorção

Fluxo sanguíneo no local de absorção

Estado físico do fármaco (solução, suspensão ou sólido)

Solubilidade em água do fármaco

Concentração no local de absorção

Esvaziamento gástrico (alterado consoante vários factores, p.e. idade,

alimentação)

pH do local de absorção

Sublingual

o Drenagem venosa da boca para a veia cava que protege os fármacos muito

solúveis de metabolismo de primeira passagem.

Transdérmica

o A absorção pela pele depende de:

Área da superfície

Solubilidade lipídica

Rectal

o Quando não é possível a administração via oral e para evitar o metabolismo de

primeira passagem pelo fígado

Intravenosa

Intramuscular

Subcutânea

o A absorção pelas vias intravenosa, intramuscular e subcutânea e muito

elevada e a biodisponibilidade é próxima de 100% pois não ocorre

metabolismo de primeira passagem.


20

Distribuição

Existem várias vias pelas quais o fármaco pode ser distribuído:

Proteínas plasmáticas

o A distribuição é determinada por:

Concentração do fármaco

Afinidade para o sítio de ligação do fármaco

Número de sítios de ligação

Doença – alteração do número de proteínas plasmática

Ligação aos tecidos

o Alguns fármacos acumulam-se nos tecidos em maior concentração que

aqueles que se encontram nos fluidos extracelulares e no sangue.

o Muitos fármacos ficam assim acumulados em reservatórios que pode

prolongar a acção dos mesmos.

o Esta acumulação pode produzir toxicidade local.

o O melhor reservatório é a gordura, pois tem um aporte sanguíneo baixo.

Redistribuição

o Quando se retira o fármaco, pode haver redistribuição do seu local de acção

para outros tecidos ou locais.

Metabolismo

O metabolismo de muitos fármacos de modo a ficarem mais hidrofílicos para serem

eliminados ou a terminação da sua actividade farmacológica/biológica é essencial.

O metabolismo pode dar-se em duas fases (I e II), que são independentes uma da

outra, ou seja, pode dar-se uma sem se dar a outra ou podem dar-se as duas em simultâneo.

As enzimas responsáveis pelo metabolismo encontram-se principalmente no fígado,

mas todos os outros tecidos corporais possuem actividade metabólica.

Excreção

Existem várias vias pelas quais o fármaco pode ser excretado

Via renal

o Filtração glomerular

o Secreção tubular activa

o Reabsorção tubular passiva


21

Fezes

o Fármacos administrados por via oral que não foram absorvidos

o Metabolitos excretados na bilís ou secretados directamente para o tracto

gastrointestinal e não foram reabsorvidos

Leite materno

o Os fármacos excretados podem ter efeitos não desejados no bebé

Pulmões

o Eliminação de gases anestésicos

4.2 Princípios Gerais da Terapia antimicrobiana.

A terapia antimicrobiana é apenas eficaz para infecções bacterianas. É necessário

restringir o uso de antibióticos para as situações onde a infecção bacteriana está confirmada

ou é muito provável que o esteja, de modo a evitar:

Gastos desnecessários

Efeitos adversos

Produção de resistências

Assim que a infecção bacteriana está confirmada é necessário proceder à identificação

do organismo infeccioso para fazer uma escolha de antibiótico racional. Habitualmente o

organismo infeccioso não é conhecido quando se inicia a terapia, mas é habitualmente

possível fazer uma previsão racional baseada em probabilidades estatísticas.

Para fazer uma previsão acerca do organismo patogénico, é importante saber:

Local da infecção

Se a infecção foi ganha em meio comunitário ou em meio hospitalar

(nosocomial)

Detalhes do portador

o Idade

o Doenças

o Factores de pré-disposição

A susceptibilidade da zona/região


22

Por vezes, não conseguindo fazer uma previsão do patogénio ou em pacientes com

doenças severas, é aconselhável identificar o organismo infeccioso e realizar testes de

susceptibilidade para que a terapia seja a mais eficaz possível.

Para a decisão da terapia mais adequada também é importante saber certos dados do

hospedeiro:

Alergias a fármacos

Função hepática e renal

Medicação que anda a tomar

Idade

Para a decisão da terapia mais adequada também é importante saber certos dados do

fármaco:

Actividade contra o patogénio

A sua habilidade se chegar ao local de infecção numa concentração

terapêutica (biodisponibilidade)

Se é bactericida ou bacteriostática

As vias de administração

Efeitos adversos

A frequência da dosagem

O sabor (p.e. para as crianças)

A estabilidade a várias temperaturas

O custo

3.3- Características gerais dos antibióticos

Os antibióticos são substâncias químicas produzidas por várias espécies de microrganismos

que suprimem o crescimento ou destroem outros microrganismos. No entanto, hoje em dia é

comum englobar nos antibióticos agentes antibacterianos sintéticos (não são produzidos por

microrganismos), como as sulfonamidas e as quinolonas.

