estudo da síntese convergente de peptídeos em fase sólida

UZGORUIZCÉSAR MANUEL

"Estudo da síntese convergente depeptídeos elTl fase sólida:

abordagelTl clássica e uso detelTlperat a alta"

Dissertação de Mestrado submétida ao Instituto de Química daUniversidade de São Paulo como parte dos re::IulSi necessários à obtenção dograu de Mestre em Ciências - Área: Bioquímica.

Aprovado por:

rf~--P-ro-fa-.D-ra-.-M-AR-I-A~ÊSA MACHINI DE MIRANDA

IQ-USP(Orientadora e Presidente)

Prof. Dr. CLÓVIS RYUICHI NAKAIEUNIFESP

SÃO PAULO12 DE DEZEMBRO 2003.

DEDICATÓRIA

A meus pais Alberto Remuzgo e Elba Ruiz pelo apoio queme deram desde o inicio da minha vida, pelo amor,carinho e compreensão que deles recebi e pelo grandeesforço que realizaram para me dar educação.

Não os vou defraudar.

A meus irmãos Alberto, Jaime, Orlando, Freddy eSandra pelos momentos vividos na infância e pelo apoioque recebi deles quando tanto precisava.

A meus sobrinhos Alonsito e Betito, a quem quero muitoe desejo servir de exemplo.

À Paola, minha futura esposa e adorável companheira.Obrigado pelo amor, carinho e paciência que me brinda,pelos bons e maus momentos que vivemos e pelo apoio efortalecimento que recebi quando tanto precisava.

A Armando Alvarez e Vi/ma Flores, pais de Paola, pelocarinho, amizade, confiança, ajuda e apoio que delesrecebi.

AGRADEÇO

À minha orientadora Pro! Dra. Maria Terêsa Machinide Miranda pela oportunidade que me dá de trabalharno seu laboratório, pelos conhecimentos recebidos dia adia que me fazem crescer de forma intelectual e humana,pela sua amizade, carinho e apoio diário.

Ao Pro! Dr. Antonio de Miranda pela ajuda, incentivo eapoio para realizar muitas de minhas análises.

À Alessandra Machado, Cleber w: Liria, PatrícÚl Barrientos Proti,Giuliano Carlone Xavier e Renata Moura pela amizade, confiança, apoio,ajuda, sugestões e por me fazer sentir rIO laboratório como se estivesse emmeu lar junto à minha família.

Aos alunos de iniciação científica Nicolas Nishikido e Rafael Chiou pelaamizade e ajuda no laboratório.

Ao Clécio, Fernanda, Lídia e Gláucia pelo auxilio na utilização doespectrômetro de massas multiusuário do Bloco 12 Inferior.

À Prof Dra. Carla Columbano pela amizade e ajuda nos esclarecimentosnos temas sobre Biologia Molecular.

Aos meus amigos peruanos e brasileros Celso, Miryam, Elianita, Andréita,Miguel, Glenda, Miguelito, Juan, Luis Fernando, Karem, Diego, Andréa,Fernando, Julio, Ricardo, Shila, Eduardo, Erik, Cesty, e o futuro peruanoque esta por nascer Diogo Erik.

À Daniela, Roberto e Juliana, pessoal amigo do laboratório da Prof CarlaColumbano.

Aos integrantes do time "La Mafia". Espero que o próximo ano consigamospassar à seguinte fase do TORQUIM.

Ao bandejão por aliviar minha fome nos almoços e às vezes no jantar

À FAPESP pelo apoio financeiro a nosso laboratório e projetos

E ao CNPq pela bolsa recebida.

LISTA DE ABREVIAÇÕES

As abreviações utilizadas estão de acordo com as recomendações da "IUPAC

IUB Comission on Biochemical Nomenclature" (J. Bio/. Chem., 264: 668-673, 1989).

ACN: acetonitrila

AeOH: ácido acético

Boe: terc-butiloxicarbonil

BOP: hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)fosfônio

2-Br-Z: 2-bromo-benziloxicarbonil

Bzl: benzil

2-CI-Z: 2-c1oro-benziloxicarbonil

2-CI-Trt: 2-cloro-tritil

DBU: 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undeca-7-eno.

DCM: diclorometano

DCP: dicetopiperazina

DIC: diisopropilcarbodimida

DIPEA: N,N'-diisopropiletilamina

DMF: N,N'-dimetilformamida

DMS: dimetilsulfeto

DMSO: dimetilsulfóxido

EDC: 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida

ESI-MS: Espectrometria de massas de ionização por electrospray

EtOH: etanol

Fm: 9-f1uorenilmetil

Fmoe: 9-f1uorenilmetiloxicarbonil

GS: grau de substituição

HATU: hexafluorofosfato de 2-(1-H-7-azabenzotriazol-1-il)-1 ,1 ,3,3-tetrametil-urônio

hCCK-33: Colecistocinina-33 humana

HOBt: 1-hidroxibenzotriazol

HODhbt: 3-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina

HF: Fluoreto de hidrogênio

KOR: resina oxima de Kaiser

LC/ESI-MS: cromatografia líquida em interface com espectrometría de massas de

ionização por electrospray

MBHA: 4-metilbenzidrilamina

MeBzl: 4-metilbenzil

MeOH: metanol

OcHex: ciclohexil

NMP: N-metilpirrolidona

Pmc: 2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonil

RP-HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência em fase inversa

SCPFS: Síntese convergente de peptídeos em fase sólida

SPFS: Síntese de peptídeos em fase sólida

StBu: terc-butilsufenil

TBTU: tetrafluoroborato de 2-(1-H-benzotriazol-1-i1)-1,1,3,3-tetrametilurônio

tBu: terc-butil

TEA: trietilamina

THF: tetraidrofurano

TIC: cromatograma de íons totais

TFA: ácido trifluoroacético

TFE: trifluoroetanol

Tos: tosil

Trt: tritil

íNDICE

RESUMO..................................................................................................... X

ABSTRACT.................................................................................................. XII

1. INTRODUÇÃO........................................................... 1

1.1. Importância dos peptideos................................... 1

1.2. Breve história da síntese de peptídeos................... 1

1.3. Métodos de síntese de peptideos......................... 4

1.3.1. Síntese química........................................... 5

1.3.2. Síntese enzimática , 5

1.3.3. Síntese via tecnologia do DNA recombinante.............. 8

1.4. Síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS)............................................. 9

1.5. Síntese convergente de peptídeos em fase sólida (SCPFS)......................... 13

1.6. SPFS em temperatura alta...................................... 18

1.7. Colecistocinina.................................................... 20

1.8. Gomesina........................................................... 21

2. OBJETiVOS................................................................ 23

3. MATERIAIS E MÉTODOS.............................................. 24

3.1. Materiais.............................................................. . 24

3.1.1. Resinas.......................... 24

3.1.2. Agentes ativadores ou acopladores..... 24

3.1.3. Reagentes e solventes '" 24

3.2. Métodos preparativos... :........................................................................ 25

3.2.1. Síntese das peptidil-resinas............................ 25

3.2.1.1. Procedimento geral para a síntese da peptidl-KOR.................. 25

3.2.1.2. Procedimento geral para as sínteses das peptidil-MBHA............ 27

3.2.1.3. Procedimento geral para a síntese da peptidl-resina 2-CI-Trt...... 28

3.2.1.4. Desproteção total e clivagem das resinas.. 29

3.2.2. Obtenção dos fragmentos protegidos a serem empregados na sínteseconvergente em fase sólida................................................................ 30

3.2.2.1. Desligamento da KOR........ .. .. 30

3.2.2.2. Desligamento da 2-CI-Trt..................................................... 31

3.2.3. Determinação do grau de inchamento ou solvatação das peptidil-resinas sintéticas ,. 31

3.2.4. Sínteses convergentes em temperatura ambiente e a 60°C.................. 32

3.2.4.1. Acoplamento de Boc-K(2-CI-Z)APS(Bzl)G-OH (FIII-OH) a H2ND(OcHex)PS(Bzl)H(Tos)R(Tos)IS(Bzl)D(OcHex)R(Tos)D(OcHex)Y(2-Br-Z)MGWMD(OcHex)F-MBHA (FI-MBHA) :.... 32

3.2.4.2. Acoplamento de Boc R(Tos)C(StBu)VT(tBu)Y(tBu)C(StBu)R(Pmc)G-OH (FIIGOM-OH) a H2NR(Tos)QC(MeBzl)R(Tos)R(Tos)LC(MeBzl)Y(2-Br-Z)K(2-CI-Z)E(MBHA)-OFm (FIGOM-MBHA) .

