UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULOFACULDADE DE CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS

Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em FarmaacuteciaAacuterea de Anaacutelises Cliacutenicas

Caracterizaccedilatildeo genotiacutepica dos fatores de virulecircncia e seu

regulador agr em cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina

Marco Aureacutelio Vianello

Dissertaccedilatildeo para obtenccedilatildeo do grau deMESTRE

OrientadorProf Dra Elsa Massae Mamizuka

Satildeo Paulo2006

Marco Aureacutelio Vianello

Caracterizaccedilatildeo genotiacutepica dos fatores de virulecircncia e seu regulador agr em cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina

Comissatildeo Julgadorada

Dissertaccedilatildeo para obtenccedilatildeo do grau de Mestre

Profa Dra Elsa Massae Mamizukaorientadorpresidente

____________________________1o examinador

____________________________2o examinador

Satildeo Paulo _________ de _____

Agradecimentos Especiais

Deus

Em vossa sabedoria regozijo-me

Meus Pais

A simplicidade enraizada em suas vidas a aacuterdua necessidade do pesado trabalho tatildeo pouco remunerado e o cansaccedilo fiacutesico de cada findar de vossas jornadas apenas solidificavam o amor demonstrado para com seus filhos De suas simples atitudes

noacutes filhos observaacutevamos a grandeza de vossas sabedorias Neste momento compreendo meus amados pais como fostes tatildeo grandes e saacutebios quando mesmo

desprovidos da intelectualidade dos bancos escolares poreacutem agraciados com o bom saber da vida mostraram-me a necessidade de sempre se buscar natildeo somente a

formaccedilatildeo acadecircmica como tambeacutem o aprimoramento profissional Satildeo vossos ensinamentos os alicerces que sustentam cada vitoacuteria minha

Guardo-vos sempre em meu coraccedilatildeo

Minha esposa Tulia

Divido contigo minha vida pois acredito que o amor eacute o somatoacuterio de um mundo infindaacutevel de sentimentos e accedilotildees compatilhar sorrir chorarabraccedilar beijar suar

as matildeosdescompassar o coraccedilatildeo Sua presenccedila em minha vida faz-me seguro contigo acredito que o vencer eacute real

em ti busco a pazsem vocecirc perco o Norteeacutes sem duacutevidas a estrela-guia de minha vida

A toda minha famiacuteliaA vocecircs todos (inclusive os cunhados) meu muito obrigado Saber que encontro-

me em qualquer momento amparado por vocecircs oferece-me a estabilidade indispensaacutevel em minha jornada

Professora ElzaApoiei-me em vossos conhecimentosEnriqueci-me com vossos conselhos

Cresci com vossas criacuteticasE alegrei-me com vossa amizade

Obrigado por aceitar-me em vosso conviacutevio

Amigos e colegasPercebi a dificuldade de conciliar meu trabalho externo com a poacutes-graduaccedilatildeo Tenho certeza que se me encontro nesta etapa final foi devido a vossa ajuda

fiacutesica intelectual e incentivadora Espero que consiga transmiti-los a intensidade e grandiosidade desta palavra Obrigado

AGRADECIMENTOS

Aos grandes amigos John Anthony McCulloch e Nilton Lincopan por toda ajuda prestada pelo excelente conviacutevio e pelas cervejas compartilhadas

Aos colegas de laboratoacuterio Ana Carolina Juliana Carla Joseacute Antocircnio Diogo e Cristina pelo companheirismo e pela convivecircncia harmoniosa

Agrave professora Anna Sara Levin do Laboratoacuterio de Investigaccedilatildeo Cliacutenica da Faculdade de Medicina da USP pela ajuda e pelo empreacutestimo de seu laboratoacuterio para a conclusatildeo praacutetica de meu trabalho

Agrave Priscila Arruda Trindade pela ajuda profissional e amiga para a realizaccedilatildeo da eletroforese de campo pulsado (PGFE)

Ao colega Robson teacutecnico do Laboratoacuterio de Investigaccedilatildeo Cliacutenica da Faculdade de Medicina da USP pela ajuda dispensada

Agrave professora Marina Baquerizo Martinez natildeo somente por ser a ldquopatrocinadorardquo de minhas especializaccedilotildees como tambeacutem de mostrar-me sempre presente e amiga

Aos estagiaacuterios do laboratoacuterio Ana Paula e Renato pela ajuda dispensada

Aos amigos do LAC HGeSP pelo conviacutevio harmonioso e camarada

Abreviaturas

APC ndash Ceacutelula Apresentadora de Antiacutegeno

agr ndash Regulador de genes acessoacuterios

bp ndash Pares de bases

cna ndash Fator de ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno

eta ndash gene codificador para toxina esfoliativa A

ETA ndash Toxina Esfoliativa A

etb - gene codificador para toxina esfoliativa B

ETB ndash Toxina Esfoliativa B

HLA ndash Alfa-Hemolisina

hla ndash Gene codificador da alfa-hemolisina

HLB ndash Beta-Hemolisina

hlb ndash Gene codificador da beta-hemolisina

HLG ndashGlfa-hemolisina

hlg ndash Gene codificador da gama-hemolisina

KDa - Kilodalton

lukE-lukD ndash Gene codificador para leucocidina E-D

lukE-lukD ndashLeucocidina E-D

MHC ndash Complexo principal de histocompatibilidade

NCCLS - ldquoNational Comitee for Clinical Laboratory Standardsrdquo

MODS - Siacutendrome de Disfunccedilatildeo de Muacuteltiplos Oacutergatildeos

ORFrsquos ndash Open Reading Frames

ORSA ndash Staphylococcus aureus resistente agrave Oxacilna

PCR ndash Reaccedilatildeo em cadeia da Polimerase

PFGE ndash Pulsed Field Gel eletrophoresis

PTs - Toxinas Pirogecircnicas

pvl ndash Gene codificador para Leucocidina de Panton-Valentine

PVL ndashLeucocidina de Panton-Valentine

PTSAgs ndash Toxinas Pirogecircnicas com Atividade de Superantiacutegenos

SAGs - Superantiacutegenos

sea ndash see ndash Genes codificadores para enterotoxinas A- E

SEAndash SEE ndash enterotoxinas A- E

SaPIs ndash Ilhas de Patogenicidades

SFP ndash Intoxicaccedilatildeo Alimentar Estafilocoacutecica

SSSS ndash Siacutendrome da Pele Escaldada Estafilocoacutecica

TCR ndash Receptor de Ceacutelulas T

TSST-1 ndash Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico

tst ndash Gene Codificador da TSST-1

UFC ndash Unidades Formadoras de Colocircnias

Sumaacuterio

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO01

11 ndash Toxinas com atividades em membranas04

111 Hemolisinas04

112 Toxinas Bicomponentes07

12 ndash Toxinas com atividades de superantiacutegenos10

121 Enterotoxinas estafilocoacutecicas11

122 Toxina da Siacutendrome do Choque toacutexico18

123 Toxinas Esfoliativas22

13 - Locus agr26

2 ndash OBJETIVOS29

21- Geral29

22 - Especiacuteficos29

3 ndash MATERIAIS E MEacuteTODOS30

31- Amostras bacterianas30

32 -Triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina33

33 - Anaacutelise do polimorfismo de DNA por eletroforese de Campo

Pulsado (PFGE)33

34 - Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico p as amplificaccedilotildees37

35 - Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo

de agr presente 37

351 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) para detecccedilatildeo

dos genes dos principais fatores de virulecircncia em

estudo37

352 determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr41

36 ndash Eletroforese em gel de agarose43

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos de DNAamplificados 43

4 ndash RESULTADOS 45

41- Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina45

42 - Anaacutelise por eletroforese de Campo Pulsado (PFGE)45

43 - Determinaccedilatildeo do tipo agr47

44 - Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia48

5 - DISCUSSAtildeO 52

6 ndash CONCLUSOtildeES70

7 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS73

8 ndash ANEXOS87

81 Anexo 1 Relaccedilatildeo dos hospitais e suas localizaccedilotildees87

82 Anexo 2 Relaccedilatildeo dos resultados obtidos de PCR para os

genes analisados88

83 Anexo 3 Meios de cultura e soluccedilotildees utilizados em PFGE 89

Iacutendice de tabelas

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo

com a procedecircncia e fonte de isolamento31

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de

campo Pulsado (PFGE)36

Tabela 3- Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado38

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo39

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr41

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo

do polimorfismo do locus agr 43

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37

isolados OSSA estudados48

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado48

Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do

tipo agr encontrado49

Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas50

Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados

em funccedilatildeo da origem das cepas estudadas51

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

Marco Aureacutelio Vianello

Caracterizaccedilatildeo genotiacutepica dos fatores de virulecircncia e seu regulador agr em cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina

Comissatildeo Julgadorada

Dissertaccedilatildeo para obtenccedilatildeo do grau de Mestre

Profa Dra Elsa Massae Mamizukaorientadorpresidente

____________________________1o examinador

____________________________2o examinador

Satildeo Paulo _________ de _____

Agradecimentos Especiais

Deus

Em vossa sabedoria regozijo-me

Meus Pais

A simplicidade enraizada em suas vidas a aacuterdua necessidade do pesado trabalho tatildeo pouco remunerado e o cansaccedilo fiacutesico de cada findar de vossas jornadas apenas solidificavam o amor demonstrado para com seus filhos De suas simples atitudes

noacutes filhos observaacutevamos a grandeza de vossas sabedorias Neste momento compreendo meus amados pais como fostes tatildeo grandes e saacutebios quando mesmo

desprovidos da intelectualidade dos bancos escolares poreacutem agraciados com o bom saber da vida mostraram-me a necessidade de sempre se buscar natildeo somente a

formaccedilatildeo acadecircmica como tambeacutem o aprimoramento profissional Satildeo vossos ensinamentos os alicerces que sustentam cada vitoacuteria minha

Guardo-vos sempre em meu coraccedilatildeo

Minha esposa Tulia

Divido contigo minha vida pois acredito que o amor eacute o somatoacuterio de um mundo infindaacutevel de sentimentos e accedilotildees compatilhar sorrir chorarabraccedilar beijar suar

as matildeosdescompassar o coraccedilatildeo Sua presenccedila em minha vida faz-me seguro contigo acredito que o vencer eacute real

em ti busco a pazsem vocecirc perco o Norteeacutes sem duacutevidas a estrela-guia de minha vida

A toda minha famiacuteliaA vocecircs todos (inclusive os cunhados) meu muito obrigado Saber que encontro-

me em qualquer momento amparado por vocecircs oferece-me a estabilidade indispensaacutevel em minha jornada

Professora ElzaApoiei-me em vossos conhecimentosEnriqueci-me com vossos conselhos

Cresci com vossas criacuteticasE alegrei-me com vossa amizade

Obrigado por aceitar-me em vosso conviacutevio

Amigos e colegasPercebi a dificuldade de conciliar meu trabalho externo com a poacutes-graduaccedilatildeo Tenho certeza que se me encontro nesta etapa final foi devido a vossa ajuda

fiacutesica intelectual e incentivadora Espero que consiga transmiti-los a intensidade e grandiosidade desta palavra Obrigado

AGRADECIMENTOS

Aos grandes amigos John Anthony McCulloch e Nilton Lincopan por toda ajuda prestada pelo excelente conviacutevio e pelas cervejas compartilhadas

Aos colegas de laboratoacuterio Ana Carolina Juliana Carla Joseacute Antocircnio Diogo e Cristina pelo companheirismo e pela convivecircncia harmoniosa

Agrave professora Anna Sara Levin do Laboratoacuterio de Investigaccedilatildeo Cliacutenica da Faculdade de Medicina da USP pela ajuda e pelo empreacutestimo de seu laboratoacuterio para a conclusatildeo praacutetica de meu trabalho

Agrave Priscila Arruda Trindade pela ajuda profissional e amiga para a realizaccedilatildeo da eletroforese de campo pulsado (PGFE)

Ao colega Robson teacutecnico do Laboratoacuterio de Investigaccedilatildeo Cliacutenica da Faculdade de Medicina da USP pela ajuda dispensada

Agrave professora Marina Baquerizo Martinez natildeo somente por ser a ldquopatrocinadorardquo de minhas especializaccedilotildees como tambeacutem de mostrar-me sempre presente e amiga

Aos estagiaacuterios do laboratoacuterio Ana Paula e Renato pela ajuda dispensada

Aos amigos do LAC HGeSP pelo conviacutevio harmonioso e camarada

Abreviaturas

APC ndash Ceacutelula Apresentadora de Antiacutegeno

agr ndash Regulador de genes acessoacuterios

bp ndash Pares de bases

cna ndash Fator de ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno

eta ndash gene codificador para toxina esfoliativa A

ETA ndash Toxina Esfoliativa A

etb - gene codificador para toxina esfoliativa B

ETB ndash Toxina Esfoliativa B

HLA ndash Alfa-Hemolisina

hla ndash Gene codificador da alfa-hemolisina

HLB ndash Beta-Hemolisina

hlb ndash Gene codificador da beta-hemolisina

HLG ndashGlfa-hemolisina

hlg ndash Gene codificador da gama-hemolisina

KDa - Kilodalton

lukE-lukD ndash Gene codificador para leucocidina E-D

lukE-lukD ndashLeucocidina E-D

MHC ndash Complexo principal de histocompatibilidade

NCCLS - ldquoNational Comitee for Clinical Laboratory Standardsrdquo

MODS - Siacutendrome de Disfunccedilatildeo de Muacuteltiplos Oacutergatildeos

ORFrsquos ndash Open Reading Frames

ORSA ndash Staphylococcus aureus resistente agrave Oxacilna

PCR ndash Reaccedilatildeo em cadeia da Polimerase

PFGE ndash Pulsed Field Gel eletrophoresis

PTs - Toxinas Pirogecircnicas

pvl ndash Gene codificador para Leucocidina de Panton-Valentine

PVL ndashLeucocidina de Panton-Valentine

PTSAgs ndash Toxinas Pirogecircnicas com Atividade de Superantiacutegenos

SAGs - Superantiacutegenos

sea ndash see ndash Genes codificadores para enterotoxinas A- E

SEAndash SEE ndash enterotoxinas A- E

SaPIs ndash Ilhas de Patogenicidades

SFP ndash Intoxicaccedilatildeo Alimentar Estafilocoacutecica

SSSS ndash Siacutendrome da Pele Escaldada Estafilocoacutecica

TCR ndash Receptor de Ceacutelulas T

TSST-1 ndash Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico

tst ndash Gene Codificador da TSST-1

UFC ndash Unidades Formadoras de Colocircnias

Sumaacuterio

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO01

11 ndash Toxinas com atividades em membranas04

111 Hemolisinas04

112 Toxinas Bicomponentes07

12 ndash Toxinas com atividades de superantiacutegenos10

121 Enterotoxinas estafilocoacutecicas11

122 Toxina da Siacutendrome do Choque toacutexico18

123 Toxinas Esfoliativas22

13 - Locus agr26

2 ndash OBJETIVOS29

21- Geral29

22 - Especiacuteficos29

3 ndash MATERIAIS E MEacuteTODOS30

31- Amostras bacterianas30

32 -Triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina33

33 - Anaacutelise do polimorfismo de DNA por eletroforese de Campo

Pulsado (PFGE)33

34 - Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico p as amplificaccedilotildees37

35 - Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo

de agr presente 37

351 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) para detecccedilatildeo

dos genes dos principais fatores de virulecircncia em

estudo37

352 determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr41

36 ndash Eletroforese em gel de agarose43

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos de DNAamplificados 43

4 ndash RESULTADOS 45

41- Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina45

42 - Anaacutelise por eletroforese de Campo Pulsado (PFGE)45

43 - Determinaccedilatildeo do tipo agr47

44 - Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia48

5 - DISCUSSAtildeO 52

6 ndash CONCLUSOtildeES70

7 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS73

8 ndash ANEXOS87

81 Anexo 1 Relaccedilatildeo dos hospitais e suas localizaccedilotildees87

82 Anexo 2 Relaccedilatildeo dos resultados obtidos de PCR para os

genes analisados88

83 Anexo 3 Meios de cultura e soluccedilotildees utilizados em PFGE 89

Iacutendice de tabelas

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo

com a procedecircncia e fonte de isolamento31

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de

campo Pulsado (PFGE)36

Tabela 3- Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado38

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo39

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr41

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo

do polimorfismo do locus agr 43

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37

isolados OSSA estudados48

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado48

Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do

tipo agr encontrado49

Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas50

Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados

em funccedilatildeo da origem das cepas estudadas51

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

Agradecimentos Especiais

Deus

Em vossa sabedoria regozijo-me

Meus Pais

A simplicidade enraizada em suas vidas a aacuterdua necessidade do pesado trabalho tatildeo pouco remunerado e o cansaccedilo fiacutesico de cada findar de vossas jornadas apenas solidificavam o amor demonstrado para com seus filhos De suas simples atitudes

noacutes filhos observaacutevamos a grandeza de vossas sabedorias Neste momento compreendo meus amados pais como fostes tatildeo grandes e saacutebios quando mesmo

desprovidos da intelectualidade dos bancos escolares poreacutem agraciados com o bom saber da vida mostraram-me a necessidade de sempre se buscar natildeo somente a

formaccedilatildeo acadecircmica como tambeacutem o aprimoramento profissional Satildeo vossos ensinamentos os alicerces que sustentam cada vitoacuteria minha

Guardo-vos sempre em meu coraccedilatildeo

Minha esposa Tulia

Divido contigo minha vida pois acredito que o amor eacute o somatoacuterio de um mundo infindaacutevel de sentimentos e accedilotildees compatilhar sorrir chorarabraccedilar beijar suar

as matildeosdescompassar o coraccedilatildeo Sua presenccedila em minha vida faz-me seguro contigo acredito que o vencer eacute real

em ti busco a pazsem vocecirc perco o Norteeacutes sem duacutevidas a estrela-guia de minha vida

A toda minha famiacuteliaA vocecircs todos (inclusive os cunhados) meu muito obrigado Saber que encontro-

me em qualquer momento amparado por vocecircs oferece-me a estabilidade indispensaacutevel em minha jornada

Professora ElzaApoiei-me em vossos conhecimentosEnriqueci-me com vossos conselhos

Cresci com vossas criacuteticasE alegrei-me com vossa amizade

Obrigado por aceitar-me em vosso conviacutevio

Amigos e colegasPercebi a dificuldade de conciliar meu trabalho externo com a poacutes-graduaccedilatildeo Tenho certeza que se me encontro nesta etapa final foi devido a vossa ajuda

fiacutesica intelectual e incentivadora Espero que consiga transmiti-los a intensidade e grandiosidade desta palavra Obrigado

AGRADECIMENTOS

Aos grandes amigos John Anthony McCulloch e Nilton Lincopan por toda ajuda prestada pelo excelente conviacutevio e pelas cervejas compartilhadas

Aos colegas de laboratoacuterio Ana Carolina Juliana Carla Joseacute Antocircnio Diogo e Cristina pelo companheirismo e pela convivecircncia harmoniosa

Agrave professora Anna Sara Levin do Laboratoacuterio de Investigaccedilatildeo Cliacutenica da Faculdade de Medicina da USP pela ajuda e pelo empreacutestimo de seu laboratoacuterio para a conclusatildeo praacutetica de meu trabalho

Agrave Priscila Arruda Trindade pela ajuda profissional e amiga para a realizaccedilatildeo da eletroforese de campo pulsado (PGFE)

Ao colega Robson teacutecnico do Laboratoacuterio de Investigaccedilatildeo Cliacutenica da Faculdade de Medicina da USP pela ajuda dispensada

Agrave professora Marina Baquerizo Martinez natildeo somente por ser a ldquopatrocinadorardquo de minhas especializaccedilotildees como tambeacutem de mostrar-me sempre presente e amiga

Aos estagiaacuterios do laboratoacuterio Ana Paula e Renato pela ajuda dispensada

Aos amigos do LAC HGeSP pelo conviacutevio harmonioso e camarada

Abreviaturas

APC ndash Ceacutelula Apresentadora de Antiacutegeno

agr ndash Regulador de genes acessoacuterios

bp ndash Pares de bases

cna ndash Fator de ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno

eta ndash gene codificador para toxina esfoliativa A

ETA ndash Toxina Esfoliativa A

etb - gene codificador para toxina esfoliativa B

ETB ndash Toxina Esfoliativa B

HLA ndash Alfa-Hemolisina

hla ndash Gene codificador da alfa-hemolisina

HLB ndash Beta-Hemolisina

hlb ndash Gene codificador da beta-hemolisina

HLG ndashGlfa-hemolisina

hlg ndash Gene codificador da gama-hemolisina

KDa - Kilodalton

lukE-lukD ndash Gene codificador para leucocidina E-D

lukE-lukD ndashLeucocidina E-D

MHC ndash Complexo principal de histocompatibilidade

NCCLS - ldquoNational Comitee for Clinical Laboratory Standardsrdquo

MODS - Siacutendrome de Disfunccedilatildeo de Muacuteltiplos Oacutergatildeos

ORFrsquos ndash Open Reading Frames

ORSA ndash Staphylococcus aureus resistente agrave Oxacilna

PCR ndash Reaccedilatildeo em cadeia da Polimerase

PFGE ndash Pulsed Field Gel eletrophoresis

PTs - Toxinas Pirogecircnicas

pvl ndash Gene codificador para Leucocidina de Panton-Valentine

PVL ndashLeucocidina de Panton-Valentine

PTSAgs ndash Toxinas Pirogecircnicas com Atividade de Superantiacutegenos

SAGs - Superantiacutegenos

sea ndash see ndash Genes codificadores para enterotoxinas A- E

SEAndash SEE ndash enterotoxinas A- E

SaPIs ndash Ilhas de Patogenicidades

SFP ndash Intoxicaccedilatildeo Alimentar Estafilocoacutecica

SSSS ndash Siacutendrome da Pele Escaldada Estafilocoacutecica

TCR ndash Receptor de Ceacutelulas T

TSST-1 ndash Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico

tst ndash Gene Codificador da TSST-1

UFC ndash Unidades Formadoras de Colocircnias

Sumaacuterio

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO01

11 ndash Toxinas com atividades em membranas04

111 Hemolisinas04

112 Toxinas Bicomponentes07

12 ndash Toxinas com atividades de superantiacutegenos10

121 Enterotoxinas estafilocoacutecicas11

122 Toxina da Siacutendrome do Choque toacutexico18

123 Toxinas Esfoliativas22

13 - Locus agr26

2 ndash OBJETIVOS29

21- Geral29

22 - Especiacuteficos29

3 ndash MATERIAIS E MEacuteTODOS30

31- Amostras bacterianas30

32 -Triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina33

33 - Anaacutelise do polimorfismo de DNA por eletroforese de Campo

Pulsado (PFGE)33

34 - Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico p as amplificaccedilotildees37