Para serem usados na terapêutica estes compostos não devem ter efeitos deletérios

significativos sobre o hospedeiro infectado.

Os antibióticos naturais são produtos do metabolismo secundário dos microrganismos

e distinguem-se dos antibióticos sintéticos ou semi-sinteticos.


23

Os antibióticos na maior parte dos casos não se destinam a influenciar qualquer

actividade biológica do organismo humano, mas sim impedir o crescimento ou provocar a

morte do microrganismo infectante e são por isso também designados fármacos etiotrópicos.

Todos os antibióticos deveriam apresentar toxicidade selectiva, pois teriam a

capacidade de actuar sobre os microrganismos, sem causar danos no hospedeiro.

Os antibióticos diferem fundamentalmente na sua estrutura física, química,

propriedades farmacológicas, espectro anti-bacteriano e nos mecanismos de acção.

4.4 Descrever os mecanismos gerais de acção dos fármacos antibacterianos

Foram sugeridos vários esquemas para classificar e agrupar os antibacterianos. A

classificação mais comum baseia-se na estrutura química e no mecanismo de acção:

1. Agentes antimicrobianos que inibem a síntese da parede celular bacteriana e que

incluem: β-lactâmicos (penincilinas, cefalosporinas, monobactâmicos, carbapenenos);

glicopéptidos (vancomicina); fosfomicina; cicloserina; bacitracina;

2. Agentes antimicrobianos que actuam directamente sobre a membrana celular da

bactéria, alterando a sua permeabilidade

3. Agentes antimicrobianos que afectam a síntese de proteínas bacterianas:

cloranfenicol; tetraciclina, eritromicina, aminoglicosideos;

4. Agentes microbianos que afectam o metabolismo bacteriano dos ácidos nucleicos:

rifamicina; quinolonas

5. Agentes antimicrobianos que interferem na síntese ou acção de folatos

1) Agentes antimicrobianos que inibem a síntese da parede celular bacteriana

Independentemente da organização da parede celular bacteriana todas possuem

peptidoglicano, sendo o componente predominante nas bactérias Gram positivas (70%) e

menos exuberante nas Gram negativas (1-5%).

O peptidoglicano é constituído por resíduos alternados de N-acetilglucosamina e ácido

N-acetilmurânico, tendo, este último, cadeias laterais peptídicas curtas que apresentam


24

ligações cruzadas. Esta ligação cruzada é responsável pela força que permite à parede celular

resistir à elevada pressão osmótica interna.

β-lactamicos1,2

penincilina

Os antibióticos β-lactâmicos, interferem com a síntese de peptidoglicano da parede

celular bacteriana. Depois de se ligarem aos sítios de ligação na bactéria (PBPs) eles inibem a

transpeptidase que faz a ligação cruzada entre as cadeias peptídicas que estão ligadas às

unidades estruturais de peptidoglicano. Daqui resulta a paragem da síntese do peptidoglicano

e a exercebação das autolisinas bacterianas.

Só são activos em bactérias em crescimento e são desprovidos de actividade contra

bactérias sem parede celular ou contra microrganismos eucariotas.

Cefalosporinas e cefamicinas1

O mecanismo de acção destes agentes é o mesmo das penicilinas – interfere com a

síntese do peptidoglicano depois de se ligar PBP β-lactâmicas.

A resistência a este grupo de fármacos tem aumentado devido às β-lactamases

codificadas pelos plasmídeo ou cromossomas.

Quase todas as bactérias gram – têm um gene cromossómico que codifica β-

lactamases que são mais activas na hidrolise das cefalosporinas que das penicilinas. Em muitos

organismos uma mutação simples pode levar a uma produção constitutiva elevada desta

enzima.

A resistência também ocorre se houver uma diminuição da penetração do fármaco

resultante de alterações nas proteínas da membrana externa ou em alterações no sítio de

ligação das proteínas.

Carbapenemos1

Actua da mesma forma que os outros β-lactâmicos. Apresenta um espectro de

actividade antimicrobiana muito amplo, sendo activo conta numerosos m.o. gram- e gram+,

tanto aeróbicos como anaeróbicos. Ex: imipenem

Monolactamicos1


25

Resistente à maioria das lactamases. Activo contra contra bactérias Gram+ aeróbias.

Ex: aztreonam

Glicopéptidos (vancomicina, teicoplanina)3,4

O principal antibiótico glicopéptido é a vancomicina. A teicoplanina é semelhante,

porem de acção mais longa. Inibem a síntese da parede celular bacteriana uma vez que se liga

especificamente ao dipeptídeo D-alanil-D-alanina, inibindo a transferência das unidades

recém-formadas impedindo, assim, a sua adição à extremidade em crescimento do

peptidoglicano. Este acontecimento provoca a lise da célula bacteriana em crescimento, por

acção das autolisinas endógenas.