333.3. Métodos analíticos.. 33

3.3.1. Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC)...... 33

3.3.2. Análise de aminoácidos..... .. 33

3.3.3. Medidas espectrofotométricas........................................ 34

3.3.4. Espectrometria de massas............................................................ 34

4. RESULTADOS E DiSCUSSÃO......................... 35

4.1. Sintese das peptidil-resinas desejadas..................................... 36

4.1.1. Estudo preliminar da obtenção das peptidil-resinas relativas àcolecistocinina-33 não sulfatada............... . 38

4.1.2. Obtenção das peptidil-resinas relativas à colecistocinina-33 nãosulfatada.................................................................................... 45

4.1.3. Obtenção de peptidil-resinas derivadas do [Gln]1-gomesina.. 49

4.1.4. Determinação dos graus de solvatação das peptidil-resinas sintetizadas. 50

4.1.5. Geração de fragmentos protegidos que funcionariam como doadores deacila.......................................................................................... 52

4.1.5.1. Hidrólise da ligação éster de oxima catalisada por DBU, NaOHou assistida por ions cálcio....................................................... 56

4.1.6. Acoplamento dos fragmentos protegidos (doadores de acila) às peptidil-MBHA (receptores de acila)........................................................... 65

4.1.6.1. hCCK-33 não sulfatada......................................... 65

4.1.6.2. [Gln1] gomesina................................................................. 84

5. CONCLUSÕES............................................................................ 97

6. REFER~NCIAS BIBLIOGRÁFiCAS.................................................. 98

x

RESUMO

A síntese de peptídeos em fase sólida passo a passo (SPFS) tem sido aplicada

com sucesso na preparação de peptídeos curtos, médios e de determinados

sequências contendo mais de 30 resíduos. Entretanto, esta apresenta problemas e

limitações que podem ser contornados pela síntese convergente de peptídeos em fase

sólida (SCPFS) que se baseia na condensação entre fragmentos peptídicos NU_

acHados protegidos em suas cadeias laterais (doadores de aeiJa) a fragmentos

protegidos ligados a um suporte polimérico (receptores de aeiJa).

Além de desenvolver outros projetos enfocados na síntese de peptídeos ou no

uso de sintéticos para o estudo de peptídeos biologicamente ativos ou proteinas, o

nosso grupo de pesquisa tem se dedicado a estudar o emprego de temperaturas altas

em SPFS. O objetivo final é propor protocolos ágeis alternativos aos empregados

classicamente. Neste trabalho nos propusemos a investigar alguns aspectos da SCPFS

e a explorar a possibilidade de agilizá-Ia a 60°C. Para tanto, empregamos como

modelos a colecistocinina-33 humana (hCCK-33) não sulfatada e o análogo [Gln1]_

gomesina.

As seqüências destes peptídeos foram divididas em: doadores de acila

(fragmentos central e N-terminal da hCCK-33 não sulfatada de 11 e de 5 resíduos, .

respectivamente, e N-terminal de 8 resíduos do [Gln1]-gomesina) e receptores de acila

(fragmentos C-terminais da hCCK-33 não sulfatada de 17 resíduos e do [Gln1]_

gomesina de 10 resíduos).

As peptidil-resinas correspondentes foram sintetizadas manualmente por SPFS

passo a passo e caracterizadas por análise de aminoácidos para determinação de seus

graus de substituição. Suas propriedades de solvatação em diferentes sistemas de

solventes foram também examinadas. Análises por RP-HPLC e LC/ESI-MS dos

peptídeos brutos obtidos após clivagem das resinas e desproteção total permitiram

avaliar as sínteses realizadas.

Os doadores de acila foram então gerados a partir das peptidil-resinas

empregando procedimentos conhecidos (catálise por DBU ou NaOH) e um proposto por

nós (assistência por íons metálicos).

Finalmente, os acoplamentos entre os doadores e receptores de acila foram

realizados a 37 e 60°C empregando sistemas de solventes adequados à solvatação

dos receptores de acila e diferentes reagentes acopladores. As peptidil-resinas

XI

alongadas foram analisadas em seu conteúdo de aminoácidos e submetidas à clivagem

e desproteção total para liberação dos peptídeos brutos correspondentes. Estes foram

submetidos à análise comparativa usando RP-HPLC e LC/ESI-MS.

Os resultados obtidos neste primeiro trabalho que emprega alta temperatura na

SCPFS demonstraram que: 1) o conhecimento do grau de solvatação das peptidH

resinas auxilia na escolha do sistema de solventes a ser empregado na geração dos

doadores de adia (desligamento dos peptídeos protegidos correspondentes) e nos

seus acoplamentos aos receptores de acHa; 2) a geração de doadores de acila a partir

de peptidil-KOR não é trivial como sugere a literatura (o fragmerto 6-19 da hCCK-33 na

forma protegida não foi obtido) e deve ser melhor estudada. O tamanho e a seqüência

peptldica parecem estar diretamente relacionados à eficiência do processo; 3) o uso de

alta temperatura agiliza o processo; 4) a geração de doadores de acHa a partir de

peptidil-2-CI-Trt empregando 1%TFA em DCM e misturas AcOH:TFE:DCM é simples e

eficiente; 5) o uso combinado de DMF, do agente acoplador TBTU e de 60°C levou à

agilização dos acoplamentos convergentes realizados, fornecendo os peptldeos

desejados com boa qualidade em tempos relativamente menores; 6) vantagens e

desvantagens da SCPFS em alta temperatura devem ser melhor avaliadas; 7) a

SCPFS também apresenta limitações e problemas a serem contornados, o que

demanda exploração sistemática empregando seqüências peptldicas e resinas

variadas.

XII

ABSTRACT

Stepwise solid-phase peptide synthesis (SSPPS) has been applied successfully

for the preparation of most peptides containing up to 3D residues. However, it presents

problems and limitations. Convergent soIid-phase peptide synthesis (CSPPS) can

overcome part of them. This methodology is based on the synthesis of peptide

segments by SSPPS followed by their condensations: the Nll_ acylated protected

segments act as acyl donors and the protected segments bound to the resin as acyl

receptors. When the sequence is completed this is detached from the resin and fully

deprotected to give the crude peptide.

Besides developing other projectsfocused on peptide synthesis itself or on the

use of synthetics to study biologically active peptides or proteins, we have

systematically examined solid-phase peptide synthesis at elevated temperature.

The aim of the present work was to investigate different aspects of convergent

solid-phase peptide synthesis and examine the possibility to improve it at 6DoC. Thus,

unsulfated human cholecystokinin-33 and [Gln1]-gomesin were divided in three and two

fragments, respectively. In the first case, the acyl donors were built-up by SSPP8 on

Kaiser oxime resin while in the second peptide elongation was done on 2-CI-Trt resin.

The acyl receptor was synthesized and kept on the MBHA resin. The synthetic process

was evaluated through characterization of every peptidyl-resin by amino acid analysis

and of each crude peptide obtained from resin c1eavage/full deprotection by RP-HPLC

and LC/E81-MS.

The swelling degrees of the peptid}'1-resins were determined in various solvents

or mixtures of high boiling points. The peptidyl-KOR and peptidyl-2-CI-Trt were then

submitted to peptide detachment under a few experimental conditions in order to

release the Nll-acyl protected peptides (the acyl donors). Finally, their couplings with the

acyl receptors were carried-out at 37 and 6DoC in solvents or mixtures suitable for

peptidyl-resin solvation containing specific coupling agents. The resulting peptidyl-resins

were isolated, dried and submitted to HF treatment to release the corresponding

unprotected crude peptides, which were analysed by RP-HPLC and LC/E81-MS.

The results found indicated that: 1) lhe knowledge of the swelling properties of

the peptidyl-resins in different solvents systems is very useful in SCPFS. Indeed, it may

guide the selection of experimental conditions to be used in peptide detachment from

KOR and 2-CI-Trt and in segment condensation at elevated temperature, 2) peptide

detachment from KOR is not as trivial as described (it was impossible to release hCCK-

XIII

33 fragment 6-19 in its protected form). Further studies are certainly required to improve

it. It seems that the size and the sequence are strictly related to the process efficiency,

3) high temperature can improve it, 4) peptide detachment from 2-CI-Trt is as simple as

described, 5) combination of DMF as solvent, TBTU as coupling agent and 60°C was

suited for the segment couplings studied: the reactions were completed in relatively

short times and crude peptides of good quality were obtained, 6) this is the first attempt

to carry-out CSPFS at elevated temperature, thus its advantages and disadvantages

must be studied, 7) CSPPS al50 presents problems and limitations to overcome. Such

task requires further investigation using various resins and peptide sequences.

Introdução 1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Importância dos peptídeos

Os peptídeos são compostos de dois a dezenas de resíduos de aminoácidos

unidos entre si através de ligações peptídicas.

