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Keitty Raquel Benevides Pereira
Estudo dos mecanismos imunológicos envolvidos na
recrudescência da malária experimental durante a
gravidez
SÃO PAULO 2012
Dissertação apresentada ao Programa de Pós graduação em Biologia da Relação Patógeno Hospedeiro do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências
Área de concentração: Biologia da Relação Patógeno Hospedeiro
Orientador: Prof. Dr. Cláudio Romero Farias Marinho
Versão original
RESUMO
PEREIRA, K.R.B. Estudo dos mecanismos imunológicos envolvidos na recrudescência da malária experimental durante a gr avidez . 2012. 105 f., [Dissertação (Mestrado em Biologia da Relação Patógeno Hospedeiro)] – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2012.
Estima-se que mais de 50 milhões de gestações ocorram, por ano, em áreas endêmicas de malária. Mulheres que vivem em áreas com alta endemicidade apresentam menos sintomas da malária durante a gravidez e os efeitos mais graves da doença estão relacionados com a primeira e segunda gestação. Neste trabalho, usamos um modelo murino de recrudescência da malária associada à gravidez, com camundongos BALB/c infectados por Plasmodium berghei ANKAGFP com o objetivo de avaliar a resposta imune associada ao recrudescimento da infecção. A análise morfométrica da placenta mostrou que as fêmeas primíparas recrudescentes apresentaram uma redução no espaço vascular placentário, quando comparado com primíparas não infectadas e não recrudescentes (Média±SD 38,6 ± 3,4, 52,6 ± 4,35 e 44,8 ± 4,64 % de redução do espaço vascular, respectivamente). Observando as populações de células do baço por citometria de fluxo notou-se um aumento no percentual de células CD4+, CD19+, TCR γδ+, GR1+ nos animais infectados, em relação aos controles não infectados. Não foram observadas diferenças no percentual de leucócitos placentários. Além disso, nossos resultados mostraram que no baço, linfócitos TCD4+ e TCD8+ estão mais ativados (representado pela maior expressão de CD69 e menor expressão de CD62L) em fêmeas recrudescentes. A análise do perfil de ativação de leucócitos placentários mostrou que os animais recrudescentes apresentaram um aumento na ativação de células TCD4+. Em relação a resposta humoral, observou-se uma diferença significativa entre os níveis de IgM especifica de animais recrudescentes e não recrudescentes, além disso não foram observadas diferenças nos níveis de IgG1 e IgG2a. No entanto, a relação IgG2a/IgG1 em animais recrudescentes e não recrudescentes indicou um aumento de 3 vezes na produção de IgG2a que indica um padrão Th1 de resposta imune. A análise de qRT-PCR concomitantemente à citometria de fluxo evidenciou que células dendríticas são os reservatórios do parasita durante o estágio crônico da doença, que antecede o recrudescimento. Juntos, esses dados sugerem que a recrudescência durante a gestação está diretamente ligada ao dano tecidual, provavelmente relacionado a uma exacerbada resposta Th1 na placenta.
Palavras chave : Malária. Gravidez. Recrudescência. Placenta. P. berghei.
ABSTRACT
PEREIRA, K.R.B. Study of the immunologic mechanisms involved in the recrudescence of experimental malaria during pregna ncy. 2012. 105 f., [Master Thesis (Biology of Host-Pathogen Relationship)] - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2012. It is estimated that more than 50 million pregnancies every year occur in malaria endemic areas. Women living in areas with high malaria endemicity have fewer symptoms of malaria during pregnancy and severe disease is predominantly related to the first and second pregnancy. In this work, we used a murine model of recrudescence of malaria associated with pregnancy, consisting of BALB / c mice infected with Plasmodium berghei ANKAGFP to evaluate the immune response associated with the recrudescence of the disease. Morphometric analysis showed that placental recrudescent primiparous showed a reduction in placental vascular space, as compared to uninfected or non-primiparous recrudescent mice (38.6 ± 3.4, 52.6 ± 4.35 and 44.8 ± 4 64% reduction in the vascular space, respectively). Observing the spleen cell populations by flow cytometry, an increase in the percentage of CD4+, CD19+, TCRγδ+, GR1+ cells was observed in the infected animals, compared to the uninfected controls. No differences were observed in the percentage of placental leukocytes. Furthermore, our results showed that in the spleen, CD4+ and CD8+ cells were in a more active state (represented by higher expression of CD69 and lower expression of CD62L) in recrudescent females. The profile analysis of placental leukocyte activation showed that recrudescent animals exhibited an increase in CD4 + T cell activation. With regards to the humoral immunity, there was a significant difference between the levels of specific IgM between the recrudescent and non-recrudescent animals. No differences were observed in the levels of IgG1 and IgG2a. However, the ratio IgG2a/IgG1 in recrudescent vs non-recrudescent animals showed a 3-fold increase in the production of IgG2a indicating a Th1 immune response. qRT-PCR analysis, together with flow cytometry, showed that dendritic cells were the reservoirs of the parasite during the chronic stage of the disease, preceding the recrudescence. Together, these data suggest that recrudescence during pregnancy is directly linked to tissue damage, probably related to an exacerbated Th1 response in the placenta. Keywords : Malaria. Pregnancy. Recrudescence. Placenta. P. berghei.
1 INTRODUÇÃO
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1.1 MALÁRIA
A malária é uma doença antiga, cujos registros mais remotos, como
documentos chineses, tábuas de argila da Mesopotamia e papiros egípcios datam
de 2000-1500 aC. No entanto, esta doença só foi realmente descrita em 400 aC,
pelo grego Hipócrates. Por mais de 2.500 anos, acreditou-se que as febres
associadas à malária eram causadas por vapores venenosos oriundos de pântanos,
teoria do “mau ar” ou “male aria” em italiano, daí o nome malária ser atribuído à
doença (COX, 2010). Somente após a descoberta das bactérias por Leeuwenhoek
em 1767 e, cem anos depois, em 1878, após Louis Pasteur e Robert Koch
postularem a “Teoria do germe”, que dizia que microorganismos seriam causadores
de doenças infecciosas, é que se começou a investigação sobre as possíveis causas
da malária (COX, 2010).