35 - Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo

de agr presente 37

351 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) para detecccedilatildeo

dos genes dos principais fatores de virulecircncia em

estudo37

352 determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr41

36 ndash Eletroforese em gel de agarose43

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos de DNAamplificados 43

4 ndash RESULTADOS 45

41- Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina45

42 - Anaacutelise por eletroforese de Campo Pulsado (PFGE)45

43 - Determinaccedilatildeo do tipo agr47

44 - Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia48

5 - DISCUSSAtildeO 52

6 ndash CONCLUSOtildeES70

7 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS73

8 ndash ANEXOS87

81 Anexo 1 Relaccedilatildeo dos hospitais e suas localizaccedilotildees87

82 Anexo 2 Relaccedilatildeo dos resultados obtidos de PCR para os

genes analisados88

83 Anexo 3 Meios de cultura e soluccedilotildees utilizados em PFGE 89

Iacutendice de tabelas

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo

com a procedecircncia e fonte de isolamento31

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de

campo Pulsado (PFGE)36

Tabela 3- Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado38

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo39

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr41

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo

do polimorfismo do locus agr 43

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37

isolados OSSA estudados48

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado48

Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do

tipo agr encontrado49

Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas50

Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados

em funccedilatildeo da origem das cepas estudadas51

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

Minha esposa Tulia

Divido contigo minha vida pois acredito que o amor eacute o somatoacuterio de um mundo infindaacutevel de sentimentos e accedilotildees compatilhar sorrir chorarabraccedilar beijar suar

as matildeosdescompassar o coraccedilatildeo Sua presenccedila em minha vida faz-me seguro contigo acredito que o vencer eacute real

em ti busco a pazsem vocecirc perco o Norteeacutes sem duacutevidas a estrela-guia de minha vida

A toda minha famiacuteliaA vocecircs todos (inclusive os cunhados) meu muito obrigado Saber que encontro-

me em qualquer momento amparado por vocecircs oferece-me a estabilidade indispensaacutevel em minha jornada

Professora ElzaApoiei-me em vossos conhecimentosEnriqueci-me com vossos conselhos

Cresci com vossas criacuteticasE alegrei-me com vossa amizade

Obrigado por aceitar-me em vosso conviacutevio

Amigos e colegasPercebi a dificuldade de conciliar meu trabalho externo com a poacutes-graduaccedilatildeo Tenho certeza que se me encontro nesta etapa final foi devido a vossa ajuda

fiacutesica intelectual e incentivadora Espero que consiga transmiti-los a intensidade e grandiosidade desta palavra Obrigado

AGRADECIMENTOS

Aos grandes amigos John Anthony McCulloch e Nilton Lincopan por toda ajuda prestada pelo excelente conviacutevio e pelas cervejas compartilhadas

Aos colegas de laboratoacuterio Ana Carolina Juliana Carla Joseacute Antocircnio Diogo e Cristina pelo companheirismo e pela convivecircncia harmoniosa

Agrave professora Anna Sara Levin do Laboratoacuterio de Investigaccedilatildeo Cliacutenica da Faculdade de Medicina da USP pela ajuda e pelo empreacutestimo de seu laboratoacuterio para a conclusatildeo praacutetica de meu trabalho

Agrave Priscila Arruda Trindade pela ajuda profissional e amiga para a realizaccedilatildeo da eletroforese de campo pulsado (PGFE)

Ao colega Robson teacutecnico do Laboratoacuterio de Investigaccedilatildeo Cliacutenica da Faculdade de Medicina da USP pela ajuda dispensada

Agrave professora Marina Baquerizo Martinez natildeo somente por ser a ldquopatrocinadorardquo de minhas especializaccedilotildees como tambeacutem de mostrar-me sempre presente e amiga

Aos estagiaacuterios do laboratoacuterio Ana Paula e Renato pela ajuda dispensada

Aos amigos do LAC HGeSP pelo conviacutevio harmonioso e camarada

Abreviaturas

APC ndash Ceacutelula Apresentadora de Antiacutegeno

agr ndash Regulador de genes acessoacuterios

bp ndash Pares de bases

cna ndash Fator de ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno

eta ndash gene codificador para toxina esfoliativa A

ETA ndash Toxina Esfoliativa A

etb - gene codificador para toxina esfoliativa B

ETB ndash Toxina Esfoliativa B

HLA ndash Alfa-Hemolisina

hla ndash Gene codificador da alfa-hemolisina

HLB ndash Beta-Hemolisina

hlb ndash Gene codificador da beta-hemolisina

HLG ndashGlfa-hemolisina

hlg ndash Gene codificador da gama-hemolisina

KDa - Kilodalton

lukE-lukD ndash Gene codificador para leucocidina E-D

lukE-lukD ndashLeucocidina E-D

MHC ndash Complexo principal de histocompatibilidade

NCCLS - ldquoNational Comitee for Clinical Laboratory Standardsrdquo

MODS - Siacutendrome de Disfunccedilatildeo de Muacuteltiplos Oacutergatildeos

ORFrsquos ndash Open Reading Frames

ORSA ndash Staphylococcus aureus resistente agrave Oxacilna

PCR ndash Reaccedilatildeo em cadeia da Polimerase

PFGE ndash Pulsed Field Gel eletrophoresis

PTs - Toxinas Pirogecircnicas

pvl ndash Gene codificador para Leucocidina de Panton-Valentine

PVL ndashLeucocidina de Panton-Valentine

PTSAgs ndash Toxinas Pirogecircnicas com Atividade de Superantiacutegenos

SAGs - Superantiacutegenos

sea ndash see ndash Genes codificadores para enterotoxinas A- E

SEAndash SEE ndash enterotoxinas A- E

SaPIs ndash Ilhas de Patogenicidades

SFP ndash Intoxicaccedilatildeo Alimentar Estafilocoacutecica

SSSS ndash Siacutendrome da Pele Escaldada Estafilocoacutecica

TCR ndash Receptor de Ceacutelulas T

TSST-1 ndash Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico

tst ndash Gene Codificador da TSST-1

UFC ndash Unidades Formadoras de Colocircnias

Sumaacuterio

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO01

11 ndash Toxinas com atividades em membranas04

111 Hemolisinas04

112 Toxinas Bicomponentes07

12 ndash Toxinas com atividades de superantiacutegenos10

121 Enterotoxinas estafilocoacutecicas11

122 Toxina da Siacutendrome do Choque toacutexico18

123 Toxinas Esfoliativas22

13 - Locus agr26

2 ndash OBJETIVOS29

21- Geral29

22 - Especiacuteficos29

3 ndash MATERIAIS E MEacuteTODOS30

31- Amostras bacterianas30

32 -Triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina33

33 - Anaacutelise do polimorfismo de DNA por eletroforese de Campo

Pulsado (PFGE)33

34 - Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico p as amplificaccedilotildees37

35 - Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo

de agr presente 37

351 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) para detecccedilatildeo

dos genes dos principais fatores de virulecircncia em

estudo37

352 determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr41

36 ndash Eletroforese em gel de agarose43

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos de DNAamplificados 43

4 ndash RESULTADOS 45

41- Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina45

42 - Anaacutelise por eletroforese de Campo Pulsado (PFGE)45

43 - Determinaccedilatildeo do tipo agr47

44 - Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia48

5 - DISCUSSAtildeO 52

6 ndash CONCLUSOtildeES70

7 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS73

8 ndash ANEXOS87

81 Anexo 1 Relaccedilatildeo dos hospitais e suas localizaccedilotildees87

82 Anexo 2 Relaccedilatildeo dos resultados obtidos de PCR para os

genes analisados88

83 Anexo 3 Meios de cultura e soluccedilotildees utilizados em PFGE 89

Iacutendice de tabelas

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo

com a procedecircncia e fonte de isolamento31

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de

campo Pulsado (PFGE)36

Tabela 3- Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado38

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo39

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr41

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo

do polimorfismo do locus agr 43

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37

isolados OSSA estudados48

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado48

Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do

tipo agr encontrado49

Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas50

Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados

em funccedilatildeo da origem das cepas estudadas51

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

Professora ElzaApoiei-me em vossos conhecimentosEnriqueci-me com vossos conselhos

Cresci com vossas criacuteticasE alegrei-me com vossa amizade

Obrigado por aceitar-me em vosso conviacutevio

Amigos e colegasPercebi a dificuldade de conciliar meu trabalho externo com a poacutes-graduaccedilatildeo Tenho certeza que se me encontro nesta etapa final foi devido a vossa ajuda

fiacutesica intelectual e incentivadora Espero que consiga transmiti-los a intensidade e grandiosidade desta palavra Obrigado

AGRADECIMENTOS

Aos grandes amigos John Anthony McCulloch e Nilton Lincopan por toda ajuda prestada pelo excelente conviacutevio e pelas cervejas compartilhadas

Aos colegas de laboratoacuterio Ana Carolina Juliana Carla Joseacute Antocircnio Diogo e Cristina pelo companheirismo e pela convivecircncia harmoniosa

Agrave professora Anna Sara Levin do Laboratoacuterio de Investigaccedilatildeo Cliacutenica da Faculdade de Medicina da USP pela ajuda e pelo empreacutestimo de seu laboratoacuterio para a conclusatildeo praacutetica de meu trabalho

Agrave Priscila Arruda Trindade pela ajuda profissional e amiga para a realizaccedilatildeo da eletroforese de campo pulsado (PGFE)

Ao colega Robson teacutecnico do Laboratoacuterio de Investigaccedilatildeo Cliacutenica da Faculdade de Medicina da USP pela ajuda dispensada

Agrave professora Marina Baquerizo Martinez natildeo somente por ser a ldquopatrocinadorardquo de minhas especializaccedilotildees como tambeacutem de mostrar-me sempre presente e amiga

Aos estagiaacuterios do laboratoacuterio Ana Paula e Renato pela ajuda dispensada

Aos amigos do LAC HGeSP pelo conviacutevio harmonioso e camarada

Abreviaturas

APC ndash Ceacutelula Apresentadora de Antiacutegeno

agr ndash Regulador de genes acessoacuterios

bp ndash Pares de bases

cna ndash Fator de ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno

eta ndash gene codificador para toxina esfoliativa A

ETA ndash Toxina Esfoliativa A

etb - gene codificador para toxina esfoliativa B

ETB ndash Toxina Esfoliativa B

HLA ndash Alfa-Hemolisina

hla ndash Gene codificador da alfa-hemolisina

HLB ndash Beta-Hemolisina

hlb ndash Gene codificador da beta-hemolisina

HLG ndashGlfa-hemolisina

hlg ndash Gene codificador da gama-hemolisina

KDa - Kilodalton

lukE-lukD ndash Gene codificador para leucocidina E-D

lukE-lukD ndashLeucocidina E-D

MHC ndash Complexo principal de histocompatibilidade

NCCLS - ldquoNational Comitee for Clinical Laboratory Standardsrdquo

MODS - Siacutendrome de Disfunccedilatildeo de Muacuteltiplos Oacutergatildeos

ORFrsquos ndash Open Reading Frames

ORSA ndash Staphylococcus aureus resistente agrave Oxacilna

PCR ndash Reaccedilatildeo em cadeia da Polimerase

PFGE ndash Pulsed Field Gel eletrophoresis

PTs - Toxinas Pirogecircnicas

pvl ndash Gene codificador para Leucocidina de Panton-Valentine

PVL ndashLeucocidina de Panton-Valentine

PTSAgs ndash Toxinas Pirogecircnicas com Atividade de Superantiacutegenos

SAGs - Superantiacutegenos

sea ndash see ndash Genes codificadores para enterotoxinas A- E

SEAndash SEE ndash enterotoxinas A- E

SaPIs ndash Ilhas de Patogenicidades

SFP ndash Intoxicaccedilatildeo Alimentar Estafilocoacutecica

SSSS ndash Siacutendrome da Pele Escaldada Estafilocoacutecica

TCR ndash Receptor de Ceacutelulas T

TSST-1 ndash Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico

tst ndash Gene Codificador da TSST-1

UFC ndash Unidades Formadoras de Colocircnias

Sumaacuterio

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO01

11 ndash Toxinas com atividades em membranas04

111 Hemolisinas04

112 Toxinas Bicomponentes07

12 ndash Toxinas com atividades de superantiacutegenos10

121 Enterotoxinas estafilocoacutecicas11

122 Toxina da Siacutendrome do Choque toacutexico18

123 Toxinas Esfoliativas22

13 - Locus agr26

2 ndash OBJETIVOS29

21- Geral29

22 - Especiacuteficos29

3 ndash MATERIAIS E MEacuteTODOS30

31- Amostras bacterianas30

32 -Triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina33

33 - Anaacutelise do polimorfismo de DNA por eletroforese de Campo

Pulsado (PFGE)33

34 - Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico p as amplificaccedilotildees37

35 - Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo

de agr presente 37

351 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) para detecccedilatildeo

dos genes dos principais fatores de virulecircncia em

estudo37

352 determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr41

36 ndash Eletroforese em gel de agarose43

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos de DNAamplificados 43

4 ndash RESULTADOS 45

41- Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina45

42 - Anaacutelise por eletroforese de Campo Pulsado (PFGE)45

43 - Determinaccedilatildeo do tipo agr47

44 - Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia48

5 - DISCUSSAtildeO 52

6 ndash CONCLUSOtildeES70

7 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS73

8 ndash ANEXOS87

81 Anexo 1 Relaccedilatildeo dos hospitais e suas localizaccedilotildees87

82 Anexo 2 Relaccedilatildeo dos resultados obtidos de PCR para os

genes analisados88

83 Anexo 3 Meios de cultura e soluccedilotildees utilizados em PFGE 89

Iacutendice de tabelas

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo

com a procedecircncia e fonte de isolamento31

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de

campo Pulsado (PFGE)36

Tabela 3- Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado38

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo39

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr41

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo

do polimorfismo do locus agr 43

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37

isolados OSSA estudados48

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado48

Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do

tipo agr encontrado49

Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas50

Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados

em funccedilatildeo da origem das cepas estudadas51

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

AGRADECIMENTOS

Aos grandes amigos John Anthony McCulloch e Nilton Lincopan por toda ajuda prestada pelo excelente conviacutevio e pelas cervejas compartilhadas

Aos colegas de laboratoacuterio Ana Carolina Juliana Carla Joseacute Antocircnio Diogo e Cristina pelo companheirismo e pela convivecircncia harmoniosa

Agrave professora Anna Sara Levin do Laboratoacuterio de Investigaccedilatildeo Cliacutenica da Faculdade de Medicina da USP pela ajuda e pelo empreacutestimo de seu laboratoacuterio para a conclusatildeo praacutetica de meu trabalho

Agrave Priscila Arruda Trindade pela ajuda profissional e amiga para a realizaccedilatildeo da eletroforese de campo pulsado (PGFE)

Ao colega Robson teacutecnico do Laboratoacuterio de Investigaccedilatildeo Cliacutenica da Faculdade de Medicina da USP pela ajuda dispensada

Agrave professora Marina Baquerizo Martinez natildeo somente por ser a ldquopatrocinadorardquo de minhas especializaccedilotildees como tambeacutem de mostrar-me sempre presente e amiga

Aos estagiaacuterios do laboratoacuterio Ana Paula e Renato pela ajuda dispensada

Aos amigos do LAC HGeSP pelo conviacutevio harmonioso e camarada

Abreviaturas

APC ndash Ceacutelula Apresentadora de Antiacutegeno

agr ndash Regulador de genes acessoacuterios

bp ndash Pares de bases

cna ndash Fator de ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno

eta ndash gene codificador para toxina esfoliativa A

ETA ndash Toxina Esfoliativa A

etb - gene codificador para toxina esfoliativa B

ETB ndash Toxina Esfoliativa B

HLA ndash Alfa-Hemolisina

hla ndash Gene codificador da alfa-hemolisina

HLB ndash Beta-Hemolisina

hlb ndash Gene codificador da beta-hemolisina

HLG ndashGlfa-hemolisina

hlg ndash Gene codificador da gama-hemolisina

KDa - Kilodalton

lukE-lukD ndash Gene codificador para leucocidina E-D

lukE-lukD ndashLeucocidina E-D

MHC ndash Complexo principal de histocompatibilidade

NCCLS - ldquoNational Comitee for Clinical Laboratory Standardsrdquo

MODS - Siacutendrome de Disfunccedilatildeo de Muacuteltiplos Oacutergatildeos

ORFrsquos ndash Open Reading Frames

ORSA ndash Staphylococcus aureus resistente agrave Oxacilna

PCR ndash Reaccedilatildeo em cadeia da Polimerase

PFGE ndash Pulsed Field Gel eletrophoresis

PTs - Toxinas Pirogecircnicas

pvl ndash Gene codificador para Leucocidina de Panton-Valentine

PVL ndashLeucocidina de Panton-Valentine

PTSAgs ndash Toxinas Pirogecircnicas com Atividade de Superantiacutegenos

SAGs - Superantiacutegenos

sea ndash see ndash Genes codificadores para enterotoxinas A- E

SEAndash SEE ndash enterotoxinas A- E

SaPIs ndash Ilhas de Patogenicidades

SFP ndash Intoxicaccedilatildeo Alimentar Estafilocoacutecica

SSSS ndash Siacutendrome da Pele Escaldada Estafilocoacutecica

TCR ndash Receptor de Ceacutelulas T

TSST-1 ndash Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico

tst ndash Gene Codificador da TSST-1

UFC ndash Unidades Formadoras de Colocircnias

Sumaacuterio

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO01

11 ndash Toxinas com atividades em membranas04

111 Hemolisinas04

112 Toxinas Bicomponentes07

12 ndash Toxinas com atividades de superantiacutegenos10

121 Enterotoxinas estafilocoacutecicas11

122 Toxina da Siacutendrome do Choque toacutexico18

123 Toxinas Esfoliativas22

13 - Locus agr26

2 ndash OBJETIVOS29

21- Geral29

22 - Especiacuteficos29

3 ndash MATERIAIS E MEacuteTODOS30

31- Amostras bacterianas30

32 -Triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina33

33 - Anaacutelise do polimorfismo de DNA por eletroforese de Campo

Pulsado (PFGE)33

34 - Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico p as amplificaccedilotildees37

35 - Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo

de agr presente 37

351 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) para detecccedilatildeo

dos genes dos principais fatores de virulecircncia em

estudo37

352 determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr41

36 ndash Eletroforese em gel de agarose43

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos de DNAamplificados 43

4 ndash RESULTADOS 45

41- Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina45

42 - Anaacutelise por eletroforese de Campo Pulsado (PFGE)45

43 - Determinaccedilatildeo do tipo agr47

44 - Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia48

5 - DISCUSSAtildeO 52

6 ndash CONCLUSOtildeES70

7 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS73

8 ndash ANEXOS87

81 Anexo 1 Relaccedilatildeo dos hospitais e suas localizaccedilotildees87

82 Anexo 2 Relaccedilatildeo dos resultados obtidos de PCR para os

genes analisados88

83 Anexo 3 Meios de cultura e soluccedilotildees utilizados em PFGE 89

Iacutendice de tabelas

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo

com a procedecircncia e fonte de isolamento31

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de

campo Pulsado (PFGE)36

Tabela 3- Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado38

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo39

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr41

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo

do polimorfismo do locus agr 43

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37

isolados OSSA estudados48

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado48

Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do

tipo agr encontrado49

Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas50

Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados

em funccedilatildeo da origem das cepas estudadas51

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

Abreviaturas

APC ndash Ceacutelula Apresentadora de Antiacutegeno

agr ndash Regulador de genes acessoacuterios

bp ndash Pares de bases

cna ndash Fator de ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno

eta ndash gene codificador para toxina esfoliativa A

ETA ndash Toxina Esfoliativa A

etb - gene codificador para toxina esfoliativa B

ETB ndash Toxina Esfoliativa B

HLA ndash Alfa-Hemolisina

hla ndash Gene codificador da alfa-hemolisina

HLB ndash Beta-Hemolisina

hlb ndash Gene codificador da beta-hemolisina

HLG ndashGlfa-hemolisina

hlg ndash Gene codificador da gama-hemolisina

KDa - Kilodalton

lukE-lukD ndash Gene codificador para leucocidina E-D

lukE-lukD ndashLeucocidina E-D

MHC ndash Complexo principal de histocompatibilidade

NCCLS - ldquoNational Comitee for Clinical Laboratory Standardsrdquo

MODS - Siacutendrome de Disfunccedilatildeo de Muacuteltiplos Oacutergatildeos

ORFrsquos ndash Open Reading Frames

ORSA ndash Staphylococcus aureus resistente agrave Oxacilna

PCR ndash Reaccedilatildeo em cadeia da Polimerase

PFGE ndash Pulsed Field Gel eletrophoresis

PTs - Toxinas Pirogecircnicas

pvl ndash Gene codificador para Leucocidina de Panton-Valentine

PVL ndashLeucocidina de Panton-Valentine

PTSAgs ndash Toxinas Pirogecircnicas com Atividade de Superantiacutegenos

SAGs - Superantiacutegenos

sea ndash see ndash Genes codificadores para enterotoxinas A- E

SEAndash SEE ndash enterotoxinas A- E

SaPIs ndash Ilhas de Patogenicidades

SFP ndash Intoxicaccedilatildeo Alimentar Estafilocoacutecica

SSSS ndash Siacutendrome da Pele Escaldada Estafilocoacutecica

TCR ndash Receptor de Ceacutelulas T

TSST-1 ndash Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico

tst ndash Gene Codificador da TSST-1

UFC ndash Unidades Formadoras de Colocircnias

Sumaacuterio

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO01

11 ndash Toxinas com atividades em membranas04

111 Hemolisinas04

112 Toxinas Bicomponentes07

12 ndash Toxinas com atividades de superantiacutegenos10

121 Enterotoxinas estafilocoacutecicas11

122 Toxina da Siacutendrome do Choque toacutexico18

123 Toxinas Esfoliativas22

13 - Locus agr26

2 ndash OBJETIVOS29

21- Geral29

22 - Especiacuteficos29

3 ndash MATERIAIS E MEacuteTODOS30

31- Amostras bacterianas30

32 -Triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina33

33 - Anaacutelise do polimorfismo de DNA por eletroforese de Campo

Pulsado (PFGE)33

34 - Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico p as amplificaccedilotildees37