Cicloserina4

É um análogo estrutural da D-alanina. Funciona como um inibidor competitivo de D-

alanina racemase e D-alanil-D-alanina sintetase, inibindo a incorporação de D-alanil-D-

alanina no percussor UDP-NAMA-Tripeptídeo.


26

Bacitracina4

Inibidor da biossíntese do peptidoglicano, actuando na fase membranar. Forma

complexos com o bactoprenol-P-P, impedindo a sua desfosforilação.

Fosfomicina4

Antibiótico bacteriolítico e actua nas fases iniciais da biosíntese do peptidoglicano.

(inibição da síntese do acido UDP-N-acetilmurâmico).


27

Resumo geral:

1) Agentes antimicrobianos que interferem com o funcionamento da membrana3

As Polimixina B e E são octapeptidos de alto peso molecular que alteram a membrana

de bacterias Gram–, produzindo efeito bactericida. Interagem com os fofolípidos da

membrana celular, tornando-a permeável, provocando um efluxo de K+, aminoácidos e

nucleotidos, provocando a morte celular.


28

2) Agentes antimicrobianos que afectam a síntese de proteínas bacterianas1

A síntese de proteínas ocorre nos ribossomas, que são estruturas nucleoprotéicas

citoplasmáticas. Os ribossomas diferem nos eucariotas e procariotas, fornecendo a base para a

acção antimicrobiana selectiva de alguns antibióticos. O ribossoma bacteriano consiste numa

subunidade 50S e numa subunidade 30S, ao passo que, no ribossoma dos mamíferos, as

subunidades são de 60S e 40S. Os outros elementos envolvidos na síntese de peptídios

incluem o RNA-mensageiro (mRNA), que forma o modelo para a síntese de proteínas, e o RNA

de transferência (tRNA), que transporta cada aminoácido individual até o ribossoma. O

ribossoma possui três sítios de ligação para o tRNA: os sítios A, P e E.

O mRNA, que é transcrito a partir do DNA, liga-se à subunidade 30S do ribossoma. A

seguir, a subunidade 50S liga-se à subunidade 30S, formando uma subunidade 70S, que se

move ao longo do mRNA, de modo que os codões sucessivos do mensageiro passam pelo

ribossoma da posição A para a posição P.

Diversas categorias de antibióticos actuam frequentemente inibindo a síntese de

proteínas bacterianas. Este fármacos possuem uma toxicidade selectiva, já que inibem a

síntese de proteínas bacterianas em muito maior proporção que as proteínas do hospedeiro. A

maior parte deste fármacos são bacteriostáticos, excepto os aminoglucosideos , que são

bactericidas.

Aminoglicosideos 1,3


29

Os aminoglicosidos penetram através da membrana celular das bactérias mediante um

sistema de transporte dependente de oxigénio através de um sistema transportador

poliamina. Uma vez dentro da célula bacteriana, ligam-se irreversivelmente ao ribossoma

(subunidade 30S), inibindo a síntese de proteínas. Possuem mínima acção contra organismos

anaeróbios.

O efeito dos aminoglicosideos é bactericida e é potenciado por agentes que

interferem na síntese da parede.

Tetraciclinas2

São moléculas constituídas por 4 aneis benzénicos fundidos. Actuam na subunidade

30S impedindo a ligação dos aminoacil-tRNA aos ribossomas, impedindo estericamente a

ligação codao-anticodao entre o tRNA e o ribossoma. São bacteriosestáticas.

Cloranfenicol4

Liga-se à subunidade 50S , impedindo a acção da transpeptidade (impede a ligação do

aminoacil-tRNA ao local do ribossoma). Isto pode interferir com a transferência do resíduo

peptidil do peptidil-RNA para o aminoacil-tRNA, impedindo portanto a transpeptidação.

Macrólidos, Estreptograminas (Quinupristina e Dalfopristina), Lincosamidas2,3,4

Embora quimicamente diferentes, têm o mesmo mecanismo de acção. Este antibióticos

actuam ao nível da subunidade 50S, com efeitos bacteriostáticos, impedindo a translocação.

Oxazolidinonas2,4

São compostos de síntese química com forte afinidade para as subunidades 50S,

actuando na interface com a subunidade 30S, impedindo a formação do complexo 70S. Tem

efeito bacteriostático.


30

3) Agentes antimicrobianos que afectam a síntese de ácidos nucleicos

quinolonas (ciprofloxacina, levofloxacina, ofloxacina, norfloxacina, acrossoxacina e

pefloxacina)1,4


31

Como é sabido o nucleoide bacteriano é constituído por uma molécula de DNA circula.

Trata-se de uma molécula de cadeia dupla de nucleótidos, antiparalelas e unidas por pontes de

H. esta molécula é bastante longa e requer compactação.

As enzimas topoisomerases, DNA girase (topoisomerase II) e topoisomerase IV,

participam no superenrolamento do DNA.

As quinolonas inibem a DNA girase e a topoisomerase IV, interferindo no enrolamento

do DNA, impedindo a replicação e a transcrição do DNA.