Foi por volta de 1880 que Charles Louis Alphonse Laveran descobriu o
agente causador da doença ao identificar, no sangue fresco de um soldado doente,
a presença de grânulos pigmentados e formas que se movimentavam
freneticamente, batizando-os de Oscillaria malariae. Cinco anos depois, em 1885,
dois patologistas italianos, Marchiafava e Celli, identificaram uma forma amebóide
em anel nas hemácias de pacientes com a doença, conferindo-lhe o nome de
Plasmodium (DAWES, 1988).
Em 1897, na India, Ronald Ross descobriu o vetor da malária aviária. Um ano
após, um grupo de pesquisadores italianos liderado por Batista Grassi descobriu que
o vetor da malária era um mosquito anofelino. Somente cerca de 50 anos depois, em
1948, é que Garnham, estudando macacos foi capaz de descrever o estágio
hepático do Plasmodium cynomolgi. Neste trabalho, os autores observaram que
havia uma fase negativa no sangue, ou seja, ausência de formas sanguíneas, que
durava de 1 hora a 6 dias após a inoculação de esporozoítos. Dois anos após, foram
descritos os estágios hepáticos do P. vivax e do P. falciparum (DAWES, 1988).
Durante a primeira e segunda guerras mundiais, milhares de soldados foram
dizimados pela malária. A partir deste momento, a incidência da doença caiu
progressivamente, principalmente em países como Estados Unidos, Itália, Grécia e
Espanha. Esta queda se atribuiu principalmente ao desenvolvimento
socioeconômico e intervenções antimaláricas como: melhorias na habitação,
drenagem de pântanos, com a consequente eliminação de criadores de mosquitos,
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uso de inseticidas como o DDT (difenildiclorotrietano) e a utilização de drogas como
a cloroquina, a primaquina, a amodiaquina, a proguanil e a pirimetamina (SACHS e
MALANEY, 2002).
Pesquisas para o desenvolvimento de uma vacina capaz de eliminar a malária
começaram a surgir no final da década de 60. Utilizando esporozoítos de P. berghei,
Nussenzweig e colaboradores demonstraram que camundongos poderiam ser
imunizados por repetidas inoculações por meio de injeção intravenosa de
esporozoítos irradiados e que essa imunização seria estágio-específica
(NUSSENZWEIG et al., 1967). Em seguida, na década de 70, Clyde obteve
resultado semelhante, com P. falciparum e P. vivax, indicando que a imunidade
induzida seria espécie e estágio-específica e não cepa-específica (CLYDE, 1990).
Acredita-se que para o desenvolvimento de vacina para malária, o primeiro
passo é a identificação de antígenos adequados e a apresentação destes em um
formato ou formulação que induza uma resposta imune eficiente. Em formato, inclui-
se peptídeos sintéticos, lipopeptídeos, proteínas recombinantes nativas, entre outros
(REED et al., 2006). Já, para formulação, o uso de adjuvantes apropriados como
hidróxido de alumínio (alum). Além deste, já foi demonstrado que vacina para
málaria formulada com o adjuvante AS02A, uma emulsão oléo-água que contém
derivados de saponina (QS21) e lípidio monofosforilado A (MPL), se mostrou segura
e altamente imunogênica (PICHYANGKUL et al., 2004).
Os mecanismos de penetração dos esporozoítos nos hepatócitos têm sido
amplamente estudados por se acreditar que uma vacina contra antígenos das
formas pré- eritrocíticas seria a melhor estratégia de imunização ativa conferindo
imunidade estéril (GRAVES e GELBAND, 2006). Neste contexto, um dos alvos é a
proteína TRAP, utilizada para penetração dos esporozoítos nos hepatócitos
(SULTAN et al., 1997).
Os antígenos-alvo dos candidatos a vacina para a forma assexual do parasita
se resumem basicamente em 3: CSP(Circumsporozoite protein), MSP-1 (Merozoite
Surface Protein) e AMA-1 (Apical Membrane Antigen). A frequência de uso dos
mesmos antígenos, em diferentes formatos de apresentação, é devida a falta de
conhecimento de uma adequada reposta imune protetiva (REED et al., 2006).
Atualmente, mais de 70 formulações de vacinas estão disponíveis, e destas
cerca de 20 estão em testes clínicos (HERRERA et al., 2007).
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1.2 ASPECTOS GERAIS
A malária, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), é a doença
parasitária mais importante do mundo. Considerada como uma doença infecciosa
aguda é causada pelo protozoário do gênero Plasmodium e transmitida
naturalmente ao homem pela picada da fêmea do mosquito do gênero Anopheles,
durante seu repasto sanguíneo (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2010).
Embora, entre os anos de 1945 e 2010, aproximadamente 79 países terem
eliminado a doença, atualmente metade da população mundial, cerca de 3,3
bilhões de pessoas em mais de 103 países, encontram-se em áreas de risco de
infecção, especialmente populações pobres de regiões tropicais e subtropicais
(Fig. 1) (FEACHEM et al., 2010).
Estimam-se cerca de 225 milhões de casos de malária, principalmente na
região africana (85% dos casos), causando aproximadamente 800 mil óbitos por
ano, sobretudo de crianças menores de cinco anos, mulheres grávidas e adultos
não imunes (WHO, 2010). Pesquisas indicam que uma criança morra de malária
no mundo a cada 40 segundos, resultando em uma perda de mais de 2.000 vidas
diariamente. Assim a malária é considerada com uma das três principais doenças
transmissíveis causadoras de morte (SACHS e MALANEY, 2002).