35 - Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo

de agr presente 37

351 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) para detecccedilatildeo

dos genes dos principais fatores de virulecircncia em

estudo37

352 determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr41

36 ndash Eletroforese em gel de agarose43

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos de DNAamplificados 43

4 ndash RESULTADOS 45

41- Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina45

42 - Anaacutelise por eletroforese de Campo Pulsado (PFGE)45

43 - Determinaccedilatildeo do tipo agr47

44 - Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia48

5 - DISCUSSAtildeO 52

6 ndash CONCLUSOtildeES70

7 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS73

8 ndash ANEXOS87

81 Anexo 1 Relaccedilatildeo dos hospitais e suas localizaccedilotildees87

82 Anexo 2 Relaccedilatildeo dos resultados obtidos de PCR para os

genes analisados88

83 Anexo 3 Meios de cultura e soluccedilotildees utilizados em PFGE 89

Iacutendice de tabelas

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo

com a procedecircncia e fonte de isolamento31

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de

campo Pulsado (PFGE)36

Tabela 3- Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado38

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo39

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr41

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo

do polimorfismo do locus agr 43

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37

isolados OSSA estudados48

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado48

Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do

tipo agr encontrado49

Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas50

Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados

em funccedilatildeo da origem das cepas estudadas51

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

ORFrsquos ndash Open Reading Frames

ORSA ndash Staphylococcus aureus resistente agrave Oxacilna

PCR ndash Reaccedilatildeo em cadeia da Polimerase

PFGE ndash Pulsed Field Gel eletrophoresis

PTs - Toxinas Pirogecircnicas

pvl ndash Gene codificador para Leucocidina de Panton-Valentine

PVL ndashLeucocidina de Panton-Valentine

PTSAgs ndash Toxinas Pirogecircnicas com Atividade de Superantiacutegenos

SAGs - Superantiacutegenos

sea ndash see ndash Genes codificadores para enterotoxinas A- E

SEAndash SEE ndash enterotoxinas A- E

SaPIs ndash Ilhas de Patogenicidades

SFP ndash Intoxicaccedilatildeo Alimentar Estafilocoacutecica

SSSS ndash Siacutendrome da Pele Escaldada Estafilocoacutecica

TCR ndash Receptor de Ceacutelulas T

TSST-1 ndash Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico

tst ndash Gene Codificador da TSST-1

UFC ndash Unidades Formadoras de Colocircnias

Sumaacuterio

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO01

11 ndash Toxinas com atividades em membranas04

111 Hemolisinas04

112 Toxinas Bicomponentes07

12 ndash Toxinas com atividades de superantiacutegenos10

121 Enterotoxinas estafilocoacutecicas11

122 Toxina da Siacutendrome do Choque toacutexico18

123 Toxinas Esfoliativas22

13 - Locus agr26

2 ndash OBJETIVOS29

21- Geral29

22 - Especiacuteficos29

3 ndash MATERIAIS E MEacuteTODOS30

31- Amostras bacterianas30

32 -Triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina33

33 - Anaacutelise do polimorfismo de DNA por eletroforese de Campo

Pulsado (PFGE)33

34 - Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico p as amplificaccedilotildees37

35 - Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo

de agr presente 37

351 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) para detecccedilatildeo

dos genes dos principais fatores de virulecircncia em

estudo37

352 determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr41

36 ndash Eletroforese em gel de agarose43

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos de DNAamplificados 43

4 ndash RESULTADOS 45

41- Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina45

42 - Anaacutelise por eletroforese de Campo Pulsado (PFGE)45

43 - Determinaccedilatildeo do tipo agr47

44 - Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia48

5 - DISCUSSAtildeO 52

6 ndash CONCLUSOtildeES70

7 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS73

8 ndash ANEXOS87

81 Anexo 1 Relaccedilatildeo dos hospitais e suas localizaccedilotildees87

82 Anexo 2 Relaccedilatildeo dos resultados obtidos de PCR para os

genes analisados88

83 Anexo 3 Meios de cultura e soluccedilotildees utilizados em PFGE 89

Iacutendice de tabelas

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo

com a procedecircncia e fonte de isolamento31

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de

campo Pulsado (PFGE)36

Tabela 3- Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado38

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo39

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr41

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo

do polimorfismo do locus agr 43

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37

isolados OSSA estudados48

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado48

Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do

tipo agr encontrado49

Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas50

Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados

em funccedilatildeo da origem das cepas estudadas51

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

Sumaacuterio

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO01

11 ndash Toxinas com atividades em membranas04

111 Hemolisinas04

112 Toxinas Bicomponentes07

12 ndash Toxinas com atividades de superantiacutegenos10

121 Enterotoxinas estafilocoacutecicas11

122 Toxina da Siacutendrome do Choque toacutexico18

123 Toxinas Esfoliativas22

13 - Locus agr26

2 ndash OBJETIVOS29

21- Geral29

22 - Especiacuteficos29

3 ndash MATERIAIS E MEacuteTODOS30

31- Amostras bacterianas30

32 -Triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina33

33 - Anaacutelise do polimorfismo de DNA por eletroforese de Campo

Pulsado (PFGE)33

34 - Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico p as amplificaccedilotildees37

35 - Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo

de agr presente 37

351 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) para detecccedilatildeo

dos genes dos principais fatores de virulecircncia em

estudo37

352 determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr41

36 ndash Eletroforese em gel de agarose43

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos de DNAamplificados 43

4 ndash RESULTADOS 45

41- Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina45

42 - Anaacutelise por eletroforese de Campo Pulsado (PFGE)45

43 - Determinaccedilatildeo do tipo agr47

44 - Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia48

5 - DISCUSSAtildeO 52

6 ndash CONCLUSOtildeES70

7 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS73

8 ndash ANEXOS87

81 Anexo 1 Relaccedilatildeo dos hospitais e suas localizaccedilotildees87

82 Anexo 2 Relaccedilatildeo dos resultados obtidos de PCR para os

genes analisados88

83 Anexo 3 Meios de cultura e soluccedilotildees utilizados em PFGE 89

Iacutendice de tabelas

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo

com a procedecircncia e fonte de isolamento31

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de

campo Pulsado (PFGE)36

Tabela 3- Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado38

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo39

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr41

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo

do polimorfismo do locus agr 43

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37

isolados OSSA estudados48

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado48

Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do

tipo agr encontrado49

Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas50

Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados

em funccedilatildeo da origem das cepas estudadas51

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

35 - Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo

de agr presente 37

351 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) para detecccedilatildeo

dos genes dos principais fatores de virulecircncia em

estudo37

352 determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr41

36 ndash Eletroforese em gel de agarose43

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos de DNAamplificados 43

4 ndash RESULTADOS 45

41- Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina45

42 - Anaacutelise por eletroforese de Campo Pulsado (PFGE)45

43 - Determinaccedilatildeo do tipo agr47

44 - Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia48

5 - DISCUSSAtildeO 52

6 ndash CONCLUSOtildeES70

7 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS73

8 ndash ANEXOS87

81 Anexo 1 Relaccedilatildeo dos hospitais e suas localizaccedilotildees87

82 Anexo 2 Relaccedilatildeo dos resultados obtidos de PCR para os

genes analisados88

83 Anexo 3 Meios de cultura e soluccedilotildees utilizados em PFGE 89

Iacutendice de tabelas

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo

com a procedecircncia e fonte de isolamento31

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de

campo Pulsado (PFGE)36

Tabela 3- Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado38

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo39

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr41

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo

do polimorfismo do locus agr 43

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37

isolados OSSA estudados48

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado48

Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do

tipo agr encontrado49

Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas50

Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados

em funccedilatildeo da origem das cepas estudadas51

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

8 ndash ANEXOS87

81 Anexo 1 Relaccedilatildeo dos hospitais e suas localizaccedilotildees87

82 Anexo 2 Relaccedilatildeo dos resultados obtidos de PCR para os

genes analisados88

83 Anexo 3 Meios de cultura e soluccedilotildees utilizados em PFGE 89

Iacutendice de tabelas

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo

com a procedecircncia e fonte de isolamento31

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de

campo Pulsado (PFGE)36

Tabela 3- Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado38

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo39

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr41

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo

do polimorfismo do locus agr 43

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37

isolados OSSA estudados48

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado48

Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do

tipo agr encontrado49

Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas50

Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados

em funccedilatildeo da origem das cepas estudadas51

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

Iacutendice de tabelas

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo

com a procedecircncia e fonte de isolamento31

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de

campo Pulsado (PFGE)36

Tabela 3- Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado38

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo39

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr41

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo

do polimorfismo do locus agr 43

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37

isolados OSSA estudados48

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado48

Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do

tipo agr encontrado49

Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas50

Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados

em funccedilatildeo da origem das cepas estudadas51

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

Iacutendice de figuras

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina

de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota06

Figura 2 ndash Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B42

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de

campo Pulsado (PGFE)46

Figura 4 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos

tipos de agr I II e III47

Figura 5 - Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de

alguns dos fatores de virulecircncia estudados48

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

Resumo

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro eacute

atribuiacuteda agrave existecircncia de algumas exotoxinas as quais satildeo codificadas por genes

acessoacuterios A expressatildeo de genes codificadores de exotoxinas eacute controlada por

reguladores tais como o agr (acessory gene regulator) sendo identificados 4 tipos

polimoacuterficos deste regulador Neste estudo foram utilizadas 37 isolados de

Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina originados de laboratoacuterios e hospitais

puacuteblicos e privados brasileiros Utilizou-se a teacutecnica de PCR para a amplificaccedilatildeo dos

genes codificadores dos fatores de virulecircncia estudados e do tipo de agr presente em

cada cepa A teacutecnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se

verificar a existecircncia clonal entre os isolados Observou-se que o gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente isolado foi o gene sea todos relacionados com o

tipo III de agr Observou-se tambeacutem alguns pontos divergentes com publicaccedilotildees

anteriores como a presenccedila dos genes seb e tst na mesma cepa (33) cuja relaccedilatildeo

julgava-se natildeo ser muito frequumlente o mesmo acontecendo com os genes tst e lukE-

lukD Natildeo se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas

esfoliatinas Segundo a teacutecnica de PFGE natildeo houve relaccedilatildeo clonal entre os isolados

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus satildeo

multi-fatoriais dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

alguns genes acessoacuterios como tambeacutem do tipo de agr presente

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988

Abstract

The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the

host is conferred to the existence of some exotoxins which are codified by accessory

genes The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators such as

agr (acessory gene regulator) being identified four different types of this regulator In

this study it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus sensible to the

oxacillin proceeding from public and private Brazilians laboratories It had been used

the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type

present in each strain The PFGE had been used for detectation of clonal relationship

between the strains Thus it was observed that the most frequently determined gene

coder of enterotoxin was sea (100 were related as type of agr III) it was observed

divergent points to the studies carried through in other countries like strains with

coders genes of seb and tst (33)This correlation the literature judged not to be

frequent the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD It

was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins According to PFGE

there wasnrsquot evidence of clonal relationship between the strains It is concluded

therefore that the molecular bases of the pathogenicity of the S aureus are

multifactorial depending not only on the presence as also of the expression of some

accessory genes and the agr type present

1 Introduccedilatildeo

Os Staphylococcus aureus satildeo cocos Gram-positivos anaeroacutebios facultativos

imoacuteveis catalase e coagulase positivos A parede celular estafilocoacutecica eacute resistente a

lisozima e sensiacutevel agrave lisostafina a qual cliva especificamente as pontes de

pentaglicina comuns em tal gecircnero (LE LOIR et al 2003) Satildeo importantes patoacutegenos

hospitalares causadores de uma variedade de manifestaccedilotildees cliacutenicas as quais

incluem septicemia feridas seacutepticas artrite seacuteptica osteomielite siacutendrome de choque

seacuteptico poacutes-ciruacutergico entre outros (BOYCE et al 1997 VICENT et al 1995) A

variaccedilatildeo deste espectro de manifestaccedilotildees cliacutenicas em sua maioria eacute dependente dos

numerosos fatores de virulecircncia que cada cepa produz (LE LOIR et al 2003) Trata-

se de um dos principais microorganismos causadores de infecccedilotildees hospitalares

(MELZER 2003) contribuindo significativamente para a taxa de mortalidade e

morbidade dos pacientes aleacutem de serem responsaacuteveis por doenccedilas adquiridas na

comunidade (COKILL et al 2004) Em torno de 30 a 50 da populaccedilatildeo humana satildeo

portadores desta bacteacuteria sendo que seu principal habitat eacute a membrana mucosa da

nasofaringe Neste local estas cepas podem persistir como membro transitoacuterio ou

persistente da microbiota normal sem causar nenhuma sintomatologia Da microbiota

nasal estes patoacutegenos podem facilmente contaminar as matildeos dos portadores e

desta feita podem contaminar alimentos

(FUEYO et al 2000) Os Staphylococcus aureus apresentam uma variedade de

fatores de virulecircncia incluindo moleacuteculas de adesatildeo peptideoglicano enzimas e

toxinas extracelulares (ARCHER et al 1998) A importacircncia dos Staphylococcus

aureus como patoacutegenos reside na combinaccedilatildeo da virulecircncia mediada por suas

toxinas seu caraacuteter invasivo e seu perfil de resistecircncia aos antibioacuteticos (LE LOIR et

al 2000) A variaccedilatildeo geneacutetica entre as cepas de Staphylococcus aureus estaacute sendo

associada com o potencial patogecircnico destas cepas (BOHACH et al 1990 DAY et

al 2001) Tal variaccedilatildeo ocorre em niacutevel dos genes constitutivos e nos genes

acessoacuterios (LAN et al 2000)

A capacidade de o Staphylococcus aureus evadir-se do sistema imune do hospedeiro

eacute conferida agrave existecircncia de vaacuterios fatores de virulecircncia incluindo hemolisinas lipases

vaacuterias proteases exotoxinas e enterotoxinas (SOMERVILLE et al 2001) Vaacuterios

genes acessoacuterios dos Staphylococcus aureus codificam fatores de virulecircncia tais

como Enterotoxinas (sea - see seg - ser seu) (FUEYO et al2005) Toxina da

Siacutendrome do Choque Toacutexico (tst) toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb)

leucocidinas(pvl lukE-lukD) e proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie como por exemplo a

Proteiacutena de Ligaccedilatildeo ao Colaacutegeno (cna) (PROJAN 1997) Alguns destes genes satildeo

frequumlentemente transportados por elementos geneacuteticos moacuteveis tais como fagos e

Ilhas de Patogenicidade (SaPIs) as quais satildeo segmentos de DNA de variados

tamanhos potencialmente moacuteveis codificadores de genes associados agrave virulecircncia

(KAPPER and HACKER 1999) sendo transferidos

horizontalmente entre as cepas (sea tst eta) (BETLEY et al1985 LINDSAY et

al1998 YAMAGUCHI et al2000 YOSHIZAWA et al2000)

No ambiente hospitalar as cepas de MSSA satildeo geneticamente diversas poreacutem

dentro desta diversidade algumas cepas satildeo claramente relacionadas e

provavelmente representam linhagem de sucesso (MOORE et al 2001)

Em cultura o Staphylococcus aureus produz exotoxinas somente quando em alta

densidade bacteriana em sua fase poacutes-exponencial de crescimento Na fase preacute-

exponencial quando em baixa densidade bacteriana a bacteacuteria expressa moleacuteculas

de superfiacutecie tais como proteiacutenas ligadoras de fibronectinas e proteiacutenas ligadoras de

fibrinogecircnio as quais permitem a aderecircncia da bacteacuteria e a colonizaccedilatildeo das ceacutelulas

do hospedeiro (Balaban et al 2000)

Segundo BOHACH et al (2000) as exotoxinas dos Staphylococcus aureus estatildeo

enquadradas dentro de dois grupos gerais agentes ativos em membranas que

compreendem as toxinas alfa beta delta gama e leucocidinas e as toxinas com

atividades de superantiacutegenos (SAgs) As toxinas com atividade de superantiacutegenos

(SAgs) incluem a famiacutelia das toxinas pirogecircnicas (PTs) que satildeo as enterotoxinas

estafilocoacutecicas (SEs) a toxina da siacutendrome do choque toacutexico (TSST-1) e a famiacutelia das

toxinas esfoliativas (ETs)

11 Toxinas com atividades em membranas

As cepas de Staphylococcus aureus podem produzir quatro classes de citotoxinas as

quais compreendem as quatro hemolisinas α β γ e δ como tambeacutem a leucocidina

de Panton-Valentine designada como PVL

111 Hemolisinas

As hemolisinas satildeo agentes citotoacutexicos cuja accedilatildeo pode auxiliar no poder invasivo da

bacteacuteria O gene codificador para a alfa-toxina hla foi clonado e sequumlenciado (SAKO

et al1983) A alfa-hemolisina eacute toacutexica a vaacuterias ceacutelulas de mamiacuteferos sendo tambeacutem

hemoliacutetica para eritroacutecitos de carneiro dermonecroacutetica e neurotoacutexica Esta toxina

causa formaccedilatildeo de poros nas membranas celulares explicando portanto sua

capacidade em causar lise nos eritroacutecitos Os monocircmeros de alfa-toxina atacam as

membranas e entatildeo formam hexacircmeros ou heptacircmeros originando a formaccedilatildeo do

poro (BHAKDI et al 1991) Relata-se que tal formaccedilatildeo de poro induz a liberaccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico pelas ceacutelulas endoteliais e que a alfa toxina induz a apoptose em

linfoacutecitos (JONASet al 1994) Vaacuterios estudos demonstraram que a alfa-toxina

apresenta um efeito favoraacutevel no surgimento de doenccedilas Cepas natildeo produtoras de

alfa-toxina foram em alguns estudos menos virulentas do que suas ancestrais

isogecircnicas produtoras desta toxina (BRAMLEY 1989 CALLEGAN 1994) A alfa-

hemolisina estaacute sob controle

do gene regulador agr e eacute produzida na fase poacutes-exponencial do crescimento

bacteriano Esta toxina produz vaacuterios efeitos sobre o hospedeiro a maioria destes

ocorre em funccedilatildeo do desequiliacutebrio osmoacutetico celular devido agrave perda de iacuteons pelos

poros formados (BHAKDI et al 1991) Como exemplo temos a ativaccedilatildeo do

metabolismo do aacutecido aracdocircnico nas ceacutelulas endoteliais devido ao influxo de caacutelcio

Isto leva agrave formaccedilatildeo de tromboxane e prostaciclinas os quais satildeo vasos-constritores

Devido ao rompimento celular secundaacuterio ao desequiliacutebrio osmoacutetico observa-se o

aumento da permeabilidade vascular e edema pulmonar (SUTTORP et al 1985)

Como resultado do influxo de caacutelcio nas plaquetas causado pela alfa-toxina ocorre a

liberaccedilatildeo de fatores ativadores da coagulaccedilatildeo (BHAKDI et al1988)

O gene para beta-hemolisina foi clonado e sequumlenciado por PROJAN et al (1989)

Estaacute localizado sobre um fragmento de DNA cromossocircmico Cla I de 4Kb Eacute

sintetizada na fase poacutes-exponencial do crescimento bacteriano A beta-hemolisina

diferentemente de outras toxinas citoliacuteticas eacute uma enzima que apresenta atividade de

esfingomielinase (WADSTRON et al 1972) As diferenccedilas na susceptibilidade dos

eritroacutecitos agrave beta-hemolisina podem ser explicadas pela quantidade de esfingomielina

presente nos diferentes eritroacutecitos Tem se observado in vitro que a accedilatildeo da beta-

hemolisina eacute antagonista agrave accedilatildeo da alfa-hemolisina Tal fato se deve agrave accedilatildeo da beta-

hemolisina sobre a membrana dos

eritroacutecitos impedindo assim a polimerizaccedilatildeo da alfa-hemolisina Isto sugere

portanto que enquanto as ceacutelulas vermelhas ou quaisquer outras ceacutelulas contendo

esfingomielina em sua membrana representem alvo para a beta-hemolisina a alfa-

hemolisina seja entatildeo direcionada para outros alvos

A delta-hemolisina eacute um peptiacutedeo contendo 26 aminoaacutecidos o qual potencializa a

accedilatildeo da beta-hemolisina in vitro aumentando suas propriedades hemoliacuteticas