É comum usar o termo peptídeo quando se refere a uma proteína. Entretanto, a

distinção entre eles é clara: enquanto os peptídeos contêm menos resíduos de

aminoácidos e em água a maioria não possui uma estrutura terciária definida, as

proteínas possuem mais aminoácidos e estrutura terciária bem definida em água

(Bailey, 1990).

Os peptídeos são produzidos por todos os seres vivos. A principal explicação

para o interesse em estudar peptídeos se encontra nas suas propriedades

farmacológicas. De fato, muitos têm sido isolados de glândulas de vertebrados,

bactérias, fungos, insetos, pele de anfíbios, plantas e venenos de serpentes e exercem

uma grande variedade de funções específicas como: ação como mensageiros químicos

ou hormônios no sentido estrito, mediadores intra- ou extra-celulares, ação

antimicrobiana, estimuladores e inibidores altamente específicos, ou ainda, ação no

sistema nervoso central (Wieland, 1995).

Muitos peptídeos podem ser facilmente isolados das diversas fontes biológicas

no seu estado puro e com bons rendimentos. Entretanto, muitas vezes a obtenção por

isolamento fornece baixos rendimentos e baixas quantidades de produto, o que

impossibilita os estudos de atividade biológica, determinação de estrutura primária,

modo de ação e comportamento conformacional (Bailey, 1990). Nestes casos, é

necessário lançar mão de métodos sintéticos que permitam obter grandes quantidades

de peptídeo de pureza elevada.

1.2. Breve história da síntese de peptídeos

Até hoje existe grande discussão sobre o início da síntese de peptídeos: alguns

afirmam que Theodor Curtius foi o primeiro a produzir um peptídeo em laboratório e

muitos outros atribuem a Emil Fisher esta realização. O que ocorreu foi o seguinte:

Em 1881 Theodor Curtius fazia o seu doutorado sob orientação de Hermann

Kolbe. Foi sugerido a ele que re-exam inasse a estrutura do ácido hipúrico que

anteriormente havia sido proposto como benzoil-glicina. Curtius reagiu glicina-prata

com cloreto de benzoíla obtendo o ácido hipúrico e alguns outros subprodutos que

Introdução 2

possuíam mais de uma glicina por resíduo de benzoíla (benzoil-dipeptídeos).

Desafortunadamente, ele não conseguiu remover o protetor benzoil da gi::ina e dos

peptídeos formados para prosseguir com o alongamento da cadeia (a metodologia a

ser empregada destruía as ligações peptídicas formadas).

Em 1889, apesar de já se ter descoberto 14 dos 20 aminoácidos que formam as

proteínas, ainda não existia um método sistemático para gerar peptídeos. Por esta

razão, Fisher decidiu usar o grupo etoxicarbonil como protetor da função amina dos

aminoácidos, assumindo que este seria removido por reação com amônia ou bases

inorgânicas. Esta metodologia, entretanto, converteu os N-carbetoxipeptídeos em

derivados da uréia (via reação de hidantoína). Por isto, Fisher passou a trabalhar na

preparação de cloretos de aminoácidos que poderiam ser acoplados a ésteres de

aminoácidos em solventes não aquosos gerando peptídeos de grupo amino livre

necessário para o alongamento da cadeia:

Cloreto de acetila

OH3C-e<

CI

------.~ H2N-eH(R)-eOCI + HCI + POCh

Esquema 1: Preparação de cloretos de aminoácidos (Fisher, 1905)

Assim, Fisher deu uma importante contribuição à qUlmlca de peptídeos

introduzindo os cloretos de ácido graxo a-hal6genos, cujo átomo de halogênio pode ser

convertido num grupo amino livre por tratamento com amônia (Fisher and 000, 1903).

Por esta realização, acabou sendo considerado o iniciador da pesquisa na área da

química de peptídeos e o criador do termo "peptídeo" (Merrifield, 1997).

Posteriormente, Max Bergmann e Leonidas lervas decidiram trocar o

etoxicarbonil de Fisher por um benzil e criaram o grupo benziloxicarbonil (Cbz), o qual é

removido por hidrogenação catalítica para produzir tolueno, CO2 e aminoácido livre

(Bergmann e lervas, 1932). Atualmente este grupo é chamado de grupo l em

homenagem a lervas.

Durante o regime nazista muitos pesquisadores alemães migraram da

Alemanha para os Estados Unidos tendo sido acolhidos pelo Instituto Rockefeller para

pesquisas em Medicina, iniciando uma nova era da química de peptídeos.

Introdução 3

Após a Segunda Guerra Mundial aumentou o interesse em desenvolver novas

técnicas para detecção, purificação e análise estrutural de peptídeos, além de novas

metodologias de síntese por parte de Bergmann, lervas, Joseph S. Fruton e Heinz

Fraenkel-Conrat (este último isolou a crotoxina - principal neurotoxina do veneno da

cascavel Crotalus durissus terrificus brasileira em colaboração com Karl Slotta; Slotta e

Fraenkel-Conrat, 1938).

Nesta época, Fraenkel-Conrat e Bergmann conseguiram sintetizar o dipeptídeo

Bz-Leu-Leu-NHPh em reação catalisada por papaína em pH 5 (Esquema 2; Bergmann

e Fraenkel-Conrat, 1938). Por sua vez, Bergmann e Fruton (1938) sintetizaram o

dipeptídeo Bz-Tyr-Gly-NHPh, demonstrando que as proteases eram capazes de

catalisar a formação de ligação peptídica que era favorecida pela precipitação dos

produtos formados. Eles também mostraram que a síntese de dipeptídeos a partir de

ésteres de aminoácidos era possível devido às propriedades esterásicas de algumas

proteases (Wieland, 1995). Estes estudos foram inspirados na crença de que as

proteases governavam a síntese de proteínas dos organismos vivos.

CSH5COLeuOH + H-LeuNHCsH5 ----.. CSH5COLeuLeuNHCsH5 + H20papalna

Esquema 2: Sintese de Bz-Leu-Leu-anilida (Wieland, 1995).

Paralelamente, foram desenvolvidos novos grupos protetores e metodologias

para a remoção do grupo l, como o uso da mistura HI e PH41 que foi utilizada com

grande sucesso por Harington e Mead em 1935 na síntese da glutationa (GSH).

Posteriormente, surgiu o grupo tert-butiloxicarbonil (Boc) desenvolvido por Carpino

(1957) e o híbrido de l e Boc chamado Dmz, que é muito sensível a ácido (Sieber e

Iselin, 1968).

Em seguida, o desenvolvimento contínuo dos métodos sintéticos permitiu a

preparação de peptideos maiores como a ocitocina, a insulina e até algumas pequenas

proteínas como a ribonuclease e a protease do HIV (Wieland, 1995).

Em 1963, Merrifield descreveu o método da síntese química de peptídeos em

fase sólida (SPFS). Esta metodologia se caracteriza por ser rápida, simplificada e

efetiva na preparação de peptídeos de pequeno e médio porte e, em alguns casos, de

pequenas proteínas (Merrifield, 1963). Esta proposição revolucionária lhe rendeu o

Prêmio Nobel de Química em 1984.

Introdução 4

Com o passar do tempo outros grupos protetores apareceram, tais como o 3,5

dimetoxi-Z (Chamberlin, 1966), que era sensível à luz UV. Em 1972, Carpino e Han

desenvolveram o grupo 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) que é sensível a bases

orgânicas e se tornou o mais utilizado (Carpino e Han, 1972).

Nas últimas décadas, passou-se a supor que a tecnologia do DNA recom binante

iria em pouco tempo substituir a síntese química de peptídeos e que a obtenção deles e

de proteínas seria só um domínio da biotecnologia (Wieland, 1995). Pelo contrario, a

síntese química de peptídeos não só continuou a ser empregada para a obtenção de

determinados peptídeos biologicamente ativos e seus análogos, mas também passou a

ser usada para a síntese de fragmentos modificados de proteínas contendo

aminoácidos não usuais ou modificações específicas (tanto L- quanto D-aminoácidos

modificados podem ser incorporados quimicamente em seqüências de fragmentos

protéicos sintéticos e estes podem ser condensados a outros fragmentos gerando

proteínas modificadas ainda não possíveis de se obter pefo método do DNA

recombinante; Machado e col., 2004; Ayers e col., 1999).

Mais de um século se passou desde que o primeiro peptideo foi sintetizado e

quase cinqüenta anos desde que Merrifield concebeu a metodolo~ de síntese em fase

sólida. Atualmente, máquinas podem sintetizar peptídeos individualmente ou de forma

múltipla. Apesar deste grande avanço, a síntese de peptídeos ainda apresenta

problem as que precisam ser contornados e que são objeto de estudo em nosso dia a

dia.