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Figura 1- Áreas de risco de transmissão por malária
Ilustração mostrando a distribuição das áreas com risco de transmissão de malária no mundo, evidenciando a ocorrência concentrada principalmente na região tropical. Fonte: modificado de (WHO, 2011)
O Brasil é responsável por um número expressivo dos casos de malária
notificados na América Latina, ocorrendo em média 500 mil casos por ano. Só em
2009, foram registrados aproximadamente 306 mil casos da doença, principalmente
na região amazônica. Nesta região prevalecem características sócio-econômicas e
ambientais favoráveis à permanência dos plasmódios, como a presença de
criadouros naturais do vetor e o contato mais aproximado do mesmo com o homem,
resultando na forma natural de transmissão da doença (OLIVEIRA-FERREIRA et al.,
2010).
Diferentes determinantes epidemiológicos como clima, forma de ocupação do
solo, modalidade de exploração dos recursos naturais e da intensa migração de área
rural para urbana aumentam a probabilidade de infecção malárica. A precária
vigilância epidemiológica e entomológica e áreas que sofreram ações antrópicas,
como o desmatamento, contribuem para o agravamento deste quadro (SARAIVA et
al., 2009).
O risco de contrair a doença não é uniforme, sendo medido por índice
parasitário anual (IPA). Este índice classifica as áreas de transmissão em alto risco-
(IPA maior que 49,9 casos de malária por mil habitantes); médio risco- (IPA entre 10
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e 49,9 casos/1.000 habitantes), baixo risco- (IPA de 0,1 a 9,9 casos/1.000
habitantes), e zero - sem risco (Fig. 2) (SARAIVA et al., 2009).
Figura 2- Áreas de risco de infecção por malária
Distribuição das áreas com risco de transmissão de malária no Brasil com base na incidência parasitária anual (IPA). Evidenciando a ocorrência concentrada principalmente na região amazônica. Fonte: modificado de (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).
Atualmente estão descritas cinco espécies de Plasmodium que infectam
humanos: P. vivax, P. falciparum, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi, sendo que no
Brasil, as espécies de maior importância são P. falciparum e P. vivax.
P. falciparum é responsável pela febre terçã maligna caracterizada pelos
acessos febris em intervalos de 36 a 48 horas. Esta espécie é a mais virulenta sendo
responsável pela maioria das mortes causadas pela doença (GARCIA et al., 2001).
A característica fundamental da patogênese relacionada a esta espécie é a
adesão de eritrócitos infectados às células endoteliais da microvasculatura de
órgãos como cérebro, e células epiteliais da placenta, devido a presença de
receptores específicos encontrados nestes, como CD36 e CSA. Isto resulta em um
baixo fluxo sanguíneo, infiltração de células inflamatórias e liberação de mediadores
pró-inflamatórios, causando alterações tissulares que caracterizam as formas graves
da doença. Além disso, a adesão promove o desaparecimento das formas
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assexuadas do parasita da circulação periférica, evitando assim, que os mesmos
sejam destruídos no baço (GREENWOOD et al., 2008).
P. vivax é o agente causador da febre terçã benigna, com acessos febris em
intervalos de 48 horas. Apesar de ser considerada benigna, Carvalho e
colaboradores demonstraram que há aderência dos eritrócitos infectados pelas
formas maduras do parasita às células endoteliais pelo receptor ICAM-1, e pelo
receptor CSA, na placenta (CARVALHO et al., 2010). Em adição, Alexandre e
colaboradores, identificaram complicações como anemia grave em pacientes na
região Amazônica, que levaram a morte associadas com infecção por P. vivax
(ALEXANDRE et al., 2010). Esta espécie, junto com a P. ovale, apresenta algumas
formas que podem ficar em estado de latência no hepatócito, sendo chamados de
hipnozoítos (do grego hipnos, sono). Estas formas levam à recaídas da doença após
períodos de incubação que, em geral, é de seis meses (HULDEN, 2011).
A maioria das infecções no Brasil é causada pelo P. vivax (Fig. 3) , sendo que
em 2009 esta espécie foi responsável por 83,7%. A imediata presença de formas
sexuadas do parasita no sangue dos indivíduos infectados, a existência das formas
hipnozoíticas, os efeitos colaterais das medicações e evidências de cepas
resistentes a cloroquina são muito provavelmente as causas do aumento dos casos
de P. vivax (OLIVEIRA-FERREIRA et al., 2010).
Figura 3- Casos no Brasil, divididos por espécies
Distribuição dos casos de malária no Brasil, divididos pelas espécies do parasita causadores da doença no homem, ao longo do tempo, com ênfase ao número de casos causados por Fonte: modificado de (WHO, 2010)
1.3 CICLO BIOLÓGICO DO
Os vetores da malária são mosquitos do
estão distribuídas pelo mundo, de modo que cada país/região apresenta uma ou
mais espécies dominantes na infecção do ser humano
principais são: Anopheles darlingi
que compreende um complexo de subespécies
gambiae, A. funestus e A. arabienses
O ciclo biológico d
reprodução sexuada em fêmeas anofelinas (hospedei
de reprodução assexuada que se desenvolve no hospedeiro vertebrado.
ocorre em dois ciclos, sendo o primeiro pré
hepáticas e o outro ciclo, eritrocítico, responsável pelos sintomas da doença.
fêmeas anofelinas necessitam se alimentar de sangue para o amadurecimento de
seus ovos e assim possibilitar a ovoposição.
um hospedeiro humano contendo as formas sexuadas do parasita (gametócitos
femininos e masculinos) inicia
Casos no Brasil, divididos por espécies
Distribuição dos casos de malária no Brasil, divididos pelas espécies do parasita causadores da doença no homem, ao longo do tempo, com ênfase ao número de casos causados por
(WHO, 2010).