(RUZIKOVA 1994) Poreacutem seu papel na virulecircncia in vivo encontra-se ainda em

estudo Sugere-se que a delta hemolisina possua propriedades surfactantes ou

formadoras de canais (BERNHEIMER 1986)

Figura 1- Representaccedilatildeo da accedilatildeo da alfa-hemolisina de S aureus sobre a membrana de uma ceacutelula eucariota

FonteFINK et al 1989

112 Toxinas Bi-componentes

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus

pvl hlg lukE-lukD e lukM-lukFrsquo-PV Exceto hlgA todos os outros genes satildeo co-

transcritos em tandem sendo que os genes codificadores para proteiacutenas

semelhantes ao componente LukS-PV (componente S) localizam-se a upstream ao

gene que codifica a proteiacutena similar ao LukF-PV (componente F) Portanto

convencionalmente a proteiacutena de classe S corresponde sempre ao primeiro elemento

mencionado

A denominaccedilatildeo S e F resulta da velocidade (Slow and Fast) com que tais proteiacutenas

satildeo eluiacutedas de uma coluna cromatograacutefica de troca iocircnica de caboxi-metil-celulose

(PREVOacuteST et al 2002) Estas toxinas compreendem seis proteiacutenas de classe S as

quais satildeo as primeiras unidades a se ligarem agraves membranas das ceacutelulas alvo e cinco

proteiacutenas de classe F as quais correspondem ao segundo elemento para continuar o

oligocircmero em formaccedilatildeo As interaccedilotildees destes componentes induzem a uma raacutepida

ativaccedilatildeo e consequumlente abertura dos canais de caacutelcio presentes nas membranas

das ceacutelulas alvo causando um influxo deste caacutetion na ceacutelula A oligomerizaccedilatildeo dos

componentes S e F conduz agrave formaccedilatildeo de poros hetero-hexameacutericos sobre a

superfiacutecie de tais ceacutelulas os quais satildeo

formados por uma proporccedilatildeo equimolar de proteiacutenas S e F e satildeo permeaacuteveis a

caacutetions monovalentes como Na+ K+ e etiacutedium (WERNER et al 2002) As toxinas bi-

componentes relatadas neste trabalho compreendem a leucocidina de Panton-

Valentine (LukS-PV + LukF-PV ou simplesmente PVL) as gama-hemolisinas

( HlgA + HlgB e HlgC + HlgB onde HlgA e HlgC satildeo componentes S e HlgB eacute um

componente F) e a leucocidina LukE-LukD Estas toxinas satildeo sinergicamente toacutexicas

(em relaccedilatildeo aos componentes S e F) aos leucoacutecitos polimorfo-nucleares monoacutecitos e

macroacutefagos tanto de coelhos quanto de humanos sendo que HlgA + HlgB podem

tambeacutem lisar alguns linfoacutecitos T bem como eritroacutecitos humanos A sensibilidade das

ceacutelulas vermelhas varia de acordo com a dupla SF formada A leucocidina Luk E-D

por sua vez natildeo eacute fortemente hemoliacutetica sobre eritroacutecitos humanos tampouco eacute tatildeo

leucotoacutexica quando comparadas a outras leucocidinas (GRAVET et al 1998)

Qualquer combinaccedilatildeo de uma proteiacutena de classe S com uma outra proteiacutena de classe

F heteroacuteloga ou natildeo pode ser toacutexica (PREVOacuteST et al 1995) Um exemplo de tal fato

eacute que a interaccedilatildeo HlgA + LukD eacute fortemente indutora de canais de caacutelcio(GRAVET et

al 1998) Estas observaccedilotildees sugerem tanto uma diferenccedila nos receptores quanto

diferentes formas de oligomerizaccedilatildeo destas toxinas

Estudos indicam que quase todas as cepas de Staphylococcus aureus produzem

gama-hemolisinas (aproximadamente 99) e somente 2 a 3 das cepas produzem

PVL Estudos conduzidos por PREVOST et al (1995) indicam que as cepas

Staphylococcus aureus possuem dois locus separados para dar origem agraves gama-

hemolisinas e PVL Entre as cepas capazes de produzir ambas as toxinas trecircs

componentes S (HlgA HlgC e LukS-PV) e dois componentes F (HlgB e LukF-PV)

podem ser produzidos Estes produtos mostram um alto grau de similaridade entre

suas sequumlecircncias Trecircs open reading frames (ORFrsquos) compreendem os genes para

gama-hemolisinas hlg localizando-se sobre um locus de 45 - Kb de um fragmento

de DNA cromossocircmico Sca-I Os trecircs ORFs em ordem satildeo designados como hlgA

hlgC e hlgB correspondendo aos genes identificados por COONEY et al (1993) Os

ORFs hlgB e hlgC satildeo co-transcritos enquanto que hlgA eacute transcrito separadamente

As toxinas HlgB e HlgC satildeo referidas tipicamente como hemolisinas O locus que

compreende hlgA hlgC e hlgB eacute estreitamente relacionado com o locus lukR

codificador da leucocidina R PLOMMET M et al1(988) relataram que linhagens de

S aureus 5R poderiam ser uma excelente fonte de gama-hemolisinas uma vez que

estas natildeo produzem alfa beta ou delta-hemolisina PREVOST et al (1995) tambeacutem

clonaram genes codificadores de PVL denominados lukS-PV e lukF-PV O locus

inteiro luk-PV estava contido em um fragmento de DNA cromossocircmico EcoRV e

consistia de dois ORFs Os extratos bacterianos do clone exibiram atividade

leucotoacutexica poreacutem nenhuma atividade hemoliacutetica lukS-PV e lukF-PV foram co-

transcritos e foram similares ao hlgC e hlgB respectivamente No locus luk-PV natildeo foi

encontrado nenhum similar ao hlgA A aquisiccedilatildeo do locus luk-PV eacute atribuiacuteda agrave accedilatildeo

lisogecircnica de bacterioacutefagos (KANECO et al 1997) Poreacutem uma transmissatildeo horizontal

deste locus deve ser um evento muito raro uma vez que nem a perda deste fenoacutetipo

em cepas produtoras de tal toxina e tampouco uma dispersatildeo natural entre diferentes

isolados foram observados (PREVOST et al 1995) Com os trecircs componentes S e

dois componentes F eacute possiacutevel para uma determinada cepa de S aureus elaborar

seis combinaccedilotildees de toxinas com um componente S e um componente F

12 Toxinas com atividade de superantigenos

Vaacuterias das toxinas extracelulares produzidas pelos Staphylococcus aureus

apresentam propriedades de superantiacutegeno incluindo as enterotoxinas as toxinas

esfoliativas e a toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1) Os superantiacutegenos

afetam o sistema imune atraveacutes da ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas do complexo principal da

histocompatibilidade de classe II (MHC II) e ativa tipos especiacuteficos de ceacutelulas-T

atraveacutes das regiotildees variaacuteveis das cadeias beta dos receptores de ceacutelulas T Como

consequumlecircncia da ativaccedilatildeo destas ceacutelulas-T ocorre a liberaccedilatildeo de citocinas tais como

Fator de Necrose Tumoral (TNF) vaacuterias interleucinas e interferon-gama

121 Enterotoxinas Estafilocoacutecicas (SEs)

As enterotoxinas estafilocoacutecicas (SEs) estatildeo dentro da classe das toxinas

pirogecircnicas com atividade de superantiacutegenos (PTSAgs) cujos membros

compartilham relaccedilotildees filogeneacuteticas estruturais e funcionais entre si (BALBAN et al

2000) Os genes das enterotoxinas estafilocoacutecicas (ses) apresentam um alto

percentual de identidade em suas sequumlecircncias nucleotiacutedicas (BETTLEY et al 1992)

Antes da descoberta de suas propriedades superantigecircnicas as enterotoxinas foram

primeiramente reconhecidas como potentes agentes emeacuteticos sendo que

atualmente estatildeo envolvidas tambeacutem em vaacuterias afecccedilotildees aleacutergicas e auto-imunes

como diabetes mellitus esclerose muacuteltipla e artrite reumatoacuteide (MCCORMICK et al

2001)

As SEs funcionam como potentes toxinas gastrintestinais e como superantiacutegenos

estimulando a proliferaccedilatildeo de ceacutelulas T natildeo especiacuteficas (BALABAN et al 2000) Tais

propriedades emeacuteticas e de superantigenicidade destas toxinas satildeo aparentemente

distintas e localizam-se sobre diferentes domiacutenios da proteiacutena (DINGES et al 2000)

indicando que elas se comportam como toxinas bifuncionais (HARRIS et al 1995)

Embora estas sejam duas funccedilotildees distintas localizadas sobre diferentes domiacutenios da

proteiacutena existe uma alta correlaccedilatildeo entre estas atividades Na maioria dos casos

uma diminuiccedilatildeo da atividade de superantigenicidade (devido a uma mutaccedilatildeo

geneacutetica) resulta em uma diminuiccedilatildeo da atividade enterotoacutexica (HARRIS et al 1993)

Poreacutem como estas atividades satildeo interligadas ainda permanece incerto Uma das

hipoacuteteses eacute que a atividade de enterotoxina pode facilitar a transcitose capacitando

portanto a entrada da toxina na corrente sanguumliacutenea permitindo desta forma a

interaccedilatildeo com as ceacutelulas T conduzindo agrave atividade superantigecircnica (BALABAN et al

2000) Das toxinas pirogecircnicas as SEs satildeo as uacutenicas que apresentam atividade

emeacutetica (LE LOIR et al 2000)

Pouco se sabe como as SEs causam os sintomas dos casos de intoxicaccedilatildeo alimentar

Estas toxinas podem desencadear um efeito direto sobre o epiteacutelio intestinal e sobre o

nervo vago causando estiacutemulo do centro emeacutetico e aumentando a motilidade

intestinal Um achado comum na estrutura das SEs eacute uma alccedila de cistina a qual

apresentou uma consideraacutevel importacircncia sobre a atividade emeacutetica baseada em

anaacutelise de mutantes (DINGES et al 2000) A SEI por sua vez natildeo apresenta a

referida alccedila de cistina portanto seu efeito emeacutetico eacute consideravelmente menor do

que o de outras SEs (MUNSON et al 1998)

A atividade de superantigenicidade das enterotoxinas resulta na presenccedila de

receptores de enterotoxinas na superfiacutecie das ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos

(APC) O termo ldquosuperantiacutegenordquo foi introduzido em 1989 por MARRACK amp KAPPLER

para se descrever um acentuada expansatildeo de ceacutelulas T mostrando regiotildees variaacuteveis

especiacuteficas da cadeia Beta (V-Beta) do receptor de antiacutegeno das ceacutelulas T(TCR)

quando exposto a estas toxinas (MCCORMICK et al 2001) Tais receptores satildeo

moleacuteculas de MHC de classe II Moleacuteculas de enterotoxinas estafilocoacutecicas realizam

portanto um ligaccedilatildeo cruzada entre estas moleacuteculas de MHC-II e a regiatildeo variaacutevel da

cadeia Beta (VB) do receptor de antiacutegenos dos linfoacutecitos T (TCR) Sabe-se que na

resposta celular imune o primeiro evento eacute o reconhecimento do antiacutegeno pelo

receptor de antiacutegeno de ceacutelulas T (TCR) ancorado agrave membrana dos linfoacutecitos T O

antiacutegeno eacute apresentado ao TCR na forma de peptiacutedeos ligados a moleacuteculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e II cujas moleacuteculas

constituintes satildeo proteiacutenas ligadas a membranas sobre a superfiacutecie das ceacutelulas

apresentadoras de antiacutegenos (APC) Este tipo de reconhecimento eacute a chave para a

alta especificidade da resposta imune onde somente poucas ceacutelulas T podem

reconhecer um antiacutegeno especiacutefico As enterotoxinas estafilocoacutecicas por apresentar

comportamento de superantiacutegenos interagem com vaacuterias ceacutelulas T de forma

inespeciacutefica sendo potente ativador de tais ceacutelulas Para ativar esta accedilatildeo estas

enterotoxinas requerem somente o reconhecimento da porccedilatildeo V da cadeia Beta do

TCR promovendo desta feita uma ligaccedilatildeo entre o TCR e o MHC de classe II das

APCs Os antiacutegenos convencionais quando apresentados juntos ao MHC sobre as

APCs requerem reconhecimento por todos os cincos elementos variaacuteveis do TCR(V-

Beta D-beta J-Beta V-alfa e J-alfa) Em contraste os SAGs satildeo principalmente

reconhecidos pela porccedilatildeo V-Beta do TCR Desta forma estes conseguem estimular

em torno de 20 de quase todos os linfoacutecitos T enquanto os antiacutegenos

convencionais estimulam na ordem de 1 10000 dos linfoacutecitos T (MCCORMICK et al

2001) Tal fato resulta em siacutentese de vaacuterias citocinas linfocinas IFN e aumento do

choque endotoacutexico resultando em imunossupressatildeo das ceacutelulas T e B com prejuiacutezo

da resposta imune ao agente invasor (JARRAUD et al 2001) A ampla expansatildeo dos

linfoacutecitos T resulta em uma massiva liberaccedilatildeo de citocinas pelo hospedeiro Acredita-

se que estas citocinas satildeo as responsaacuteveis pela maioria das consequumlecircncias graves

dos SAGs os quais atuam como vasodilatadores capilares conduzindo agrave hipotensatildeo

ao choque agrave falecircncia de muacuteltiplos oacutergatildeos e morte (MCCORMICK et al 2001)

Foi proposto que as enterotoxinas desencadeiam suas propriedades emeacuteticas

ligando-se a receptores especiacuteficos no intestino Isto eacute confirmado pelo fato de que a

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) mediada por estas toxinas cujos principais

achados satildeo vocircmitos diarreacuteias e anormalidades histopatoloacutegicas caracteriacutesticas natildeo

eacute uma infecccedilatildeo mas sim uma intoxicaccedilatildeo na qual a toxina jaacute havia sido produzida no

alimento contaminado anteriormente agrave ingestatildeo (HOLMBERG 1984) Tal ocorrido

permite entatildeo especular-se que a bacteacuteria selecionou uma famiacutelia de toxinas que a

permite escapar do ambiente hostil encontrado no trato digestivo Importantes

propriedades compartilhadas por todas SEs satildeo sua habilidade em induzir vocircmito e

gastrenterites apoacutes administraccedilatildeo oral em primatas superantigenicidade

conformaccedilotildees similares estabilidade agrave pepsina e estabilidade ao calor Esta uacuteltima

propriedade significa que a atividade bioloacutegica da toxina permanece inalterada mesmo

apoacutes o processamento teacutermico do alimento (HOLECKOVA et al 2002)

A heterogeneidade das SEs fornece os criteacuterios para sua para diferenciaccedilatildeo dentro

das classes atualmente reconhecidas (SEA - SEE SEG - SER SEU) (FUEYO et

al2005) sendo que a SEC pode ser ainda diferenciada em subclasses (SEC1 SEC2

e SEC3) (MARR et al 1993) Uma exotoxina estafilocoacutecica envolvida na TSS foi

inicialmente designada SEF (BERGDOLL et al 1981) natildeo apresentando poreacutem

atividade bioloacutegica in vivo de uma verdadeira SE (FUEYO et al 2005) Com relaccedilatildeo

agrave similaridade entre as classes das SEs 15 dos resiacuteduos de aminoaacutecidos satildeo

completamente conservados A maioria conservada destes resiacuteduos estaacute localizada

nas porccedilotildees central e C-terminal das sequumlecircncias

Os genes codificadores destas enterotoxinas possuem diferentes suportes geneacuteticos

sendo que a maioria dos quais satildeo elementos geneacuteticos moacuteveis Nem todos os genes

das SEs satildeo controlados pelos sistema agr Desta feita seb sec e sed satildeo

dependentes do agr enquanto sea e sej satildeo agr independentes (LE LOIR et

al2000)

1211 Enterotoxina Estafilocoacutecica A (SEA)

SEA eacute a enterotoxina estafilocoacutecica mais comum recuperada de surtos de

intoxicaccedilotildees alimentares nos EUA perfazendo 78 de todos os surtos (BALABAN et

al 2000) A habilidade de a enterotoxina A modificar diretamente a funccedilatildeo dos

neutroacutefilos sugere um importante papel desta enterotoxina na patogecircnese de algumas

doenccedilas (MULLARY 2001) O gene para SEA (sea) eacute carreado por um bacterioacutefago

temperado Este gene eacute composto de 771 pares de base e codifica um precursor de

enterotoxina A de 257 resiacuteduos de aminoaacutecidos Uma porccedilatildeo de 24 resiacuteduos N-

terminais eacute processada resultando entatildeo ma moleacutecula ativa SEA eacute expressa na fase

exponencial de crescimento poreacutem natildeo eacute regulada pelo agr (Tremaine et al 1993)

diferentemente de seb sec e sed os quais requerem um agr funcional para a maacutexima

expressatildeo

1212 Enterotoxina estafilocoacutecica B (SEB)

A regiatildeo codificadora do gene seb conteacutem aproximadamente 900 nucleotiacutedeos A

proteiacutena precursora conteacutem 267 aminoaacutecidos O gene seb eacute cromossocircmico em

isolados cliacutenicos relacionados a casos de intoxicaccedilatildeo alimentar Poreacutem em outras

cepas estaacute localizado em um plasmiacutedio de 750 KB

1213 Enterotoxina estafilocoacutecica C (SEC)

SECs satildeo um grupo de proteiacutenas altamente conservadas com importantes

reatividades imunoloacutegicas cruzadas Existem trecircs subtipos de SEC antigenicamente

distintos SEC 1 SEC 2 e SEC3 O gene sec3 conteacutem 801 pares de bases e codifica

uma proteiacutena precursora de 267 aminoaacutecidos O gene sec3 eacute estritamente

relacionado com o gene sec1 com 98 de identidade entre as sequumlecircncias

nucleotiacutedicas SEC3 difere das enterotoxinass C1 e C2 por 4 e 9 aminoaacutecidos

respectivamente O gene sec2 conteacutem uma ORF de 801bp codificando um precursor

de 267 aminoaacutecidos O gene sec estaacute localizado em uma ilha de patogenicidade

(FITZGERALD et al 2001)

1214 Enterotoxina estafilocoacutecica D (SED)

O gene sed localiza-se sobre um plasmiacutedeo de 276 Kb designado piB485 O produto

do gene sed conteacutem 258 aminoaacutecidos O polipeptiacutedeo maduro conteacutem 228

aminoaacutecidos A atividade de superantigenicidade de SED eacute dependente de Zn+2 para

uma alta afinidade com o MHC de classe II

1215 Enterotoxina estafilocoacutecica E (SEE)

O gene see codifica uma proteiacutena de 29-KDa que eacute aparentemente processada a uma

forma extracelular madura com um massa molecular de 26 KDa A identidade na

sequumlecircncia de DNA indica que SEE SED e SEA satildeo estritamente relacionadas O

gene see eacute carreado por um fago defectivo (LE LOIR 2000)

Estas toxinas conhecidas pelo envolvimento em gastrenterites designadas como

intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica (SFP) nos anos atuais receberam uma maior

atenccedilatildeo por estarem envolvidas com a Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) (BOHACH

et al 1990) Como outras PTSAgs as SEs apresentam propriedades imuno-

modulatoacuterias e letais necessaacuterias para a TSS SEs e TSST-1 compartilham

propriedades estruturais e bioloacutegicas comuns sugerindo que elas derivam de um

ancestral comum (MARRACK et al1990) A diferenccedila entre SFP e TSS satildeo bem

demonstradas em vaacuterios trabalhos e satildeo um reflexo de rotas alternadas de exposiccedilatildeo

agraves SEs

122 Toxina da Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSST-1)

A Siacutendrome do Choque Toacutexico (TSS) eacute uma doenccedila estafilocoacutecica caracterizada

pelo estabelecimento agudo de febre alta rash eritematoso difuso descamaccedilatildeo da

epiderme hipotensatildeo hipoalbuminemia e envolvimento de trecircs ou mais sistemas

orgacircnicos (REINGOLD et al 1982) Esta siacutendrome foi primeiramente descrita por

TODD et al (1978) quando estes autores relataram tal sintomatologia em um grupo

de sete crianccedilas de 8 a 17 anos com doenccedila febril aguda Durante os anos que se

seguiram ocorreu um aumento no nuacutemero de casos de TSS e tal siacutendrome foi

associada com mulheres jovens em periacuteodo menstrual Posteriormente tornou-se

evidente que tais casos tambeacutem ocorriam em mulheres que natildeo estavam no periacuteodo

menstrual tornado-se notaacutevel que tal siacutendrome poderia acometer qualquer populaccedilatildeo

(HERZER 2001) Hoje se sabe que sem uma adequada terapia um choque letal

pode se desenvolver dentro de 24 horas apoacutes o estabelecimento dos sintomas

(DEURENBERG et al 2005) Sabe-se que satildeo 3 os criteacuterios para se desenvolver

a TSS (1) o paciente deve ser infectado ou colonizado por uma cepa de

Staphylococcus aureus (2) esta cepa deve produzir a toxina TSST-1 ou toxinas

similares (3) a toxina deve encontrar uma rota de entrada na circulaccedilatildeo(HERZER

2001) Foi proposto que aos achados cliacutenicos caracteriacutesticos o diagnoacutestico da TSS

fosse incorporado a achados laboratoriais importantes como Isolamento de S

aureus de mucosa ou site normalmente esteacuteril produccedilatildeo de toxina associada agrave TSS

pela cepa isolada carecircncia de anticorpos relacionados agrave toxina em questatildeo durante a

fase aguda da doenccedila e desenvolvimento de anticorpos contra tal toxina durante a

fase de convalescenccedila Este item poreacutem natildeo eacute muito adequado uma vez que vaacuterios

pacientes natildeo desenvolvem anticorpos neutralizantes para esta toxina (MCCORMICK

et al 2001)

