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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO Strictu-Sensu EM MICROBIOLOGIA E
PARASITOLOGIA APLICADAS
CARACTERIZAÇÃO DA VIRULÊNCIA, RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA E RELAÇÃO
GENÉTICA DE ENTEROBACTÉRIAS (Escherichia coli e Klebsiella sp.) ISOLADAS DE
LAVADOS TRAQUEAIS E AMOSTRAS FECAIS DE POTROS DE MUAR COM E SEM SINAIS
CLÍNICOS DE ALTERAÇÕES RESPIRATÓRIAS
Vanessa Couto Carneiro
Orientador: Prof. Dr. Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira
Niterói, 2013.
2
VANESSA COUTO CARNEIRO
CARACTERIZAÇÃO DA VIRULÊNCIA, RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA E RELAÇÃO
GENÉTICA DE ENTEROBACTÉRIAS (Escherichia coli e Klebsiella sp.) ISOLADAS DE
LAVADOS TRAQUEAIS E AMOSTRAS FECAIS DE POTROS DE MUAR COM E SEM SINAIS
CLÍNICOS DE ALTERAÇÕES RESPIRATÓRIAS
Banca examinadora:
__________________________________________
Profª. Dra. Rosana Rocha Barros
Universidade Federal Fluminense
__________________________________________
Profª. Dra. Renata Fernandes Rabello
Universidade Federal Fluminense
__________________________________________
Profª. Dra. Ana Claudia de Paula Rosa
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Niterói, 2013.
Dissertação apresentada ao
Curso de Mestrado em
Microbiologia e Parasitologia
Aplicadas da Universidade
Federal Fluminense, como
requisito parcial para a
obtenção do Grau de Mestre.
3
C289 Carneiro, Vanessa Couto
Caracterização da virulência, resistência antimicrobiana e
relação genética de enterobactérias (Escherichia coli e Klebsiella
sp.) isoladas de lavados traqueais e amostras fecais de potros de
muar com e sem sinais clínicos de alterações respiratórias /
Vanessa Couto Carneiro.-Niterói: [ s.n.], 2013.
77 f. : il.
Dissertação (mestrado em Microbiologia e Parasitologia
Aplicadas)-Universidade Federal Fluminense, 2013.
1.Escherichia coli . 2. Enterobacteriaceae. I. Título.
CDD 616.0145
4
Dedico este trabalho
à minha Família a base e
alicerce de tudo na minha vida.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela oportunidade de viver.
Agradeço imensamente a minha família, em especial a minha mãe Solange e minha irmã
Roberta que me ajudaram no trabalho diário, incansavelmente me dando a oportunidade e incentivo
para a realização dos meus projetos e sonhos. Ao meu pai José pelo apoio, incentivo e torcida. Obrigada
por sempre acreditarem em mim.
Aos meus avós in memorian pelo orgulho e amor de sempre.
Ao meu amorzinho Fred pela paciência, dedicação, respeito, amor, principalmente nesta fase
tão estressante.
Ao professor Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira, meu orientador e amigo, agradeço pelos
ensinamentos, amizade, paciência, apoio e pela oportunidade da realização de um sonho.
Aos amigos do laboratório uma nova família que guardarei para sempre no meu coração, por
tanta cumplicidade, carinho, dedicação e harmonia, agradeço por entrarem na minha caminhada de
vida e por me receberem com tanto carinho nesta grande família LEMA, sem vocês com certeza este
trabalho não teria tido um final feliz.
A Dra. Helena Magalhães do Centro Estadual de Pesquisa em Sanidade Animal da PESAGRO
e profª Dra.Maria Helena Cosendey Aquino do laboratório de doenças infecciosas da Faculdade de
Medicina Veterinária da UFF, pela enorme e preciosa contribuição.
A profª. Dra. Ana Luiza Mattos Guaraldi (UERJ) e Dra. Cintia Silva dos Santos (UERJ)
pelos ensinamentos e grandiosa colaboração e paciência.
Aos funcionários da UFF, Laura Dantas (técnica) e Ana Soares (secretária da pós-graduação)
do MIP, sem vocês tudo seria bem mais difícil obrigada por tanta dedicação.
As minhas “filhinhas do coração” (Bela, Capitu, Ginger e Pipoca) por sempre me mostrarem o
que é o amor incondicional.
A CAPES pela concessão da bolsa de Mestrado e à FAPERJ pelo auxílio à pesquisa concedido.
Aos professores que aceitaram participar da banca, agradeço por toda contribuição ao longo do
trabalho e me sinto honrada por terem aceitado o convite.
Ao Instituto Vital Brazil por autorizar a coleta de material na Fazenda Vital Brazil – Cachoeiras
de Macacu – RJ. Ao prof. Daniel Augusto Lessa pela idealização e coordenação do projeto e as amigas
que realizaram a exaustiva coleta do material, muito obrigada, sem vocês este trabalho não teria
6
acontecido. Aos grandes amigos “burrinhos” por darem a oportunidade pela pesquisa, sem eles,
impossível seria a realização deste trabalho.
A todos que de uma forma ou de outra, colaboraram para realização deste trabalho.
Quero um dia dizer às pessoas que nada foi em vão...
Que o amor existe que vale a pena se doar às amizades e às
pessoas, que a vida é bela sim e que eu sempre dei o melhor
de mim... e que valeu a pena...
Mário Quintana
7
RESUMO
Afecções respiratórias são frequentes em cavalos jovens, principalmente em potros de um
a seis meses, sendo provocadas por diferentes agentes infecciosos e diversos fatores, que
contribuem para o estabelecimento dessas afecções, geralmente associados principalmente ao
manejo inadequado. Este estudo teve como objetivo isolar e caracterizar cepas de Escherichia coli
e Klebsiella sp. isoladas de lavados traqueais e de material fecal de potros de muar de até seis
meses de idade, da Fazenda Vital Brazil (Cachoeiras de Macacu, RJ), apresentando ou não sinais
clínicos de alterações respiratórias. No período de dezembro de 2011 a novembro de 2012 foram
coletadas amostras de lavados traqueais (n=56) e de material fecal (n=56). As cepas de
enterobactérias (Escherichia coli e Klebsiella sp.) provenientes das amostras foram caracterizadas
quanto ao perfil de sensibilidade a 13 antimicrobianos, à triagem fenotípica da produção de ESBL
e pesquisa dos genes blaCTX-M, blaTEM, blaSHV. Foi investigada por PCR a presença de
marcadores de virulência extraintestinais, incluindo os genes kpsMTII, fimH, cnf, afa1, hlyA e pap.
A relação genética entre as cepas foi avaliada pela determinação do grupo filogenético de E. coli
e pela Amplificação Randômica de DNA Polimórfico (RAPD-PCR). A maioria das cepas
apresentou resistência a um ou mais antimicrobianos testados, sendo detectada multirresistência e
produção de ESBL. Todos os genes codificadores de ESBL pesquisados foram detectados. O gene
fimH foi o mais frequente porém todos os genes de virulência pesquisados foram detectados a
exceção do gene afa encontrado apenas em cepas isoladas de trato respiratório. Presença múltipla
de fatores de virulência só foi detectada em cepas provenientes de animais apresentando sinais de
alterações respiratórias. O grupo filogenético B1 foi predominante, porém as cepas identificadas
no filogrupo B2 apresentaram maior número de genes de virulência. O RAPD demonstrou a
diversidade genética das cepas e diferenciou as cepas de origem fecal daquelas isoladas de trato
respiratório. Uma melhor compreensão do perfil de bactérias envolvidas na colonização ou
infecção do trato respiratório de potros de muar pode auxiliar a adoção de práticas mais eficazes
de manejo e terapia visando o controle destas afecções.
Palavras chave: Afecções respiratórias, potros de muar, Escherichia coli, Klebsiella sp.
ABSTRACT
8
Respiratory conditions are common in young horses, especially foals from one to six
months of age, and are caused by different infectious agents and several factors that contribute to
the onset of these diseases, generally associated to mismanagement. This study aimed to isolate
Enterobacteriaceae (Escherichia coli, and Klebsiella sp.) from tracheal washes and fecal material
of mule foals up to six months old, from Vital Brazil Farm (Cachoeiras de Macacu City), with or
without clinical signs of respiratory distress. From December 2011 to November 2012, tracheal
washes (n = 56) and fecal samples (n = 56) were collected. Enterobacteriaceae (Escherichia coli
and Klebsiella sp.) strains isolated from clinical samples were characterized by antimicrobial
resistance profile, phenotypic ESBL production screening and search for blaCTX-M, blaTEM,
blaSHV, encoding ESBL genes. The extraintestinal virulence genes kpsMTII, fimH, cnf, afa1,
hlyA and pap were additionally searched by PCR. The genetic relationship of strains was evaluated
by phylogenetic grouping and Randomic Amplified Polymorphic DNA (RAPD-PCR) assays.
Most strains presented resistance to at least one antimicrobial. Multiresistance and ESBL
production were detected. The fimH gene was the most common but all the virulence genes were
detected, except the afa gene only found in strains isolated from respiratory tract. Multiple
presence of virulence genes was only found in strains isolated from animals presenting respiratory
distress signs. The phylogenetic group B1 was predominant, but the strains identified as B2
phylogroup had a higher number of virulence genes. The RAPD showed the genetic diversity of
strains and differentiate strains of fecal origin from those isolated from the respiratory tract. A
better understanding of the profile of bacteria involved in colonization or infection of the
respiratory tract of mule foals can facilitate the adoption of best management and therapy practices
for the control of these diseases.
Key-words: Respiratory colts, mules, Escherichia coli, Klebsiella sp.
9
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................................... 14
2 OBJETIVO GERAL................................................................................................................... 16
2.1 Objetivos Específicos ............................................................................................................... 16
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA............................................................................................. 17
3.1 Afecções respiratórias em potros............................................................................................... 17
3.2 Enterobactérias........................................................................................................................... 19
3.2.1 Escherichia coli....................................................................................................................... 19
3.2.2 Klebsiella sp. ......................................................................................................................... 20
3.2.3 Genes de virulência associados à patogenicidade extraintestinal em Escherichia coli e
Klebsiella sp......................................................................................................................................
21
3.2.4 Resistência a antimicrobianos em E. coli e Klebsiella sp....................................................... 22
3.2.4.1 Produção de ESBL................................................................................................................ 22
3.2.5 Relação genética...................................................................................................................... 23
3.2.5.1 Grupos filogenéticos de Escherichia coli............................................................................. 23
3.2.5.2 RAPD................................................................................................................................... 24
4 MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................................... 25
4.1 Amostras clínicas animais…….................................................................................................. 24
4.1.1 Coleta de amostras clínicas…................................................................................................. 24
4.1.2 Processamento das amostras clínicas e identificação das cepas ............................................ 26
4.2 Testes de sensibilidade a antimicrobianos................................................................................. 27
4.2.1 Técnica qualitativa de disco-difusão....................................................................................... 27
4.2.2 Detecção fenotípica da produção de β-lactamases de espectro estendido (ESBLs)............... 28
4.3 Ensaios moleculares................................................................................................................... 29
4.3.1 Obtenção de DNA das cepas bacterianas ............................................................................... 29
10
4.3.2 Reação de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)............................................................... 30
4.4 Investigação dos genes que codificam ESBLs........................................................................... 30
4.5 Investigação de determinantes genéticos................................................................................... 33
4.5.1 Caracterização genética da virulência...................................................................................... 33
4.5.1.1 Enterobactérias..................................................................................................................... 33
4.6 Análise da relação genética das cepas........................................................................................ 35
4.6.1 Determinação do grupo filogenético das cepas de Escherichia coli....................................... 35
4.6.2 Amplificação Randômica de DNA Polimórfico (RAPD-PCR).............................................. 37
4.6.2.1 Obtenção de DNA................................................................................................................ 37
4.6.2.2 Reação de amplificação........................................................................................................ 38
4.6.2.3 Análise da relação genética das cepas isoladas .................................................................. 38
4.7 Análise estatística....................................................................................................................... 39
5 RESULTADOS ........................................................................................................................... 40
5.1 Amostras clínicas de lavados traqueais...................................................................................... 40
5.2 Isolamento de enterobactérias e outras bactérias das amostras clínicas de lavados
traqueais.............................................................................................................................................