Rifamicina4

Inibe a transcrição nas células bacterianas susceptíveis. Inibe a RNA polimerase não

ocorrendo portanto a síntese de mRNA. Tem efeito bactericida.

4) Agentes antimicrobiano que interferem com a síntese ou acção dos folatos.

A síntese de folato fornece um exemplo de uma via metabólica encontrada nas

bactérias, mas não nos seres humanos. O folato é necessário para a síntese de DNA tanto nas

bactérias quanto nos seres humano. Os seres humanos são incapazes de sintetizá-lo e obtêm-

no a partir da dieta e, para isso, desenvolveram um mecanismo de transporte para sua

captação no interior das células.

Em contraste, a maioria das espécies de bactérias, não desenvolveram os mecanismos

de transporte necessários e, por conseguinte, são incapazes de utilizar o folato pré-formado.

Por isso, precisam sintetizar seu próprio folato.


32

Sulfonamidas1,4

A sulfonamida é estruturalmente análoga ao ácido p-aminobenzoico, que é essencial

na síntese de ácido fólico na bactéria.

As sulfonamidas competem com o PABA pela enzima dihidropteroato sintetase e o

efeito da sulfonamida pode ser ultrapassado pela adição de um excesso de PABA. As

sulfonamidas bloqueiam a cadeia metabólica, impedindo portanto a formação do ácido

dihidrofolato, indispensável para a síntese do acido fólico.

A acção de uma sulfonamida é inibir o crescimento da bactéria mas não matá-la, isto é,

é bacteriostática.

Trimetoprim1

Interfere com o metabolismo do ácido fólico ao inibir uma enzima que impede a

conversão de dihidrofolato a tetrahidrofolato, inibindo a formação da timidina e purinas.


33

4.5- Distinguir a acção bacteriostática e bactericida. Saber os parâmetros que influenciam

estas acções. Defenir MIC e MBC.

Acção bacteriostática – inibe o crescimento e reprodução de bactérias, deixando ao

sistema imunitário a tarefa de eliminar a infecção.

Isto acontece quando temos uma concentração de antibiótico superior à MIC, mas

inferior à MBC no plasma.

Acção bactericida – destrói a parede bacteriana, matando as bactérias.

Isto acontece quando temos uma concentração de antibiótico superior à MBC no

plasma.

MIC (concentração mínima inibitória) – concentração de antibiótico mínima necessária

para inibir o crescimento da bactéria.

MBC (concentração mínima bactericida) – concentração de antibiótico mínima

necessária para matar a bactéria.

Parâmetros que influenciam as acções bactericida e bacteriostática:

1. O agente tem de estar na forma activa


34

Parâmetros farmacodinâmicos: directamente relacionados com a via de

administração e acção do fármaco (o que o fármaco faz no organismo)

2. O agente tem de atingir um nível de concentração suficiente no local da infecção

Parâmetros farmacocinéticos: distribuição anatómica com vista à aproximação do

agente à bactéria (o que o organismo faz ao fármaco)

3. Interacções directas entre o agente e a célula bacteriana

Parâmetros farmacocinéticos: relacionados com a absorção do agente na célula

bacteriana

Características fisiológicas e bioquímicas da bactéria – ligação do agente a alvos

intracelulares.

A absorção exige um contacto permanente com a superfície da célula bacteriana.

A concentrações suficientes dá-se a ligação do agente ao alvo através de um ou mais

componentes bioquímicos. Através desta ligação, são desencadeados processos que resultam

na:

- Inibição da multiplicação/crescimento da bactéria

- Eliminação da bactéria.

Nota: Tanto uma como outra actividade são determinadas in vivo pondo uma

concentração padrão do microrganismo com uma série de diluições de antibióticos.

3.6. Explicar o resultado da acção combinada de diferentes antibióticos

Ocasionalmente, recorre-se ao uso combinado de dois ou mais antibióticos contra o

mesmo patogénio. Todavia, esta tem um fundamento lógico e é recomendado em situações

especificamente definidas, uma vez que estas interacções podem ter consequências quer para

o microrganismo quer para o hospedeiro. Como os antibióticos podem actuar em diversos

alvos, a acção conjunta poderá potenciar ou reduzir a actividade antimicrobiana global.


35

Para caracterizar a actividade antimicrobiana resultante da combinação de fármacos,

são utizados dois métodos:

Método1:

Consiste numa curva de tempo-destruição que avalia a actividade bactericida,

efectuando-se incubação simultânea com culturas idênticas com antibióticos adicionados

isoladamente ou em combinação.

Se determinada combinação de

antibióticos for mais bactericida que

aquela do fármaco mais activo, então a

combinação é denominada de

sinergismo;

Se a combinação destruir menos

bactérias que o fármaco mais activo,

ocorrerá antagonismo;

Se a combinação destruir o mesmo

número de bactérias que o fármaco

isolado mais activo, então estamos numa

situação de indiferença.