A TSS eacute uma das mais comuns causas de morte nas unidades de terapia intensiva A

TSS eacute separada em dois eventos distintos Menstrual e natildeo-menstrual Em 1980 foi

descrito um quadro cliacutenico de TSS epidecircmico em mulheres que faziam o uso de

tampotildees absorventes principalmente aqueles de alta absorccedilatildeo Sabe-se que isto eacute

devido agrave habilidade desta toxina em atravessar barreiras mucosas A doenccedila foi

relacionada com cepas de S aureus toxigecircnicas principalmente aquelas do grupo

faacutegico I localizadas em mucosa vaginal ou da ceacutervice uterina Sabe-se que mais de

99 dos casos de TSS menstrual eacute relacionado ao uso de tampotildees absorventes

Acima de 45 de todos os casos de TSS eacute natildeo menstrual (HERZER 2001) Embora

a TSS natildeo menstrual possa ocorrer em associaccedilatildeo com qualquer infecccedilatildeo

estafilocoacutecica foram descritas algumas formas principais desta doenccedila Estas incluem

TSS poacutes-ciruacutergica TSS associada agrave gripe influenza siacutendrome eritematosa e TSS

associada ao uso de diafragmas como meacutetodo contraceptivo (MCCORMICK et al

2001)

A apresentaccedilatildeo cliacutenica do choque inclui inflamaccedilatildeo estabelecimento agudo de febre

alta rash eritematoso difuso vocircmito diarreacuteia mialgias falecircncia circulatoacuteria e

envolvimento de trecircs ou mais sistemas orgacircnicos (siacutendrome de disfunccedilatildeo de muacuteltiplos

oacutergatildeos - MODS) (PARRILO et al 1993) O LPS endotoxina presente na membrana

externa das bacteacuterias Gram-negativas induz vaacuterios dos achados associados com o

choque seacuteptico O LPS geralmente desencadeia o choque seacuteptico atraveacutes da ativaccedilatildeo

excessiva de macroacutefagos o que resulta na superproduccedilatildeo de citocinas incluindo TNF

e IL-1 e IL-6 Poreacutem as bacteacuterias Gram-positivas especialmente os Staphylococcus

aureus os quais carecem de membrana externa e aleacutem do mais natildeo produzem LPS

satildeo tambeacutem capazes de induzirem o choque seacuteptico Eacute sugerido que os

superantiacutegenos produzidos pelos Staphylococcus aureus desenvolvem um papel

importante no choque seacuteptico atraveacutes do estiacutemulo da proliferaccedilatildeo das ceacutelulas-T

induzindo a liberaccedilatildeo de citocinas A siacutendrome foi primeiramente descrita por TODD

et al (1978) como a principal doenccedila sistecircmica associada com cepas de S aureus

natildeo invasivas sendo designada como TSS por estes investigadores Os pacientes

com TSS normalmente natildeo apresentam bacteremia detectaacutevel ainda que se

encontrem achados cliacutenicos da doenccedila sugerindo que a TSS resulta de uma

intoxicaccedilatildeo com a toxina bacteriana (MCCORMICK et al 2001)

A TSST-1 foi a primeira toxina relacionada com a TSS sendo que hoje eacute aceita como

a responsaacutevel em torno de 75 dos casos cliacutenicos Eacute codificada por um gene tstH

(sendo que H refere-se a isolados de humanos) presente no cromossomo Este gene

pode ser encontrado em uma das duas ilhas de patogenicidade inserindo-se tanto

proacuteximo a tyrB (SAPI1) quanto em trp (SAPI2) (LYNDSAY et al 1998) O gene tst foi

encontrado tambeacutem na ilha de patogenicidade SaPIbov Os principais isolados

oriundos de TSS menstrual conteacutem tstH inserido proacuteximo ao locus trp sendo

portanto considerado contendo SaPI2 (MACCORMICK et al2001) Eacute responsaacutevel

por aproximadamente todos os casos de TSS menstrual sendo que a TSS natildeo

menstrual eacute tambeacutem atribuiacuteda agraves enterotoxinas estafilocoacutecicas tipos B (SEB) e C

(SEC) (MCCORMICK et al 2001) A toxina foi caracterizada e identificada como uma

nova exotoxina de S aureus por dois pesquisadores (SCHLIEVERT amp BERGDOLL)

A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das cepas de S aureus isolados de mucosa

cervical ou vaginal de mulheres que apresentaram TSS e em aproximadamente 50

dos isolados de outros siacutetios corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual

Somente a TSST-1 foi envolvida com os casos de TSS menstrual devido agrave

caracteriacutestica da TSST-1 em atravessar as barreiras mucosas diferentemente das

enterotoxinas (SCHLIVIERT et al 2000) A TSST-1 induz a uma resposta humoral in

vivo a qual se acredita ser protetora Em torno de 90 a 95 das mulheres de meia

idade apresentam tiacutetulos de anticorpos detectaacuteveis contra esta toxina Pacientes com

TSS produzem uma resposta ineficaz agrave TSST1 apresentando tiacutetulos inferiores a 15

enquanto que indiviacuteduos saudaacuteveis apresentam tiacutetulos acima de 1100 (HERZER

2001)

123 Toxinas Esfoliativas

Foram descritas duas toxinas esfoliativas distintas sorologicamente designadas como

toxina esfoliativa A e toxina esfoliativa B (ETA e ETB respectivamente) Ambos os

genes satildeo designados como etA e etB sendo que suas sequumlecircncias jaacute foram

determinadas (LEE et al1987) Dentre as manifestaccedilotildees cliacutenicas causadas por cepas

produtoras de ETs destacam-se a siacutendrome da pele escaldada estafilocoacutecica (SSSS)

a qual pode manifestar-se em sua forma claacutessica generalizada pela epiderme ou

localizada caracterizando o impetigo O impetigo por sua vez pode apresentar-se

como bolhoso ou natildeo-bolhoso (YAMASAKI et al 2005) A siacutendrome da pele

escaldada (SSSS) observada usualmente em receacutem nascidos (Doenccedila de Ritter)

geralmente em forma de surtos hospitalares (HELLALI et al 2004) eacute uma dermatite

esfoliativa mediada pela infecccedilatildeo com cepas de Staphylococcus aureus produtoras

tanto de ETA quanto de ETB Poreacutem a presenccedila do gene etb eacute fortemente associado

agrave SSSS generalizada enquanto que o gene eta associa-se com o impetigo bolhoso

(YAMASAKI et al 2005) Atualmente relaciona-se a accedilatildeo destas toxinas como

serino-proteases (Dancer et al 1990) Estas toxinas desencadeiam uma separaccedilatildeo

intradeacutermica do estrato granular pela clivagem especiacutefica da desmogleiacutena-1 a qual eacute

uma proteiacutena desmossomal que media a adesatildeo intercelular dos queratinoacutecitos

presentes na camada granular (YAMASAKI et al 2005) Na SSSS quando se

observa a ocorrecircncia de bolhas o liacutequido intradeacutemico eacute esteacuteril sendo que a cepa

infectante eacute usualmente recuperada de siacutetios distantes da lesatildeo como garganta ou

cavidade nasal (YAMASAKI et al 2005) Alguns autores atribuem uma forte

predominacircncia da ETB nesta siacutendrome em relaccedilatildeo agrave ETA (KANZAKI et al 1997)

Trata-se de uma condiccedilatildeo tiacutepica de crianccedilas embora possa tambeacutem ocorrer em

adultos (LISA 2004) Esta doenccedila inicia-se abruptamente com febre e eritema

geralmente proacuteximo agrave boca podendo se espalhar pelo corpo inteiro em poucos dias

seguido pela formaccedilatildeo de bolhas esteacutereis na epiderme as quais provocam a

separaccedilatildeo das camadas epideacutermicas especialmente em niacutevel do estrato granuloso

(AMAGAI et al 2002) A esfoliaccedilatildeo da epiderme a qual predispotildee o paciente a

infecccedilotildees secundaacuterias por patoacutegenos oportunistas (LADHANI et al 1999) ocorre em

um siacutetio distante do local da infecccedilatildeo Acredita-se que a SSSS origina-se atraveacutes da

absorccedilatildeo das ETs produzidas por cepas destes siacutetios longiacutenquos Estas toxinas

atingiriam a circulaccedilatildeo sistecircmica por difusatildeo para chegar aos siacutetios alvos (YAMASAKI

et al 2005) Segundo LADHANI (2003) a alta incidecircncia da SSSS generalizada em

crianccedilas seria em funccedilatildeo do clearance renal menos eficaz destas toxinas e a

imaturidade imunoloacutegica observada nesta populaccedilatildeo resultando em baixos tiacutetulos de

anticorpos anti-ETs A mortalidade em crianccedilas situa-se em torno de 3 quando em

uso de antibioticoterapia apropriada sendo usualmente associada com infecccedilotildees

secundaacuterias (GEMMELL 1995) Poreacutem surtos hospitalares ainda continuam a ser

relatados (MACKENZIE et al 1995) Em contraste no impetigo bolhoso o qual eacute

uma infecccedilatildeo localizada tambeacutem provocada por cepas de S aureus produtoras de

ETs o liacutequido eacute formado por exsudato purulento sendo que estas cepas satildeo

usualmente isoladas deste liacutequido Esta manifestaccedilatildeo cliacutenica pode ocorrer em

qualquer idade (YAMASAKI et al 2005) Koning e colaboradores demonstraram a

relaccedilatildeo de cepas produtoras de ETB com PVL e um plasmiacutedio resistente a vaacuterias

drogas denominado pSK41 (Gillet et al 2002) Estes autores relataram que a relaccedilatildeo

entre tais fatores de virulecircncia contribui para a gravidade do impetigo natildeo-bolhoso

A ETA eacute codificada por um gene cromossocircmico (eta) dentro de um segmento de 43

Kb de um fago temperado (YAMAGUCHI et al 2000) e eacute a mais comum das toxinas

esfoliativas Jaacute a ETB eacute codificada por um plasmiacutedio de aproximadamente 382 a 385

Kb ETA e ETB compartilham uma significativa identidade entre suas sequumlecircncias de

aminoaacutecidos apresentando tambeacutem importantes propriedades biofiacutesicas comuns

(LEE et al 1987) ETA eacute uma toxina muito estaacutevel a qual eacute resistente ao calor

extremo enquanto ETB eacute sensiacutevel ao calor (LISA 2004) Recentemente foi

identificada uma nova toxina esfoliativa ETD de uma cepa isolada de ferida Foi

inicialmente relacionada a uma ORF com uma significante homologia agraves ETs

conhecidas (YAMAGUCHI et al 2002) Uma quarta toxina esfoliativa potencialmente

ativa em humanos denominada ETC foi isolada em infecccedilotildees em cavalos e

apresentou atividades em modelos de ratos neonatais (SATO et al 1994) poreacutem

ainda natildeo foi associada com doenccedila em humanos As ETs como a maiorias das

proteiacutenas estafilocoacutecicas associadas com virulecircncia estatildeo codificadas em elementos

geneacuteticos moacuteveis (NOVICK 2003) permitindo a transferecircncia horizontal destes

fatores de virulecircncia Por uma razatildeo ainda natildeo muito bem compreendida as toxinas

esfoliativas natildeo satildeo co-produzidas com TSST-1 pelas cepas de Staphylococcus

aureus embora as Ets possam ser co-produzidas com as demais enterotoxinas

(GRAVET et al 2001) Como a maioria dos fatores de virulecircncia dos Staphylococcus

aureus as ETs satildeo reguladas pelo locus agr (NOVICK 2003)

Existem vaacuterias controveacutersias na associaccedilatildeo das ETs como superantiacutegenos Embora

na SSSS possa se encontrar eritema febre e focos purulentos estes natildeo estatildeo

sempre presentes Embora tenha sido demonstrado o estiacutemulo especiacutefico de ceacutelulas

T a SSSS geralmente carece de sintomas sistecircmicos associados agrave siacutendrome

mediada por superantiacutegenos Poreacutem a superantigenicidade fica fundamentada sobre

o fato de que a bacteacuteria natildeo eacute necessariamente encontrada em todas as lesotildees

bolhosas presentes na SSSS (VATH et al1999)

13 Locus agr

A expressatildeo dos genes de exotoxinas eacute controlada por reguladores tais como o

agr (acessory gene regulator) (PROJAN 1997) sendo identificadas quatro classes

diferentes e mutuamente inibitoacuterias deste gene (JARRAUD et al1997 JI et al1997)

O locus agr eacute um regulador positivo para as exotoxinas secretadas durante a fase

poacutes-exponencial de crescimento poreacutem eacute um regulador negativo para os fatores de

virulecircncia associados agrave superfiacutecie As exotoxinas reguladas pelo agr natildeo satildeo

sintetizadas ou satildeo significativamente reduzidas em agr mutantes defectivos

(RECSEI et al 1986) A produccedilatildeo de alfa-hemolisina delta-hemolisina e TSST-1

parecem ser fortemente reguladas pelo agr Estas toxinas satildeo produzidas em altas

quantidades por cepas agr+ e satildeo produzidas em quantidades iacutenfimas em cepas agr-

sendo referidas como toxinas de classe-I Jaacute as beta-hemolinas as enterotoxinas B

e C e a toxina esfoliativa A parecem natildeo ser tatildeo fortemente reguladas pelo agr uma

vez que estas proteiacutenas satildeo produzidas em altas quantidades em cepas agr+ e em

quantidades moderadas em cepas agr- sendo referidas como toxinas de classe II

Satildeo consideradas como proteiacutenas de classe III a proteiacutena A a coagulase e a

proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave fibronectina as quais satildeo feitas em altas concentraccedilotildees em

cepas agr- poreacutem em baixas concentraccedilotildees em cepas agr+ O locus agr foi

sequumlenciado e clonado compreendendo pelo menos cinco genes agrA agrB agrC

agrD e o gene para a delta-hemolisina (hld) (PENG et al 1989) O locus agr parece

ser um sistema regulatoacuterio de dois componentes com o agrD originando um

componente sinalizador e o agrA codificando um ativador de transcriccedilatildeo Os dois

transcritos principais produzidos pelo agr satildeo designados como RNAII (agr A B C D)

e RNA III ( hld ) O RNA III age primeiramente para iniciar a transcriccedilatildeo dos fatores de

virulecircncia

Os genes codificadores de fatores de virulecircncia abordados neste trabalho satildeo os

seguintes enterotoxinas A B C D e E (sea seb sec sed see) Toxina da Siacutendrome

do Choque Toacutexico (tst) Toxinas Esfoliativas A e B (eta e etb) Leucocidina de Panton-

Valentine (pvl) Leucocidina E-D (luk-E-lukD) e as hemolisinas Alfa Beta e Gama

(hla hlb hlg) Aleacutem de tais genes seratildeo estudados o tipo do locus agr presente em

cada cepa

Por seu importante papel no controle dos genes de virulecircncia de Staphylococcus

aureus tal gene tornou-se na atualidade um alvo importantiacutessimo na terapia uma

vez que sua resposta pode ser controlada por peptiacutedeos sinteacuteticos (MAYVILLE et al

1999) Como tais respostas satildeo agr especiacuteficas e como a distribuiccedilatildeo dos tipos de agr

em cepas cliacutenicas eacute pouco conhecida torna-se importante o conhecimento da

prevalecircncia do tipo agr em cepas nosocomiais

2 Objetivos

21 GERAL

Caracterizaccedilatildeo dos isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus sensiacuteveis agrave oxacilina

quanto a presenccedila dos principais genes codificadores de exotoxinas e os tipos

polimoacuterficos do locus agr

22 ESPECIacuteFICOS

221 Amplificar os principais genes que codificam exotoxinas produzidas por cepas

de Staphylococcus aureus sensiacuteveis a oxacilina

222 Estudar o polimorfismo do locus agr e classificar os perfis presentes nas cepas

OSSA estudadas

223 Determinar a frequumlecircncia dos genes codificadores de fatores de virulecircncia

encontrados nas cepas estudas confrontando-os com o perfil agr de acordo com a

procedecircncia material cliacutenico ou alimentos

3 Material e meacutetodos

31 Amostras bacterianas

No presente estudo foram utilizados 37 isolados de Staphylococcus aureus

provenientes de 12 laboratoacuterios de hospitais puacuteblicos e privados brasileiros Estes

isolados foram confirmados como S aureus sensiacuteveis a oxacilina (OSSA) no

screening para oxacilina Destes 37 OSSA sete foram isolados de alimentos

responsabilizados por casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar A escolha das amostras foi

baseada na heterogeneidade do material cliacutenico e de alimentos provenientes de

casos de toxi-infecccedilatildeo alimentar

Tabela 1 - Distribuiccedilatildeo das cepas estudadas de acordo com a procedecircncia e fonte de isolamento

n Cepas Procedecircncia Material01 C1 Hosp A LCR02 C2 Hosp A LP03 C3 Hosp A Sg04 C4 Hosp A LCR05 C5 Hosp A LP06 C6 Hosp B S

g07 C7 Hosp B Sg08 C8 Hosp C Sg09 C9 Hosp C Sg10 C10 Hosp C Sg11 C11 Hosp D Sg12 C12 Hosp D Sg13 C13 Hosp E Sg

14 C14 Hosp E Sg15 C15 Hosp F Sg16 C16 Hosp F Sg17 C17 Hosp G Sg18 C18 Hosp H S

g19 C19 Hosp H Sg

n Cepas Procedecircncia Material20 C20 Hosp H Sg21 C21 Hosp H Sg22 C22 Hosp I Sg23 C23 Hosp J Sg24 C24 Hosp L Sg25 C25 Hosp L Sg26 C26 Hosp L Sg27 C27 Hosp L Sg28 C28 Hosp M Sg29 C29 Hosp N Sg30 C30 Hosp N Sg31 Al-1 L-1 Al-32 Al-2 L -2 Al-33 Al-3 L -3 Al-34 Al-4 L -4 Al-35 Al-5 L -5 Al-36 Al-6 L -6 Al-37 Al-7 L -7 Al-

Hosp A - N Hospitais de diferentes cidades brasileiras onde as cepas foram isoladas L1 - 7 Laboratoacuterio de microbiologia de alimentos onde foram isoladas 7 cepas oriundas de alimentos relacionados com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar (anexo-1) LCR- Liacutequido Ceacutefalo-Raquidiano LP ndashLiacutequido Pleural Sg ndashsangue Al ndashAlimentos relacionados a espisoacutedios de toxi-infecccedilatildeo alimentar

32 Triagem para a confirmaccedilatildeo da sensibilidade a oxacilina

Todos os isolados foram submetidos agrave triagem para confirmaccedilatildeo da sensibilidade agrave

oxacilina atraveacutes do meacutetodo descrito pelo NCCLS (2005) que utiliza o aacutegar Mueller-

Hinton contendo 6microgmL de oxacilina e 4 de cloreto de Soacutedio (NaCl) O inoacuteculo foi

aplicado na placa atraveacutes do uso de um swab embebido em uma suspensatildeo

bacteriana equivalente agrave escala 05 de McFarland A placa foi incubada a 35degC por

exatas 24 horas A observaccedilatildeo de uma ou mais colocircnias na aacuterea de aplicaccedilatildeo do

inoacuteculo definiu o resultado como positivo ou seja a cepa foi considerada resistente agrave

oxacilina

33 ANAacuteLISE DO POLIMORFISMO DO DNA POR ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE)

331 Extraccedilatildeo do DNA genocircmico para PGFE

As cepas de Staphylococcus aureus foram semeadas em aacutegar-sangue de carneiro a

5 (AS) (OXOID England) e incubadas a 37degC durante 24 horas Posteriormente

foram repicadas em caldo de soja-tripticaseiacutena (TSB) (DIFCO USA) e incubadas a

37degC por uma noite Apoacutes esse periacuteodo centrifugou-se as amostras a 3345g durante

10 minutos O sedimento foi ressuspenso em 1mL de soluccedilatildeo salina esteacuteril e

transferido para um tubo de microcentriacutefuga previamente

pesado Essa suspensatildeo foi centrifugada a 23100g durante 15 minutos e o

sobrenadante foi descartado A seguir ressuspendeu-se o sedimento em 1mL de

soluccedilatildeo salina esteacuteril centrifugou-se a 23100g durante 15 minutos e descartou-se o

sobrenadante Esse procedimento foi repetido trecircs vezes O sedimento foi entatildeo

pesado e re-suspenso em EDTA 50mM pH80 para uma concentraccedilatildeo final de 100microg

de massa bacteriana por microL Desta suspensatildeo transferiu-se15microL para um tubo de

micro-centriacutefuga contendo 215microL de tampatildeo EC (anexo II) adicionado de 250microL de

agarose de baixo ponto de fusatildeo a 2 (Sigma USA) e 20microL de soluccedilatildeo de lisostafina

(100microgmL) (Sigma USA) Esta suspensatildeo foi transferida para os moldes onde

permaneceu por 30 minutos a 4degC para que os blocos se solidificassem Apoacutes esta

etapa os blocos foram transferidos para uma placa de cultura de ceacutelulas de 24

orifiacutecios contendo 2mL de tampatildeo EC em cada orifiacutecio e incubadas a 37degC por um

periacuteodo de cinco horas sob agitaccedilatildeo suave Apoacutes a incubaccedilatildeo lavou-se os blocos

com 25mL de tampatildeo CHEF TE (anexo II) incubando-se a seguir com 2mL de

tampatildeo ES (anexo II) adicionado de 100microL de soluccedilatildeo de proteinase K (20mgmL)