40
5.3 Isolamento de enterobactérias das amostras fecais de potros de muar....................................... 42
5.4 Teste de sensibilidade aos antimicrobianos................................................................................ 42
5.4.1 Detecção fenotípica e genotípica de β-lactamases de espectro estendido (ESBLs)................ 45
5.5 Pesquisa de marcadores de virulência........................................................................................ 47
5.6 Análise da relação genética das cepas........................................................................................ 49
5.6.1 Determinação do grupo filogenético das cepas de Escherichia coli....................................... 49
5.6.2 Perfil genético gerado após ensaio de RAPD-PCR................................................................ 50
6 DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 58
7 CONCLUSÃO............................................................................................................................ 65
11
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 67
12
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Fluxograma de determinação do grupo filogenético de E. coli a partir da amplificação
por PCR dos genes chuA e yjaA e fragmento de DNA TSPE4.C2...................................................
37
Figura 2: Bactérias isoladas de lavados traqueais de postros de muar............................................ 41
Figura 3: Percentual de potros de muar com isolamento de E. coli e Klebsiella sp. em amostras
de lavado traqueal segundo a presença ou ausência de alterações de respiratórias..........................
42
Figura 4: Genes marcadores de virulência extra intestinal em E. coli. isoladas de potros de
muar...................................................................................................................................
Figura 5: Genes marcadores de virulência extra intestinal em Klebsiella sp. isoladas de potros de
muar..............................................................................................................................................
48
Figura 6: Grupos filogenéticas de E. coli isoladas de potros de muar ............................................ 49
Figura 7: Dendograma das cepas de ExPEC de lavados traqueias e amostras fecais, construído
pelo método UPGMA do Programa MEGA4 (TAMURA et al., 1994) após ensaios de RAPD-
PCR com o uso dos oligonucleotídeos 1254. Os valores da escala denotam a distância genética
entre os ramos. Adicionalmente, é apresentado o perfil de marcadores de virulência presentes nos
cepas do presente estudo............................................................................................................
51
Figura 8: Dendograma das cepas de Klebsiella pneumoniae isoladas de lavados traqueias e
amostras fecais de potros de muar construído pelo método UPGMA após ensaios de RAPD-PCR
com o uso dos oligonucleotídeos 1254. Os valores da escala denotam a distância genética entre os
ramos............................................................................................................................................
52
Figura 9: Foto representativa do ensaio de RAPD-PCR com oligonucleotídeo 1254 de cepas de
E. coli e Klebsiella pneumoniae provenientes de amostras de lavado traqueal................................
53
Figura 10: Foto representativa do ensaio de RAPD-PCR com oligonucleotídeo 1254 de cepas
de E. coli e Klebsiella pneumoniae provenientes de amostra fecal..................................................
54
Tabela 1: Critérios de interpretação fenotípica para detecção de amostras ESBL.......................... 29
Tabela 2: Iniciadores utilizados nos ensaios de PCR para genes ESBL neste estudo..................... 32
Tabela 3: Marcadores de virulência pesquisados em cepas de Esherichia coli e Klebsiella sp. de
lavados traqueais e amostras fecais no presente estudo....................................................................
33
Tabela 4: Iniciadores utilizados nos ensaios de PCR para genes de virulência neste
estudo................................................................................................................................................
34
Tabela 5: Iniciadores utilizados nos ensaios de PCR para grupos filogenéticos de E. coli neste
estudo................................................................................................................................................
36
13
Tabela 6: Perfil de resistência de Escherichia coli e Klebsiella sp. isoladas de lavados traqueais
de potros de muar no município de Cachoeiras de Macacu..............................................................
44
Tabela 7: Perfil de resistência de Escherichia coli e Klebsiella sp. isoladas de amostras fecais de
potros de muar no município de Cachoeiras de Macacu...................................................................
45
Tabela 8: Genes codificadores de ESBLs em E. coli e Klebsiella sp. de cepas de potros de muar
provenientes de Cachoeiras de Macacu............................................................................................
46
Tabela 9: Caracterização das cepas de E. coli e Klebsiella sp. isoladas dos lavados traqueais de
potro de muar....................................................................................................................................
55
Tabela 10: Caracterização das cepas de E. coli e Klebsiella sp. isoladas das amostras fecais de
potro de muar....................................................................................................................................
57
14
1 INTRODUÇÃO
Afecções respiratórias são frequentes em cavalos jovens, principalmente em potros de um
a seis meses de idade, sendo provocadas por diferentes agentes infecciosos. Dependendo da
evolução das enfermidades, podem causar perdas econômicas consideráveis, relacionadas a custos
com tratamento, profilaxia, mortalidade e perda de valor comercial do animal devido ao prejuízo
no desenvolvimento e crescimento.
Os fatores que predispõem a ocorrência das afecções respiratórias em potros estão
associados principalmente a um manejo inadequado, tais como elevada lotação animal, transição
dos animais para locais desconhecidos, estresse térmico, estado nutricional deficiente e carência
de controle parasitário. A maior susceptibilidade ocorre a partir de seis semanas de vida, quando
há um declínio na imunidade passiva.
Para que o tratamento seja eficiente, o diagnóstico da enfermidade respiratória e o agente
etiológico devem ser bem definidos, pois existem diferentes causas e estão envolvidas espécies de
fungos, vírus, parasitas e até mesmo causas idiopáticas. Porém, os principais agentes etiológicos
são bacterianos e são identificados nas enfermidades respiratórias de potros de zero a seis meses
de idade: Streptococcus equi subsp. zooepidemicus e Rhodococcus equi são considerados como
agentes primários. Também já foram relatadas infecções por Staphylococcus sp., Actinobacillus
sp., Pasteurella sp. Bordetella sp., Pseudomonas sp., Mycoplasma sp. e Enterobactérias
(particularmente Eschericha coli, Klebsiella pneumoniae e Enterobacter sp.). As infecções podem
ser isoladas ou polimicrobianas.
15
Tendo em vista o impacto que as afecções respiratórias podem provocar, amostras de
materiais obtidos de equinos adultos ou de potros com problemas respiratórios são rotineiramente
estudadas. No entanto, existe grande escassez de informações na literatura sobre afecções
respiratórias em potros de muares comparadas a de potros de equinos. Adicionalmente, poucos
dados são disponíveis sobre a caracterização de enterobactérias envolvidas nestas afecções.
Ressalte-se que muares, animais híbridos oriundos do cruzamento de jumentos com éguas, devido
à sua maior rusticidade e resistência, além de serem usados em atividades como tração, serviço de
campo, cavalgadas, têm sido utilizados em substituição aos equinos no processo da produção de
imunoglobulinas e soros hiperimunes, o que aumenta a importância de um maior conhecimento
sobre o perfil e potencial de virulência dos microrganismos associados a infecções respiratórias.
16
2 OBJETIVO GERAL
Este estudo teve como objetivo isolar e caracterizar enterobactérias (Escherichia coli e
Klebsiella sp.) isoladas de lavados traqueais e material fecal de potros de muar de até seis meses
de idade, do município de Cachoeiras de Macacu, apresentando ou não sinais clínicos de alterações
respiratórias.
2.1 Objetivos Específicos
• Determinar o perfil de resistência a drogas antimicrobianas e a produção de β-lactamases
de espectro estendido (ESBL);
• Investigar a presença de genes de virulência associados à patogenicidade extraintestinal;
• Analisar a relação entre a virulência das enterobactérias isoladas e a presença ou não de
sinais clínicos de afecções respiratórias;
• Determinar a relação genética das cepas isoladas de enterobactérias dos lavados traqueais
e do material fecal dos respectivos animais.
17
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Afecções respiratórias em potros de equinos
As afecções respiratórias são comuns em potros e os índices de mortalidade e morbidade
são significativos até um ano de idade (COHEN, 1994, ALBUQUERQUE et al., 2006). Porém, os
animais até três meses de idade possuem ainda a imunidade passiva adquirida através da ingestão
do colostro da égua (LINS et al., 2006). No entanto, a grande maioria das informações disponíveis
refere-se a equinos, sendo escassos os dados sobre muares.
O surgimento de doenças respiratórias é influenciado por diversos fatores, como sistema
de criação e manejo implantado na propriedade. Dentre eles, destaca-se a elevada lotação animal,
fluxo alto de equinos transitórios, falta de vacinação e falta de controle antiparasitário (RIBAS et
al., 2009). No entanto, estes fatores devem ser minimizados o máximo possível na fase inicial da
vida dos equinos, pois é uma fase em que o sistema imunológico do animal é desafiado diariamente
(BEECH, 1991).
O diagnóstico das afecções respiratórias quando realizado somente por meio de exame
físico se torna difícil, havendo necessidade da realização de exames complementares, como por
exemplo, a coleta de secreções para exames microbiológicos, endoscopias, radiografias e
ultrassonografia. O conhecimento da etiopatogenia e da epidemiologia das doenças é de extrema
importância para que sejam implantadas medidas corretas de tratamento e controle (MELLOR &
STAFFORD, 2004, HOLLOMBE, 2005), diminuindo as perdas econômicas, a morbidade e
mortalidade na maioria dos casos (COHEN, 1994).
18
A maioria das características do trato respiratório dos muares é semelhante à dos equinos,
porém existem diferenças significativas na anatomia e fisiologia que influenciam na incidência de
doenças, morbidade e no tratamento de diferentes doenças infecciosas, inclusive afecções
respiratórias. Em alguns casos, os muares apresentam tardiamente os sinais clínicos de algumas
doenças dificultando o tratamento. Apresentam também maior resistência a algumas doenças
parasitárias, porém são predispostos a apresentarem maior gravidade em algumas doenças como a
Influenza equina (THIEMANN, 2012). Nos muares, alguns fármacos são metabolizados mais
rapidamente, com isso devem ser administrados mais frequentemente para alcançar níveis
terapêuticos ideais (MEALEY et al., 1997).
Uma diferença sutil da anatomia dos muares, mas que pode influenciar na realização de
exame clínico para diagnóstico de afecções respiratórias é o diâmetro da traquéia e da laringe. Foi
observado que as vias aéreas são mais estreitas, tornando mais difícil a passagem do endoscópio
através desta área (MATTHEWS et al.,1997 e DELVAUX et al., 2001). Estas semelhanças e
diferenças entre muares e cavalos devem ser levadas em consideração na execução de exames
complementares. Segundo Delvaux et al. (2001), é importante o estudo das diferenças das funções
cardiorrespiratórias em muares para que se favoreça o diagnóstico e a implementação da terapia
adequada.
A maioria das afecções respiratórias é causada por patógenos bacterianos oportunistas,
geralmente devido a uma prévia doença respiratória viral, por estresse ou por infecção parasitária,
devido à imunossupressão do hospedeiro (COHEN, 1994, LEGUILLETE et al., 2002). Com
exceção de Rhodococcus equi, os outros agentes bacterianos estão presentes na microbiota do trato
respiratório, algumas vezes fazem parte da microbiota transitória e que por diversos fatores passam
a causar doença no animal, dentre eles estão: Streptococcus equi subsp. zooepidemicus,
Streptococcus equi subsp. equi, Staphylococcus sp., Actinobacillus sp., Pasteurella sp. Bordetella
sp., Mycoplasma sp. e Enterobactérias (particularmente Eschericha coli, Klebsiella pneumoniae e
Enterobacter sp.). Os principais sinais clínicos são febre, anorexia, depressão, tosse, descarga
nasal purulenta, em casos avançados taquipnéia, taquicardia, estresse respiratório e cianose
(WILSON, 1992).