Aplicações:

1. Tratamento de infecções polimicrobianas.

2. Terapia de infecções cuja causa é desconhecida.

3. Aumentar a actividade antimicrobiana no tratamento de infecções específicas

(sinergismo).

Desvantagens:

1. Risco de toxicidade proveniente de dois ou mais agentes.

2. Selecção de microrganismos resistentes a múltiplos fármacos.

3. Custo elevado para o paciente.

4. Possibilidade de ocorrência de antagonismo com a administração parelela de

bacteriostáticos e bactericidas.

Método 2:


36

Método que avalia o efeito bacteriostático, com recurso a duplas diluições sucessivas

de antibióticos num caldo inoculado com um número padrão de microrganismos num

tabuleiro que permita o estudo simultâneo de um largo nº de concentração de antibióticos. A

quantificação da inibição do crescimento bacteriano é feita 18h-24h depois da incubação.

Este método determina se a MIC de um fármaco é reduzido, se não se altera ou se

aumenta, na presença de outro.

Índice de CIF (Concentração Inibitória Fraccionada) =

= à soma dos

valores de CIF para os fármacos individuais.

Sinergismo – definido como a inibição do

crescimento pela combinação de fármacos a

concentrações menores ou iguais a 25% da MIC de

cada fármaco isolado.CIF < 1 - Curva côncava.

Aditivo – Se for necessária metade da concentração

inibitória de cada fármaco para produzir inibição

CIF = 1 – Fármacos estão a trabalhar

independentemente.

Antagonismo – Se mais de metade da MIC de cada

fármaco for necessária para produzir o efeito inibitório CIF > 1 - Curva convexa.

4.7- Saber explicar o conceito PAE (Efeito pós-Antibiótico)

Quando as bactérias são expostas a um antibiótico e posteriormente, o antibiótico é

removido do meio, a replicação bacteriana não se dá num período de tempo variável – este

fenómeno denomina-se Efeito Pós-Antibiótico (PAE).

Este consiste:

- Acção que o medicamento mantém após ser retirado do meio, uma vez que o crescimento

bacteriano se retarda, permitindo alargar o intervalo de alterações da dosagem;

- Mostra a capacidade do antibiótico para diminuir o crescimento bacteriano, após a remoção

do fármaco do meio de cultura;

- Providencia um tempo necessário ao sistema imunológico para remover a bactéria;


37

- Não ocorre em todas as combinações fármaco-bactéria, mas quando está presente a sua

duração é normalmente dependente da concentração. Quanto maior a concentração de

antibiótico presente ao qual a bactéria é exposta, maior o PAE.

Nota: pode existir associação entre PAE e o tipo de antibiótico, como por exemplo, um

antibiótico de inibição da síntese proteica aumenta o PAE (antibióticos que actuam em

receptores intracelulares).

4.8 Saber explicar o conceito da actividade espectral dos antibióticos

Um antibiótico pode ter largo ou estreito espectro de acção consoante a diversidade

de microrganismos que consegue afectar.

Um antibiótico de largo espectro de acção (ex: levofloxacina) é um antibiótico com

actividade contra uma grande variedade de bactérias causadoras de doenças, e também

significa que ele actua tanto em bactérias Gram-positivas como Gram-negativas. São usados

nas seguintes situações:

- Empiricamente antes da identificação da bactéria, quando do atraso no tratamento

possam resultar doenças potencialmente graves (ex: meningite, onde o doente pode ficar tão

mal e até morrer em poucas horas se não são iniciados tratamentos com antibióticos de largo

espectro.)

- Em super-infecções em que existem vários tipos de bactérias que causam doença

Por outro lado, um antibiótico de estreito espectro de acção é apenas eficaz contra

famílias específicas de bactérias.

Actualmente, uma série de laboratórios trabalha com o objectivo de isolar e purificar

antibióticos de espectro restrito, que actuam especificamente sobre um ou um pequeno

número de microrganismos. No entanto, actualmente os antibióticos comercializados

enquadram-se nas categorias de estreito e largo espectro de acção.


38

Exemplos de diferentes antibióticos, classificados de acordo com o espectro de acção

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

4.9 Explicar a resistência aos antibióticos

Resistência aos antibióticos - refere-se a uma capacidade adquirida dum

microrganismo patogénico para resistir aos efeitos de um agente quimioterapêutico ao qual

era susceptível, que leva a uma diminuição do efeito do agente quimioterapêutico no

tratamento da doença infecciosa causada pelo microrganismo.

O uso de drogas antimicrobianas terá conduzido ao desenvolvimento de mecanismos

de resistência a diversas drogas nos microrganismos-alvo (tornam-se menos susceptíveis ou

resistentes).