(GibcoBRL Life Technologies USA) por uma noite agrave temperatura de 50degC Os blocos

foram entatildeo lavados com 25mL de tampatildeo CHEF TE (4 lavagens com incubaccedilotildees de

1 hora cada) e armazenados nesta soluccedilatildeo ateacute serem submetidos agrave digestatildeo

enzimaacutetica e eletroforese (PFALLER 1993)

332 Digestatildeo enzimaacutetica

A digestatildeo do DNA cromossocircmico foi realizada com a enzima de restriccedilatildeo SmaI

(Amersham Pharmacia Biotech USA) que reconhece e cliva sequumlecircncias de

nucleotiacutedeos que aparecem poucas vezes ao longo do DNA de Staphylococcus

aureus (12 a 20 siacutetios de restriccedilatildeo) (PREVOST et al 1992 STRUELENS et al

1992) Para o tratamento com enzimas de restriccedilatildeo transferiu-se um bloco de

agarose de cada amostra para uma placa de cultura de ceacutelulas de 96 orifiacutecios

contendo 300microL de tampatildeo DNS A seguir o tampatildeo DNS foi retirado e novamente

adicionados 300microL de tampatildeo DNS incubando-se os blocos a temperatura ambiente

durante 1 hora Este processo foi repetido 4 vezes Apoacutes este periacuteodo substituiu-se o

tampatildeo DNS por 200microL de tampatildeo da enzima de restriccedilatildeo e o bloco foi incubado a

temperatura ambiente por 2 horas Em seguida descartou-se o tampatildeo e entatildeo foram

adicionados 200microL de tampatildeo da enzima e 40microL da enzima SmaI e os blocos entatildeo

foram incubados por 2 horas a 4degC e a seguir por 15 horas a 30degC (PFALLER 1993)

333 Eletroforese em Campo Pulsado

A eletroforese em campo pulsado foi realizada em gel de agarose a 1 (Sigma

USA) em 05TBE (90mM Tris 90mM aacutecido boacuterico 2mM EDTA [Amersham

Pharmacia Biotech USA]) (SAMBROOK et al 1989) no equipamento CHEF DRII

System (BIO-RAD USA) com intervalos de tempo de pulso de 1 a 30 segundos por

24 horas acircngulo de 120deg temperatura de 14degC e voltagem de 60 voltscm

(PFALLER 1993)

Apoacutes a separaccedilatildeo corou-se os geacuteis com soluccedilatildeo aquosa contendo 05microgmL de

brometo de etiacutedio (Sigma USA) e foram fotografados sob transiluminaccedilatildeo com luz

ultravioleta Foi utilizado como padratildeo de peso molecular Lambda DNA ladder PFG

(New England Biolabs Inc USA) com extensatildeo das bandas de 485Kb ateacute 10Mb

(PFALLER 1993) Utilizou-se como controle cepa de S aureus ATCC 25923 A

anaacutelise das bandas obtidas pela eletroforese foi realizada de maneira visual de

acordo com o guia de interpretaccedilatildeo de Eletroforese de campo pulsado proposto por

TERNOVER et al (1995) (Tabela 2)

Tabela 2- Criteacuterios para interpretaccedilatildeo de eletroforese de campo Pulsado (PFGE)

Categorias Nordm de diferenccedilas

geneacuteticas

Nordm de fragmentos

diferentes

Interpretaccedilatildeo

Semelhantes 0 0 Cepas fazem parte do

mesmo cloneRelacionadas 1 2-3 cepas sagraveo

consideradas como

subgrupoPossivelmente

relacionadas

2 4-6 cepas possivelmente

relacionadasDiferentes Maior ou igual a 3 maior ou igual a 7 cepas diferentes

Fonte TERNOVER et al1995

34 Obtenccedilatildeo do DNA Genocircmico para as amplificaccedilotildees

O DNA total foi extraiacutedo atraveacutes da teacutecnica de extraccedilatildeo fenol-clorofoacutermio

(SAMBROOK et al 1989) As cepas foram cultivadas overnight em caldo LB e

ressuspendidas em tampatildeo de lise (50nM Tris pH 8 5mM EDTA pH 8 50mM NaCl)

A lisostafina (concentraccedilatildeo final de 20mgL) foi utilizada para a fase de rompimento

das ceacutelulas Lisozima e proteinase K foram utilizadas para lise das proteiacutenas que

foram removidas do meio atraveacutes de separaccedilatildeo de fases com fenol-clorofoacutermio-aacutelcool

isoamiacutelico O DNA restante na fase aquosa foi precipitado com etanol absoluto gelado

e centrifugado no equipamento Sorvall RC2-B (rotor SS34) aderindo agrave parede do

tubo Posteriormente foi solubilizado em tampatildeo TE (10mM Tris 1 mM EDTA pH 8)

e armazenado a -20degC

A quantificaccedilatildeo do DNA e sua integridade foram verificadas atraveacutes de eletroforese

em gel de agarose 08 comparando-se com um padratildeo de massa molecular

conhecido (High DNA MassTM Ladder - InvitrogemTM) O gel foi corado com soluccedilatildeo de

brometo de etiacutedio (InvitrogemTM) na concentraccedilatildeo final de 05 microgmL e as suas bandas

foram visualizadas sob luz ultravioleta(UV)

35 Detecccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia e o tipo de agr

presente

351 PCR para detecccedilatildeo dos genes dos principais fatores de virulecircncia

Foram utilizados 13 pares de iniciadores para a amplificaccedilatildeo de estruturas especiacuteficas

para cada um dos 13 genes relacionados aos fatores de virulecircncia pesquisados

(tabela 4) Como controles internos foram utilizadas cepas padrotildees que contecircm os

genes codificadores dos fatores de virulecircncia pesquisados

Tabela 3 - Cepas controle-positivo para cada gene de toxina pesquisado

Gene de toxina

eta etb

hlahlbhlg tst sea seb sec sed pvl LukED

Cepa Padratildeo

ZM N5 N315 N315 Mu50 T116 N315 RN4220 MR108 N315

eta- Gene codificador para Toxina Esfoliatina A etb- Gene codificador para Toxina Esfoliatina B hla - Gene codificador para alfa-hemolisina hlb - Gene codificador para beta-hemolisina hlg - Gene codificador para gama - -hemolisina tst - Gene codificador para TSST-1 sea - Gene codificador para enterotoxina A sec - Gene codificador para enterotoxina C sed - Gene codificador para enterotoxina D pvl - Gene codificador para Leucocidina Panton-Valentine LukED - Gene codificador para leucocidina E-D

As cepas ZM N5 RN4220 e MR108 foram doadas pela professora doutora Teruyo

Ho e Dr Keiichi Hiramatsu da Universidade de Juntendo Toacutequio como portadoras

dos genes mencionados na tabela 3 A cepa Mu50 foi citada por KURODA et al

2001 como carreadora do gene sea A cepa N315 apresenta seu genoma publicado

na lancet com a referecircncia 357 (9264) 1225-1240 (2001) A cepa T116 teve seu

amplicon para gene seb sequenciado no centro de estudos do genoma humano no

Instituto de Biociecircncias da Universidade de Satildeo Paulo

Tabela 4 ndash Iniciadores utilizados para as toxinas em estudo

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosSEA sea SEA-1 5 - GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA - 3

SEA-2 5 - CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGATTC - 3SEB seb SEB-1 5 - ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA - 3

SEB-2 5 - ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT - 3SEC sec SEC-1 5 - GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG - 3

SEC-2 5 - CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT - 3SED sed SED-1 5 - GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG - 3

SED-2 5 - GCTGTATTTTTCCTCCGAGAG - 3SEE see SEE-1 5 - CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC - 3

SEE-2 5 - CACCTTACCGCCAAAGCTG - 3TSST-1 tst TST-1 5 - TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT - 3

TST-2 5 - TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT - 3ETA eta mpETA-1 5 - ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT - 3

mpETA-3 5 - TGGATACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC - 3ETB etb mpETB-1 5 - CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC - 3

mpETB-2 5 - AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC - 3

Toxina Gene Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPVL comps S

e F

lukS-PV PVL-1 5 ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- 3lukF-PV NPVL-2 5 - GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3

LukE-LukD lukE-lukD LUKED-1 5 - TGAAAAAGGTTCAAAGTTGATACGAG - 3LUKED-2 5 - TGTATTCGATAGCAAAAGCAGTGCA - 3

HLA hla HLA-1 5 - CTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG - 3HLA-2 5 - CTTTCCAGCCTACTTTTTTATCAGT - 3

HLB hlb HLB-1 5 - GTGCACTTACTGACAATAGTGC - 3HLB-2 5 - GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT - 3

HLG hlg mpHLG-1 5 - GTCAYAGAGTCCATAATGCATTTAA - 3mpHLG-2 5 - CACCAAATGTATAGCCTAAAGTG - 3

Iniciadores sintetizados conforme JARRAUD et al 2002SEA ndash SEE enterotoxinas A B C D E TSST-1 Toxinas asociada agrave siacutendrome do Choque Toacutexico ETA Toxina Esfoliatina A ETB Toxina Esfoliatina B PVL Leucocidina de Panton ndashValentine LukE-LukD leucocidina E-D HLA alfa-hemolisina HLB Beta-hemolisina HLG Gama-hemolisinaObs Acompanhando cada toxina encontra-se o seu respectivo gene codificador sempre representado em itaacutelico e em caixa baixa

Para amplificaccedilatildeo das estruturas gecircnicas correspondentes aos genes das toxinas em

estudo seguiu-se o seguinte protocolo descrito por JARRAUD et al (2002) com a

diluiccedilatildeo preacutevia de 1100 do DNa obtido Utilizou-se volume de 20microL de uma mistura

para reaccedilatildeo contendo 2microL de DNA 05 unidades de Taq polimerase e uma

concentraccedilatildeo final dos seguintes componentes 200microM de cada dNTP 15mM de

MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM (NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos

primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram executados cada um

consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC Cada teste de PCR foi

controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os genes de virulecircncia em

estudo e controles negativos com amostras livre de microrganismos Dez microlitros

de produto de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 08 e

visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com brometo de etiacutedio

352 Determinaccedilatildeo do perfil do polimorfismo do locus agr

Tabela 5 ndash Iniciadores utilizados para a classificaccedilatildeo do locus agr

Iniciador Sequecircncia de nucleotiacutedeosPAN-agr 5 - ATGCACATGGTGCACATGC - 3

agr -I 5 - GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT - 3agr -II 5 - TATTACTAATTGAAAAGTGGCCATAGC - 3agr -III 5 - GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG - 3

Sequumlecircncia de iniciadores conforme JARRAUD et al 2002

Para amplificar o locus agr em estudo utilizou-se o iniciador folowed PAN-agr o qual

anela-se em uma regiatildeo comum a todos os tipos de agr polimoacuterficos descritos Com

este iniciador foram utilizados em cada reaccedilatildeo cada um dos iniciadores reversos

agrI agrII e agrIII os quais anelam-se em segmentos especiacuteficos a cada um dos

respectivos tipos polimoacuterficos I II ou III respectivamente Utilizou-se para a reaccedilatildeo

de PCR um volume de 20microL de uma mistura contendo 2microL de DNA (diluiacutedo 1100)

05 unidades de Taq polimerase e uma concentraccedilatildeo final dos seguintes

componentes 200microM de cada dNTP 15mM de MgCl2 75mM Tris-HCl pH 90 20mM

(NH4)2SO4 001 Tween 20 250nM dos primers Trinta ciclos de amplificaccedilatildeo foram

executados cada um consistindo de 60s a 95degC 60s a 55degC e 2 minutos a 72degC

Cada teste de PCR foi controlado com controles positivos de cepas-padratildeo com os

subtipos do locus agr em estudo e controles negativos com amostras livre de

microrganismos Dez microlitros de produto de PCR foram separados por eletroforese

em gel de agarose a 08 e visualizado sob luz ultravioleta apoacutes coloraccedilatildeo com

brometo de etiacutedio Como controle positivo foram utilizadas cepas controles portadoras

dos principias tipos de agr isolados no Brasil

Figura 2- Representaccedilatildeo dos genes agr A C D e B e as regiotildees utilizadas para as amplificaccedilotildees dos segmentos polimoacuterficos dos tipos 1 2 3 e 4 do agr

Desenho elaborado por ldquoMcCulloch et alrdquo em XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia131240-2 2005

Tabela 6 - Cepas padrotildees utilizadas para classificaccedilatildeo do polimorfismo do locus agr

agrTipo agr I II III

cepa R137 N315 ATCC 25923Tipo de agr confirmado por sequenciamentono projeto genoma IB USP

36 Eletroforese em gel de agarose

Para visualizaccedilatildeo e anaacutelise do fragmento de DNA amplificado na reaccedilatildeo da PCR um

gel de agarose foi preparado a 08 em tampatildeo 05 X TBE (Trisma base - 890 mM

EDTA - 25 mM ac boacuterico - 89 mM) Para a verificaccedilatildeo dos tamanhos dos produtos de

PCR aliacutequotas desta amostras assim como um padratildeo de massa molecular

conhecido (1Kb DNA Ladder - InvitrogemTM) misturados a uma soluccedilatildeo tampatildeo ( azul

de bromofenol 025 xileno cianol FF 025 glicerol 30) foram submetidos a

separaccedilatildeo eletroforeacutetica por cerca de 45 minutos a 100 volts O gel foi corado e

visualizado como descrito no item 34

37 Determinaccedilatildeo do tamanho dos fragmentos do DNA amplificados

Para a obtenccedilatildeo da imagem do gel de agarose (corado previamente com brometo de

etiacutedio) tanto fotograacutefica quanto digital foi utilizado o sistema Photodocumentation

System Modelo DP-001FDC Versatildeo 10 (Vilber Loumart Marne-lavalleacutee Cedex 1 -

Franccedila) A imagem fotograacutefica foi impressa pelo sistema Video Graphic Printer UP-

895CE(SONY)

Apoacutes obtenccedilatildeo da imagem digital os tamanhos dos fragmentos de DNA foram

analisados atraveacutes do programa PhotoCaptMw Versatildeo 1001 para Windows

4 Resultados

41 Triagem para verificaccedilatildeo da sensibilidade agrave oxacilina

Todos os isolados utilizados neste estudo foram caracterizados como OSSA quando

submetidas agrave triagem para verificaccedilatildeo da resistecircncia agrave oxacilina atraveacutes do meacutetodo

descrito no item 32

42 Anaacutelise por Eletroforese de campo pulsado (PFGE)

O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado das cepas OSSA neste trabalho

mostrou uma diversidade clonal entre os isolados provenientes de uma mesma

unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os isolados C3 e C5 oriundos do

hospital A apresentando somente uma banda de diferenccedila e entre os isolados C31 e

C33 oriundos dos Laboratoacuterios L1 e L3 apresentando duas bandas diferentes Estas

exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um mesmo clone segundo os

criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995) As cepas C10 e C11 natildeo tiveram

seus perfis moleculares analisados devido a dificuldades de recuperaccedilatildeo das

mesmas

Figura 3 - Fotografia do gel obtido da eletroforese de campo Pulsado (PGFE)

Figura 3a ndash Amostras C20 ndash C30

Figura 3b ndash Amostras C1 ndash C19

43 Determinaccedilatildeo do tipo agr

Figura ndash 4 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo dos tipos de agr I II e III

Tabela 7 - Distribuiccedilatildeo do tipo agr encontrado nos 37 isolados OSSA estudados

agr Cepas OSSA Total ()I C2C8C10C13C25C36C29 7 (19 )II C9C11C14C24C28C37C30 7 (19 )III C1C3C4C5C6C7C12C15C16C17C18C19C20

C21C22C23C26C27C31C32C33 C34C35 23 (62)

As siglas e o nordm que acompanham cada isolado satildeo apenas coacutedigos de identificaccedilatildeo dos mesmosOs valores percentuais encontram-se entre parecircntesesOSSA(Oxacillin Sensitive Staphylococcus aureus)

Tabela 8 - Fonte dos isolados em funccedilatildeo do tipo de agr encontrado Fonte

deIsolamento

n=37

agrI () II () III ()

Al1(14) 1(14) 5(72)

Mat Cliacutenico6(20) 6(20) 18(60)

n - corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Mat Cliacutenico Cepas provenientes de material cliacutenico Al cepas provenientes de alimentos envolvidos com quadros de toxi-infecccedilatildeo alimentar

44 Determinaccedilatildeo dos genes codificadores dos fatores de virulecircncia

Figura ndash 5 Fragmentos obtidos com a amplificaccedilatildeo de alguns dos fatores de virulecircncia estudados

441 Tabela 9 - Genes codificadores de toxinas em funccedilatildeo do tipo agr encontrado

Toxinas

(n=37)

agrI () II () III ()

sea 0 0 15 (100)seb 1(14) 1(14) 5(72)sec 0 1 (9) 11(91)sed 0 1(50) 1(50)see 0 0 0tst 1 (11) 2 (22) 6 (67)eta 0 0 0etb 0 0 0pvl 1(14) 1(14) 5 (72)luKED 6 (17) 7 (20) 22 (63)hla 7 (18) 7 (18) 23 (64)hlb 5 (17) 4 (13) 20 (70)hlg 7 (19) 7 (19) 22 (62)

n corresponde ao nordm de isolados relacionados a cada item os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

Figura ndash 5-aFragmentos amplificados dosGenes hla hlb hlg lukED e pvl Figura ndash 5-bFragmentos amplificados dos

Genes sea seb sed e etb

442 Tabela 10 - Frequumlecircncia dos genes codificadores de toxinas nos 37 isolados OSSA

Genes codificadores

de exotoxinas

Frequumlecircncia ()

sea 40seb 19sec 34sed 5see 0tst 25eta 0etb 0pvl 19luKED 94hla 100hlb 78hlg 97

443 Tabela 11 - Relaccedilatildeo dos Genes de toxinas encontrados em funccedilatildeo da origem

das cepas estudadas

Genes codificadores

de exotoxinas

n=37

Alimentos Mat Cliacutenico

n=7 n=30

sea 4 (57) 11(37)seb 0 7(23)sec 3 (43) 9 (30)sed 0 2 (6)see 0 0tst 2 (28) 5 (16)eta 0 0etb 0 0pvl 1 (14) 6 (20)luKED 7(100) 18 (60)hla 7 (100) 30 (100)hlb 6 (86) 23 (77)hlg 7(100) 29 (97)

n corresponde ao nordm de cepas relacionadas a cada item Os valores percentuais encontram-se entre parecircnteses

5 Discussatildeo

Os patoacutegenos microbianos tecircm uma oacutetima versatilidade em colonizar diversos nichos

ecoloacutegicos e causar infecccedilotildees em diferentes siacutetios anatocircmicos de seus hospedeiros

O processo molecular responsaacutevel pela doenccedila em hospedeiros especiacuteficos eacute pouco

conhecido Todavia grande importacircncia neste contesto eacute atribuiacuteda aacute variaccedilatildeo

geneacutetica entre as cepas (FITZGERALD et al 2001)

O Staphylococcus aureus podem ser comensais como tambeacutem patoacutegenos

extremamente versaacuteteis em humanos A doenccedila causada por esta bacteacuteria pode ser o

resultado da invasatildeo tissular direta ou devido agrave accedilatildeo de uma variedade de exotoxinas

liberadas As cepas de Staphylococcus aureus patogecircnicas expressam vaacuterios fatores

de virulecircncia os quais incluem tanto toxinas secretadas (exotoxinas) como tambeacutem

moleacuteculas de superfiacutecie celular associadas com a adesatildeo bacteriana Pelo menos 34

diferentes proteiacutenas extracelulares satildeo produzidas por estas cepas sendo que vaacuterias

delas possuem um papel jaacute definido na patogecircnese da doenccedila estafilocoacutecica (LISA

2004) Com exceccedilatildeo da toxemia as bases moleculares da patogenicidade do

Staphylococcus aureus satildeo multifatoriais dependendo da presenccedila e tambeacutem da

expressatildeo de vaacuterios genes acessoacuterios Em processos invasivos satildeo vaacuterios os fatores

de virulecircncia que as cepas de S aureus podem sintetizar os quais incluem

polissacaacuterides capsulares proteiacutenas associadas agrave superfiacutecie e vaacuterias exotoxinas

(SUTRA et al 1993)

Os meacutetodos geneacutetico-moleculares satildeo capazes de detectar o potencial das cepas

produzirem a toxina em questatildeo pois existem casos em que genes de toxinas natildeo

satildeo expressos (Koleckova et al 2002) Portanto os achados deste presente estudo

fornecem-nos dados sobre os aspectos geneacuteticos dos fatores de virulecircncia intriacutensecos

nas cepas de Staphylococcus aureus estudadas Analisamos portanto a presenccedila de

vaacuterios genes acessoacuterios codificadores de exotoxinas e o tipo de seu gene regulador

presente no intuito de verificar a ocorrecircncia de algum perfil de virulecircncia prevalente

nos tipos de agr encontrados bem como no material de origem de cada cepa

Ademais procurou-se confrontar os resultados obtidos por diversos autores com os

resultados encontrados nesta pesquisa

Para saber se os isolados analisados de cada centro natildeo eram clonais realizou-se a

tipagem molecular destes isolados segundo a teacutecnica da Eletroforese em gel de

Campo Pulsado (PFGE) Segundo TERNOVER et al(1995) a anaacutelise de tipagem

molecular deve ser aplicada a isolados que estejam relacionados a pelo menos um

dos itens (i) a uma aacuterea especiacutefica na qual a infecccedilatildeo estaacute ocorrendo(ii) a um

periacuteodo comum a uma dada infecccedilatildeo (iii) ou a uma fonte comum de uma infecccedilatildeo

Ademais segundo este mesmo autor estudos de tipagem molecular realizados sobre

isolados os quais natildeo apresentam nenhuma correlaccedilatildeo epidemioloacutegica podem

conduzir a informaccedilotildees errocircneas Portanto na tipagem molecular pela teacutecnica de