Uma importante causa de broncopneumonia piogranulomatosa em potros com menos de
seis meses de idade é Rhodococcus equi, cuja enfermidade apresenta alta morbidade e
mortalidade, acometendo equinos de diferentes regiões do mundo. É um microrganismo
intracelular facultativo sendo capaz de sobreviver e se multiplicar no interior de macrófagos
19
(KREWER, 2008). Está amplamente distribuído pelo ambiente, sendo um microrganismo
telúrico, apresentando necessidades nutricionais simples. Pode ser encontrado também no trato
gastrintestinal de equinos adultos (BELL et al., 1998).
Por outro lado, um exemplo de afecção respiratória não infecciosa comumente observada
em potros é a hiperplasia linfóide da faringe (faringite), que se apresenta como uma hiperemia ou
inflamação da mucosa faríngea, podendo produzir material mucóide ou mucopurulento. Os
animais acometidos podem apresentar dificuldade de deglutição e diminuição do apetite, na
maioria das vezes não é necessária a utilização de antimicrobianos, somente de antiflamatórios não
esteróides, já solucionando os sinais apresentados (BAYLY & AIELLO 2001).
3.2 Enterobactérias
A família Enterobacteriaceae é uma das mais importantes famílias bacterianas, sendo seus
membros em sua maioria comensais do trato gastrointestinal, comumente isolados de amostras
humanas e animais. O estudo destas bactérias em animais é importante não só por causarem perdas
econômicas, mas por estes representarem potencialmente um importante reservatório de patógenos
para humanos. As enterobactérias podem causar infecções em humanos e animais, intestinais e
extra-intestinais, localizadas ou sistêmicas. São bacilos Gram negativos, anaeróbios facultativos,
fermentadores de glicose, oxidase negativos e reduzem nitrato a nitrito (TRABULSI; ORDOÑEZ
& MARTINEZ, 2008).
Abrange muitos gêneros, e sua taxonomia complexa vem sofrendo transformações nos
últimos anos, devido às técnicas moleculares que avaliam as diferentes evoluções, como
sequenciamento e hibridização (BROOKS et al., 2012). Mais de 50 gêneros foram definidos,
porém as enterobactérias de importância clínica correspondem a pouco mais de 20 espécies
patogênicas, mais frequentemente encontradas em infecções.
3.2.1 Escherichia coli
A maioria das cepas desta espécie é residente da microbiota intestinal de humanos e de
outros mamíferos, porém aproximadamente 10% são patogênicas, podendo causar doenças
intestinais e extraintestinais, devido à presença de fatores de virulência que afetam uma ampla
20
variedade de processos celulares. As cepas de E. coli que adquirem fatores de virulência
específicos têm maior capacidade de adaptação a novos nichos de infecção, causando diferentes
tipos de doenças. Estas combinações bem sucedidas de fatores de virulência são classificadas como
patotipos de E. coli, sendo capazes de causar doenças em indivíduos saudáveis (KAPER, 2004,
RUSSO & JOHNSON, 2000). Exemplos de doenças causadas por diferentes cepas de E. coli são:
diarréia, infecções do trato urinário e do trato respiratório, sepse e meningite neonatais (ORSKOV,
1992).
As cepas de E. coli patogênicas intestinais são classificadas de diversas formas de acordo
com suas características como: modo de transmissão, característica do hospedeiro afetado,
mecanismos de patogenicidade, determinantes genéticos de virulência, entre outros fatores. Já as
cepas de E. coli patogênicas extra intestinais (patotipos ExPEC) são geralmente denominadas de
acordo com seu sítio de isolamento, porém sabe-se que cepas isoladas em um determinado sítio
podem causar infecção em outros sítios e/ou até em outros hospedeiros. Estudos mostram que a
maioria das cepas de ExPEC evoluiu de uma cepa ancestral com um acúmulo de genes de
virulência recebidos por transferência horizontal (RUSSO & JONHSON, 2000, PITOUT, 2012).
3.2.2 Klebsiella sp.
No gênero Klebsiella destaca-se a espécie K. pneumoniae, importante agente causador de
pneumonia, bacteremia e infecções em outros órgãos. Acometem mais comumente o trato
respiratório e urinário, cada vez mais aumentando sua relevância em infecções associados aos
cuidados em saúde. A facilidade que possui em colonizar mucosas justifica sua classificação como
patógeno oportunista, tendo altas taxas de mortalidade e morbidade quando o indivíduo acometido
é imunocomprometido. É uma espécie que também possui fatores de virulência que desempenham
um importante papel no processo de colonização intestinal, contribuindo para o desenvolvimento
de infecções. O trato gastrointestinal tem se mostrado como reservatório de cepas de K.
pneumoniae envolvidas em infecções hospitalares (DE CHAMPS et al., 2004).
Outras espécies de Klebsiella podem estar associadas a quadros patológicos em equinos.
Szeredi et al. (2008), relataram K. oxytoca como causa esporádica de aborto em equinos.
21
3.2.3 Genes de virulência associados à patogenicidade extraintestinal em E.
coli e Klebsiella sp.
A presença de diferentes genes de virulência está relacionada com a patogenicidade
extraintestinal de enterobactérias (E. coli e Klebsiella sp.). Esses genes são expressos por meio de
sistemas complexos de regulação, sensíveis a diferentes condições ambientais, que permitem que
as enterobactérias patogênicas consigam se adaptar a diferentes nichos ecológicos (KAPER, 2004;
PITOUT, 2012). A maioria dos genes que codificam fatores de virulência são organizados em
grandes grupos, chamados de ilhas de patogenicidade, que podem se disseminar de forma
horizontal entre cepas diferentes de E. coli, sejam eles localizados em plasmídeos, bacteriófagos
ou transposons (PICARD et al., 1999, JONHSON, 2005). No entanto, a presença de somente um
fator de virulência raramente faz que o microrganismo se torne patogênico, mas sim a combinação
de diferentes fatores e a suscetibilidade do hospedeiro determina se uma bactéria pode causar
doença (DOBRINDT, 2005).
Enterobactérias (E. coli e Klebsiella sp.) apresentam uma diversidade de fatores associados
à virulência, incluindo toxinas, adesinas, lipopolissacarídeo, cápsula polissacarídicas, proteases e
invasinas. A patogenicidade do microrganismo está relacionada à forma como a bactéria se liga à
célula do hospedeiro, à produção de toxinas e a sua invasão (SEARS & KAPER, 1996).
A colonização e aderência das cepas extraintestinais são mediadas pela expressão de vários
tipos de adesinas. O gene pap (pilus associado à pielonefrite) codifica uma adesina, a fímbria P,
que promove adesão da bactéria com glicolipídeos encontrados na superfície das células do trato
urinário, facilitando a colonização da pélvis e a entrada no parênquima renal. É um fator de
virulência comumente associado à pielonefrite (BLANCO et al. 1992, RUSSO & JONHSON,
2000, JONHSON, 2005). O gene afa codifica uma adesina afimbrial pertencente a família das
hemaglutininas manose resistentes sendo encontrado em amostras de E. coli tanto uropatogênicas
quanto diarreiogênica. Já o gene fimH codifica a fímbria tipo I, que conferem ligação bacteriana
às glicoproteínas com terminais manose. (ANTÃO, 2009, TCHESNOKOVA, 2011).
A cápsula é um mecanismo de defesa bacteriano e um dos seus determinantes genéticos
extraintestinais, o gene kpsMTII. É uma estrutura polissacarídica que protege a bactéria do sistema
imune do hospedeiro, inibindo a fagocitose, além de estar associada também à aderência
(JONHSON, 2005; BIEN, 2012).
22
A produção de toxinas, como alfa-hemolisina (hlyA) e fator de necrose citotóxica I (cnf1),
provoca danos nos tecidos do hospedeiro facilitando a disseminação bacteriana e modulando vias
de sinalização que afetam vários processos, incluindo a reposta inflamatória, podendo também
interferir na sobrevivência da célula hospedeira (WILES et al., 2008).
3.2.4 Resistência Antimicrobiana em E. coli e Klebsiella sp.
A resistência antimicrobiana é considerada uma ameaça à saúde pública em todo o mundo,
devido à diminuição da eficácia dos antimicrobianos e aumento dos custos com tratamentos
(PENDERS, 2013). O uso indiscriminado dos antimicrobianos é o principal fator na seleção e
disseminação da resistência, porém a utilização de doses inadequadas, baixa adesão ao tratamento
e baixa qualidade de antimicrobianos têm também um papel relevante (ROSSI, 2011).
O perfil de resistência aos antimicrobianos das enterobactérias pode ser bastante diverso,
dependendo da origem da amostra, da espécie hospedeira e do sítio de infecção. (HIRSH E ZEE,
2002). Estudos de resistência de E. coli extra-intestinal isolada de animais apontam para uma
resistência frequente a ampicilina, tetraciclina e sulfonamidas e de modo mais recente a diversos
beta lactâmicos e quinolonas (MAYNARD et al., 2004; PITOU, 2012; EWERS et al., 2012).
3.2.4.1 Produção de ESBL
As β-lactamases de espectro estendido (ESBL) são enzimas que hidrolizam as
cefalosporinas e são inibidas por compostos como o ácido clavulânico, o sulbactam e o tazobactam
(STURENBURG, 2003). A produção dessas enzimas tem sido descrita como um importante
mecanismo de resistência a antibióticos β-lactâmicos, por hidrolisar o anel beta-lactâmico e
quebrar a ligação amida, fazendo com que os antimicrobianos percam a capacidade de inibir a
síntese da parede celular bacteriana, transformando os antibióticos correspondentes em produtos
inativos (WILLIAMS, 1999; JAWETZ, 2000).
Exemplos de enzimas de ESBLs são dos tipos CTX-M, SHV e TEM. As enzimas CTX-M
estão substituindo SHV e TEM, enzimas consideradas até então predominantes, principalmente
nas cepas de infecções causadas por Escherichia coli. A frequência de ESBL entre as cepas
nosocomiais de Enterobacteriaceae têm aumentado consideravelmente em vários países,
23
principalmente as da espécie Klebsiella sp. (FALAGAS & KARAGEORGOPOULOS, 2009). A
prevalência de enzimas ESBL e suas características fenotípicas nas cepas podem variar entre áreas
geográficas. Ocorre principalmente em Klebsiella sp.e Escherichia coli (STEWARD, 2001 e
VENEZIA, 2003).
Segundo Ewers et al. (2012), a ocorrência de amostras produtoras de ESBL em animais
faz com que eles se tornem fontes de infecção ou até mesmo reservatórios, contribuindo para a
disseminação destas bactérias. Animais de companhia são os mais propensos devido à proximidade
com os proprietários. Tanto animais doentes quanto saudáveis são acometidos, prejudicando o
bem-estar animal e causando problemas de saúde pública.
3.2.5 Relação genética
3.2.5.1 Grupos filogenéticos de Escherichia coli
Cepas de E. coli podem ser classificadas em quatro grupos filogenéticos principais A, B1,
B2 e D. Sua identificação é possível pela investigação de três marcadores genéticos chua, yjaA e
o fragmento de DNA TSPE4.C2 (CLERMONT, 2000). O gene chuA codifica o receptor de
membrana externa para hemina, está relacionado com o transporte de ferro, presente em cepas
enterohemorrágicas, o gene yjaA,um gene até então de função desconhecido mas que atualmente
foi reconhecido como um codificador de proteína relacionada a estresse metabólico (LEE et
al.,2010) e um fragmento de DNA designado TSPE4.C2, que foi recentemente identificado como
parte de um gene de uma lipase-esterase.
Em cada patotipo de E. coli há uma grande diversidade filogenética. As amostras
patogênicas intestinais geralmente fazem parte dos grupos filogenéticos A, B1e D. Já as cepas
associadas a infecções extraintestinais fazem parte dos grupos B2 e em menor quantidade do grupo
D. Por sua vez, a maioria das cepas comensais pertence ao grupo filogenético B1 (DURIEZ, et al.,
2001, FRANICZEK et al., 2012).