1.3. Métodos de síntese de peptídeos

Os peptídeos tornaram-se ferramentas muito usadas na pesquisa interdisciplinar

devido à sua multifuncionalidade, o que já foi citado anteriormente. Assim, a demanda

dos grupos de pesquisa interdisciplinares aumenta a cada dia.

Para sintetizar peptídeos pode-se lançar mão de três tipos de metodologias:

1. Síntese química de peptídeos: É aquela que utiliza reagentes químicos para mediar

a formação da ligação peptídica.

2. Síntese enzimática ou biocatalisada: É aquela onde a formação de ligação peptídica

é catalisada por enzimas.

3. Síntese via tecnologia do DNA recombinante: É aquela que se baseia no uso de

técnicas de clonagem e da maquinaria ribossomal de sistemas biológicos conhecidos

para a formação das ligações peptídicas.

Introdução 5

1.3.1. Síntese químíca

É caracterizada pelo uso de reagentes qUlmlcos para ativar a carboxila do

aminoácido que funcionará como o doador de grupo acila para a formação de ligação

peptídica. Esta sofrerá o ataque nucleófilico do grupo am ino de um outro aminoácido.

Esta metodologia apresenta a vantagem de ser geral e perm itir o uso de

aminoácidos usuais, não usuais e modificados. Ela requer a proteção total das cadeias

laterais reativas dos aminoácidos. Ainda assim, várias são as reações secundárias que

ocorrem nas suas diferentes etapas.

Existem dois tipos de síntese química de peptídeos:

Síntese em solução. É aquela onde os todos os reagentes e os produtos estão

dissolvidos nos meios reacionais (Bodansky, 1984, LIoyd-Williams e col., 1997);

Síntese em fase sólida: É aquela onde o alongamento do peptídeo é realizado sobre

um suporte polimérico que é insolúvel nos meios reacionais (Steward e Young, 1984,

Atherton e Sheppard, 1989, LIoyd-Williams e col., 1997).

A síntese em solução é também chamada de síntese clássica. Nesta

metodologia cada etapa de acoplamento ou desproteção é acompanhada pelo

isolamento e caracterização de cada um dos produtos formados, o que implica em

extração, lavagem, precipitação, cristalização, filtração, centrifugação, cromatografias,

secagem, etc (Esquema 3). A síntese em solução é bastante usada para a preparação

de peptídeos em grande escala e para aplicações em laboratórios especializados.

A síntese de peptídeos em fase sólida é a mais utilizada devido à sua

praticidade. Ela é o motivo de nossa pesquisa e, por isto, será discutida mais à frente.

1.3.2. Síntese enzimática

Esta metodologia oferece algumas vantagens sobre os métodos químicos como

a ausência de racem ização, proteção parcial das cadeias laterais, ativação mínima e a

alta quimo-, regio- e enantioespecificidades. Apesar destas grandes virtudes das

enzimas, esta metodologia não é usada rotineiramente nos laboratórios devido à

termodinâmica desfavorável em água pura, à estreita especificidade das enzimas e à

possibilidade de hidrólise secundária do peptídeo em crescimento quando o

biocatalisador é uma protease (Kitaguchi, 1996). Atualmente, a síntese enzimática tem

sido também usada para a condensação de segmentos peptídicos (Cerovsky e col.,

2000).

Introdução 7

portanto, é necessário manipular as condições para deslocar o equilíbrio para o sentido

da formação da ligação peptídica.

b) Cinéticamente controlada. Este tipo de reação é mais rápido e precisa de

quantidades inferiores de enzima porque o substrato é um éster de aminoácido ou

peptídeo (forma ativada da carboxila) que forma um intermediário acil-enzima e é

rapidamente atacado pelo grupo amino de um outro aminoácido ou peptídeo formando

a ligação peptídica. Em uma reação competitiva a água também pode atacá-lo para

gerar um aminoácido ou peptídeo com carboxila livre (Esquema 4B).

A)

R-COa' + H3N+-R' ~~--~ R-COOH + H2N-R' .~--~ R-Co-NH-R' + H20~ GOlonl• < o 6.

B)

Z-AA1-0R : éster de N-Z-aminoácido

E : serina o tioI protease

Z-AA1-E : intermediário acil-enzima

AAz-NH2 : aminoácido amida

ESQUEMA 4. Síntese enzímática termodinâmica e cinéticamente controladas.

É possível manipular os meios reacionais trocando a água por solventes

orgânicos e assim diminuir a reação de hidrólise e otimizar a reação de síntese do

peptídeo. Nestas condições, porém, a enzima pode diminuir ou perder sua atividade.

Por esta razão, diferentes combinações de solventes e tampões tem sido estudadas

objetivando obter misturas que maximizem o rendimento de síntese.

Introduç~o 8

1.3.3. Síntese via tecnologia do DNA recombinante

É também denominada de clonagem molecular ou engenharia genética e

consiste na produção de peptídeos ou proteínas em células de microorganismos

(bactérias e leveduras), insetos ou de mamíferos a partir de seqüências de DNA

sintetizados quimicamente, segmentos de DNA obtidos por clivagem com

endonucleases de restrição (as quais clivam o DNA em seqüências específicas) ou

DNA complementar (cDNA) obtido a partir seqüências de mRNA por transcrição

reversa. Estas seqüências são incorporadas em um vetor usando uma DNA ligase,

estes vetores podem ser plasmídeos (não mais do que 10 kpbs), fagos (até 23 kpbs),

cosmídeos ou cromossomo artificial de levedura \fACs) (45 kpbs e centos de kpbs,

respectivamente). Posteriormente, estes vetores são inseridos na célula apropriada que

vai expressar ou produzir o peptídeo ou proteína de interesse (Figura 1).

Figura 1. Sintese de peptídeos via DNA recombinante (extraído de Lehninger e col.,

1993)

Introdução 9

Geralmente, bactérias são utilizadas como sistemas de expressão, mas quando

a seqüência tem aminoácidos modificados deve-se escolher outros sistemas de

expressão como as leveduras, células de animais ou insetos, já que as bactérias não

realizam modificação pós-traducionaL

Atualmente são produzidas grandes quantidades de polipeptídeos via este

método (Lorenzini e coL, 2003, Wang e coL, 2003; Matarese e coL, 2002), mas os

peptídeos de tamanho médio ainda são produzidos em laboratórios químicos via

métodos de fase sólida.

1.4. Síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS)

o fundam ento básico desta metodologia é o uso de um suporte polimérico ao

qual se ligam seqüencialmente os aminoácidos de um peptídeo desejado (Merrifield,

1997). Resumidamente, o derivado de aminoácido que é o resíduo C-terminal do

peptídeo de interesse (protegido no grupo amino e na sua cadeia lateral reativa) é

ligado a um suporte sólido insolúvel ou resina via uma ligação covalente (acilação). Em

seguida, o protetor do grupo amino é removido (desproteção) e, se necessário, a

aminoacil-resina formada é neutralizada. Um novo aminoácido (que também está

protegido no seu grupo amino e, se necessário, na sua cadeia lateral reativa) é então

acoplado à aminoacil-resina na forma de uma espécie pré-ativada ou diretamente (in

situ) na presença de um reagente químico (acoplamento). Estes ciclos se repetem

para todos os aminoácidos da seqüência desejada. Após cada um deles, a peptidil

resina é lavada com alternância de solventes para remover os materiais reagentes.

Finalmente, o peptídeo-resina é c1ivado para obter o peptídeo com sua COOH terminal

livre ou amidada (clivagem). O agente de c1ivagem pode também remover os grupos

protetores das cadeias laterais dos aminoácidos para produzir o peptídeo bruto

totalmente desprotegido (d esproteção total) (Borgia e Fields, 2000, Esquema 5).

A vantagem principal da metodologia de SPFS sobre a síntese orgânica clássica

é a combinação entre a velocidade e praticidade. Sendo o suporte polimérico insolúvel

em todos os solventes orgânicos usados, o peptídeo em crescimento também se torna

insolúvel sendo facilmente filtráveL Assim, as reações de acoplamento podem ser

realizadas em presença de excesso molar de aminoácidos protegidos. As lavagens

minuciosas com grandes volumes de solventes podem remover os excessos de

reagentes e os produtos solúveis eficientemente, efetuando uma purificação rápida

Ligaçõesde

hidrogênio

ft

Introdução 11

Cadeiaspeptídica5

Esquema 6:

peptídicas.