CICLO BIOLÓGICO DO PLASMÓDIO
Os vetores da malária são mosquitos do gênero Anopheles
distribuídas pelo mundo, de modo que cada país/região apresenta uma ou
mais espécies dominantes na infecção do ser humano. No território bra
Anopheles darlingi, presente em 80%, A. aquasalis
que compreende um complexo de subespécies. Na África, as predominantes são
A. arabienses (PORTES et al., 2010).
do plasmódio compreende duas fases: uma fase onde ocorr
reprodução sexuada em fêmeas anofelinas (hospedeiro invertebrado
de reprodução assexuada que se desenvolve no hospedeiro vertebrado.
ocorre em dois ciclos, sendo o primeiro pré-eritrocítico, assintomático, nas células
hepáticas e o outro ciclo, eritrocítico, responsável pelos sintomas da doença.
fêmeas anofelinas necessitam se alimentar de sangue para o amadurecimento de
seus ovos e assim possibilitar a ovoposição. Assim, após estas ingerir
um hospedeiro humano contendo as formas sexuadas do parasita (gametócitos
) inicia-se uma fase sexuada no interior de seu estômago
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Distribuição dos casos de malária no Brasil, divididos pelas espécies do parasita causadores da doença no homem, ao longo do tempo, com ênfase ao número de casos causados por P. vivax.
Anopheles e suas espécies
distribuídas pelo mundo, de modo que cada país/região apresenta uma ou
o território brasileiro as
A. aquasalis e o A. albitarsis,
, as predominantes são A.
duas fases: uma fase onde ocorre
ro invertebrado-vetor); e outra
de reprodução assexuada que se desenvolve no hospedeiro vertebrado. Esta última
cítico, assintomático, nas células
hepáticas e o outro ciclo, eritrocítico, responsável pelos sintomas da doença. As
fêmeas anofelinas necessitam se alimentar de sangue para o amadurecimento de
ingerirem sangue de
um hospedeiro humano contendo as formas sexuadas do parasita (gametócitos
se uma fase sexuada no interior de seu estômago
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com a fecundação e formação de um ovo ou zigoto, chamado de oocineto, que após
atravessar a parede intestinal do mosquito, aloja-se na membrana basal onde se
desenvolve em oocisto. No interior do oocisto ocorre uma diferenciação que culmina
com a produção de esporozoítos (esporogonia). Estes migram para as glândulas
salivares do inseto, os quais poderão, no momento da picada, serem inoculados no
ser humano (BARILLAS-MURY e KUMAR, 2005).
Ao picar o homem, essas fêmeas injetam uma pequena quantidade de saliva,
onde está presente uma enzima com atividade de peroxidase que degrada a
serotonina, liberada pelas plaquetas, e assim a vasoconstricção é bloqueada. É
nesta saliva que os esporozoítos (formas infectantes do parasita) são encontrados.
Após a inoculação destes, passa-se um breve período de cerca de 30 minutos que
circulam livres pelo sangue. Em seguida, os esporozoítos invadem as células do
fígado (hepatócitos), onde ocorre a primeira divisão assexuada (esquizogonia
tecidual), dando origem aos merozoítos, que vão romper os hepatócitos, cair na
corrente sanguínea e invadir as hemácias (YAMAUCHI et al., 2007).
Dentro dos eritrócitos, ocorre a esquizogonia eritrocítica, em ciclos variáveis,
de acordo com a espécie do parasita (de 24 à 72h), onde novos merozoítos serão
formados. Estes rompem a hemácia e invadem outras, dando início a ciclos
repetitivos de multiplicação eritrocitária. Alguns merozoítos diferenciam-se em
gametas masculinos (microgametas) e outros em femininos (macrogametas). Numa
nova picada, os gametas serão ingeridos pelo mosquito e neste irão fecundar-se
dando origem às formas de esporozoítos que irão continuar o ciclo (GARCIA et al.,
2001).
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Figura 4- Ciclo biológico do plasmódio
Parasitas na forma de esporozoítos são inoculados na pele do ser humano pela picada do mosquito vetor. Os parasitas seguem para o fígado onde geram a fase hepática da doença de onde saem para dar origem à fase sanguínea onde se observa o quadro sintomatológico. Fonte: (CROMPTON et al., 2010).
Além dos sintomas já citados, que correspondem a um quadro de malária não
complicada, pode ocorrer um agravamento do quadro infeccioso, causado em
decorrência principalmente de infecções por P. falciparum e que é responsável por
grande número de mortes em regiões tropicais. Este quadro é considerado como
malária grave ou severa, sendo que três fatores são importantes para virulência do
plasmódio: capacidade de multiplicação (para cada esporozoíto de P. falciparum que
penetra no hepatócito, são formados 40 mil merozoítos, quatro vezes mais do que
P.vivax); preferência por determinado estágio de vida da hemácia (P. falciparum:
hemácias de todas as idades, enquanto P. vivax invade apenas reticulócitos) e por
fim, pela capacidade do parasita ser sequestrado na micro circulação periférica,
fenômeno conhecido como citoaderência (MILLER et al., 2002).
Concomitantemente a estes fatores, as inadequadas condições de
diagnóstico e tratamento da doença, resultam em maiores parasitemias e maior risco
de desenvolvimento de complicações, relacionadas com surgimento de hemorragia,
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convulsão, edema pulmonar, insuficiência renal, entre outras. Os grupos com
manifestações mais graves são as gestantes, crianças (com idade de 1 mês a 5
anos) e primoinfectados (TRAMPUZ et al., 2003).
1.4 MALÁRIA GESTACIONAL
O termo malária associada à gravidez (PAM, do inglês, Pregnancy Associated
Malaria) é usado para se referir a qualquer infecção por plasmódio que ocorre
durante a gestação, independentemente da espécie do hospedeiro e da espécie do
parasita, sem considerar ainda, o envolvimento placentário. Por exemplo, aumento
da incidência de complicações como malária cerebral durante a gestação. Além
disso, este termo é usado restritamente para se referir a infecção placentária
causada por P. falciparum. Já malária placentária (PM, do inglês, Placental Malaria)
indica um mecanismo patogênico relacionado especificamente à placenta, excluindo
outros fenômenos que possam estar associados à gestação (HVIID et al., 2010).