Ainda que as ExPECs tenham habitat similar às E. coli comensais, têm perfis de virulência
e grupos filogenéticos distintos (RUSSO & JONHSON 2000).
24
3.2.5.2 RAPD
RAPD (Amplificação Randômica de DNA Polimórfico) é uma técnica de tipificação
genética baseada em PCR, que visa avaliar a relação genética entre as cepas. É uma técnica
simples, pois só utiliza um oligonucleotídeo inespecífico, havendo anelamento em diferentes sítios
no DNA, o que gera fragmentos de tamanhos diferentes (WILLIAMS et al, 1990). O princípio da
técnica de RAPD-PCR lhe garante vantagens como técnica de tipificação bacteriana, pois não há
necessidade do conhecimento prévio da sequência a ser amplificada, além de ser uma técnica
rápida e de fácil execução. A chance é grande de se encontrar diferenças entre as cepas, pois todo
o genoma serve de molde para amplificação, que pode ser obtido de modo simplificado, sem
obrigatoriedade na sua purificação e em pequenas quantidades. Os produtos de amplificação
podem ser visualizados imediatamente após coloração do gel de agarose, sendo possível a análise
combinada de perfis de amplificação obtidos pelo uso de mais de um iniciador (WILLIANS et al.,
1993; BRIKUN et al., 1994).
25
4 MATERIAL E MÉTODOS
Este projeto foi realizado de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal.
Obteve a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA/UFF), sob nº 00125/11 e
autorização do Instituto Vital Brazil.
4.1 Amostras clínicas animais
4.1.1 Coleta de amostras clínicas
No período de dezembro de 2011 a novembro de 2012, foram coletadas 56 amostras
clínicas de lavados traqueais de potros de muar de até seis meses de idade, obtidas por coleta via
endoscópio com cateter de polietileno estéril de lúmen duplo EMAC 700 (Mila International®,
Erlanger, USA), a cada coleta o equipamento sofreu processo de higienização padronizado.
Adicionalmente, 56 amostras de material fecal obtido do reto com auxílio de “swabs”,
transportados em meio de Stuart (Labor Import, São Paulo, Brasil) foram obtidas de cada
animal∕coleta, totalizando 112 amostras clínicas. A coleta for realizada na Fazenda Vital
Brazil/IVB situada no município de Cachoeiras de Macacu (Latitude Sul – 22.542753 e Longitude
Oeste – 42.783391), no estado do Rio de Janeiro de animais nascidos no próprio local.
As amostras foram encaminhadas para o laboratório da própria fazenda e o aspirado
contendo o lavado traqueal foi inserido em meio BHI (Brain Heart Infusion) em tubo (10x100mm)
com 3 mL. As amostras foram armazenadas a 4-8°C (isopor com gelo) até o transporte para o
laboratório, em até 4 horas, onde foram processadas. Juntamente a amostra, foi obtida informações
26
sobre idade e número de identificação do animal. Além disso, a presença de alterações
respiratórias, compatíveis com sinais clínicos de afecções respiratórias, foi observada. Dentre os
sinais clínicos respiratórios apresentados citam-se: presença de secreções com ou sem presença de
muco ou mucopurulento, hiperemia da mucosa da faringe e tosse.
4.1.2 Processamento das amostras clínicas e identificação das cepas
O processamento das amostras clínicas foi realizado no Laboratório de Enteropatógenos,
Microbiologia Veterinária e de Alimentos do Departamento de Microbiologia e Parasitologia do
Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense, com colaboração do Laboratório de
Doenças Infecciosas do Instituto de Veterinária da Universidade Federal Fluminense e do Núcleo
de Animais de Laboratório (NAL) do Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense,
este último para a detecção de Micoplasmas. Todos os meios de cultura utilizados foram da marca
Himedia (Mumbai, India).
As amostras clínicas recebidas em meio de cultura BHI foram incubadas em estufa
bacteriológica a 37°C (Luferco, São Paulo, Brasil) durante 24 horas e posteriormente inoculadas
em Ágar Sangue e Ágar MacConkey incubados 24-48h a 37ºC. O crescimento em BHI foi também
semeado em ágar triptona de soja (TSA, Himedia Labs) do qual se obteve uma densa suspensão
polimicrobiana com salina tamponada fosfatada (PBS) 1x, que foi homogeneizada 1:1 (v∕v) com
caldo cérebro coração (BHI, Himedia Labs) com 20% glicerol e armazenadas a -20°C estudos
adicionais.
As enterobactérias foram isoladas e inicialmente identificadas quanto à fermentação da
lactose no ágar Mac Conkey. A identificação foi realizada empregando o Enterokit B (Probac do
Brasil, São Paulo, Brasil) segundo instruções do fabricante. Quando necessário foram realizados
outros testes para diferenciação de espécies bacterianas, seguindo recomendações de Edwards &
Ewing (1962), Costa & Hofer (1972), Coutinho et al. (2005), Carter (1986) e Quinn et al. (1994).
O isolamento e identificação de outras bactérias aeróbias ou facultativas foram realizados
segundo metodologia convencional a partir da análise da morfologia colonial do crescimento
obtido no Ágar Sangue e Ágar MacConkey e celular por esfregaços em lâmina submetidos à
coloração de Gram. A identificação de bactérias Gram positivas e Gram negativas foi realizada de
27
acordo com procedimentos recomendados por Costa & Hofer (1972), Carter (1986), Coutinho et
al. (2005) e Quinn et al. (1994).
As amostras fecais foram processadas especificamente para o isolamento e identificação
de enterobactérias da mesma forma que os lavados traqueais. Todas as cepas de E. coli e Klebsiella
sp. isoladas foram estocadas a -20ºC em BHI + glicerol 20% para estudos adicionais.
As amostras de lavados traqueais foram adicionalmente investigadas quanto à presença de
Rhodococcus equi e micoplasmas. R. equi foi investigado por ensaio molecular utilizando-se
iniciadores para amplificação de fragmento específico do gene RNAr 16S, desenhados pela Profª.
Dra. Ana Luiza Mattos Guaraldi (UERJ, dados não publicados). Para micoplasmas, uma alíquota
dos lavados traqueais foi adicionada em tubos contendo Meio Frey com glicerol (1:1),
acondicionado em gelo e enviado ao laboratório do NAL, onde foram processadas segundo as
metodologias de Whitford et al., (1994) para cultivo e de Mendonça et al., (2000) e Nascimento
et al.,(2002) para a PCR.
4.2 Testes de sensibilidade a antimicrobianos
4.2.1 Técnica qualitativa de difusão em ágar
As cepas isoladas foram submetidas a ensaios de difusão em ágar (BAUER & KIRBY,
1966) conforme recomendações do CLSI (“Clinical and Laboratory Standarts Institute”) - CLSI
M100-S22 (2012) e CLSI M31-A3 (2008) Veterinário para testes de bactérias isoladas de animais.
A escolha dos antimicrobianos utilizados nos testes tem os mesmos critérios, privilegiando as
drogas de uso rotineiro na terapêutica em Medicina Equina. Foram selecionados os
antimicrobianos: amicacina, amoxicilina+ácido clavulânico, ampicilina, ceftiofur, cefotaxima,
ciprofloxacina, doxiciclina, enrofloxacina, estreptomicina, gentamicina, norfloxacina,
sulfametoxazol+trimetoprim e tetraciclina. Os antimicrobianos ceftiofur e enrofloxacina são de
uso exclusivamente veterinário.
Cada cepa foi inoculada em ágar triptona de soja (TSA) para crescimento em estufa a 37°C
por 24 h. Em seguida, colônias foram transferidas para um tubo com solução salina 0,85% estéril
para realizar uma suspensão padronizada, com uma turbidez padrão de 0,5 na escala de McFarland,
28
que representa aproximadamente 1 x 108 UFC/mL de suspensão. A suspensão foi semeada por
espalhamento, com o uso de um “swab” estéril (Labor swab, São Paulo, Brasil) em uma placa de
Petri contendo ágar Mueller Hinton de modo a obter-se um crescimento confluente e os discos dos
antibióticos foram posicionados equidistantemente nas placas de forma manual. Após incubação
por 16 a 18 h a 35ºC em estufa bacteriológica Certomat BS-1 (Braum Biotech International,
Melsungen, Alemanha), foram realizadas as leituras dos diâmetros dos halos formados pela
inibição de crescimento bacteriano ao redor dos discos. Os valores foram comparados com os
padrões interpretativos do diâmetro da zona de inibição para enterobactérias segundo critério
veterinário (CLSI 2008) e humano (CLSI 2012). Para enrofloxacina o padrão interpretativo é
exclusivamente veterinário enquanto para cefotaxima, estreptomicina e norfloxacina utilizaram-se
os padrões de interpretação humanos. Para as demais drogas os valores interpretativos são iguais.
4.2.2 Detecção fenotípica da produção de β-lactamases de espectro estendido (ESBLs)
A detecção fenotípica da produção de β-lactamases foi realizada nas cepas de
enterobactérias que se mostraram resistentes à beta-lactâmicos ou cefalosporinas, de acordo com
teste de triagem previstas no CLSI (2012) por meio da comparação com os valores de “breakpoint”
dos halos de inibição apresentados na Tabela 1.
Tabela 1: Critérios de interpretação fenotípica para detecção de amostras ESBL
29
Antimicrobiano “Breakpoint”*
Aztreonam ≤ 27mm
Ceftazidima ≤ 22mm
Cefotaxima ≤ 27mm
Ceftriaxona ≤ 25mm
*halo máximo de inibição indicativo da produção de ESBL
4.3 Ensaios Moleculares
4.3.1. Obtenção de DNA
Foi obtido DNA de todas as cepas de E. coli e Klebsiella sp. provenientes de lavado traqueal e
material fecal. Inicialmente foi retirada uma alíquota do estoque congelado das cepas e inoculada
em caldo triptona de soja (TSB), foram mantidos em estufa à 37ºC por 24 h. Posteriormente, o
crescimento foi semeado em tubos com ágar triptona de soja (TSA) inclinado, que foram mantidos
em estufa nas mesmas condições, durante 24 horas. Após esse período, foi inserido em microtubos
estéreis previamente identificados 200 µl de água destilada estéril, com alças descartáveis de 10µL
estéreis foi retirada uma alíquota do tubo e inserida no microtubo e homogeneizado no Vortex. O
DNA foi obtido por meio da lise por fervura (100ºC durante 10 min) (STEWART, TORTORELLO
& GENDEL, 1998), com posterior centrifugação durante 20s a 14.000 rpm em centrífuga Z160M
(Hermle Labortechnik, Wehingen, Alemanha). O DNA obtido foi mantido congelado a - 20ºC e
utilizado nos ensaios de PCR em um prazo máximo de 30 dias.
4.3.2. Reação de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
30
Todos os ensaios de reação em cadeia da polimerase (PCR) foram executados nos
termocicladores modelo Swift® MaxPro (Esco Healthcare, Esco, Singapura) e MJ Research
modelo PTC 100 (Watertown, EUA). Os oligonucleotídeos e o conjunto de dNTP
(desoxirribonucleotídeos fosfatados) foram obtidos do fabricante Invitrogen (Carlsbad, EUA). A
enzima Taq polimerase, e os reagentes de MgCl2 e Tampão 10 X foram obtidos do fabricante
Ludwig Biotec (Alvorada, Brasil).
Os oligonucleotídeos e suas respectivas temperaturas de anelamento estão apresentados na
Tabela 2. As concentrações dos reagentes utilizados nas reações de amplificação foram utilizadas
de acordo com as referências específicas para cada par de oligonucleotídeos.