Representação da agregação intermolecular entre cadeias

RI

-HN-Y-C0-XH

B

B:BASE

RI

-HN-g-GO-X

Esquema 7: Abstração do próton do carbono a pela base (extraído de Sodansky, 1984)

Q .- )o\·~/ __ H\~'f/ __ ,J/ ~ r:l __ r-f l' __ ~H..J.' nH" (Y' "e)L-., ~/'" ~)L, ~>----, "~)'-tt, " ('y

(, · R=.....:d.· " ·B : Ri = cadeia lateral do aminoácido ativado

X = Agente ativadorB = Base orginica

Esquema 8: Racemização via formação de oxazolona (modificado de L1oyd-Williamse coL, 1996)

A SPFS pode ser realizada manual ou automaticamente de forma individual ou

múltipla usando a estratégia teri-butiloxicarbonil (t-Soc) ou 9-f1uorenilmetiloxicarbonil

Introdução 12

(Fmoc) (Alewood e coL, 1997). Estas duas estratégias estão baseadas no sistema de

proteção ortogonal em que se usam duas ou mais classes de grupos protetores que

são removidos em diferentes condições reacionais.

Assim, na primeira estratégia o grupo protetor Boc é estável a base e nucleófilos

e é removido rapidamente usando ácidos orgânicos e inorgânicos (geralmente se usa

TFA, Barany e Merrifield, 1979). Este protetor do grupo amino é removido após cada

aminoácido ter sido incorporado na seqüência e, por isso, é chamado de protetor

temporário. Finalmente, a clivagem do peptídeo da resina e a remoção dos protetores

da cadeia lateral derivados do benzil (protetores permanentes estáveis a TFA) do

peptídeo são realizadas usando ácido fluorídrico (HF) a ooe ou ácido

trifluorometanosulfônico (TFMSA) a 25°C na presença de reagentes captores de

carbocátions (scavengers) (Esquema 9).

Na segunda estratégia o protetor do grupo amino Fmoc (protetor temporário) é

removido com base (usualmente se usa piperidina) e a clivagem do peptídeo da resina

e remoção dos protetores da cadeia lateral derivados do t-butil (protetores

permanentes) são realizados usando TFA a 25°e (Esquema 10).

Esquema 9: Esquema de proteção na estratégia t-Boc (Fields e coL, 1992)

Como descrito acima, a síntese passo a passo ocorre através de repetitivas

desproteções do grupo amino e repetitivos passos de acoplamento de aminoácidos

protegidos individualmente (Esquema 5). Esta metodologia é aplicada à síntese de

peptídeos relativamente pequenos e médios; porém, ela já foi usada para sintetizar a

ribonuclease A (124 resíduos, Gutte e Merrifield, 1971), a aspartil-protease do HIV-1

(99 resíduos, Nutt e coL, 1988), o inibidor da tripsina bovina pancreática e seus

Introdução 13

análogos (58 resíduos, Ferrer e coL, 1992) e análogos de colecistocinina -33, -39 e-58

(Miranda e col, 1993a; 1993b).

Esquema 10: Esquema de proteção na estratégia Fmoc (Fields e coL, 1992)

1.5. Síntese convergente de peptídeos em fase sólida {SCPFS}

A SPFS passo a passo apresenta problemas como as agregações intercadeias

seqüência-dependentes, inúmeras reações secundárias que envolvem os resíduos de

aminoácidos presentes na cadeia peptídica em crescimento (ou mesmo a ligação

peptídeo-resina), a racemização e o acúmulo de subprodutos produzidos durante as

etapas distintas de processo sintético (acoplamento, desproteção, neutralização e

clivagem da resina). Quanto maior é o peptídeo, mais estes problemas se agravam e,

por isto, costuma-se generalizar que os peptídeos longos são mais difíceis de obter

pela SPFS do que os curtos. Esta generalização, entretanto, nem sempre é correta; já

que existem seqüências curtas difíceis de obter e longas facilmente obtidas.

Assim, na busca de um aprimoramento da síntese de peptídeos longos ou de

seqüências difíceis, desenvolveu-se a abordagem de síntese convergente de peptídeos

em fase sólida (SCPFS). Esta consiste na síntese de fragmentos peptídicos protegidos

pertencentes à seqüência de um peptídeo longo seguida do acoplamento posterior

entre eles (Esquema 11 ). Os fragmentos são escolhidos com diferentes critérios,

sendo que após a sua síntese eles são purificados e caracterizados quimicamente

(Albericio e coL, 1997; Borgia e Fields, 2000). Assim, os problemas acumulativos da

síntese passo a passo citados acima são minimizados. É por isto que este método é

considerado a estratégia mais apropriada para a síntese química de peptídeos longos,

Introdução 15

longos compatíveis com a química Boc, onde os fragmentos peptídicos protegidos são

sintetizados sobre suportes poliméricos com funcionalização baseada no ácido

a-hidroximetil acrílico e a ligação peptídeo-resina pode ser clivada em meio básico

(Eggenweiler e coL, 1998). Igualmente à síntese passo a passo é usada a proteção

ortogonal. O primeiro passo na SCPFS é a preparação dos fragmentos protegidos com

carboxila livre. Para isso, tem que se considerar alguns critérios tais como:

Tipo de resina.

Quando a estratégia t-Boc é utilizada na geração de fragm entos empregam -se

resinas que formem com o peptídeo uma ligação lábil a base ou luz. Quando a

estratégia Fmoc é usada emprega-se a acidólise branda para a clivagem do peptídeo

da resina (L1oyd-Williams e coL, 1993). Vários tipos de resinas que permitem a

obtenção de fragmentos peptídicos com carboxila livre têm sido desenvolvidas (L1oyd

Williams e coL, 1993; Albericio e coL, 1997). Elas têm como polímero básico o

poliestireno/divinilbenzeno, diferindo na sua funcionalização:

a) Resinas fotolábeis: A fotólise é uma técnica branda e não invasiva que permite o

desligamento de fragmentos peptídicos protegidos nas suas cadeias laterais por

irradiação em 350 nm. A resina o-nitrobenzil, por exemplo, foi usada na preparação do

tripeptideo protegido Boc-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-OH com um rendimento de 60% e sem

que a tirosina fosse afetada (Rich e Gurwara, 1975). A 3-nitro-4

bromometilbenzidrilamina (Nbb), cuja estrutura é

~~...·•••. 2.·· .. H

~NO 'P' ..

~

também foi utilizada na síntese da apaminas com rendimentos de 65-89% (Giralt e coL,

1982; Albericio e coL, 1984) e da toxina 11 de Androctonus austra/is (Giralt e coL, 1986;

Albericio e coL, 1987). Por outro lado, Wang empregou a resina a-metilfenaciI para

gerar fragmentos protegidos obtendo rendimento superior ao obtido usando a resina o

nitrobenzil (Wang, 1976). Estas resinas são instáveis à piperidina, sendo incompatíveis

com a estratégia Fmoc.

Introdução 16

b) Resinas lábeis a ácido. Estas são compatíveis com a estratégia Fmoc que evita

condições ácidas. Os primeiros "handles" introduzidos foram ácido 4-hidroximetil-3

metoxifenoxiácetico (HMPA) e ácido 4-(4-hidroxim etil-3-metoxifenoxi)butirico (HMPB)

(Sheppard and Williams, 1982; Riniker e coL, 1993) onde o peptídeo protegido é clivado

da resina tratando a peptidil-resina com 1% de TFA em DCM repetidamente por 6-8

mino Outras resinas deste tipo são a resina SASRIN (super-sensível a ácido; Mergler e

coL, 1988) e a 2-c1orotritil (Barlos e coL, 1989). Esta última tem a seguinte estrutura:

O peptídeo pode ser liberado na forma protegida usando uma mistura de TFA

1% em DCM ou de ácido acético e trifluoroetanol em DCM (Barlos e coL, 1989,1991).

c) Resinas funcionalizadas com o grupo aliL São muito usadas devido às condições

brandas de c1ivagem por transferência catalisada por Pdo de grupos alil a nucleófilos

levemente básicos (Kunz e Dombo, 1988). Este tipo de resina é compatível com o uso

da estratégia Boc e Fmoc.

d) Resinas funcionalizadas com o grupo f1uorenilmetiL A clivagem dos peptídeos

protegidos da resina se dá por mecanismos de p-eliminação com tratamento por

aminas secundárias como a piperidina ou a morfolina (Mutter e Bellof, 1984). Altos

rendimentos podem ser obtidos utilizando 0,1 M DBU em dioxano ou 20% de piperidina

em DMF por 2h a temperatura ambiente.

e) Resinas funcionalizadas com o grupo oxima. A clivagem dos peptídeos protegidos

da resina oxima p-nitrobenzofenona ou resina de Kaiser (KOR) se dá por hidrólise com

amônia, hidrazinólise e aminólise utilizando ésteres de aminoácido (DeGrado e Kaiser,

1980).