Entre os adultos expostos à malária, as mulheres grávidas são mais
suscetíveis à infecção, constituindo um dos principais grupos de risco. Cerca de 125
milhões de mulheres engravidam, por ano, em zonas endêmicas, aumentando
consideravelmente o risco de sofrerem as complicações associadas às infecções
pelo Plasmodium falciparum e consequentemente o desenvolvimento de malária
placentária (PM) (DELLICOUR et al., 2010). Este quadro é observado principalmente
em infecções por P. falciparum, porém estudos apontam para a gravidade da doença
ocasionada por P. vivax (KALILANI et al., 2010). Nayak e colaboradores mostraram
que a anemia materna causada por P. vivax é a complicação mais comum durante a
gestação, entretanto podem surgir outras consequências como sangramento
vaginal, aborto, parto prematuro, hipoglicemia, trombocitopenia e síndrome
respiratória aguda (NAYAK et al., 2009). Além disso, malária vivax causa baixo peso
ao nascer, que foi associado à ligação do parasita a placenta por meio do receptor
CSA (NOSTEN et al., 1999).
Um dos efeitos da malária gestacional sobre o recém-nascido é o baixo peso
ao nascer, definido como inferior a 2500g, principalmente em áreas de transmissão
estável. As consequências imediatas são hipotermia neonatal, hipoglicemia e
aumento do risco de mortalidade. A longo prazo, as sequelas da infecção incluem
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comprometimento do desenvolvimento neurológico e metabólico, crescimento
deficiente e problemas crônicos na idade adulta (ARIBODOR et al., 2009).
A infecção, durante a gestação, é responsável por 10.000 óbitos maternos e
aproximadamente 20.000 óbitos de crianças no primeiro ano de vida, resultado do
baixo peso ao nascer (CHAGAS et al., 2009).
O motivo pelo qual as mulheres grávidas são particularmente suscetíveis à
malária tem sido foco de intenso debate nos últimos anos. Inicialmente foi proposto
que a maior suscetibilidade seria devido apenas à imunosupressão materna, que
protege o feto contra a ação do sistema imunológico, mas que por outro lado a deixa
menos resistente às infecções (MENENDEZ, 1995, NOSTEN et al., 2004).
Entretanto, sabe-se que a placenta oferece um ambiente único para o
desenvolvimento de sub-populações do parasita que se ligam a receptores como a
Condroitina Sulfato A (CSA) presentes em grande quantidade neste órgão (FRIED e
DUFFY, 1996).
A gravidade da malária placentária está diretamente relacionada com o nível
de endemicidade (LUXEMBURGER et al., 1997). Em zonas de baixa transmissão,
onde não se observa altos níveis de imunidade contra a malária, devido à baixa taxa
de exposição ao parasita, normalmente a doença é mais expressiva e sintomática,
com maior risco de desenvolver doença grave. A mortalidade materna nestas zonas
pode resultar diretamente do desenvolvimento de malária grave ou indiretamente
pela anemia em consequência da doença (WHO, 2004).
Por outro lado, em zonas de transmissão moderada e alta, consideradas
estáveis, devido à constante exposição ao parasita, o desenvolvimento da
imunidade é assegurado e poucos sintomas da doença são observados. Nestas
áreas, crianças até os cinco anos de idade desenvolvem mais facilmente a doença
aguda, sendo menos comum nos adultos. Já, nas grávidas, o impacto da infecção
está associado à anemia e a presença de parasitas na placenta, que juntos vão
contribuir para um deficiente aporte nutricional ao feto, determinando baixo peso ao
nascer com consequente aumento da mortalidade infantil nessas zonas (NOSTEN et
al., 2004).
Outro fator que influencia a susceptibilidade a malária placentária é a
frequência de paridade. Mulheres multíparas, que já tiveram mais de um parto,
apresentam uma menor prevalência da doença e das alterações histopatológicas na
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placenta, enquanto que os mais graves efeitos são observados nas primeiras
gestações, sugerindo a existência de um forte mecanismo de proteção associado à
imunidade específica e que poderia ser reforçado pela vacinação (NOSTEN et al.,
2004, KALILANI et al., 2010).
Isto está relacionado com a pressão evolutiva sobre o P. falciparum, que
selecionou parasitas com capacidade de adesão ao endotélio microvascular,
evitando sua destruição no baço. Este mecanismo de citoaderência envolve o
aparecimento de protusões elétron-densas, chamadas de knobs na superfície dos
eritrócitos infectados (MILLER et al., 2002). Estes knobs são formados por proteínas
codificadas pelo parasita, que são exportadas para a superfície do eritrócito, tais
como PfEMP1(HO e WHITE, 1999). Esta proteína altamente variável é codificada
pela família dos genes var, sendo que existem aproximadamente 60 genes var por
genoma do parasita que vão codificar cerca de 60 variantes diferentes de PfEMP1.
Os principais receptores endoteliais são CD36, molécula de adesão ICAM-1, CSA
entre outros (KIRCHGATTER e DEL PORTILLO, 2005, KYES et al., 2007).
Na malária gestacional, os eritrócitos parasitados expressam na sua
membrana uma variante da proteína PfEMP1, codificada pelo alelo var2csa, que tem
grande afinidade pelo receptor CSA. Este receptor é um membro da família de
glicosaminoglicanos polissacarídeos que contem unidades de repetição constituídas
por ácido glucorônico-galactosamina-sulfato. Os resíduos de N-acetilgalactosamina
são sulfatados em C-4, entretanto os receptores presentes no espaço interviloso da
placenta e no sinciciotrofoblasto possuem pequena sulfatação e com isso os
eritrócitos parasitados se ligam com alta afinidade, consequentemente observa-se o
sequestro destes eritrócitos (GOEL e GOWDA, 2011).