Os produtos da PCR amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1%
em tampão TBE (Tris-Borato-EDTA). A eletroforese foi feita no mesmo tampão e a voltagem
utilizada foi de 80V, mantendo-se a amperagem em torno de 60mA, por aproximadamente 60 min,
utilizando fonte modelo PW300 PWSys (Biosystems, São José dos Pinhais, Brasil) e cuba MGU-
502T CBS (Scientific Company, DelMar, EUA). Nos poços do gel, foram colocados os controles
positivo e negativo, os amplicons, uma alíquota de 8 µL de cada produto amplificado adicionado
a 2 µL do tampão de corrida azul de bromofenol 0,25% (Amresco, Solon, EUA) e o marcador de
pares de base de 100 (pb) (Ludwig). Concluída a eletroforese, o gel foi retirado da cuba e corado
em solução de TBE com brometo de etídio (0,5 μg/mL) durante 10 min , descorado em água
destilada por 10 minutos e visualizado em transiluminador UV modelo Transluminator LPIX
Molecular Imaging (Loccus bioecnologia, Cotia, SP). A visualização e armazenagem das imagens
foram feitas através do Programa LPIX IMage Ex.
4.4 Investigação dos genes que codificam ESBLs
As cepas de enterobactérias (E.coli e Klebsiella sp.) que se mostraram resistentes à beta-
lactâmicos ou cefalosporinas foram investigados por ensaios de reação em cadeia da polimerase
(PCR) quanto à presença dos genes blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, codificadores de ESBLs das
famílias CTX, TEM e SHV, respectivamente, conforme Bonnet et al. (2003) e Wiegand et al.(2007).
As seguintes cepas foram utilizadas como controles positivos das reações de PCR: E. coli
A41 e E. coli H21 (amostras da coleção do laboratório de Enteropatógenos), e Klebsiella
31
pneumoniae ATCC 700603.
32
Gene Iniciador Sequências dos oligonucleotídeos
Produto
da
PCR (pb)
Temperatura
de Anelamento
Referência
blaCTX-M ctx-ma
ctx-mb
5’ CGCTTTGCGATGTGCAG 3’
5’ ACCGCGATATCGTTGGT 3’
550 54°C Wiegand et al., 2007; Bonnet et
al., 2003
blaSHV shv-s2
shv-s1
5’ATGCGTTATATTCGCCTGTG 3’
5’GTTAGCGTTGCCAGTGCTCG 3’
860 58°C Wiegand et al., 2007; Fu et al.,
2007
blaTEM tem-t1
tem-t3
5’ATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTC 3’
5’TTGGTCTGACAGTTACCAATGC 3’
1100 55°C Wiegand et al., 2007.
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase; pb: pares de base, ESBL: β lactamase de espectro estendido
Tabela 2: Iniciadores utilizados nos ensaios de PCR para genes ESBL neste estudo
33
4.5 Investigação de determinantes genéticos
4.5.1 Caracterização Genética da Virulência
4.5.1.1 Enterobactérias
As amostras de enterobactérias foram investigadas por PCR para a presença de marcadores
de virulência, incluindo os genes kpsMTII; fimH ; cnf1 ; afa1; hlyA e pap associados à virulência
de amostras patogênicas extra-intestinais de Escherichia coli (ExPEC) e outras enterobactérias,
como a Klebsiella sp., descritos na Tabelas 3 e 4 (JOHNSON et al., 2000; USEIN et al., 2001;
LE BOUGUENEC et al., 1992; BEUTIN et al., 2004).
As seguintes cepas de E. coli foram utilizadas como controles positivos das reações de
PCR: J96 (pap), KS52 (afa), RS218 (kps), MR219 (cnf1), U4-41 (hlyA) e EC784(fimH).
Genes Descrição Função
afa1 Adesina afimbrial I Adesina
pap Pilus associado à pielonefrite/ fimbria P Adesina
hlyA Alfa-hemolisina Toxina
cnf1 Fator de necrose citotóxica 1 Toxina
FimH Fímbria tipo 1 Adesina
kpsMTII Cápsula associada à aderência Cápsula
Tabela 3: Marcadores de virulência pesquisados em cepas de Esherichia coli e Klebsiella sp.de
lavados traqueais e amostras fecais no presente estudo.
34
Gene Sequências dos oligonucleotídeos
Produto da
PCR (pb)
Temperatura
de Anelamento
Referência
afa1 afa1 5’- GCT GGG CAG CAA ACT GAT AAC TCT C – 3’
afa2 5’- CAT CAA GCT GTT TGT TCG TCC GCC G – 3’ 750 65°C Le Bouguenec, Archambaud & Labigne, 1992
pap pap1 5’ - GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGC G – 3’
pap2 5’- GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGC G – 3’ 328 65°C Le Bouguenec, Archambaud & Labigne, 1992
hlyA hlyA-f16 5’ - CAG TCC TCA TTA CCC AGC AAC – 3’
hlyA-b14 5’- ACA GAC CCC TTG TCC TGA AC – 3’ 355 52,6°C Paton & Paton, 1998
cnf1 cnfs 5’ - TTA TAT AGT CGT CAA GAT GGA – 3’
cnfs 5’ - CAC TAA GCT TTA CAA TAT TGA – 3’ 760 60°C De Rycke, Milon & Oswald, 1999
fimH fimHf 5’ - AAC AGC GAT GAT TTC CAG TTT GTG TG – 3’
fimHr 5’ - ATT GCG TAC CAG CAT TAG CAA TGT CC – 3’ 465 60°C Usein et al, 2001
kps kpsII 5’- CAT CCA GAC GAT AAG CAT GAG CA – 3’
kpsI 5’- GCG CAT TTG CTG ATA CTG TTG – 3’ 272 63°C Bekal et al, 2003
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase; pb: pares de base
Tabela 4: Iniciadores utilizados nos ensaios de PCR para genes de virulência neste estudo.
35
4.6 Análise da relação genética das cepas
4.6.1 Determinação do grupo filogenético das cepas de Escherichia coli
A origem filogenética das amostras foi determinada baseando-se na metodologia descrita
por Clermont et al., 2000. Essa classificação é realizada por PCR (Reação em Cadeia da
Polimerase) triplex, onde há a amplicação de dois genes chuA e yjaA e de uma região do DNA
TspE4.C2. Os iniciadores utilizados estão descritos na Tabela 5. De acordo com o resultado do
PCR, as cepas são classificadas segundo o fluxograma apresentado na Figura 1 em quatro grupos
filogenéticos principais A, B1, B2 e D.
Como controles positivos das reações de PCR para determinação do grupo filogenético
foram utilizadas as cepas E. coli : C61, 61H e 61F da bacterioteca de nosso laboratório .
36
Gene Primers Sequências dos oligonucleotídeos
Produto da
PCR (pb)
Temperatura
de Anelamento
Referência
chuA chuA.1
chuA.2
5’-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3’
5’-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3’
279 55°C Clermont et al.,
2000
yjaA yjaA.1
yjaA.2
5’-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3’
5’ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3’
211 55°C Clermont et al.,
2000
TspE4.C2 tspE4C2.1
tspE4C2.1
5’-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3’
5’-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3’
152 55°C Clermont et al.,
2000
Tabela 5: Iniciadores utilizados nos ensaios de PCR para grupos filogenéticos de E. coli neste estudo.
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase; pb: pares de base
37
4.6.2 Amplificação Randômica de DNA Polimórfico (RAPD-PCR)
As cepas de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae isoladas dos lavados traqueais e do
material fecal das mesmas espécies foram comparadas quanto à sua relação genética através de
ensaios de PCR randômico (RAPD) utilizando os iniciadores arbitrários 1254 (PFALLER et al.,
1994; SON et al., 2006).
4.6.2.1 Obtenção de DNA
De cada cepa em estoque, foi retirada uma alíquota e inoculada em 2 mL de TSB, distribuído
em tubos 18x180 mm, onde foram mantidos inclinados sob agitação constante (120 rpm) por 18 h
a 37°C, em estufa Certomat® BS-1 (B. Braum Biotech international, Pennsylvania, EUA). Após
o período de incubação, a densidade óptica (DO) a 600 nm de uma diluição 1:10 em água, da
cultura foi em espectrofotômetro modelo QI1080 (Quimis®, Diadema, SP, Brasil). Para uma DO
- +
chuA
B1 ou A B2 ou D
yjaA
TspE4.C2
- + + -
B1
D
A
B2
Figura 1: Fluxograma de determinação do grupo filogenético de E. coli a partir da amplificação por PCR
dos genes chuA e yjaA e fragmento de DNA TSPE4.C2 (Clermont et al., 2000).
38
de 0,4, foi utilizada uma alíquota de 200 μL do crescimento original, suspensa em 900 μL de PBS
estéril (PACHECO et al., 1997). As suspensões foram fervidas por 10 minutos a 100ºC,
centrifugadas por 20 s e congeladas a - 20ºC, para utilização como fonte de DNA para as reações
de amplificação.
4.6.2.2 Reação de amplificação
Todas as reações foram executadas em um mesmo termociclador PTC-100 (MJ Research,
Watertown, MA, EUA). A reação foi realizada utilizando 4 μL dos oligonucleotídeos 1254 (5‟-
CCGCAGCCAA-3‟) (30 pmol/mL), 3 μL de tampão de PCR 10x, 1,8 μL MgCl2 (1,5 mM), 3 μL
de dNTP (2,5 mM), 0,3 μL de DNA Taq polimerase (1,5 U) e 3,0 μL do DNA molde para um
volume final de 30 μL (PACHECO et al., 1997).
Foram utilizados os seguintes parâmetros para o programa de amplificação: quatro ciclos de
94°C (5 min), 37°C (5 min) e 72°C (5 min), seguidos de 30 ciclos de 94°C (1 min), 37°C (1 min)
e 72°C (2 min) e uma etapa final de extensão de 72°C (10 min) (PACHECO et al, 1997).
Os produtos do RAPD-PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,2% (p/v)
em tampão TBE, fonte modelo PW300 PWSys (Biosystems, São José dos Pinhais, Brasil) e cuba
MGU-502T (CBS, Scientific Company, DelMar, CA, EUA). com voltagem de 70 V e amperagem
aproximada de 60 mA. Imediatamente após a corrida, o gel foi corado com solução de brometo de
etídio (0,5 μg/mL, descorado em água destilada por 10 min e visualizado em transiluminador UV
modelo Transluminator LPIX Molecular Imaging (Loccus bioecnologia), a visualização e
armazenagem das imagens foram feitas através do Programa LPIX IMage Ex. No gel, além das
cepas, foi colocado o marcador pares de base Ladder 100 pb (Ludwig Biotec).
4.6.2.3 Análise da relação genética das cepas
Para análise da relação genética das cepas, utilizou-se o programa RAPDistance1.04
(ARMSTRONG et al., 1994), utilizando-se como algoritmo de similaridade o coeficente de
Jaccard. Na caracterização das cepas considerou-se como de mesmo tipo RAPD-PCR (designado
por números romanos) aquelas que apresentassem índice de similaridade acima de 75% (GRIF et
al., 1998). Os subtipos foram designados por letras minúsculas. A matriz de distâncias gerada pelo
39
programa foi utilizada para a construção de um dendograma, empregando o método UPGMA
(agrupamento pareado por médias aritméticas), com o auxílio do programa MEGA4 (TAMURA
et al., 1994).
4.7 Análise Estatística
A associação entre a presença de enterobactérias e a presença de sinais de alterações
respiratórias foi avaliada através do teste de Qui-quadrado considerando-se como significativo um
p valor igual ou menor a 0,05.
40
5 RESULTADOS
5.1 Amostras clínicas de lavados traqueais
Após a coleta das 56 amostras clínicas de lavados traqueais constatou-se que a grande
maioria, (85,7% ∕ n= 46) foi proveniente de animais com algum tipo de alteração respiratória.
5.2 Isolamento de enterobactérias e outras bactérias das amostras clínicas de lavados
traqueais
Após o processamentos das 56 amostras clínicas de lavados traqueais foram isoladas pelos
métodos convencionais 140 cepas de diversos gêneros bacterianos potencialmente capaz de causar
afecções respiratórias. Rhodococcus equi não foi detectado nas amostras enquanto Mycoplasma
sp. foi detectado em 16 amostras, totalizando 156 isolamentos∕detecções bacterianas (Figura 2).