Introdução 17

HO.,wN ... -.;; .

o procedimento mais utilizado talvez seja a de transesterificação com 1

hidroxipiperidina gerando um éster de hidroxipiperidina que após tratamento com Zno

em ácido acético fornece o peptídeo protegido com carboxila livre (Nakagawa e Kaiser,

1983). Outras metodologias de desligamento utilizam o DBU (Pichette e coL, 1997),

sais de tetra n-butilamônio aminoácido (Lansbury e col, 1989) e assistência por íons

metálicos como Ca+2 (Moraes e coL, 2000; Moraes e coL, 2001).

Resíduo C-terminal dos fragmentos.

Uma das principais preocupações na escolha dos fragmentos é a possibilidade

de ocorrência de racemização decorrente da ativação química das carboxilas terminais

dos fragmentos (Albericio e coL, 1997, Borgia e Fields, 2000). Por isso, se a prolina ou

a glicina estão presentes na seqüência em intervalos moderados, elas são escolhidas

como resíduos C-terminais dos fragmentos doadores de acila que não sofrerão

racemização. De fato, a glicina é aquiral e a prolina desfavorece o processo por razões

estéricas. Se a seqüência não contém estes aminoácidos, deve-se escolher o

aminoácido que possua a menor cadeia lateral não funcionalizada (Benz, 1994).

Tamanho do fragmento.

A escolha do tamanho do fragmento é difícil e leva em conta muitos fatores. Por

exemplo, uma seqüência de 100 aminoácidos poderia ser dividida em fragmentos de 10

aminoácidos com o fim de facilitar a sua síntese passo a passo, geração dos

fragmentos protegidos e a purificação deles. Sabe-se que muitos destes fragmentos

podem apresentar problemas de solubilidade e, portanto, não são acoplados aos

receptores de acila com sucesso. Problemas de solubilidades são apresentados

usualmente por peptídeos que possuem glutamina e asparagina na seqüência (Benz,

1994). Existem poucos exemplos de acoplamentos bem sucedidos usando fragmentos

com mais de 15 resíduos (Gisin e coL, 1969, 1981; Kaiser e coL, 1989; Kubiak e coL,

1987).

Introdução 18

É observado que os acoplamentos entre fragmentos são muito mais lentos do

que os acoplamentos dos aminoácidos na síntese passo a passo. Em 1999 Rinnova e

col. propôs o uso do chamado "volume de inchamento" nos acoplamentos levando a

um gasto menor de reagentes e a altos rendimentos. Em 2001, Mihala e col. obtiveram

excelentes resultados ao usar a mistura clorofórmio:fenol (3:1, v/v) como solvente e

EDC e HODhbt como agentes ativadores.

1.6. SPFS em temperatura alta

A idéia de usar temperaturas elevadas para aumentar as velocidades de

acoplamento em SPFS não é recente. Ela é atraente porque permite uma diminuição

do tempo necessário para sintetizar um peptídeo e, portanto, se torna especialmente

interessante na preparação de peptídeos longos ou quando o peptídeo desejado tem

em sua seqüência aminoácidos difíceis de acoplar nas condições experimentais da

SPFS convencional. Além disso, existe hoje uma alta demanda de compostos

peptídicos para uso de investigação interdisciplinar que exige grande agilidade dos

processos sintéticos.

Os primeiros estudos envolvendo o uso de temperaturas altas em acoplamentos

da SPFS foram feitos por Merrifield e colaboradores (1974), que conseguiram um

aumento significativo do rendimento de síntese de Bpoc-Gly-Val-resina (42 para 64 ou

74%) aumentando a temperatura da reação de -15° para 20°C ou 25°C,

respectivamente. Posteriormente, foi descrito o uso de 50°C durante a síntese do fator

transformador de crescimento alfa (TGFa., Tam, 1986). L10yd e colaboradores

sintetizaram os peptídeos Q13N e ANF(1-28) do rato a 40,50 e 60°C e observaram que

os acoplamentos feitos a 60°C forneceram produtos brutos mais limpos; embora as

análises por espectrometria de massas mostraram a presença de grande quantidade

de material desidratado na síntese de Q13N (L1oyd e col., 1990). Em 1992, Yu e col.

(1992) propuseram que a etapa de acoplamento em SPFS poderia ser realizada em

forno de microondas. Este procedimento tem sido aplicado e foi recentemente

automatizado (Erdélyi e GogolI, 2002).

A realização de todas as etapas da SPFS em altas temperaturas foi inicialmente

demonstrada na síntese do neuropeptídeo Y de porco e o fator liberador da

corticotrofina de rato (hCRF) a 75°C usando como solvente 25% DMSO/tolueno por

Rabinovich e Rivier. Eles mostraram que os tempos de acoplamento foram reduzidos

Introdução 19

para menos de 30 mino e sugeriram que seus protocolos poderiam ser utilizados em

sintetizadores automáticos (Rabinovich e Rivier, 1994, Rivier e Miranda, 2001). Dois

anos depois, Saneii e colaboradores tentaram empregar tais condições em protótipos

de sistemas automatizados sem muito sucesso (Saneii e col., 1996).

Desde 1997 o nosso grupo de pesquisa vem desenvolvendo estudos

sistemáticos da metodologia de SPFS em temperatura alta. Os primeiros trabalhos se

concentraram em alguns aspectos nunca estudados como a temperatura ótima,

avaliação dos peptídeos brutos, análise comparativa das eficiências de vários

reagentes acopladores, compatibilidade das resinas às condições empregadas e

propriedades de inchamento de diferentes resinas comerciais (MBHA, TMBHA, RINK e

SAMBHA) em diferentes solventes a 60°C. Constatou-se a possibilidade de utilizar tais

resinas com sucesso e que a mistura 25% DMSOltolueno, DMF e NMP a 60°C

promovem o seu inchamento máximo. Para este estudo se utilizaram como modelos-+

o fragmento 65-74 da proteína transportadora de acila (ACP65-74 ), uma seqüência

agregante típica, e a colecistocinina-8 (CCK-8) não sulfatada. Como resultado se

determinou uma condição ótima para a síntese de CCK-12 não sulfatada pela SPFS

passo a passo que poderia ser conveniente para a preparação das suas formas

moleculares maiores (Varanda e Miranda, 1997, Rivier e Miranda, 2001).

Posteriormente, foi realizado em nosso laboratório um novo estudo para analisar

racemização e agregação na SPFS em temperaturas altas. Para tal, foram usados os

peptídeos-modelo lIe-Phe-Gly-Thr-NH2, (D-Tyr)-Lys-Trp e Ac-lIe-Gly (estudo de

racemização) e os peptídeos ph-GnRH (14-36) e a protease do HIV-1 (89-99) (estudo

de agregação). Os resultados desta pesquisa, que utilizou RP-HPLC, análise de

aminoácidos e electroforese capilar para a análise dos peptídeos brutos, evidenciaram

que a racemização não foi significativamente aumentada nas condições de SPFS a

60°C empregadas. Por outro lado, não foi possível tirar uma conclusão definitiva em

relação à minimização da agregação nestas condições (Souza, 2000). Tal estudo só

pode ser conclusivo se a SPFS em altas temperaturas for acompanhada de medidas de

grau de solvatação, medidas calorimétricas ou análise por ressonância magnética

nuclear de ângulo mágico (MAS-NMR), espectroscopia de infravermelho com

transformada de Fourier (I R-FT) ou ressonância param agnética eletrônica (EPR).

Alguns experimentos preliminares de SCPFS da CCK-12 não sulfatada a 60°C

também foram realizados com sucesso (dados não publicados).

Introdução 20

1.7. Colecistocinina

A colecistocininina (CCK) é um hormônio intestinal muito importante pelas

diversas funções biológicas que exerce: contração da vesícula biliar e estimulação da

secreção das a-amilases pancreáticas, influência na saciedade e motilidade intestinal,

neurotransmissão e neuromodulação no sistema nervoso central, participação na

regulação inibitória da secreção gástrica, envolvimento na diferenciação sexual e

comportamento reprodutivo, efeito nos processos de aprendizagem e memória e

indução de comportamentos semelhantes à ansiedade (Crawley e Corwin, 1994).

A CCK foi primeiramente identificada em extrato de intestino delgado de porco

como um peptídeo carboxiam idado contendo 33 resíduos de aminoácidos (CCK-33)

apresentando na sua seqüência uma tirosina o-sulfatada (Mutt e Jorpes, 1971 ).