PFGE os isolados OSSA abordados neste trabalho natildeo foram analisados como um

conjunto uacutenico uma vez que satildeo provenientes de aacutereas natildeo relacionadas Desta feita

tal metodologia serviu para salientar a diversidade clonal entre os isolados de OSSA

oriundos de localidades diferentes O perfil obtido da eletroforese de campo pulsado

das cepas OSSA neste trabalho mostrou baixa relaccedilatildeo clonal entre as cepas

provenientes de uma mesma unidade hospitalar Exceccedilatildeo se fez notar entre os

isolados C3 e C5 oriundos do hospital A apresentando somente uma banda de

diferenccedila e entre os isolados C31 e C33 oriundos do hospital N apresentando duas

bandas diferentes Estas exceccedilotildees portanto poderiam estar relacionadas a um

mesmo sub-clone segundo os criteacuterios apresentados por TERNOVER et al (1995)

Segundo PEACKOC et al (2002) o nuacutemero de genes associados agrave virulecircncia

carreados por uma cepa bacteriana eacute um produto da interaccedilatildeo entre as taxas de

aquisiccedilatildeo do gene o custo para manutenccedilatildeo bioloacutegica e a taxa de falecircncia da cepa

causadora da doenccedila Como a vasta maioria das infecccedilotildees graves por

Staphylococcus aureus natildeo pode ser explicada pela accedilatildeo de somente um

determinado fator de virulecircncia eacute imperativa a accedilatildeo de vaacuterios destes fatores durante

o processo infeccioso

A sobrevivecircncia e proliferaccedilatildeo de um determinado patoacutegeno dentro de um hospedeiro

satildeo favorecidas por mecanismos que permitem a evasatildeo dos mecanismos de defesa

do hospedeiro bem como a colonizaccedilatildeo do microrganismo neste microambiente Por

conseguinte cepas que escapam mais eficientemente dos mecanismos de defesa do

hospedeiro seratildeo os tipos mais prevalentes encontradas em tal microambiente

A anaacutelise estatiacutestica de uma ampla base de dados de cepas patogecircnicas tem

fornecido informaccedilotildees importantes em relaccedilatildeo a genes ligados agrave virulecircncia de um

dado grupo prevalente destas cepas Existem evidecircncias de que alguns tipos clonais

satildeo mais virulentos que outros e que estes aparecem com uma frequumlecircncia maior

entre isolados de doentes do que em portadores sadios (MELLES et al2004)

Em trabalhos preacutevios o estudo das exotoxinas estafilocoacutecicas permitiu sua

associaccedilatildeo com algumas siacutendromes estafilocoacutecicas especiacuteficas Assim verificou-se

associaccedilotildees entre TSST-1 e a siacutendrome do choque toacutexico estafilocoacutecico (TODD et al

1985) as epidermolisinas ETA e ETB com a SSSS (PIEMONT et al 1988) a

leucocidina de Panton-Valentine (PVL) com a ocorrecircncia de furuacutenculos (PREVOacuteST et

al 1995) e a presenccedila de cepas produtoras de SEA com diarreacuteia estafilocoacutecica poacutes-

antibioacutetica (GRAVET et al 1999) Tambeacutem associou se em trabalhos preacutevios o

nuacutemero de genes de exotoxinas com o potencial virulento de certas linhagens

estafilocoacutecicas Assim YAGI et al (2004) estudando cepas de Staphylococcus

aureus isoladas de pacientes com dermatite atoacutepica ao examinar os genes de toxinas

das cepas isoladas de siacutetios anatocircmicos diferentes destes pacientes observou que a

maior parte das cepas produtoras de toxinas (SEA-SED TSST-1 ETA e ETB)

correspondia agraves cepas provenientes da aacuterea de lesotildees exsudativas (754) Todavia

observou que somente 407 das cepas isoladas das aacutereas sem lesotildees eram

produtoras das referidas exotoxinas

A habilidade de cepas de S aureus em evadir-se do sistema de defesa do hospedeiro

eacute relatada pelo menos em parte agrave capacidade de produccedilatildeo de enterotoxinas (LE

LOIR et al2003) As cepas produtoras de enterotoxinas podem ser isoladas de

diversos materiais sejam eles cliacutenicos ou natildeo A literatura mostra resultados muito

variaacuteveis com relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de cepas enterotoxigecircnicas de Staphylococcus

aureus isolados tanto de amostras cliacutenicas quanto de alimentos (ROSEC et al1997

GRAVET et al 2001) Isto eacute provavelmente devido a diferenccedilas entre os tipos de

materiais examinados nuacutemero de amostras meacutetodos de detecccedilatildeo utilizados bem

como a origem geograacutefica da cepa Entre as cepas de S aureus isoladas de

alimentos o percentual de cepas enterotoxigecircnicas eacute estimado em cerca de 25

Poreacutem tais estimativas variam em funccedilatildeo do tipo do alimento e local do estudo (LE

LOIR et al 2000) Na Franccedila entre 61 cepas isoladas de alimentos 159 foram

enterotoxigecircnica (ROSEC et al 1997) Na Repuacuteblica Eslovaacutequia de 51 cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de alimentos 392 foram positivos para

enterotoxinas (SEA - 59 SEB - 235 SEA e SEB - 98)

Aleacutem da accedilatildeo enterotoxigecircnica as enterotoxinas de S aureus tambeacutem foram

associadas a outras manifestaccedilotildees cliacutenicas Neste sentido GRAVET et al (2001)

observaram que SEB foi produzida em 52 dos isolados de pacientes com impetigo e

em 32 dos isolados de pacientes com furuacutenculos MULLARY (2001) estudando 255

cepas de S aureus isoladas de mastite bovina concluiu que o genoacutetipo mais comum

de S aureus encontrado era do tipo contra o qual os neutroacutefilos e sobretudo os

mecanismos de defesa do hospedeiro mostravam-se menos eficientes Isto sugere

que os tipos encontrados em alta prevalecircncia possuam caracteriacutesticas uacutenicas que os

auxiliam na evasatildeo do sistema imune do hospedeiro uma vez que existem dados que

confirmam a atividade de enterotoxinas de S aureus na proteccedilatildeo contra apoptose

mediada por neutroacutefilos (MOULDING et al 1999) Poreacutem existem portadores de

cepas de S aureus carreadoras de genes para enterotoxinas que natildeo apresentam

nenhuma manifestaccedilatildeo cliacutenica Em um estudo espanhol analisou-se 269 isolados

coletados da microbiota nasal de portadores saudaacuteveis e de alimentos obtendo-se

positividade para enterotoxinas em 239 das cepas provenientes de portadores e

26 das cepas provenientes de alimentos (LE LOIR et al 2003) Aleacutem disto a

frequumlecircncia do tipo de enterotoxina encontrada eacute variaacutevel existindo poreacutem um

predomiacutenio de algumas delas A literatura mostra que a SEA eacute o tipo de enterotoxina

mais encontrada em surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica LE LOIR et al

(2003) analisando-se 269 isolados coletados da microbiota nasal de portadores

saudaacuteveis e de alimentos encontrou que SEA e SEC foram as mais frequumlentes nas

amostras analisadas (97 para ambas) sendo que a menos frequumlente foi a SEB

(3) Este autor tambeacutem concluiu que SEA e SEC relacionavam-se a organismos

isolados de surtos de intoxicaccedilatildeo alimentar estafilocoacutecica Este dado eacute importante

uma vez que existe evidecircncia de transmissatildeo de portadores de tais cepas para os

alimentos MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite

bovina achou que dentre os isolados positivos para SEs 624 eram positivos para

SEA 54 para SEC 32 para SEB e 32 para SED YAGUI et al( 2004)

observaram que do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica 44

eram positivos para SEB 272 para SEA 272 para SEC e 4 para SED Neste

estudo o gene de exotoxina mais detectado correspondeu ao seb Por outro lado

SEB eacute sugerida ser o mediador a induzir a lesatildeo da dermatite atoacutepica como

superantiacutegeno por estes autores embora estes tambeacutem mencionem a importacircncia da

presenccedila das ETs em tal manifestaccedilatildeo cliacutenica Observa-se desta forma que a

frequumlecircncia de determinados tipos de enterotoxina eacute dependente do quadro cliacutenico do

hospedeiro

No atual trabalho verificou-se que 541 das cepas analisadas foram positivas para

pelo menos um gene de enterotoxina Para as amostras provenientes de alimentos

relacionados a quadros de intoxicaccedilatildeo alimentar (n=7) 100 das cepas analisadas

foi positivo para pelo menos um gene de enterotoxina servindo como controle

positivo uma vez que a sua expressatildeo jaacute havia sido previamente identificada por

testes fenotiacutepicos como a hemaglutinaccedilatildeo indireta para a determinaccedilatildeo das

enterotoxinas

Linhagens de S aureus carreadores de genes codificadores de enterotoxinas tambeacutem

satildeo encontradas em animais conforme recentes trabalhos (CARDOSO et al 1999

LARSEN et al 2000 AKINEDEN et al 2001) Em um estudo realizado em Minas

Gerais Brasil encontrou-se um valor de 43 de positividade para enterotoxinas (SEA

- SEE) em cepas de S aureus isoladas de mastite bovina (CARDOSO et al 1999)

Jaacute na Dinamarca das 414 cepas de Staphylococcus aureus isolados de mastite

bovina somente uma carregava gene para SEs (LARSEN et al2000) Na Alemanha

dos isolados de S aureus oriundos de mastite bovina 728 apresentaram-se

enterotoxigecircnicas (SEA -SEJ)( AKINEDEN et al 2001)

No presente trabalho foi constatado que o gene de enterotoxina mais frequumlente nos

37 isolados analisados foi o gene sea (405) seguido por sec (343) seb (189)

e sed (55) Por outro lado o gene see natildeo foi detectado em nenhuma cepa Com

relaccedilatildeo aos materiais analisados o maior universo foi representado por isolados de

infecccedilotildees da corrente sanguiacutenea e de alimentos Apesar da presenccedila da toxina SEB

em alimentos contaminados por enterotoxinas estafilocoacutecicas ser ressaltada por

YAGUI et al 2004 no presente trabalho nenhuma amostra de Saureus isolada de

alimentos apresentou o gene seb Com relaccedilatildeo agrave associaccedilatildeo dos genes de

enterotoxinas e o tipo de seu regulador agr houve 100 de associaccedilatildeo entre e a

presenccedila de gene sea e o agr de tipo III Dentre todas as cepas portadoras de um dos

genes de enterotoxinas estudados somente uma cepa a qual foi positiva para seb

foi enquadrada dentro do tipo agrI Desta forma conclui-se que as cepas que

apresentam genes para enterotoxinas enquadraram-se preferencialmente dentro dos

tipos de agr II e III revelando uma caracteriacutestica que pode ser inerente a

determinados paiacuteses uma vez que JARROUD et al (2001) observaram que as cepas

causadoras de doenccedilas mediadas por enterotoxinas na Franccedila pertenciam

principalmente aos grupos agr I e II

O gene tst codifica a produccedilatildeo de TSST-1 a qual eacute uma das exoproteiacutenas

estafilocoacutecicas responsaacuteveis pela TSS A TSST-1 eacute produzida em torno de 100 das

cepas de S aureus isolados de mucosa cervical ou vaginal de mulheres que

apresentaram TSS e em aproximadamente 50 dos isolados de outros siacutetios

corpoacutereos de pacientes com TSS natildeo-menstrual Por razotildees que natildeo satildeo totalmente

conhecidas certos segmentos de DNA codificadores de SAGs estafilocoacutecicos natildeo

coexistem na mesma cepa Por exemplo SEB e TSST-1 satildeo raramente produzidos

pelo mesmo isolado cliacutenico Especula-se como explicaccedilatildeo para tal fato que em

cepas portando determinados segmentos geneacuteticos (Ex SaPI1) a regiatildeo de adiccedilatildeo

para uma segunda ilha de patogenicidade (exSaPI2 ou 3) eacute modificada de tal forma a

prevenir a integraccedilatildeo da mesma no cromossoma Investigaccedilotildees adicionais deveratildeo

elucidar os mecanismos pelos quais estes elementos geneacuteticos podem excluir a

integraccedilatildeo destes elementos ldquocompetidoresrdquo (MCCORMICK et al 2001)

Dos isolados analisados no presente trabalho 25 foram positivas para tst Nos

isolados provenientes tanto do liacutequido pleural quanto do liacutequido cefalorraquidiano

todos apresentaram o gene tst Os isolados portadores do gene tst em sua maioria

(667) foram classificadas como agr tipo III sendo que somente uma pertenceu

ao agr tipo I

Isolados portadores do gene tst podem ser encontrados tanto no ambiente hospitalar

quanto na comunidade Deuremberg et al (2005) encontraram 24 dos 51

Staphylococcus aureus comunitaacuterios positivos para o gene tst enquanto 14 das 36

cepas de S aureus hospitalares foram positivos para tst Por outro lado estes autores

constataram a presenccedila de tst em 25 dos isolados de S aureus oriundos de

pacientes acometido com Granulomatose de Wegener uma doenccedila na qual o

paciente eacute debilitado pela inflamaccedilatildeo dos vasos sanguiacuteneos estipulando uma relaccedilatildeo

entre esta doenccedila e a presenccedila de tais cepas YAGUI et al (2004) observaram que

160 do universo de 81 pacientes estudados com dermatite atoacutepica eram positivos

para TSST-1 JARROUD et al (2001) relataram que em seu universo de estudo o

gene tst natildeo foi encontrado na mesma cepa portadora de LukE-LukD

Cepas portadoras de gene tst foram encontradas tambeacutem em animais como relatado

por MULLARY (2001) estudando 255 cepas de S aureus isoladas de mastite bovina

onde 43 destas cepas portavam o gene para tst

As cepas de Staphylococcus aureus produzem duas classes de toxinas bi-

componentes compostas de duas proteiacutenas de accedilotildees sineacutergicas secretadas

independentemente referidas como componentes de classe F e classe S Foram

caracterizados quatro loci codificando leucotoxinas bi-componentes em S aureus pvl

hlg LukE-LukD e lukM-LukFrsquo-PV No presente trabalho verificou-se a presenccedila dos

genes pvl hlg e lukE-lukD frequentemente citados na literatura como representantes

dos genes codificadores das toxinas bi-componentes Dentre o conjunto de cepas

analisadas 973 foram portadoras do gene hlg enquadrando-se dentro das

estatiacutesticas publicadas Alta tambeacutem foi a frequumlecircncia observada para estas cepas em

relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene lukE-lukD atingindo 9615 destas cepas

Com relaccedilatildeo agrave presenccedila do gene para pvl a frequumlecircncia encontrada foi de 194 Esta

frequumlecircncia eacute baixa em relaccedilatildeo a alguns trabalhos publicados (GRAVET et al 2001

VON EIFF et al 2004) os quais relatam a alta prevalecircncia deste gene em cepas

isoladas de pacientes com manifestaccedilotildees cutacircneas natildeo se enquadrando em nosso

grupo de estudo por serem na sua maioria isolados de liacutequidos bioloacutegicos Poreacutem tal

prevalecircncia eacute alta quando comparada agrave frequumlecircncia estipulada de 2 para as cepas

cliacutenicas que apresentam tal gene (PREVOacuteST et al 1995) Deste modo esta

frequumlecircncia relativamente alta do referido gene pode ser o reflexo de um alto potencial

de virulecircncia destas cepas Das sete cepas que se apresentaram positivas para o

gene pvl cinco (714) destas enquadraram-se dentro do tipo de agrIII e as outras

duas pertenceram aos tipos de agr I e II

O frequumlente isolamento de cepas de Staphylococcus aureus produtoras de

leucotoxinas em pacientes com lesotildees epideacutermicas necroacuteticas furuacutenculos e

osteomielites sugerem que estas toxinas desempenham um papel importante na

virulecircncia estafilocoacutecica pelo menos no que concerne agraves infecccedilotildees de pele e de

tecidos (VON EIFF et al 2004) Tal fato eacute evidenciado em isolados de

Staphylococcus aureus portadores do gene pvl de pacientes imunocompetentes os

quais apresentavam um tipo de pneumonia hemorraacutegica necrotizante altamente letal

(GILLET et al 2002)

O gene pvl eacute encontrado em torno de 2 das cepas cliacutenicas e eacute fortemente

associado com a ocorrecircncia de furuacutenculos enquanto que os genes codificadores de

gama hemolisinas satildeo encontrados em torno de 99 dos isolados cliacutenicos de S

aureus (PREVOacuteST et al 1995) GRAVET et al (2001) observaram que todas as

cepas de Staphylococcus aureus isolados de furuacutenculos eram positivas para pvl

Ademais isolados nasais de portadores deste gene podem servir como um

reservatoacuterio endoacutegeno para infecccedilotildees cliacutenicas disseminadas podendo se espalhar

para outros pacientes (VON EIFF et al 2004) Consequentemente uma estrateacutegia

para se reduzir a infecccedilatildeo hospitalar por estas cepas seria sua erradicaccedilatildeo nos

portadores nasais encontrados (ARCHER et al 2001)

A toxina LukE-LukD demonstrou ser altamente frequente (82) entre os isolados

sanguiacuteneos de Staphylococcus (VON EIFF et al 2004)

Jaacute em cepas de Staphylococcus aureus isolados de pacientes com impetigo bolhoso

a associaccedilatildeo desta manifestaccedilatildeo cliacutenica com a presenccedila leucotoxinas LukE-Luk-D foi

demonstrado em 78 do casos estudados (GRAVET et al 2001) GRAVET et al

(2001) em um estudo na Guiana mostrou a associaccedilatildeo entre cepas de

Staphylococcus aureus isoladas de furuacutenculos com a presenccedila do gene pvl o mesmo

sendo relatado para isolados de Staphylococcus aureus na Aacutefrica (BABA et al1999)

Com relaccedilatildeo agraves draacutesticas consequumlecircncias bioloacutegicas secundaacuterias aos danos em

membranas celulares originados pelas leucocidinas as quais contribuem direta ou

indiretamente para a patogecircnese da doenccedila aguda ou crocircnica os dados sobre a

epidemiologia molecular destas toxinas satildeo ainda limitados e restritos

principalmente no que se refere agraves cepas de Staphylococcus aureus isolados no

Brasil

Haacute descriccedilatildeo de duas toxinas exfoliativas sorologicamente distintas designadas

como toxina exfoliativas A e toxina exfoliativas B (ETA e ETB respectivamente)

cujos genes satildeo designados como etA e etB Cinco por cento dos isolados cliacutenicos

de Staphylococcus aureus produzem ETs (PIEMONT et al 1984) sendo que haacute

relatos de diferenccedilas geograacuteficas na frequecircncia da expressatildeo destas toxinas (LISA

2004) No presente trabalho natildeo foi encontrado nenhum isolado portador dos genes

eta e etb Tal fato fundamenta-se pela forte associaccedilatildeo das ETs com algumas

siacutendromes especiacuteficas (SSSS e impetigo bolhoso) as quais natildeo estavam dentro do

universo do material cliacutenico analisado Outro fato importante foi natildeo se encontrar

nenhum tipo de agr IV nas cepas analisadas tipo este fortemente relacionado com as

ETs

Na Ameacuterica do Norte Europa e Aacutefrica onde menos de 5 dos isolados cliacutenicos de

Staphylococcus aureus produzem ETs a ETA eacute a predominante dentre as ETs

(LADHANI 2001) Em contraste a ETB foi a mais comum relatada no Japatildeo (KONDO

et al 1975) A frequumlecircncia de genes para ETs em cepas isoladas de Staphylococcus

aureus varia conforme trabalhos publicados segundo manifestaccedilotildees cliacutenicas

especiacuteficas Em contrapartida sabe-se que a incidecircncia destas cepas em pacientes

saudaacuteveis eacute menos frequumlente (ZOLLNER et al 2000)

DANCER amp NOBILE (1991) relataram que 3 das cepas de S aureus isoladas da

cavidade nasal axila ou periacuteneo de mulheres graacutevidas eram portadoras de cepas

produtoras de ETs YAGUI et al (2004) em pacientes portadores de dermatite

atoacutepica observaram que 399 dos 81 pacientes estudados eram positivos para ETA

enquanto que 346 dos pacientes eram positivos para ETB YAMASAKI et al (2005)

relataram que em 103 crianccedilas com SSSS generalizada as cepas de S aureus

isoladas apresentavam pelo menos um gene de eta ou etb 30 eram infectadas com

isolados que carreavam somente eta 19 carreavam somente etb e 51 carreavam

ambos os genes GRAVET et al (2001) em um estudo na Guiana mostrou que

isolados de Staphylococcus aureus de pacientes com impetigo produziam ETs em

86uml

Ademais foi relatado uma forte associaccedilatildeo entre as ETs com o tipo agr IV (JARRAUD

et al2000)

No presente trabalho aleacutem da Gama-hemolisina jaacute descrita junto com as toxinas bi-

componentes verificou-se a presenccedila das alfa e beta-hemolisinas Estas hemolisinas

satildeo frequentemente encontradas nas cepas de Staphylococcus aureus ARESTRUP

et al(1999) observaram que das cepas de Staphylococcus aureus isolados de

portadores sadios 56 carreavam o gene para beta-hemolisina e naquelas isoladas

de pacientes com bacteremia 57 carreavam este gene O gene para alfa hemolisina

foi encontrado em todas as cepas analisadas

Em nosso trabalho 100 das cepas analisadas apresentaram o gene da alfa-

hemolisina consoante com trabalhos de ARESTRUP et al(1999)

Para o gene codificador para beta-hemolisina encontrou-se uma positividade de

784 nos isolados analisados sendo que especificamente nos isolados de

alimentos encontrou-se uma alta positividade para este gene (857)