41
Figura 2: Bactérias isoladas de lavados traqueais de potros de muar
Dentre os gêneros bacterianos isolados, houve um predomínio das enterobactérias (46,8%
n=73), principalmente de E. coli (16 %; n=25) e Klebsiella sp. (14,1%; n=22). Apenas uma cepa
de Klebsiella correspondeu à espécie distinta de K. pneumoniae, sendo identificada como K.
oxytoca. As 47 cepas de E. coli e Klebsiella sp., foram provenientes principalmente de animais
que apresentavam sinais de alterações respiratórias (87%; n=41) em comparação àqueles que não
apresentavam alterações respiratórias (13%; n=6). A ocorrência de E. coli e Klebsiella sp. em
amostras clínicas de lavado traqueal, foi maior no grupo de animais com sinais de alterações
respiratórias (69,6% vs 40%) apesar desta diferença não ter se mostrado significativa (p= 0,077)
(Figura 3).
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
14%
16%
18%
42
Figura 3: Percentual de potros de muar com isolamento de E. coli e Klebsiella sp. em amostras de
lavado traqueal segundo a presença ou ausência de alterações de respiratórias.
5.3 Isolamento de enterobactérias das amostras fecais de potros de muar
Após o processamento das 56 amostras fecais para o isolamento de enterobactérias, foram
isoladas de todas as amostras um total de 67 cepas. Porém, somente 22 cepas de E. coli e Klebsiella
sp. foram utilizadas, em função do pareamento com as cepas isolada de lavados traqueais. A
presença de E. coli foi predominante 91% (n=20) e Klebsiella pneumoniae 9% (n=2).
5.4 Teste de sensilibidade aos antimicrobianos
Foi realizado o teste de sensibilidade aos antimicrobianos em todas as amostras de E. coli
e Klebsiella sp., das cepas provenientes dos lavados traqueais (n=47) e das amostras fecais (n=22)
dos potros. O percentual de amostras susceptíveis, resistentes ou com resistência intermediária aos
antimicrobianos testados está apresentado nas Tabelas 6 e 7.
Nas cepas isoladas de lavado traqueal foi observada resistência ou intermediária a uma ou
mais drogas em 30 amostras (64%), enquanto que 17 amostras (36%) foram sensíveis a todos os
antimicrobianos testados. Para as cepas de E. coli (25) os maiores índices de resistência foram
observados para os antimicrobianos tetraciclina (20%), ampicilina e sulfametaxazol + trimetoprim
(16%), amoxicilina + ácido clavulânico e doxicilina (12%). Menores índices de resistência foram
observados para enrofloxacina, estreptomicina e norfloxacina (4%). Já para as cepas de Klebsiella
0%
20%
40%
60%
80%
COM ALTERAÇÕES SEM ALTERAÇÕES
43
pneumoniae (22) os maiores índices de resistência foram observados para os antimicrobianos
ampicilina (77,3%), amoxacilina + ácido clavulânico (31,8%), tetraciclina (13,6%). Menores
índices de resistência foram observados para estreptomicina e sulfametaxazol + trimetoprim
(4,5%). Ao contrário das cepas de E. coli, todos os cepas de Klebsiella pneumoniae apresentaram
sensibilidade aos antimicrobianos norfloxacina, doxiciclina e enrofloxacina. Todas as amostras
mostraram-se sensíveis a amicacina, ceftioufur, cefotaxima, ciprofloxacina e gentamicina.
A ocorrência de cepas resistentes a uma ou mais drogas em função da presença ou não de
alteração respiratória nos animais coletados mostrou valores similares nos dois grupos (36,6% vs.
33,3%, respectivamente. No entanto as quatro amostras multirresistentes (resistentes a mais de 3
classes de antimicrobianos), de E. coli (n=3) e Klebsiella pneumoniae (n=1) foram provenientes
de animais apresentando sinais de alteração respiratória.
44
Tabela 6: Perfil de resistência de Escherichia coli e Klebsiella sp. isoladas de lavados traqueais
de potros de muar no município de Cachoeiras de Macacu.
* As cepas bacterianas não apresentaram resistência aos antimicrobianos amicacina, ceftiofur,
cefotaxima, ciprofloxacina e gentamicina.
R: resistência; I: Intermediária
Em relação às cepas de E. coli (20) provenientes das amostras fecais dos potros, foi
observada resistência ou resistência intermediária a uma ou mais drogas em oito (40%) amostras.
Maiores índices de resistência foram observadas para os antimicrobianos tetraciclina (30%),
estreptomicina (25%) e doxicilina (20%). Menores índices de resistência foram observados para
amoxicilina + ácido clavulânico (15%) e ampicilina (10%). Em relação às duas cepas de Klebsiella
pneumoniae apenas uma apresentou resistência à ampicilina (50%). Todas as amostras mostraram-
se sensíveis a amicacina, ceftioufur, cefotaxima, ciprofloxacina, enrofloxacina, gentamicina,
norfloxacina, sulfametaxazol + trimetoprim (Tabela 7).
Antimicrobiano % (R + I)
Escherichia coli (n=25) Klebsiella sp. (n=22)
Ampicilina 16% 77,3%
Amoxicilina + Ácido Clavulânico 12% 31,8%
Tetraciclina 20% 13,6%
Sulfametaxazol + Trimetoprim 16% 4,5%
Doxiciclina 12% 0%
Estreptomicina 4,0% 4,5%
Enrofloxacina 4,0% 0%
Norfloxacina 4,0% 0%
45
Tabela 7: Perfil de resistência de Escherichia coli e Klebsiella sp. isoladas de amostras fecais de
potros de muar no município de Cachoeiras de Macacu.
* As cepas bacterianas não apresentaram resistência aos antimicrobianos sulfametaxazol +
trimetoprim, enrofloxacina, norfloxacina, amicacina, ceftiofur, cefotaxima, ciprofloxacina e
gentamicina.
R: resistência; I: Intermediária
5.4.1 Detecção fenotípica e genotípica de β-lactamases de espectro estendido (ESBLs)
Os testes fenotípicos revelaram 14 cepas potencialmente produtoras, sendo sete de lavados
traqueais e sete de amostras fecais. Os ensaios de PCR realizados permitiram a identificação de
genes codificadores de ESBLs em seis amostras de lavados traqueais e seis de amostras fecais.
Dentre as cepas de E. coli, predominou a presença do gene blaCTX, enquanto o gene blaSHV foi
mais frequente em Klebsiella pneumoniae. Presença simultânea de dois genes (blaTEM e blaSHV)
foi detectada em uma cepa de E. coli e duas cepas de Klebsiella pneumoniae.
Todas as cepas ESBL positivas provenientes de lavado traqueal eram de animais com
algum tipo de alteração respiratória (Tabela 8).
Antimicrobiano % (R + I)
Escherichia coli (n=20) Klebsiella pneumoniae
(n=2)
Tetraciclina 30% 0%
Estreptomicina 25% 0%
Doxiciclina 20% 0%
Amoxacilina + Ácido Clavulânico 15% 0%
Ampicilina 10% 50 %
46
Tabela 8: Genes codificadores de ESBLs em E. coli e Klebsiella pneumoniae de potros de muar
de Cachoeiras de Macacu.
Cepas Origem Gene
blaCTX-M blaTEM blaSHV
E. coli
17E AF +
23E AF +
47E AF +
50E AF +
53E LT + +
53E AF +
Klebsiella pneumoniae
11K LT +
18K AF +
44K LT +
53K LT + +
58K LT +
60K LT + +
LT: lavado traqueal ; AF: amostra fecal
47
5.5 Pesquisa de marcadores de virulência
Na investigação dos fatores de virulência associados à patogenicidade extra-intestinal das
amostras de E. coli e Klebsiella sp., isoladas de lavados traqueais, todos os investigados foram
detectadas, mas com frequências variadas. O fator fimH, relacionado à fímbria tipo 1 foi o mais
frequente, sendo observado em 23∕25 (92%) e 13∕22 (59%) das cepas de E. coli e Klebsiella sp.,
respectivamente. Quanto à ocorrência dos demais fatores em cepas dos lavados traqueais, citam-
se cepas de E. coli - pap 3∕25(12%), afa1 1∕25(4,0%), hlyA 2∕25(8,0%), cnf1 2∕25(8,0%) e kps
4∕25(16,0%); Klebsiella sp. - pap 1∕22(4,5%), hlyA 2∕22(9,1%) e cnf11∕22(4,5%) (Figura 4 e 5).
De modo similar, nas cepas provenientes das amostras fecais dos potros, o fator fimH
também foi o mais frequente, sendo observado em todos os cepas de E. coli e em um das duas
cepas de Klebsiella sp.Quanto à ocorrência dos demais fatores em cepas das amostras fecais, citam-
se cepas de E. coli - pap 1∕20(5%), hlyA 4∕20(20,0%) e cnf11∕20(5,0%) e kps 8∕20(40,0%);
Klebsiella sp. – nenhum outro gene foi detectado (Figura 4 e 5).
Duas cepas de E. coli provenientes de lavado traqueal apresentaram cinco dos seis genes
de virulência investigados. A cepa LT17E apresentou os genes pap, hlyA, cnf1, fimH e kps. A cepa
LT29E apresentou os genes pap, afa1, cnf1, fimH e kps. Adicionalmente, um isolado recuperado
de amostra fecal do mesmo animal (RP29E) foi positivo para quatro genes de virulência: hlyA,
cnf1, fimH e kps
Excluindo-se o gene fimH, nenhum outro gene de virulência foi detectado nas cepas
provenientes de animais sem sinais de alterações respiratórias.
48
Figura 4: Genes marcadores de virulência extra intestinal em E. coli isoladas de potros
de muar.
Figura 5: Genes marcadores de virulência extra intestinal em Klebsiella sp. isoladas de
potros de muar.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
pap afa hlya cnf fimH kps
LAVADO TRAQUEAL
AMOSTRA FECAL
0%
20%
40%
60%
80%
100%
pap afa hlya cnf fimH kps
LAVADO TRAQUEAL
AMOSTRA FECAL
49
5.6 Análise da relação genética das cepas
5.6.1 Determinação do grupo filogenético das cepas de Escherichia coli
O perfil filogenético das 25 cepas de E. coli provenientes de lavados traqueais revelou uma
maior frequência (n=13; 52%) de cepas do grupo B1, que se repetiu dentre os 20 cepas de amostras
fecais dos potros, que (n=13; 65%) pertenceram ao grupo B1.
Cepas pertencentes aos grupos B2 e D, normalmente mais relacionadas a amostras
patogênicas extraintestinais foram detectadas em pequeno número nas amostras fecais dos potros,
em cada grupo B2 e D foram observadas três (15%) cepas enquanto nas amostras de lavados
traqueais a frequência foi de três (12%) para o grupo D e um (4%) para B2. Quanto ao grupo A,
foi detectado em oito (32%) cepas de lavados traqueais e um (5%) de amostras fecais (Figura 6).
As três cepas provenientes dos lavados traqueais dos animais que não apresentaram
nenhum sinal de alteração respiratória pertenceram a três grupos filogenéticos distintos: A e B1
(comensais) e D (potencialmente patogênica).
Figura 6: Grupos filogenéticos de E. coli isoladas de potros de muar
0%
20%
40%
60%
80%
100%
A B1 B2 D
LAVADO TRAQUEAL
AMOSTRAS FECAIS
50
5.6.2 Perfil genético gerado após ensaios de RAPD-PCR
Para os ensaios de RAPD, foram selecionadas cepas representativas dos perfis de
resistência antimicrobiana e de virulência encontradas. Desse modo, 16 cepas de E. coli, incluindo
oito provenientes de lavado traqueal e oito cepas de material fecal pareados foram avaliadas
enquanto cinco cepas de Klebsiella pneumoniae de lavado traqueal e duas de material fecal não
pareadas foram também avaliadas.