Posteriormente, foi encontrada em rato, frango, cão e o homem (Eysselein e coL, 1984;

Fan e coL, 1987; Maton e coL, 1982; Rehfeld. 1978). Estudos subseqüentes mostraram

que a pro-CCK é processada em formas bioativas de diferentes tamanhos como a

CCK-83, CCK-58 (gato, cão e homem), CCK-39 (porco, cão e porquinho da (ndia),

CCK-22 e CCK-8 (porco, rato, frango cão e homem), sendo esta última predom inante

em neurônios periféricos e centrais (Crawley e Corwin, 1994). Nas últimas décadas,

tem sido descrito que a CCK-58 é a maior forma de CCK presente no plasma de

mam iferas como o homem (Eberlein e coL, 1988; Eysselein e coL, 1990).

Recentemente, foi demonstrado que no plasma as formas predom inantes são a CCK

33 seguida da CCK-22 (Rehfeld e coL, 2001).

Devido à complexidade química das seqüências de suas diferentes formas

moleculares (CCK-8, CCK-22, CCK-33, CCK-58) que contém os aminoácidos serina,

metionina e triptofano, ligações ácido-sensíveis e uma tirosina sulfatada ácido-Iábil, as

suas sínteses se tornam extremamente difíceis (Kurano e coL, 1987).

A primeira síntese total da CCK-33 de porco foi feita em solução empregando-se

proteção máxima e realizando-se a sulfatação no final da síntese (Kurano e coL, 1987).

No ano seguinte, a síntese da CCK-33 humana foi realizada por meio da condensação

via azida em solução entre 7 fragmentos seguida de sulfatação de uma Tyr por

esterificação seletiva com piridina-S03 (Fujíi e col., 1988). Em 1991, a síntese da CCK

33 de porco por SPFS usando a estratégia Fmoc e a resina SAMBHA foi descrita

(Penke e Nyerges, 1991). Dois anos depois, Miranda e col. descreveram a síntese por

SPFS passo a passo de análogos metil-sulfonados das CCK-8, CCK-33, CCK-39 e

Introdução 21

CCK-58 (Miranda e caL, 1993a e 1993b). Em 1997 e 2001 Kitagawa e cal. descreveram

as sínteses das CCK-33, CCK-39 e CCK-58 também empregando SPFS passo a passo

e síntese convergente em solução usando uma estratégia sintética especialmente

desenvolvida para peptídeos sulfatados (Kitagawa e coL, 1997, Kitagawa e coL, 2001a,

Kitagawa e caL, 2001b). Em todos os casos os rendimentos finais não ultrapassaram

10%.

Estes fatos fazem com que até hoje não se tenha conseguido realizar um

estudo biológico detalhado das formas moleculares longas de CCK .

1.8. Gomesina

A gomesina é um peptídeo antimicrobiano isolado dos hemócitos da aranha

caranguejeira Acanthoscurria gomesiana. Este peptídeo se caracteriza por possuir 18

aminoácidos que incluem um ácido piroglutâmico no extremo N-terminal, uma arginina

amidada no extremo C-terminal e quatro cisteínas que formam duas pontes dissulfeto

(Silva Jr., 2000). A sua análise por ressonância magnética nuclear forneceu uma

estrutura em forma de gram po "p-hairpin" (Mandard e caL, 2002) semelhante às de

outros peptídeos catiônicos ricos em cisteína como a taquiplesina (Nakamura e caL,

1988), polifemusina (Miyata e caL, 1989), protegrina (Kokryakov e caL, 1993) e

androctonina (Hetru e coL, 2000) que também possuem forma de grampo na sua

estrutura.

Gomeslna i: Androctonlna

A gomesina apresenta um amplo espectro de atividade antimicrobiana sobre

bactérias Gram-positivas (Bacillus cereus, B. thuringiensis, Listeria monocytogenes,

Micrococcus luteus, Staphy/ococcus aureus, S. epidermidis, Streptococcus pyogenes),

Introdução 22

Gram-negativas (E. colí., Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,

Xanthomonas campestris), fungos (Aspergillus fumigatus, Beauveria bassiana,

Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Trichoderma viridae) , leveduras (Candida

albicans, C. glabrata, Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae). Além

disto, ela também é ativa sobre formas promastigotas de Leishmania amazonensis. Por

outro lado, este antimicrobiano é também hemolítico (20% de hemólise a 100 ~M ; Silva

Jr. e coL, 2000).

Obietivas 23

2. OBJETIVOS

Neste trabalho nos propusemos a investigar alguns aspectos da SCPFS e a

explorar a possibilidade de agilizá-Ia a SO°C.

Os aspectos estudados foram a geração dos fragmentos doadores de acila, a

adequação de solventes para este processo e para o acoplamento entre os fragmentos

doadores e receptores de acila e a eficiência de agentes ativadores nestes

acoplamentos.

Os modelos peptídicos escolhidos foram:

1) a colecistocinina-33 humana (hCCK-33) não sulfatada:

H-Lys-Ala-Pro-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Ile-Val-Lys-Asn-Leu-GIn-Asn-Leu-As p-Pro-Ser-His

Arg-Ile-Ser-Asp-Arg-Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2

Como citado na Introdução, a complexidade química da seqüência da hCCK-33

torna a sua síntese difícil e de rendimento extremamente baixo (Miranda e col., 1993 a

e 1993b). De fato, a hCCK-33 não sulfatada já foi sintetizada anteriorm ente em nosso

laboratório usando a SPFS passo a passo convencional e em temperatura alta, tendo

sido observado que ambos os peptídeos brutos obtidos eram de péssima qualidade

(Souza, 2000; Souza e col., submetido).

2) [Gln1]-gomesina:

H-Gln-Cys-Arg-Arg-Leu-Cys-Tyr-Lys-Gln-Arg-Cys-Val-Thr-Tyr-Cy-Arg-Gly-Arg-OH

Como citado na Introdução, a gomesina é um peptídeo antimicrobiano [biciclo

(2,15 e S,11) pGlu-Cys-Arg-Arg-Leu-Cys-Tyr-Lys-Gln-Arg-Cys-Val-Thr-Tyr-Cys-Arg-Gly

Arg-NH2], Silva e col., 2001) que vimos estudando em colaboração com outros dois

laboratórios. Com interesse de obter um análogo N-C ciclizado (análogo tricíclico), foi

sintetizado o análogo linear [Gln1]-gomesina por SPFS passo a passo convencional.

Este, porém, foi de péssima qualidade comprometendo as oxidações para formação

das pontes dissulfeto e a ciclização N-C necessárias (resultados não mostrados).

Materiais e Métodos 24

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais

3.1.1. Resinas

Os suportes poliméricos utilizados na síntese dos peptídeos foram os seguintes:

resina 4-metilbenzilhidrilamina (MBHA, 100-200 mesh, da Bachem Califórnia Inc.,

USA), resina cloreto de 2-clorotritil (2-CI-Trt, 100-200 mesh, da Novabiochem Corp.,

Suíça) e resina oxima de p-nitrobenzofenona (KOR também chamada de resina de

Kaiser, 100-200 mesh, da Advanced Chemtech, USA). Os seus graus de

funcionalização eram de 0,67,1,6 e 0,9 mmol de resina/g de resina, respectivamente.

Também foi empregada uma KOR sintetizada em nosso laboratório segundo o

método descrito por DeGrado e Kaiser (1980) a partir do suporte polimérico Bio-Beads®

SX-1 de 200-400 mesh da Bio-Rad. Esta apresentou grau de funcionalização de 0,78

0,96 mmol/g de resina.

3.1.2. Agentes ativadores ou acopladores

Os agentes acopladores usados foram os seguintes: tetrafluoroborato de 2-(1 H

benzotriazol-1-i1)-1 ,1,3,3-tetrametilurônio, hexafluorofosfato de benzotriazol-1-i1-oxi

tris(dimetilamino)fosfônio (TBTU e BOP, respectivamente, da Advanced Chemtech,

USA), hexafluorofosfato de 7-azabenzotriazol-1-i1-1, 1,3,3-tetrametilurônio (HATU, da

Millipore Inc., USA), N-hidroxibenzotriazol (HOBt, da Protein Research Foundation,

Japão), N,N'-diisopropilcarbodiimida e 1-etil-3-(3-dim etilaminopropil)carbodiim ida (DIC

e EDC, respectivamente, da Sigma Chemical Co., USA).

3.1.3. Reagentes e solventes

Os Boc- e Fmoc-L-aminoácidos (protegidos ou não em suas cadeias laterais)

utilizados nas sínteses realizadas foram obtidos da Bachem Califórnia Inc" USA.