É também durante esse período que o sistema imune pode gerar uma
resposta específica contra essa variante. Quando antígenos são apresentados
apropriadamente, células do sistema imunológico respondem à infecção; à medida
que a gestação progride, a resposta local torna-se mais efetiva, limitando a
replicação e possibilitando a destruição parasitária. Esse mecanismo torna-se
progressivamente eficiente com gestações sucessivas (MCGREGOR, 1984). Assim,
mulheres multíparas, que foram infectadas durante a primeira gravidez, são capazes
de gerar uma resposta imune mais efetiva contra o plasmódio. Isso se deve à
presença de anticorpos capazes de prevenir o sequestro de eritrócitos parasitados
por bloquear a ligação destes
(STAALSOE et al., 2004)
atenuar significativamente
sequelas podem levar ao aborto, restrição do crescimento intra
infecção congênita nos fetos. Já para o recém
prematuridade, baixo peso ao nascer e natimortalidad
Figura 5- Sequestro de eritrócitos parasitados na placenta
Ligação de eritrócitos infectados na microvasculatura endotelial da placenta. Mulheres grávidas, principalmente as primigrávidasplacenta. EP placentários são antigenicamente e funcionalmente distintos dos encontrados sistemicamente e não se ligam ao receptor CD36 e sim ao CSA. Estes EP que se ligam ao CSAraros em infecções antes da gravidez, e por isso conseguem escapar do sistema imune infecções mais severas na placentaessa variante do parasita, os quais podem bloquear ligaçãopara a destruição por monócitos, reduzindo assim a gravidade da doença em gestações subsequentes. Fonte: (GAMAIN et al., 2002)
1.5 RESPOSTA IMUNE NA MALÁRIA
Como em qualquer infecção, o sistema imune inato é o primeiro a reconhecer
o plasmódio, seja ele na forma de esporozoíto ou como merozoíto
através de macrófagos, células dendríticas, células NK, TCR
a ligação destes as moléculas de adesão no endotélio vascular
(STAALSOE et al., 2004). A geração de uma resposta imune específica pode
atenuar significativamente as sequelas decorrentes da malária placentária
sequelas podem levar ao aborto, restrição do crescimento intra
infecção congênita nos fetos. Já para o recém-nascido pode ocasionar
prematuridade, baixo peso ao nascer e natimortalidade (ROGERSON et al., 2007)
Sequestro de eritrócitos parasitados na placenta
Ligação de eritrócitos infectados na microvasculatura endotelial da placenta. Mulheres grávidas, primigrávidas, são mais suscetíveis ao sequestro de eritrócitos infectados na
placenta. EP placentários são antigenicamente e funcionalmente distintos dos encontrados sistemicamente e não se ligam ao receptor CD36 e sim ao CSA. Estes EP que se ligam ao CSAraros em infecções antes da gravidez, e por isso conseguem escapar do sistema imune infecções mais severas na placenta. Durante a gravidez, as mulheres desenvolvem anticorpos contra essa variante do parasita, os quais podem bloquear ligação de eritrócitos infectados ou opsnonizápara a destruição por monócitos, reduzindo assim a gravidade da doença em gestações
(GAMAIN et al., 2002).
RESPOSTA IMUNE NA MALÁRIA
Como em qualquer infecção, o sistema imune inato é o primeiro a reconhecer
, seja ele na forma de esporozoíto ou como merozoíto
através de macrófagos, células dendríticas, células NK, TCR
36
de adesão no endotélio vascular
A geração de uma resposta imune específica pode
da malária placentária. Estas
sequelas podem levar ao aborto, restrição do crescimento intra-uterino, anemia e
nascido pode ocasionar
(ROGERSON et al., 2007).
Ligação de eritrócitos infectados na microvasculatura endotelial da placenta. Mulheres grávidas, são mais suscetíveis ao sequestro de eritrócitos infectados na
placenta. EP placentários são antigenicamente e funcionalmente distintos dos encontrados sistemicamente e não se ligam ao receptor CD36 e sim ao CSA. Estes EP que se ligam ao CSA são raros em infecções antes da gravidez, e por isso conseguem escapar do sistema imune e provocar
. Durante a gravidez, as mulheres desenvolvem anticorpos contra de eritrócitos infectados ou opsnonizá-los
para a destruição por monócitos, reduzindo assim a gravidade da doença em gestações
Como em qualquer infecção, o sistema imune inato é o primeiro a reconhecer
, seja ele na forma de esporozoíto ou como merozoíto eritrocítico,
através de macrófagos, células dendríticas, células NK, TCRγδ+ e proteínas do
37
complemento. Além disso, há secreção de citocinas, potencializando a fagocitose e
contribuindo para a ativação de células T CD4+ (LUNDIE, 2011).
O curto período de tempo entre a entrada do esporozoíto no indivíduo e a
penetração no fígado determina que a eliminação do parasita pelo sistema imune
seja extremamente rápida. Citocinas como IL-12 e IFN-γ podem neutralizar as
formas esporozoítas, assim que caem na corrente sanguínea, antes de invadirem os
hepatócitos. A proteína circunsporozoítica que recobre o esporozoíto é um dos
principais alvos de reconhecimento do sistema imune e estímulo para a produção de
grandes quantidades de IFN-γ. Esta citocina é produzida por células NK em resposta
a IL-12 produzida por macrófagos ativados (ROETYNCK et al., 2006). Além disso,
células de Kupffer, macrófagos residentes no fígado, são ativadas e produzem IL-18
impedindo o crescimento de esporozoítas dentro deste órgão. IL-18 tem potencial de
ativar a resposta inflamatória através da indução da produção de IFN-γ (TSUTSUI et
al., 2003). Em adição, células TCD8+ (citotóxicas) ativadas pela presença de IFN-γ
desempenham papel importante de eliminação parasitária, agindo durante a
replicação nas células hepáticas (REID, 1998).
Já a eliminação do parasita no sangue requer a intervenção de células T
CD4+ para o controle da parasitemia e de células B com a finalidade da síntese de
anticorpos, sendo que os principais alvos antigênicos do reconhecimento humoral
são as proteínas PfEMP1. Os eritrócitos parasitados induzem a produção de TNF-α,
IL-12 e IFN-γ pelas células mononucleares sanguíneas (HAFALLA et al., 2011).