A análise dos fragmentos gerados após a realização da RAPD-PCR com o uso do
oligonucleotídeo 1254 (Figura 7) mostrou nas cepas de E. coli uma variedade de bandas (n=19),
variando de 200 a 2000 pb. Em relação às amostras de Klebsiella pneumoniae 17 bandas foram
observadas variando de 200 a 2000 pb. Duas cepas de E. coli e uma de Klebsiella pneumoniae não
geraram perfis de amplificação com o primer utilizado.
A matriz de distâncias gerada pelo programa RAPDistance 1.04 foi utilizada para a
construção de um dendograma (Figura 7 e 8), empregando o método UPGMA (Unweighted Pair
Group Method with Arithmetic Mean) com o auxílio do programa MEGA4.
Utilizando-se o índice de similaridade acima de 75%, foram identificados oito tipos RAPD-
PCR (nomeados I a VIII) e 14 subtipos (nomeados em letras minúsculas) dentre os cepas de E.
coli . Todas as amostras isoladas de lavado traqueal pertenceram aos tipos IV a VII, enquanto a
maioria das cepas isoladas de material fecal foram dos tipos I a III e VIII.
As amostras classificadas no filogrupo B2, que apresentaram diversos genes de virulência,
independente da origem (lavado traqueal ou amostra fecal) apresentaram tipos RAPD distintos
(Figura 7).
O dendograma das cepas de Klebsiella pneumoniae, revelou cinco tipos e seis subtipos. As
cepas de Klebsiella pneumoniae de subtipos Ia e Ib apresentaram algumas semelhanças em relação
ao perfil de resistência, presença de genes codificadores de ESBL e de virulência. As cepas dos
tipos IV e V apresentaram o mesmo perfil de resistência e gene codificador de ESBL (Figura 8).
51
Figura 7: Dendograma das cepas de E.coli de lavados traqueias e amostras fecais, construído pelo método UPGMA do Programa
MEGA4 (TAMURA et al., 1994) após ensaios de RAPD-PCR com o uso do oligonucleotídeo 1254. Os valores da escala denotam a
distância genética entre os ramos. Adicionalmente, é apresentado o perfil de marcadores de virulência presentes nas cepas do presente
estudo. LT: lavado traqueal e RP: reto de potro (amostra fecal).
hlyA, fimH, kps B1
hlyA, fimH B1
SHV hlyA, fimH B1
AMC CTX fimH B1
AMC, AMP hlyA, cnf, fimH, kps B2
fimH, kps B1
hlyA, fimH, kps B1
pap, afa, cnf, fimH, kps B1
pap, fimH, kps B2
SUT, TET fimH A
fimH, kps B1
pap, hlyA, cnf, fimH, kps B2
fimH B1
CTX fimH, kps B2
ESBL Resistência Filogenético
II
III
Genes de virulência
IV
V
Cepas
VIII
VII
I
VI
I
I
52
Figura 8: Dendograma das cepas de Klebsiella pneumoniae isoladas de lavados traqueias e amostras fecais de potros de muar construído
pelo método UPGMA após ensaios de RAPD-PCR com o uso do oligonucleotídeo 1254. Os valores da escala denotam a distância
genética entre os ramos. LT: lavado traqueal e RP: reto de potro (amostra fecal).
LT AMC AMP TEM SHV fimH
LT AMP SHV fimH
LT AMC AMP CTX fimH
RP fimH
LT AMP SHV
RP AMP SHV
Origem Resistência Genes de virulência ESBL Cepas
I
V
IV
III
II
53
Kb 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11
Figura 9: Foto representativa do ensaio de RAPD-PCR com
oligonucleotídeo 1254 de cepas de E. coli e Klebsiella
pneumoniae provenientes de cepas de lavado traqueal.
54
.
Kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
55
Figura 10: Foto representativa do ensaio de RAPD-PCR
com oligonucleotídeo 1254 de cepas de E. coli e Klebsiella
pneumoniae provenientes de amostra fecal.
56
AMOSTRAS
LT*
ALTERAÇõES
RESPIRATÓRIAS
PERFIL DE
RESISTÊNCIA CTX TEM SHV FILOGENÉTICA RAPD pap afa hlyA cnf fimH Kps
LT11E X D X
LT11K X AMP X NR
LT13E X B1 X
LT15E X B1 X
LT17E X B2 VIIb X X X X X
LT18K X AMP NR
LT19K X NR
LT23E X B1
LT24E X A X
LT24K X AMC, AMP NR X
LT26K X NR X
LT28E X B1 VIIc X
LT28K X AMP, EST, TET NR
LT29E X B1 Va X X X X X
LT29K** X AMP NR X
LT30K X AMP NR X
LT31K X AMP NR
LT34E X AMC, AMP A X
LT34K X AMP NR X
LT35K X AMC NR X
LT39K X AMC, AMP NR X
LT43E X AMC, AMP A X
LT44K X AMC, AMP X NR IIa X
LT45E X B1 X
LT46E X ENR A X
LT47E X B1 VIIa X X
Tabela 9: Caracterização das cepas de E. coli e Klebsiella sp. isoladas de lavados traqueais de potro de muar.
57
*LT: Lavado traqueal; E: Escherichia coli; K: Klebsiella (todas, a exceção de LT29K são K.pneumoniae); ** K. oxytoca NR: Não realizado; X: Indica presença
AMC – Amoxicilina+ácido clavulânico; AMP- Ampivilina; DOX- Doxiciclina; ENR- Enrofloxacina; EST – Estreptomicina; NOR – Norfloxacina; SUT – Sulfametaxazol+
trimetoprim; TET - Tetraciclina
LT48E X AMP D X
LT49E X B1 IVa X X X
LT50E X B1 X
LT50K X AMP NR X
LT52E X SUT, TET A VIb X
LT53E X AMC, AMP, EST, SUT,TET X X B1 X
LT53K X AMC, AMP X X NR Ia X
LT54E X NOR, SUT, TET B1 X
LT56E X DOX A X
LT56K X AMP NR
LT57E X DOX, SUT, TET A X
LT58E X B1 X X
LT58K X AMP X NR Ib X
LT59K X AMC, AMP NR X
LT60K X SUT, TET X X NR X X
LT06K AMP NR X
LT14E D
LT32E DOX, TET A
LT32K TET NR X
LT33E B1 X
LT33K AMC, AMP NR X
Continuação da tabela 9
58
AMOSTRAS
RP*
PERFIL DE
RESISTÊNCIA CTX TEM SHV FILOGENÉTICA RAPD pap afa hlyA cnf fimH Kps
RP13 E B1 X
RP14 E D X
RP17 E AMC X B1 IIa X
RP18K AMP X NR Va
RP23 E AMC, AMP, EST, TET X B1 X
RP24 E D X X
RP28 E B2 VIa X X X
RP29 E AMC, AMP B2 IIIa X X X X
RP34 E DOX, EST, TET B1 X
RP43 E DOX, EST, TET B1 X
RP45 E D X
RP46 E A X
RP47 E X B2 VIIIa X X
RP 48 E B1 Ib X X
RP 49 E B1 IIIb X X
RP50 E X B1 X X
RP52 E B1 Ia X X X
RP53 E X B1 Ic X X
RP54E DOX, EST, TET B1 X
RP56 K NR IIIa X
RP57E TET B1 X X
RP58 E DOX, EST, TET B1 X
Tabela 10: Caracterização das cepas de E. coli e Klebsiella pneumoniae isoladas das amostras fecais de potro de muar.
* RP: Reto de potro (amostra fecal); E: Escherichia coli; K: Klebsiella pneumoniae; NR: Não realizado; X: Indica presença
AMC – Amoxicilina+ácido clavulânico; AMP- Ampivilina; DOX- Doxiciclina; EST – Estreptomicina; TET - Tetraciclina
59
5 DISCUSSÃO
As afecções respiratórias são um dos principais problemas associados à elevada morbidade
e mortalidade em potros e equinos adultos, a etiologia destas afecções é muito variada, sendo
frequente a participação de enterobactérias (COHEN, 1994; ALBUQUERQUE, 2006). No entanto,
apesar de apresentar importância similar em muares, os estudos são mais escassos e as informações
são mínimas (THIEMANN, 2012).
O presente trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar as cepas de Escherichia coli e
Klebsiella sp. isoladas de lavados traqueais de potros de muar, devido a sua predominância nestas
amostras. Adicionalmente, foram isoladas cepas de amostras fecais dos animais com finalidade
comparativa. Desta forma avaliamos o perfil de resistência aos antimicrobianos, à presença de
genes de virulência, de genes codificadores de ESBL e a relação genética das cepas isoladas de
lavados traqueais e amostras fecais.
As enterobactérias foram as mais frequentes dentre as bactérias isoladas de amostras
clínicas de lavados traqueais de potros de muar (46,8%; n=73) e destas a maioria correspondeu a
Escherichia coli (16% n=25) e Klebsiella sp. (14,1%; n=22) sendo que diversos outros gêneros
foram isolados. Estes resultados concordam em parte com estudos anteriores, como o de Ryu et al.
(2011), que em um estudo com cavalos jovens de corrida apresentando algum tipo de sinal clínico
de doença do trato respiratório superior, foram isoladas diferentes espécies bacterianas, sendo o
mais comum cepas Pseudomonas sp., Escherichia coli e Streptococcus equi (subsp. equi e subsp.
zooepidemicus).
Outros estudos também detectaram E. coli e Klebsiella sp., porém em menor frequência.
Resultados de um estudo sobre doença respiratória aguda em cavalos, em Ontário, Canadá
60
(CARMAN et al.,1997) demonstraram que as bactérias mais frequentemente isoladas foram
Streptococcus α-hemolítico, Staphylococcus coagulase negativos, Actinobacillus equuli e
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. E. coli foi detectada, porém em menor frequência que
os anteriores. Um estudo alemão (FEY & SCHMID, 1995) relacionado com sinais clínicos
respiratórios em cavalos observou que S. equi subsp. equi e S. equi subsp. zooepidemicus foram as
espécies dominantes, sendo observada a presença de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae
porém em menor frequência.
Já em um estudo de potros com infecções do trato respiratório superior na Polônia
(BOGUTA et al., 2002) informou que Staphylococcus coagulase negativos e Acinetobacter sp.
foram as espécies identificadas predominantes, mas uma informação relevante foi observada, em
três casos de animais que foram a óbito, em dois casos a espécie bacteriana Klebsiella pneumoniae
e um caso em que a Escherichia coli foram isoladas de abscessos pulmonares post mortem.
No presente trabalho, a análise dos lavados traqueais não resultou em isolamento elevado
de Streptococcus sp., que foi frequentemente detectado em outros estudos. Tal fato pode ter sido
influenciado pela estratégia adotada de estocagem da amostra na forma de suspensão
polimicrobiana para isolamento posterior.
Resistência ou resistência intermediária a uma ou mais drogas foi observada em 30∕47
(64%) cepas de lavado traqueal. Nas amostras fecais foi observada resistência ou resistência
intermediária a uma ou mais drogas em 8∕20 (40%) das cepas de E. coli. A maioria das cepas
resistentes de E. coli e Klebsiella sp. provenientes de lavados traqueais, apresentou-se resistente a
uma ou duas drogas. Multirresistência (resistência a três ou mais classes de drogas) foi
caracterizada em três cepas de E. coli e um isolado de Klebsiella sp. No tocante as cepas de
amostras fecais, no entanto, cinco cepas multirresistentes de E. coli foram detectadas. Schoster et
al. (2012), analisando E. coli de amostras fecais de equinos encontrou 13,4% das cepas resistentes
a ao menos um antimicrobiano e 2,6% de cepas multirresistentes. Clark et al. (2008) que isolaram
cepas bacterianas do trato respiratório de equinos relataram uma baixa resistência antimicrobiana,
sendo rara a resistência antimicrobiana a múltiplas drogas.