Existem 5 categorias principais de resistência bacteriana:

1- Redução da permeabilidade bacteriana à

droga resulta em mudanças na membrana

celular nas bactérias Gram -;

2-Produção de enzimas bacterianas que alteram

a estrutura de antibióticos. As enzimas podem

ser hidrolíticas (ex: lactamases) ou não

hidrolíticas (ex: enzimas modificadoras de

aminoglicosideos);


39

Inactivação de antibióticos β-Lactâmicos – As enzimas envolvidas são as β-lactamases,

que clivam o anel β-lactâmico das penicilinas e das cefalosporinas. Staphylococci são as

principais bactérias produtoras de -lactamases, e os genes codificadores destas enzimas

estão nos plasmídeos e podem ser transferidos por transdução.

Os organismos gram-negativos também podem produzir β-lactamases sendo que as

enzimas podem ser codificadas ou por genes cromossómicos ou por genes dos plasmídeos.

Inactivação do cloranfenicol – é inactivado pela enzima cloranfenicol aciltransferase

produzida por cadeias resistentes organismos Gram-positivos e Gram-negativos, sendo o gene

de resistência transportado por plasmídeos.

Inactivação dos aminoglicosídeos – são inactivados por fosforilação, adenilição ou

acetilação, e as enzimas necessárias são encontradas em Gram-positivos e Gram-negativos. O

gene de resistência é transportado por plasmídeos e alguns podem ser encontrados em

transposões.

3-Alteração do sítio-alvo, quando ocorre uma simples mutação onde o antibiótico

normalmente se liga pode ser suficiente para produzir resistência ao fármaco.

O local de ligação dos aminoglicosídeos na subunidade 30S do ribossoma pode ser

alterado por mutação cromossómica.

Uma alteração mediada por plasmídeos do local de ligação proteica na subunidade 50S

também é resistente à eritromicina e diminui da ligação das fluoroquinolonas por causa da

mutação pontual na DNA-girase A. A RNA polimerase dependente do DNA é determinada por

uma mutação cromossomal e é a base de resistência da rifampicina.

4- Desenvolvimento de via bioquímica alternativa

5-Expulsão da droga para fora da célula por sistema de transporte activo (efluxo).

Propagação da resistência numa população bacteriana:

-Existência de plasmídeo de resistência (plasmídeo R) que pode ser transferido por

transdução, transformação e conjugação;

- Transferência do gene de resistência por intermédio de elementos genéticos móveis,

como transposões.


40

- Os genes que conferem resistência podem ser transferidos em cassetes associados a

integrões.

Determinantes genéticos da resistência ao antibiótico:

Determinantes cromossómicos: mutações

A taxa de mutações espontânea nas populações bacterianas é baixa. Felizmente, em

muitos casos, um pequeno número de mutantes não é suficiente para produzir resistência.

Determinantes extracomossómicos

Além do cromossoma, muitas bactérias contêm elementos genéticos

extracromossómicos, chamados plasmídeos, que existem livremente no citoplasma (podem

replicar-se independentemente). São “loops” fechados de DNA que podem compreender até

500 genes ou mais e os que transportam genes para resistência aos antibióticos são chamados

plasmídeos R.

Transposões – alguns segmentos de DNA são prontamente transferidos de um

plasmídeo para outro, e também de plasmídeo para o cromossoma. Isto porque a integração

dos transposões no DNA aceitador poder ocorrer independentemente do mecanismo normal

de recombinação genética homóloga. Os transposões podem transportar um ou mais genes de

resistência e podem unir-se a um plasmídeo produzindo novas espécies de bactéria; mesmo se

o plasmídeo for incapaz de se replicar no novo hospedeiro, o transposão pode transportar

para os cromossomas do novo hospedeiro ou para os plasmídeos indígenas.

Transferência dos genes de resistência entre as bactérias:

Conjugação – envolve o contacto célula-célula, durante o qual o DNA cromossómico ou

extracromossómico é transferido de uma bactéria para outra, e é o principal mecanismo de

disseminação da resistência. A capacidade disto acontecer está contida nos plasmídeos de

conjugação (muitos plasmídeos R são de conjugação).

Transdução – é o processo pelo qual o DNA do plasmídeo é incorporado num

bacteriófago (ou fago) e transferido para outra bactéria da mesma espécie.

Transformação – captação do DNA do meio ambiente e incorporação deste no genoma

por recombinação.


41

7. Caracterizar os antibióticos Beta-Lactâmicos.

-Estrutura base e mecanismo de ação:

Os antibióticos β-lactâmicos constituem o grupo de antibióticos mais importante, dada

a sua eficácia terapêutica e a sua baixa toxicidade para os animais, incluindo o Homem. Possui

a característica comum de exibir um anel β-Lactâmico constituído por 3 átomos de e 1 de

azoto com radicais substituintes, ou seja, forma uma amida cíclica(p.109).

Mecanismo de ação: os antibióticos β-lactâmicos (penicilinas, cefalosporinas,

monobactamos e carbapenemos) são conhecidos como antibióticos antiparetais, atuando na

fase final (parietal) da biossíntese do peptidoglicano. Os antibióticos β-lactâmicos inibem

irreversivelmente as D-D-carboxitranspeptidases coletivamente conhecidas por PBPs

(Penicillin-Binding-Proteins), impedindo os “cross-linking” (p.112).