Anticorpos das subclasses IgG1 e IgG3 em humanos têm alta afinidade por
receptores Fc presentes na superfície de fagócitos, assim como possuem alta
afinidade por proteínas do sistema complemento, ativando a via clássica deste
sistema (LAZAROU et al., 2009).
Apesar de a resposta imune ao plasmódio ser eficiente, se for rápida, e contar
com componentes pró-inflamatórios, que possam controlar ou eliminar os eritrócitos
infectados, esta resposta deve ser suprimida por mediadores anti-inflamatórios, a
partir do momento em que a carga parasitária esteja controlada, evitando assim,
danos ocasionados pela própria resposta, que é amplificada, podendo levar ao
quadro de malária grave (RILEY et al., 2006). Já foi demonstrada uma correlação
entre a gravidade da doença e níveis circulantes de citocinas, principalmente TNF-α,
que está correlacionada com surtos de febre da doença, além de estar
38
potencialmente envolvida com interrupção da gravidez (POOVASSERY e MOORE,
2009). Além disso, a produção de óxido nítrico na cascata de sinalização de TNF-α
pode gerar sintomas encontrados na malária grave como: hipotensão, acidose
láctica, hipoglicemia e coma (MENDIS e CARTER, 1992).
Esses dados apontam para uma imunidade parcial que pode ser adquirida
progressivamente para as formas graves da doença, após poucas infecções.
Entretanto esta imunidade não é esterilizante, mesmo com um extenso período de
exposição, sendo, portanto, necessária persistência da carga parasitária para a
manutenção da população de células de memória (STEVENSON e RILEY, 2004).
Devido a diversidade antigênica promovida pela presença dos genes var em
P. falciparum, que induzem uma modificação na expressão da proteína PfEMP1,
dificultando a completa eliminação do parasita, a imunidade contra os estágios
sanguíneos é adquirida de forma insuficiente. Além disso, a imunidade contra as
formas hepáticas vem a ser falha, possivelmente relacionada à supressão da
resposta imunológica ou ainda devido a uma insuficiente imunoestimulação
(BORRMANN e MATUSCHEWSKI, 2011).
1.6 RESPOSTA IMUNE NA MALÁRIA PLACENTÁRIA
A placenta é um órgão que surge com o crescimento do feto e das suas
necessidades nutricionais, tem como função a troca de produtos metabólicos como
nutrientes e eletrólitos, gases e transmissão de anticorpos da mãe para o feto.
Sendo assim, a primeira linha de defesa contra a infecção malárica ocorre neste
órgão (REZENDE FILHO e MONTENEGRO, 2011).
A cada gestação a placenta e a circulação útero-placentária, são formadas
sem desafio prévio à infecção malárica, portanto sem imunidade específica local.
Quando antígenos são apresentados apropriadamente, células imunes maternas
respondem à infecção; à medida que a gestação progride a resposta local torna-se
mais efetiva, limitando a replicação e possibilitando a destruição parasitária
(MCGREGOR, 1984).
A resposta imune durante a gravidez varia entre a resposta Th1, importante
para implantação do feto e durante o momento do parto, e uma resposta Th2,
propícia para manutenção da gestação. No entanto, em casos de malária, há
alteração no perfil imune para Th1 (FRIED et al., 1998). Esta resposta Th1 durante a
39
gestação está associada com anemia materna, aborto espontâneo e parto
prematuro (ROGERSON et al., 2007).
O espaço interviloso placentário abriga linfócitos que são determinantes na
evolução da infecção. Na presença do parasita ou produtos derivados dele, por
exemplo, hemozoína, as células mononucleares maternas e do sinciciotrofoblasto
liberam quimiocinas, como MIP-1α (do inglês, Macrophage-Inflammatory Protein 1),
MCP-1 (do inglês, Monocyte Chemoattractant Protein 1) e IL-8, que favorecem o
recrutamento de monócitos (ROGERSON e BOEUF, 2007, LUCCHI et al., 2008).
Um intenso infiltrado inflamatório constituído predominantemente por
macrófagos/monócitos desenvolve-se nesse espaço, com consequente produção de
citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, IFN-γ, IL-1β, óxido nítrico e espécies
intermediárias de oxigênio, que auxiliam na eliminação do parasita por aumentar a
atividade fagocítica de macrófagos e estimular a proliferação de células T. Por outro
lado, levam a deterioração da função placentária (MENENDEZ, 1995).
Os efeitos mais severos da malária são observados em áreas de baixa
endemicidade em consequência da gravidez associada com a resposta de células
mediadoras da reposta imune, como as células T, ou a ausência de níveis
adequados de anticorpos específicos (SMITH, 1996). Além disso, as mulheres
multíparas são menos susceptíveis a infecção do que primíparas, devido a aquisição
da resposta humoral para malária, durante o curso da primeira gravidez, reduzindo o
risco da infecção em gravidez subsequente (DESAI et al., 2007).
Através da presença da hemozoína (pigmento malárico), do parasita e da
inflamação, pode-se classificar histologicamente a malária placentária em: ativa,
onde os parasitas são encontrados nos espaços intervilosos e ausência ou mínima
presença do pigmento malárico; crônica, presença do parasita e do pigmento
malárico também nos monócitos/macrófagos intervilosos; passada, quando não se
identifica o parasita, mas o pigmento é encontrado em locais como depósitos
fibrinóides no espaço interviloso, dentro de macrófagos e na decídua basal. Na
malária placentária, estes depósitos de hemozoína estão relacionados com o baixo
peso ao nascer (MUEHLENBACHS et al., 2010).