Em relação aos lavados traqueais, para as cepas de E .coli (n=10) os maiores índices de
resistência foram observados para os antimicrobianos tetraciclina (20%), ampicilina e
sulfametaxazol + trimetoprim (16%). Já para as cepas de Klebsiella sp. (n= 20) os maiores índices
61
de resistência foram observados para ampicilina (77,3%), amoxacilina + ácido clavulânico
(31,8%).
Em relação às amostras fecais, maiores índices de resistência foram observados para as
cepas de E. coli (n=8), para os antimicrobianos tetraciclina (30%) e estreptomicina (25%). Para os
cepas de Klebsiella sp. (n=1) só houve resistência a ampicilina (50%).
As cepas de E. coli de amostras fecais do presente estudo foram todas sensíveis aos
antimicrobianos sulfametoxazol + trimetoprim e gentamicina, em contraste ao estudo de
Dunowskaet al. (2006) que, estudando E. coli isoladas de amostras fecais de animais hospitalizados
e da comunidade, sem utilização de qualquer classe de antimicrobiano relataram resistência
frequente aos antimicrobianos sulfametoxazol + trimetoprim e gentamicina. Resistência frequente
à sulfametoxazol + trimetoprim em amostras de E. coli de origem fecal em equinos jovens também
foi relatada por Schoster et al. (2012).
Os resultados dos ensaios de PCR para identificação de genes codificadores de ESBLs em
seis amostras de lavados traqueais e seis de amostras fecais mostraram que dentre as cepas de E.
coli predominou a presença do gene blaCTX-M, uma das quais se apresentou multirresistente,
enquanto o gene blaSHV foi mais frequente em Klebsiella pneumoniae, que não apresentou
nenhuma cepa multirresistente. Presença simultânea de dois genes (blaTEM e blaSHV) foi
detectada em uma cepa de E. coli e duas cepas de Klebsiella pneumoniae
Resultados do estudo de Dolejska et al. (2011) mostraram que todas as cepas de E. coli de
amostras fecais de equinos ESBLs positiva foram multirresistentes e tiveram a presença dos genes
blaCTX-M e blaTEM, em contraste com os nossos resultados que somente uma das cinco amostras
multirreresistentes foi positiva para ESBL apresentando o gene blaCTX.
O gene blaCTX-M está se tornando cada vez mais frequente principalmente em amostras
de E. coli e Klebsiella pneumoniae (JONES et al.,2009), como no estudo de Dierikx et al., (2012)
em que foram utilizadas cepas de E. coli de amostras de diferentes origens e diferentes espécies
animais. Foi pesquisada a presença de genes ESBLs, havendo predominância deste gene em
amostras isoladas de feridas de equinos.
A patogenicidade extraintestinal de enterobactérias está normalmente relacionada à
presença de fatores de virulência que permitem a colonização (p. ex., adesinas), sobrevivência e
multiplicação (p. ex., evasinas) e agressão (p. ex., toxinas) do hospedeiro. Dentre os fatores de
62
virulência investigados, fimH foi o mais frequente tanto em cepas de E. coli (92%) como de
Klebsiella sp. (59%). A fímbria do tipo I, apesar de ser comum em amostras comensais intestinais
de E. coli, apresenta um papel reconhecido como adesina nas amostras extraintestinais. O gene
fimH foi o único identificado dentre as cepas provenientes de animais sem alterações respiratórias.
Todos os demais fatores de virulência investigados em cepas de E. coli provenientes de
lavados traqueais foram detectados, ainda que em menor proporção que fimH : pap (12%), afa
(4,0%), hlya (8,0%), cnf (8,0%) e kps (16,0%). A presença destes fatores de virulência também foi
investigada em cepas de E. coli provenientes das amostras fecais dos potros. De modo similar, o
fator fimH também foi o mais frequente (100%) e em uma das duas cepas de Klebsiella sp. Apenas
o gene afa não foi detectado dentre estas cepas e a frequência dos demais genes foi superior : hlyA
(20,0%) e kps (40,0%). Tais resultados eram esperados pois sabe-se que o habitat das cepas
patogênicas extraintestinais é o trato intestinal (Maynard et al., 2004).
Além disso, há relatos da presença destes genes em amostras isoladas de casos de diarréia.
Starcic et al. (2002) estudaram 24 cepas de E. coli hemolíticas provenientes de fezes diarréicas
caninas e a grande maioria das cepas foi positivo para pap (80%), cnf1 (80%), kps (62,5%) e hlyA
(100%). Regua-Mangia et al. (2009) associaram a presença do gene kps com diarréia em crianças.
Além de fimH, os genes pap, hlya e cnf foram detectados em baixa frequência em cepas de
Klebsiella sp.provenientes de lavado traqueal (4,5%, 9,1% e 4,5%, respectivamente). No entanto,
nenhum dos outros genes investigados além de fimH foi detectado em cepas provenientes de
material fecal. Há poucos dados na literatura sobre a presença destes fatores de virulência em
Klebsiella sp., que apontam em geral para a presença do gene fimH e a ausência dos demais fatores
(LIVRELLI et al.,1996; EL FERTAS-AISSANI et al., 2012).
DebRoy et al. (2008) investigaram a presença de genes de virulência em uma cepa de E.
coli de um caso fatal de broncopneumonia de uma égua, detectando o gene do fator citotóxico
necrotizante (cnf1) e das fímbrias fimH e pap. Estes genes são normalmente associados a infecções
do trato urinário, pneumonia, meningite e outras doenças em seres humanos. Em animais, têm sido
associados à infecção do trato urinário e pneumonia em cães e gatos. Semelhante aos nossos
resultados das cepas de lavado traqueal de animais com alguma alteração respiratória, nas cepas de
E. coli também foram detectados os genes de virulência descritos acima.
63
Diversos outros estudos indicam que os genes pap, afa, cnf1 e kps são encontrados
principalmente em cepas E.coli uropatogênicas (BEKAL et al., 2003; TAVECHIO et al., 2004;
VON-SIDOW, 2005).
A presença de E. coli isolada de sítios extraintestinais de diversos animais e apresentando
fatores de virulência e outras características similares a cepas de origem humana demonstra o
potencial papel dos animais como reservatórios ou a possibilidade do compartilhamento das
mesmas cepas (JOHNSON, STEEL & DELAVARI, 2001; MAYNARD et al., 2004; JOHNSON
et al. 2012).
Três cepas de E. coli provenientes de lavado traqueal (n=2) e amostra fecal (n=1)
apresentaram quatro ou cinco dos seis genes de virulência investigados, apresentando, portanto um
perfil de maior virulência. Uma cepa oriunda de lavado traqueal e a cepa de amostra fecal foram
isoladas do mesmo animal.
Além da maioria das cepas ter sido proveniente de animais com alterações respiratórias,
nenhum outro gene de virulência extraintestinal, à exceção de fimH, foi detectado nas cepas
provenientes de animais sem sinais de alterações respiratórias. Tal fato reforça a possível
contribuição das cepas de E. coli e Klebsiella sp. no surgimento destas alterações. Certamente,
outros fatores associados, dentre estes os demais agentes microbianos presentes, devem ser
considerados.
As amostras patogênicas extraintestinais de E.coli na maioria das vezes são agrupadas nos
filogrupos B2 e D, enquanto as amostras patogênicas intestinais pertencem aos filogrupos A, B1 e
D. As amostras comensais não patogênicas pertencem frequentemente aos filogrupos A e B1
(JONHSON et al., 2002; ESCOBAR et al., 2004). Amostras ExPEC que apresentam perfis de
virulência similares normalmente pertencem ao mesmo filogrupo, distinto das amostras comensais
(RUSSO & JONHSON, 2000).
No presente estudo, observou-se que a maior frequência de cepas de E. coli de lavados
traqueais foi do grupo B1 (52%), que se repetiu dentre os cepas de amostras fecais (65%). A maioria
das cepas apresentando mais de um gene de virulência além de fimH pertenceu a este filogrupo.
No entanto, duas das três amostras que apresentaram mais de quatro genes de virulência eram do
filogrupo B2.
64
Três cepas provenientes de lavado traqueal e três de material fecal foram classificadas no
filogrupo D, porém apresentaram apenas um gene associado à virulência extraintestinal (fimH).
Apesar de ser mais comum em amostras comensais ou enteropatogênicas, o grupo A foi detectado
em 32% das cepas de amostras de lavados traqueais e em apenas 5% de cepas de amostras fecais.
As três cepas provenientes dos lavados traqueais dos animais que não apresentaram nenhum sinal
de alteração respiratória pertencem a três grupos filogenéticos distintos: A e B1 (comensais) e D
(potencialmente patogênica).
A relação genética das cepas de E. coli e Klebsiella pneumoniae também foi avaliada por
ensaios de RAPD. Os perfis gerados pelas cepas não apresentaram número elevado de bandas,
porém considerando-se o conjunto das cepas, um númeo razoável de bandas polimórficas foi
observado. Inicialmente buscou-se a utilização dos iniciadores 1252 e 1254, mas o primeiro não
gerou perfis com mais de três bandas (dados não mostrados). Mesmo com o uso de apenas um
iniciador e um critério de 75% de similaridade para o agrupamento das cepas num mesmo tipo
RAPD, foi possível constatar a diversidade entre as cepas de origem fecal daquelas isoladas de
trato respiratório. Estes resultados sugerem uma fonte externa para as cepas de trato respiratório,
que poderiam ser provenientes de animais adultos por exemplo. No entanto, estudos adicionais são
necessários para comprovar esta possibilidade.
O isolamento de cepas de enterobactérias predominantemente de animais com sinais de
alterações respiratórias, principalmente E. coli e Klebsiella sp. suscitou o estudo e caracterização
destes cepas. O conjunto de resultados obtidos demonstrou a heterogeneidade das mesmas, no
entanto, amostras multirresistentes, produtoras de ESBL e portadoras de diversos fatores
associados à virulência extraintestinal foram detectados. A comparação do perfil das cepas isoladas
dos lavados traqueais com aquelas oriundos do material fecal não revelou uma grande similaridade
o que sugere a possibilidade da contaminação dos potros por outras fontes, tais como bactérias dos
animais adultos.
Uma melhor compreensão das características de bactérias envolvidas na colonização ou
doença de trato respiratório de potros de muar, principalmente em função da escassez de dados,
poderá orientar a adoção de práticas de manejo na criação bem como de tratamento e profilaxia
mais eficazes.
65
66
6 CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos no presente trabalho, e tendo como base os objetivos propostos,
pode-se concluir que:
- E. coli e Klebsiella pneumoniae foram as espécies mais frequentes em lavados traqueais de
potros de muar;
- A maioria das cepas de E. coli e Klebsiella sp. provenientes de trato respiratório inferior de
potros de muar apresentou resistência a um ou mais antimicrobianos sendo detectadas cepas
multirresistentes e produtoras de ESBL. Um perfil semelhante foi encontrado em cepas
recuperados das amostras fecais dos animais;
- Os genes pap, afa1, hlyA, cnf e kpsMTII, normalmente presentes em amostras patogênicas
extra-intestinais, mesmo que em baixa frequência, foram detectados,: nas cepas de E. coli
provenientes de lavados traqueais, excetuando-se o gene fimH cuja frequência foi elevada. Nas
cepas de E. coli isoladas de amostras fecais a frequência dos genes foi maior porém o gene afa não
foi detectado.
- Genes de virulência presentes em amostras patogênicas extra-intestinais só foram detectados
em cepas de Klebsiella sp. isoladas de trato respiratório.
- Presença múltipla de fatores de virulência só foi detectada em cepas provenientes de animais
apresentando sinais de alterações respiratórias.
- A maioria das cepas de E. coli provenientes de lavado traqueal e material fecal pertenceram
ao filogrupo B1, no entanto as cepas com mais fatores de virulência foram do filogrupo B2.
- Os perfis de RAPD revelaram a diversidade genética das cepas de E. coli e Klebsiella
pneumoniae, porém distinguiram aquelas isoladas de trato respiratório das isoladas de material
fecal.
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