Só são ativos sobre bactérias em crescimento.

A penicilina formaria um complexo com a enzima, criando-se um composto

peniciloilenzima (p.113), cuja formação está dependente se o anel β-lactâmico tem intacto a

ligação CO-N.

Tal facto ocorre devido á analogia estrutural entre a molécula de penicilina e a porção

terminal D-alanil-D-alanina, da cadeia peptídica do peptidoglicano. (p.113).

A penicilina ocuparia o lugar do substrato natural da transpeptidase, não ocorrendo

portanto as actividades enzimáticas (transpeptidases e carboxipeptidases), que estariam

impedidas pelas penicilinas.

Os antibióticos β-lactâmicos participam provavelmente na activação das autolisinas

endógenas, com a subsequente lise celular. Esta autólise ocorre, dado que o relacionamento

fisiológico entre as autolisisnas e a síntese parietal é alterado e como é sabido, nas bactérias

Gram positivas, os ácidos lipoteicóicos funcionam como inibidores ou mesmo como

controladores da atividade autolítica endógena. Ora na presença de antibióticos β-lactâmicos,

as bactérias Gram +, cedem ácidos lipoteicoicos para o meio ambiente, o que ocasiona,

provavelmente, a perda do controlo da atividade autolítica endógena.

PBP (Penicillin-Binding-Protein)


42

Os diferentes efeitos produzidos pelos antibióticos β-lactâmicos, refletem as diferentes

especificidades destes antibióticos param as PBPs, localizadas no folheto exterior da

membrana celular.

O número de PBPs e a natureza destas proteínas varia de espécie para espécies

bacteriana, subdividindo-se normalmente em dois grupos em função do seu peso molecular.

As bactérias Gram +, de um modo geral, têm um menor número de PBPs do que as

Gram-, não tendo sido possível correlacionar as alterações morfológicas que ocorrem nas

bactérias Gram+, induzidas por doses sub-inibitórias de antibióticos β-lactâmicos, com os

diferentes tipos de PBPs.

Em conclusão, podemos afirmar que as PBPs de elevado peso molecular parecem ser

vitais para as funções microbianas e a associação dos antibióticos β-lactâmicos a alguns ou a

todos os PBP1,2,3 é condição fundamental para que ocorra a inibição do crescimento e autólise

celular.

Mecanismos de resistência:

As bactérias escapam ao efeito bacteriolítico dos antibióticos β-lactâmicos por 4

mecanismos:

1. Hidrólise enzimática dos β-lactâmicos por β-lactamases

As β-lactamases são enzimas plasmídicas ou cromossómicas que catalizam a hidrólise

do anel β-lactâmico (ligação CO-N), inativando o antibiótico. São produzidas por bactérias

Gram+ sendo excretadas para o meio ambiente e por bactérias Gram- ficando retidas no

periplasma.

As serino-β-lactamases (têm serina no centro ativo) acilam os antibióticos β-lactâmicos

e quebram a ligação amida do anel β-lactâmico, dado que há ataque nucleofílico do grupo –OH

da serina ao C do anel β-lactâmico, dando origem a um intermediário acil-enzima e cataliza a

desacilação muito eficazmente. (mecanismo p.118). As β-Lactamases são os principais

determinantes da resistência bacteriana aos antibióticos.

2. Modificação dos alvos (PBPs)

Estereomodelos revelam que a conformação da penicilina é muito semelhante a D-

Alanil-D-alanina, impedindo que as D-D-carboxipeptidases exerçam a sua ação sobre aquele


43

dipeptídeo, porque liga-se á penicilina e não ao dipeptídeo, formando um intermediário

relativamente estável, uma vez que a desacilação é muito lenta.

Mutações nos genes produtores de PBPs, recombinações homólogas entre genes de

PBPs ou a síntese de novos PBPs sem grande afinidade param os β-lactâmicos conferem às

estirpes resistência a estes antibióticos.

Este mecanismo de resistência assume um grande significado em S.aureus e S.pneumonia.

3.Impermeabilização da membrana externa (OM)

A natureza da molécula condiciona a permeacção da OM, através dos canais de porina.

As porinas clássicas são trímeros estáveis que produzem grande permeabilidade a moléculas

neutras, hidrofílicas e de baixo P.M. (até 600Da).

Além das porinas clássicas, existem também porinas monoméricas que permitem uma

difusão lenta e não específica (ex: OmpA de E.coli e OprF de P. aeruginosa).

Como a OM de P. aeruginosa não tem as porinas clássicas, os canais de porinas

específicos (ex:OprD-canal de aminoácidos básico) têm um papel importante na entrada de

nutrientes. Os antibióticos carbapenemos atravessam a OM através dos canais OprD. Assim a

modificação da expressão das OprD2 ou a sua ausência que ocorre em algumas estirpes de P.

aeruginosa justifica a sua resistência aos carbapenemos.