40
1.7 RECRUDESCÊNCIA DA MALÁRIA
A recrudescência é definida como uma recaída precoce, onde o paciente
apresenta “cura clínica”, porém, após um ou dois meses ele volta a apresentar os
sintomas maláricos. Este fenômeno está relacionado especificamente com infecções
por P. falciparum durante a gestação e tem uma alta frequência em primigrávidas
(VAN ZON et al., 1985). Em contraste, nas infecções por P. vivax, podem ocorrer
recaídas de 8 a 10 meses depois dos primeiros ataques de malária. Estas recaídas
correspondem a ciclos pré-eritrocíticos e eritrocíticos tardios, devido à esporozoítas
que permaneceram quiescentes no fígado durante todo esse tempo, que são
chamados de hipnozoítos (HULDEN, 2011).
Mulheres que vivem em áreas de alta transmissão e que, por isso, são
constantemente expostas a malária, podem ser mais susceptíveis à infecção durante
a gestação. Além disso, a malária pode ser assintomática durante a gravidez e
mesmo assim, trazer consequências graves para o feto em desenvolvimento,
sugerindo um complexo mecanismo de patogênese ligado a recrudescência,
patologia placentária e desenvolvimento intra-uterino (MARINHO et al., 2009).
Entender quais os mecanismos envolvidos neste processo é de difícil
observação em humanos, pois a recrudescência é facilmente confundida com uma
re-infecção, devido a constante transmissão nessas áreas. No entanto, existem
estudos feitos com pacientes africanos, indicando recrudescência, através da
genotipagem do parasita. Sutherland e colaboradores analisaram amostras de
pacientes com málaria causada por P. falciparum através de amplificação de DNA
por PCR e observaram a correlação entre amostra coletada durante a
recrudescência e amostra de 26 dias antes, comprovando ser o mesmo parasita
(SUTHERLAND et al., 2008). Além disso, Mayor e colaboradores, usando um
método de genotipagem, mostraram infecções recrudescentes em 21% das
mulheres que tiveram os parasitas isolados, sem evidências de novas infecções e
com um intervalo de tempo médio de 58 dias (MAYOR et al., 2009).
Em camundongos, foi demonstrada pela primeira vez, na década de oitenta,
por van Zon e Eling, onde foi observada maior vulnerabilidade em fêmeas grávidas,
reforçando a hipótese que o recrudescimento da infecção malárica está associado
com a gestação (VAN ZON e ELING, 1980). Duas décadas depois, foi demonstrado
41
que fêmeas grávidas acumulavam anticorpos específicos contra o parasita
recrudescente (MEGNEKOU et al., 2009).
Recentemente, nosso grupo desenvolveu um modelo experimental, onde se
observou que 60% das fêmeas primíparas, que haviam sido expostas ao parasita
anteriormente, apresentaram recrudescência quando grávidas e que o parasita
utilizado P. berghei fazia adesão placentária (MARINHO et al., 2009). Além disso, as
fêmeas recrudescentes com alta parasitemia apresentaram uma redução do espaço
vascular, indicando que esta redução é altamente dependente da carga parasitária,
sendo assim, o parasita desempenha um importante papel na patologia placentária.
Como Van Zon, 1985, também foi visto uma maior incidência de recrudescência em
primigrávidas, sugerindo que existe um mecanismo de proteção induzido em
multigrávidas, relacionado com a presença de anticorpos capazes de bloquear a
adesão placentária (VAN ZON et al., 1985).
Nos últimos anos, muitos estudos têm definido as manifestações clínicas da
malária associada à gravidez, no entanto, os mecanismos celulares que conduzem à
patologia ainda permanecem obscuros. Uma possível explicação para isto é que
estudos em humanos, embora sejam muito importantes, não são suficientes, devido
às limitações óbvias intrínsecas aos sistemas experimentais humanos e à
acessibilidade ao material biológico nos diferentes estágios da gestação. Assim, os
modelos murinos oferecem a possibilidade de estudo dos tipos celulares
potencialmente envolvidos na recrudescência da malária experimental durante a
gravidez, em condições experimentais, definidas e controladas.
Modelos experimentais murinos de infecção por plasmódio, vem sendo
utilizados pelo nosso grupo de pesquisa no estudo das populações e mediadores
imunológicos que participam no controle do parasita, bem como na análise dos
fatores que propiciam o estabelecimento de lesões nos diferentes tecidos (NERES et
al., 2008).
Estes modelos nos permitem conhecer os elementos envolvidos na
recrudescência associada à malária gestacional em um sistema experimental que
represente um bom modelo animal da enfermidade humana. Estes estudos poderão
fornecer conhecimentos relevantes para a compreensão da malária gestacional,
particularmente no entendimento dos mecanismos imunológicos envolvidos na
recrudescência da infecção durante a gravidez, na aquisição e na transferência de
42
imunidade específica, nos estudos de suscetibilidade genética, além de ser uma
importante ferramenta para o teste de novas drogas e vacinas.
Assim, face ao quase completo desconhecimento dos elementos
determinantes da recrudescência da malária durante a gravidez, o presente projeto
tem como objetivo final a identificação e a compreensão dos elementos envolvidos
nessa doença, além de possibilitar a possível compreensão da localização do
parasita antes do processo de recrudescimento.
93
6 CONCLUSÕES
94
Os resultados obtidos nesse trabalho trazem contribuições para o entendimento dos
mecanismos envolvidos na recrudescência da malária placentária. Dessa forma, as
principais conclusões obtidas foram:
• A utilização de camundongos BALB/c infectados com 104EP com Plasmodium
berghei ANKAGFP via i.p. foi considerada mais adequada para o estudo da
recrudescência;
• A recrudescência leva a uma diminuição da área do espaço interviloso na
placenta, podendo levar ao decremento da sua função;
• As fêmeas recrudescentes quando comparadas com as não recrudescentes e
controle apresentam um perfil aumentado de ativação do sistema imunológico
caracterizado por linfócitos ativados, presença de citocinas pró-inflamatórias e
aumento dos níveis de IgG2a;
• A presença de altos títulos de anticorpos específicos induzidos pelo desafio
reduz a recrudescência, e por esse motivo, uma vacina capaz de modular a
resposta humoral, parece ser promissora;
• Algumas evidências indicam que células dendríticas são neste modelo o
reservatório natural do parasita.
95
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