Considerando-se as muacuteltiplas formas e siacutetios das infecccedilotildees estafilocoacutecicas eacute natural

que estas bacteacuterias sejam bem equipadas com sensores que lhes indiquem as

condiccedilotildees de seu microambiente e regulem a expressatildeo dos fatores de virulecircncia

possibilitando-as colonizar dificultar as defesas imunoloacutegicas multiplicar e

dispersarem-se pelo organismo do hospedeiro ( GRAVET et al2001) A expressatildeo

da maioria dos fatores de virulecircncia em Staphylococcus aureus eacute controlada pelo

locus agr o qual codifica uma cascata regulada por dois componentes cujo ligante

ativador eacute um peptiacutedeo sensor de densidade bacteriana (peptiacutedeo auto-indutor)

tambeacutem codificado pelo agr (NOVICK et al2000) Baseando-se no polimorfismo da

sequumlecircncia de aminoaacutecidos do peptiacutedeo auto-indutor e seu correspondente receptor

(AgrC) pode-se dividir as cepas de Staphylococcus aureus em quatro grupos

principais Associaccedilotildees entre um tipo peculiar de agr e uma siacutendrome estafilocoacutecica

especiacutefica foi demonstrada para Siacutendrome do choque Toacutexico (TST) e a Siacutendrome da

Pele Escaldada (SSSS) Em trabalhos anteriores observou-se que isolados

produtores de TSST-1 enquadravam-se principalmente dentro do grupo agr III (JI et

al1997) Cepas produtoras de esfoliatina responsaacuteveis por SSSS pertencia ao

grupo agr IV (JARRAUD et al 2000) Em estudo de VAN LEEUWEN et al 2000

abrangendo 192 cepas de Staphylococcus aureus isoladas de portadores observou-

se a prevalecircncia do grupo agrI sendo que a maioria das quais foram resistentes a

meticilina

JARROUD et al (2001) observaram que as cepas causadoras de doenccedilas mediadas

por enterotoxinas pertenciam principalmente aos grupos agr I e II e III e que a

distribuiccedilatildeo dos tipos agr nas cepas estudadas foram I (436) II (280) III (247)

IV(33) MOORE et al (2001) estudando MSSA acharam a seguinte prevalecircncia

dos tipos de agr I (61) II (26) e III (13) e relataram tambeacutem a associaccedilatildeo do

tipo de agr III com tst natildeo encontrando esta toxina juntamente com seb em uma

mesma cepa

Em nosso estudo a maioria dos isolados OSSA analisados enquadraram-se dentro

do agr de tipo III (622) O restante ficou igualmente distribuiacutedo entre os tipos de agr

I e II (189 cada) Observa-se desta feita que as cepas de Staphylococcus aureus

sensiacuteveis agrave oxacilina isoladas no Brasil utilizadas neste estudo devido ao

predomiacutenio do tipo de agr III (622) destoa-se de trabalhos publicados em outros

paiacuteses como o predomiacutenio do agr tipo I( 436) em cepas Staphylococcus aureus

observado na Franccedila( JARROUD et al 2001) e na Inglaterra (MOORE et al 2001)

Com relaccedilatildeo ao tipo de material cliacutenico os dois isolados provenientes de liacutequido

pleural enquadraram-se dentro do tipo de agr I enquanto que os dois isolados

provenientes de liacutequido cefalorraquidiano enquadraram-se dentro do tipo de agr III

Este tipo de agr correspondeu a maioria dos isolados de hemoculturas(577) e de

alimentos (714) Portanto o agr tipo- III mostrou-se o mais frequumlente entre os

isolados provenientes dos diferentes materiais cliacutenicos analisados com exceccedilatildeo da

observada nas cepas provenientes de liacutequido pleural

Curiosamente 100 das cepas portadoras do gene sea pertenceram ao tipo de agr

III chamando atenccedilatildeo especial para esta associaccedilatildeo A mesma relaccedilatildeo de

predomiacutenio do tipo de agr III foi observado para os demais genes analisados pvl

(714) lukE-lukD (629) hla (628) hlb (689) hlg(612)

Consoante com MOORE et al (2001) o gene tst pertenceu em sua maioria ao tipo

de agr III(667)

Verificou-se portanto que os Staphylococcus aureus podem usar combinaccedilotildees de

diversos fatores de virulecircncia os quais podem resultar em uma siacutendrome cliacutenica e

possivelmente contribuir para a dispersatildeo bacteriana no organismo do hospedeiro

Determinados genes acessoacuterios codificadores de exoproteiacutenas podem ser usados

como marcadores potenciais de virulecircncia para tais cepas como eacute o caso dos genes

seb sea tst e pvl os quais foram encontrados com frequumlecircncia relevante nestes

estudos Ademais o tipo de agr III pode ser considerado um potencial representante

de cepas OSSA bem sucedidas no ambiente hospitalar e ou comunitaacuterio

6 Conclusotildees

O presente trabalho mostrou que a frequumlecircncia dos genes codificadores de exotoxinas

dependeu de variaccedilotildees decorrentes de alguns fatores como por exemplo natureza

da fonte de isolamento da cepa e localizaccedilatildeo geograacutefica O gene codificador de

enterotoxina mais frequumlentemente determinado foi sea seguido por sec e 100 das

amostras portadoras do gene sea estavam relacionadas com agr de tipo III

Observou-se resultados divergentes aos estudos realizados em outros paiacuteses como o

encontro de isolados contendo genes codificadores de seb e tst (33) correlaccedilatildeo

esta que a literatura pesquisada julgava natildeo ser frequumlente o mesmo acontecendo

para a presenccedila simultacircnea de tst e lukE-lukD

Natildeo se encontrou isolados portadores de toxinas esfoliativas tampouco genes com o

agr de tipo IV no universo estudado

Apesar do baixo universo de isolados oriundos de LCR (n=2) e Liacutequido Pleural (n=2)

observou-se que todos estes isolados foram positivos para pvl indicando que em

infecccedilotildees invasivas eacute possiacutevel a participaccedilatildeo das leucocidinas do tipo Panton-

valentine A frequumlecircncia relativamente alta (14) de isolados portadores deste gene

encontradas neste trabalho parece ressaltar a participaccedilatildeo da leucocidina PVL no

incremento da virulecircncia de tais isolados

A maioria (62) dos isolados analisados foram portadores do tipo de agr III

divergindo de resultados publicados em outros paiacuteses que relatam um predomiacutenio de

agr I

Conclui-se portanto que as bases moleculares da patogenicidade do S aureus eacute

multifatorial dependendo natildeo somente da presenccedila como tambeacutem da expressatildeo de

vaacuterios genes acessoacuterios Desta feita observa-se que as infecccedilotildees graves

desencadeadas por estas bacteacuterias satildeo o produto do somatoacuterio de vaacuterios fatores de

virulecircncia codificados por tais genes Neste contexto torna-se de suma importacircncia o

conhecimento do perfil genotiacutepico apresentado pelas cepas de S aureus isoladas

frequumlentemente de determinada localidade podendo-se com isto natildeo somente prever

manifestaccedilotildees cliacutenicas decorrentes de uma possiacutevel dispersatildeo como tambeacutem

encontrar mecanismos que auxiliem no controle das mesmas

7 Referecircncias Bibliograacuteficas

AMAGAI M YAMAGUCHI T HANAKAWA Y NISHIFUGI K SUGAI M STANLEY JR Staphylococcal exfoliative toxin B specifically cleaves desmoglein 1 J Invest Dermatol V 118 p 845-850 2002

AKINEDEN ordm ANEMULLER C HASSAN AA LAMMLER C WOLTER W ZSCHOC M Toxin genes and others characteristics of Staphylococcus aureus isolates from milk of cows with mastitis Clin Diagn Lab immunol v 8 p 959-9642001

ARCHER GL Staphylococcus aureus a well-armed pathogen Clin Infect Dis v 26p 1179-1181 1998

ARCHER GL CLIMO MW Staphylococcus aureus bacteremia ndash consider the source N Engl J Med V344 p 55-56 2001

ARESTRUP FMLARSEN HD ERIKSEN NH ELSBERG CS JENSEN NE Frequency of alpha- and beta haemolisin in Staphylococcus aureus of bovine and human origin A comparison between phenol- and genotype and variation in phenotypic expression APMIS V107 p425-430 1999

BALABAN N GOLDKORN T GOV T HIRSHBERG M KOYFMAN N MATHEWS HR NHAN RT SINGH B UZIEL O regulation of Staphylococcus aureus pathogenesis via target of RNA-III-activating protein (TRAP) J Biol Chem v 276 p 2658-2667 2001

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF ROBBINS NR DAVIS JP A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with the Toxic Shock syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet j v8228 1017-1027 1981

BHAKDI S TRANUM JJ Alpha-toxin of Staphylococcus aureus MicrobiolReview v 55 p733 1991

BHAKDI S MUHLY M MANNHARDT U et al Staphylococcal alpha-toxin promotes blood coagulation via attack on human platelets J Exp Med v168 p527 1988

BERGDOLL MS CRASS BA REISER RF et al A new staphylococcal enterotoxin enterotoxin F associated with Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus isolates Lancet v1 p1017 1981

BERNHEIMER AW RUDY B Interactions between membranes and cytolytic peptides Biochim Biophys Acta v864 p123 1986

BETTLEY MJ BORST DW REGASSA LB Staphylococcal enterotoxins toxic shock sindrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins A comparative study of their molecular biology Chem Immunol v 55 p 1-35 1992

BETLEY MJ MEKALANOS JJ Staphylococcal enterotoxin A is encoded by phago Science v 229 p 185-187 1985

MOUSSA BL SANNI A DAGNRA AY ANAGONOUS DAVID MP et al Approche eacutepideacutemiologique de lrsquoantibioreacutesistance et de la proction de leucotoxines par lecircs souches de Staphylococcus aureusisoleacutees em Afrique de lrsquoOuest Med Mal Infect V 29 p689-696 1999

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pirogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses Crit Rev Microbiol v 17p 251-2721990

BOHACH GA FOSTER TJ Gram-Positive Pathogens American Society for Microbiology p 367-378 2000

BOHACH GA FAST DJ NELSON RDSCHLIEVERT PM Staphylococcal and Streptococcal pyrogenic toxins involved in toxic shock syndrome and related illnesses CRC Crit Rev Microbiol v17 p251 1990

BOYCE JM The staphylococci in human disease Epidemiology and prevention of nosocomial infections Churchill Livingstone New York NY p 309-329 1997

BRMLEY AJ PATEL HA REILLY MO et al Roles of alpha-toxin and beta-toxin in virulence of Staphylococcus aureus for the mouse mammary gland Infect Immun v 57 p 2489 1989

CALLEGAN MC ENGEL LS HILL JM OrsquoCALLAGHAN RJ Corneal virulence of Staphylococcus aureus roles of alpha-toxin and protein A in pathogenesis Infect Immun v62 p2478 1994

CARDOSO HF SILVA N SENAMJ CARMO LS Production of enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brasil Lett Appl Microbiol v29 p 347-349

COONEY J KIENLE Z FOSTER TJ OrsquoTOOLE PW The gama hemolysin locus of Staphylococcus aureus comprises three linked genes two of which are identical to the genes form F and S components of leucocidin Infect Immun v61 p768 1993

CORKILL EJANSON JJ GRIFFTS P HART CA Detection of elements of the Staphylococcal cassette chromosome in a methicillin susceptible (mec A gene negative) homologue of a fucidin-resistant MRSA Journal of Antimicrobial Chemottherapy v54 p 229-2312004

DANCER SJ NOBLE WC Nasal axillary and perineal carriage of Staphylococcus aureus among women identification of strais producing epidermolytic toxin J Clin Pathol V44 p681-684 1991

DAY NPJ MOORE CE ENRIGHT MC BERENDT AR SMITH JM MURPHY MF PEACOCK SJ SPRATT PG FEIL EJ A link between virulence and ecological abudance in natural populations of Staphylococcus aureus Science v 292p 114-116 2001

DEURENBERG RH NIEUWENMHUIS RF DRIESSEN C LONDON N STASSEN FR VAN TIEL FH et al The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital- acquired strains and isolates from Wegenerrsquos Granulomatosis patients FEMS Microbiol Lett V245 p 185-189 2005

DINGES MM ORWIN PM SCHLIEVERT PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol v 13 p16-34 2000

FiNK D CONTRERAS ML LELKESPI LAZAROVICIP Staphylococcus aureus alpha-toxin activates phospholipases and induces a Ca2+ influx in PC12 cells Cell Signal V1(4) P 387-393 1989

FTZGERALD JR MONDAY SR FOSTER TJ BOLACH Gordf HARTIGAN PJ et al Characterization of putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens J Bacteriol v183 p63-70 2001

FITZGERALD JR STURDEVANT ED MACKIE SMGILL SR MUSSER JM Evolutionary genomics of Staphylococcus aureus Insights into the origin of methicillin-

resistant strains and the toxic shock syndrome epidemic PNAS V98 p8821-8826 2001

GEMMEL CG Staphylococcal scalded skin syndrome J Med Microbiol V 43 p 318-327 1995

GILLET Y ISSARTEL B FOURNET JC LINA G BES M et al association between Staphylococcus aureus strains carrying gene for Panton-Valentine leucocidin and highly lethal necrotizing pneumonia in young immunocompetent patients Lancet V359 p 753-759 2002

GOTTILIEB GS FOWLER VG KANG LK Staphycoccus bacteraemia in the surgical patient a prospective analysis of 73 postoperative patients who developed Staphylococcus aureus bacteraemia at a tertiary care facility J Am Coll Surg v 190p 50-57 2000

GRAVET A COLIN DA KELLER D GIRADOT R MONTEIL H PREVOacuteST G Characterization of a novel structural member LukE-LukD of the bi-component staphylococcal leucotoxins family FEBS Lett V 436 p 202-208 1998

GRAVET A RONDEAU M MONTEacuteIL CH GRUNEMBERGER F MONTEIL H et al Predominat Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant an produces enterotoxin Aand the bicomponent toxin LukE-LukD J Clin Microbiol V 37 p 4012-4019 1999

GRAVET A COUPPIE P MEUNIER O et al Staphylococcus aureus isolated in cases of impetigo produces both epidermolisin A or B and LukE-Lukd in 78 of 131 retrospective and prospective cases J Clin Microbiol V 39 p 4349-4356 2001

HARRIS TO BETLEY MJ Biological activities of staphylococcal enterotoxin type A mutants with N-terminal substituitions Infect Immun v63 p2133 1995

HARRIS TO GROSSMAN D KAPPLER J W MARRACK P RICK RR BETLEY MJ et al Lack of complete correlation emetic and T-cell-stimulatory activities of staphylococcal enterotoxins Infect Immun v 61 p 3175-3183 1993

HELALI NE CARBONNE A NAAS T KERNEIS S FRESCO O GIOVANGRANDI Y et al Nosocomial outbreak of staphylococal scalded skin syndrome in neonates Epidemiological investigation and control J Hosp Infect V 20 p1-9 20005

HERNANDEZ FJ GOYACHE J ORDEM JA BLANCO JL DOMENECH ordf SUAREZ G et al Repair and enterotoxin syntesis by Staphylococcus aureus after tthermal shock Appl Environ Microbiol v 59 p 1515-1519 1993

HERZER CM Toxic shock syndrome Broadening the differential diagnosis J Am Board Fam Pract V 14 p 131-136 2001

HOLEKOVA B HOLODA E FOTTA M KALINASKOVA V GONDOL J GROLMUS J Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in foood Ann Agric Environ Med v9 p 179-182 2002

HOLMBERGSD BLAKE PA Staphylococcal food poisoning in the United States New facts and old misconceptions JAMA v251 p487 1984

JARRAUD S LYON G J FIGUEIREDO AM LINAG VANDENESCH F ETIENE J MUIRTW NOVICK RP Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specificity group in Staphylococcus aureus J Bacteriol v182 p6517-6522 2000

JARRAUD S PEYRAT MA LIM A TRISTAN A BES M et al A high prevalent operon of enterotoxin gene forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus J Immun v 166 p 669-677 2001

Jarraud S Mougel C Thioulouse J Lina G1 Meugnier H Forey F Nesme X Etienne J Vandenesch F Relationships between Staphylococcus aureus Genetic Background Virulence Factors agr Groups (Alleles) and Human Disease Infect Immun v70 p631ndash6412002

JI G BEAVIS R NOVICK RP Bacterial interference caused by autoinducing peptide variants Science v276 p2027-2030 1930

JONAS D WALEV I BERGER Tet al Novel path to apoptosis small transmembrane pores created by staphylococcal alpha-toxin in T limphocytes evoke internucleosomal DNA degradetion Infect Immun v 62 p13041994

KANZAKI H UEDA M MORISHITA Y AKIJIAMA H ARATA A KANZAKI S Producibility of esfoliative toxin and Staphylococcus coagulase types of Staphylococcus aureus strais isolated from skin infections and atopic dermatitis Dermatol V195 p 6-9 1997

KAPER JB KACKER J Pathogenicity islands and other mobile virulence elements ASM Press Washington DC 1999

KONDO I SAKURAI S SARAI Y FUTAKI S Two serotypes of exfoliatin and their distribution in staphylococcal strains isolated from patients with scalded skin syndrome J Clin Microbiol V1 p 397- 400 1975

LADHANI S JONNOU CL LOCHRIE DP EVANS RW POSTON SM Clinical microbial and biochemical aspects of the esfoliative toxins causing Staphylococcal scalded Skin Syndrome Clin Microbiol Rev v12 p224-242 1999

LADHANI S Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrome Clin Microbiol Infect v7 p 301-307 2001

LAN R REEVES PR Intraspecies variation in bacterial genomes the need for a species genome concept Trends Microbiol v 8p 396-401 2000

LARSEN HD HUDA A ERIKSEN NHR JENSEN NE Differences between Danish bovine and human Staphylococcus aureus isolates in possession of superantigens Vet Microbiol v 76 p 153-162 2000

LE LOIR I BARON F GAUTIER M Staphylococcus aureus and food poisoning Genet Mol Res v2 p 63-76 2003

LEE CY SCHIMIDT JJ WINEGAR JAD et al Sequence determination of the exfoliative toxin a and toxin b genes from Staphylococcus aureus J Bacteriol v169 p3904 1987

LINDSAY JA RUZIN A ROSS HF KUREPINA N NOVICK NP The gene for toxic shock toxin is carried by a family of mobile pathogenicity islands in Staphylococcus aureus Mol microbiol v29 p 527-543 1998

LISA RW Staphylococcus aureus exfoliative toxins How they cause disease Derm Foundat V122 p 1070-1077 2004

MACKENZIE A JOHNSON WBH NORRISH B JAMIESON F A prolonged outbreak of esfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a Newborn Nursery Diagn Microbiol Infect Dis V 21 p69-75 1995

MARR JC LYON JD ROBERSOM JR et al Characterization of novel type c staphylococcal enterotoxins Biological and evolutionary implications Infect Immun v61 p4254 1993 MAYVILLE P JI G BEAVIS R YANG H GOGERM NOVICK RP MUIR TW Struture-activity analysis of synthetic autoinducing thiolactona peptides from Staphylococcus aureus responsible for virulence Proc Natl Acad Sci USA v96 p1218-1223 1999

MARRACK P KAPPLER J The Staphylococcus enterotoxins and their relatives Science p 248-705 1990

McCORMICK JK YARWOOD JM SCHLIEVERT PM Toxic shock syndrome and bacterial superantigens an update Annu Ver Microbiol v55 p 77-104 2001

MELLES D C GORKINK R F BOELENS HA SNIJDERS SV PEETERS J K MOORHOUSE MJ VAN DER SPEK P J VAN LEEUWEN WB SIMONS G VERBRUGH HA VAN BELKUM A Natural population dynamics and expansion of pathogenic clones of Staphylococcus aureus J Clin Invest v 114 p1732-1740 2004

MELZER M EYKYN SJ GRANSDEN WR CHINN S Is methicilin-resistent Staphylococcus aureus more virulent than methicilin-susceptible S aureus A comparative cohort study of Britsh patients with nosocomial infection and bacteremia Clin Infecti Dis v 37p 1453-1460 2003

MOULDING D A WATER C HART CA EDWARDS S W Effects of Staphylococcal enterotoxins on human neutrophil functions and apoptosis Infect immun v67 p 2312-2318 1999

MOORE PCL LINDSAY JA Genetic variation among hospital isolates of methicilin-sensitive Staphylococcus aureus evidence for horizontal transfer of virulence genes J Clinl Microbiol v 39 p2760-2767 2001

MUNSON SH TREMAINE LT BETLEY MJ WELKRA Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus Infect Immun v66 p 3337-3348 1998

MULLARY IK SU C FRIEZE N PARK YH SORDILLO LM Staphylococcus aureus agr genotypes with enterotoxin production capabilities can resist neutrophil bactericidal activity v 69 p45-51 2001

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORIAL STANDARDS (NCCLS) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing M100-S11 v 21 2003

NOVICK RP Patogenicity factors and their regulation In FischettiV A Novick R P Ferretti JJ Portnoy DA Rood JJ Gram-positive pathogens ASM Washington DC p 392-407 2000NOVICK RP Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence Mol Microbiol V 48 p 1429- 1449 2003

PARRILO JE Pathogenetic mechanisms of septic shock N Engl J M v329 p1427 1993

PENG HL NOVICK RP KREISWIRTH B et al Cloning characterization and sequence of an accessory gene regulator (agr) in Staphylococcus aureus J Bacteriol v170 p4168 1994

PIEMONT Y RIFAI S MONTEacuteIL H Les esfoliatines de Staphylococcus aureus Bull Inst V 86 p 263-296 1988