4. Bombas de efluxo

Estudos em E.coli demonstraram que nas estirpes TetraR havia na membrana celular

uma proteína específica Tet, bombeando o antibiótico para o exterior, impedindo-o de

atingir a concentração intracelular para inibir a síntese proteica.

As bombas de efluxo bacterianas tem sido agrupadas em 5 famílias, de acordo com a

sua sequência em aminoácidos:

- a família ABC (ATB-Binding-Cassete);

- MFS (Major Facilitator Superfamily);

- RND (Resistance-Nodulation-Division);

- SMR (Small Multidrug Resistance);

- MATE (Multidrug And Toxic compound Extrusion).

O sistema de transporte tipo MFS predomina nas bactérias Gram + e os sistemas RND

e MATE nas bactérias Gram-.


44

7.1 – Penicilinas G e V.

Penicilina G

Estrutura química: é a benzilpenicilina (ver página 201)

Mecanismo de ação ao nível celular e molecular: é um antibiótico antiparietal β-lactâmico

como tal vai atuar ao nível da fase parietal impedindo a colocação do NAG e do NAMA-

pentapeptídeo na parede celular da bactéria em crescimento, ao não permitir a ligação entre

estes e a parede existente.

Efeito terapêutico:

Efeito adverso:

-administração oral ocasiona perturbações gastrointestinais, por destruição da flora entérica;

-efeitos neurotóxicos em doentes com insuficiência renal;

-utilização em altas doses de sais sódicos de penicilina, pode causar problemas cardíacos;

-reações de hipersensibilidade em doentes atópicos;

-penicilina-procaína pode ocasionar de imediato vertigens, cefaleias, alucinações e também

alergia;

-penicilina clemizol em grandes quantidades pode causar sedação

Efeito pós antibiótico: como é antibiótico β-lactâmico, atua ao nível da fase parietal, como tal

não apresenta PAE

Farmacocinética:

Absorção

É fracamente absorvida no tubo digestivo, sendo 1/3 da dose administrada absorvida no

duodeno. É rapidamente absorvida por via oral e atinge-se um pico sérico ao fim de 30-60

min. Nos doentes aclorídricos ocorre melhor absorção 2-3horas após as refeições. Por via

intramuscular os picos máximos são atingidos em 15-30minutos. As penicilinas insolúveis

(penicilina-benzatínica, procaínica ou com clemizol) não atinge concentrações importantes,

mas são de eliminação lenta.(figura 102 da página 202)

Distribuição


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Apresenta boa difusão nos tecidos e fluídos do organismo (fígado, rins, sémen, fluído das

articulações e linfa) e atinge boa concentração biliar. Não atravessa facilmente a barreia

hematoencefálica, exceto com as meninges inflamadas, devido á vasodilatação

Quando a concentração sanguínea é alta aumenta a concentração no S.N.C. A penicilina no

LCR também passa para o sangue por transporte ativo. Em casos de uremia há no LCR

acumulação de ácidos orgânicos que vão competir com o antibiótico para o transportador, o

que pode ocasionar altas concentrações de antibiótico com efeitos neurotóxicos e convulsivos.

Aproximadamente 60% da penicilina G presente no plasma está ligada reversivelmente á

albumina.

Metabolização

A metabolização da penicilina G é quase nula, sendo recuperada inalterada na urina a dose

administrada.

Excreção

A sua eliminação faz-se por via renal, predominantemente por secreção tubular (80%) e

também por filtração glomerular. Em cerca de 1-2 horas é recuperada na urina cerca de 90%

da dose administrada e na forma biologicamente ativa, característica comum nos antibióticos

β-lactãmicos e daí serem muito utilizados nas infeções urinárias. Nos casos de insuficiência

renal, pode criar-se uma via alternativa de eliminação, a secreção biliar, sem no entanto

compensar a deficiente excreção renal.

Farmacodinâmica:

Vias de administração: oral (instável em meio ácido do estõmago e básico do intestino),

parentérica(intramuscular)

Resistência: não resistentes a penicilinases (β-lactamases)

Interações: incompatíveis com aminoglicosídeos, tetraciclinas, ácido ascórbico e bicarbonato

Penicilina V

Estrutura química: é a alfa-fenoximetilpenicilina (ver página 205)

Mecanismo de ação ao nível celular e molecular: igual ao da penicilina G


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Efeito terapêutico:

Efeito adverso: iguais aos da penicilina G

Farmacocinética: exibe o mesmo perfil da penicilina G, com exceção da absorção oral que

atinge 60-73% da dose administrada

Farmacodinâmica:

Vias de administração: oral (estável á acidez gástrica)

Resistência: não resistentes a penicilinases (β-lactamases)

Interações: incompatíveis com aminoglicosídeos, tetraciclinas, ácido ascórbico e bicarbonato

2.1 identificar os mecanismos de virulência dos … · -produção de proteases anti...

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