Os outros reagentes requeridos foram: anisol, dimetilsulfeto (DMS), m-cresol,

ácido trifluoroacético (TFA), trietilamina (TEA), fluoreto de hidrogênio (HF), N,N'

diisopropiletilamina (DIPEA), N-metilpirrolidona (NMP), acetato de cálcio, ácido pícrico,

1,8-diazabiciclo[5,4,0]undeca-7-eno (DBU) e anidrido acético. Todos eles eram de grau

analítico ou de síntese, provenientes da Merck KgaA (Alemanha), Sigma Chemical Co.


(USA), Aldrich chemical Co. (USA), Riedel-De Haen AG (Alemanha), EM Science

(USA) ou da Applied Biosystem (USA) e foram empregados sem purificação prévia.

Os solventes empregados foram: diclorometano (OCM), N,N'-dimetilformamida

(DMF), metanol (MeOH); no caso da síntese em fase sólida em temperatura alta usou

se MeOH seco (máximo 0,005 % de água), isopropanol, etanol 96% extra-puro, éter

diisopropilico, dimetilsulfóxido (OMSO), tolueno e tetraidrofurano (THF). Esses

solventes eram procedentes da Merck KGaA (Alemanha), Sigma Chemical Co. (USA),

Riedel-Oe Haen AG (Alemanha), EM Science (USA) ou da Applied Biosystem (USA).

Com exceção do tolueno e o tetraidrofurano (THF), de grau espectroscópico, todos

eram de grau analítico ou de síntese e foram empregados sem qualquer tratamento

prévio.

Para o monitoramento dos acoplamentos por meio do teste de Kaiser ou de

ninidrina (Kaiser e col. 1970) foram empregadas as misturas: fenol/etanol 76% (VIV)

(monitor 1), cianeto de potássio/piridina 0,0002 M (monitor 2), ninidrinaletanol 0,28 M

(monitor 3) de grau síntese e obtidos da Applied Biosystems, USA.

As hidrólises ácidas das peptidil-resinas foram realizadas em presença de ácido

clorídrico fumegante 37% (Merck KGaA, Alemanha) e ácido propiônico 99% na

proporção 1:1, v:v (Aldrich Chem ical Co., USA).

Na preparação dos solventes para as análises por RP-HPLC foram utilizados

acetonitrila (EM Science, USA) e ácido trifluoroacético (TFA) (Merck KGaA, Alemanha)

de grau espectroscópico.

3.2. Métodos Preparativos

3.2.1. Síntese das peptidil-resinas

Todas foram sintetizadas manualmente pelo método de síntese de peptídeos

em fase sólida (SPFS) passo a passo utilizando as estratégias t-Boc ou Fmoc (Stewart

e Young, 1984; Atherton e Sheppard, 1989; Varanda e Miranda, 1997).

3.2.1.1. Procedimento geral para a síntese das peptidil-KOR (DeGrado e Kaiser,

1980; Moraes e col., 2000)

A. Aminoacilação da resina

A KOR (1,5 g) foi colocada em um frasco de síntese e lavada com OCM (2X),


metanol (2X) e DCM (2X). O volume de DCM foi suficiente para cobri-Ia e foram

acrescentadas as quantidades de Boc-L-aminoácido, HOBt, e Dle 1M em DCM

correspondentes a 2,5 vezes de excesso molar em relação ao número de moi de

grupos funcionais da KOR. A mistura resultante foi deixada reagir sob agitação por 22

horas. Passado este tempo, a resina foi filtrada, lavada com DCM (2X), metanol (2X) e

DCM (3X) e submetida a um teste de ninidrina (Kaiser e col., 1970). Para assegurar a

introdução do primeiro aminoácido e obter um bom grau de aminoacilação fez-se um

reacoplamento. Depois do reacoplamento e das respectivas lavagens com DCM (2X),

metanol (2X) e DCM (2X), a Boc-aminoacil-KOR resultante foi seca sob vácuo e

pesada.

B. Determinação do grau de substituição

O grau de aminoacilação foi determinado por meio do teste do ácido picrico num

frasco de placa porosa (Gisin, 1972) empregando 10 mg de resina. O grupo Soc foi

removido em uma solução 25% de TFA em DCM (1 x 1 min, 1 x 30 min) e a aminoacil

resina desprotegida foi lavada com DCM (4X), solução 10% de TEA em DCM (3X) e

DCM (6X). Ao material lavado foi adicionada uma solução 0,15 M de ácido pícrico em

DCM. A suspensão resultante foi deixada em repouso por 5 minutos. Esta operação foi

repetida por mais 4 vezes. Finalmente, o excesso de ácido pícrico foi eliminado com

lavagens da resina com etanol e DCM alternadamente, até que a solução de lavagem

ficasse incolor. O picrato ligado foi extraído com uma solução 10% de TEA em DCM (3

x 3 ml) e DCM (3 x 3 ml). A solução de extração foi coletada num balão e levada a 100

ml com etanol. A concentração de picrato de trietilamônia foi determinada por leitura

espectrofotométrica em comprimento de onda de 358 nm (E358 =14500 M·1.cm·1).

O grau de aminoacilação também foi obtido por análise de aminoácidos do

hidrolisado total das aminoacil-resinas. Tanto a hidrólise quanto a análise serão

descritas a seguir.

c. Alongamento da cadeia peptídica

Depois da introdução do primeiro aminoácido e determinação do grau de

aminoacilação, iniciou-se a síntese das peptidil-resinas conforme descrito na Tabela 1.

Foram realizados reacoplamentos dos Boc-aminoácidos sempre que os acoplamentos

não foram completados (teste de ninidrina da peptidil-resina negativo).


Introduzido o último derivado de aminoácido (N-terminal da seqüência), a Na

Boc-peptidil-resina foi seca a vácuo, caracterizada e estocada a 4°C.

3.2.1.2. Procedimento geral para as sínteses das peptidil-MBHA (Varanda e

Miranda, 1997)

As sínteses dos peptídeos ligados à resina MBHA foram feitas em temperatura

ambiente ou em temperatura alta (60°C) em frascos de síntese jaquetados conectados

a um banho de circulação com controle digital de temperatura (PolyScience Modelo

8001).

Inicialmente a resina foi lavada com OCM (2X), metanol (2X), OCM (2X),

metanol (2X), OCM (2X) e submetida a um teste de ninidrina (o qual se mostrou

positivo, já que a resina MBHA apresenta um grupo amino livre). As etapas de

desproteção, lavagem, neutralização e acoplamento foram realizadas segundo os

protocolos descritos na Tabela 1 para síntese em temperatura ambiente e na Tabela 2

para a síntese a 60°C.

Tabela 1: Protocolo de síntese de peptídeos em fase sólida passo a passo em

temperatura ambiente usando a estratégia t-Boc.

Etapa de desproteção

Solução 40%Bou 50%b de TFA em OCM +5 gotas de anisol por 20 mino

Lavagem pós-desproteção

2x 1% anisol em isopropanol2x OCM2x 10% TEA em OCMb

2xOCM2x MeOH2xOCMTeste de ninidrina

a Para sínteses feitas na resina oxima de Kaiser.b Para sínteses feitas na resina MBHA.

Etapa de acoplamento

Boc-aminoácido (2,5 vezes de excesso) +TBTU em OMF comOIPEA (pH 9-10)B ou HOBt + 1 M de OICem OCM + OCM até cobrir a resina por 60mino

Lavagem pós-acoplamento

2x OMFBou OCMb

2x MeOH2x OCM2x MeOH2x OCMTeste de ninidrina

Introduzido o último derivado de aminoácido (N-term inal da seqüência), a Na.



3.2.1.3. Procedimento geral para a síntese da peptidil-resina 2-CI-Trt (Barlos e coL,

1991)

A. Aminoacilação da resina

Para isso, 0,6 mg de resina (2-CI-Trt) foram colocados em um balão de vidro

contendo uma solução de 0,6 equivalentes de Fmoc-Gly-OH dissolvido em 2 mL de

DCM, 0,5 mL de DMF e 41 ~I de DIPEA. A mistura reacional foi mantida sob agitação

magnética por 5 minutos. Posteriormente, 82 ~L de DIPEA e 3,5 mL de DCM foram

acrescentados a ela e a agitação foi mantida por mais 60 mino Passado este tempo,

foram adicionados 0,5 mL de metanol (grau espectroscópico) para reação por mais 10

minutos. A mistura reacional foi então transferida para um frasco de síntese e lavada

com DCM (3x), DMF (2x), isopropanol (2x), DMF (2x), isopropanol (2x), metanol (2x) e

éter etílico (2x).

Tabela 2: Protocolo de síntese de peptídeos em fase sólida passo a passo a 60°C

usando a estratégia t-Boc.


50% TFA em tolueno + 5 gotas de anisolpor 10 mino


2x 1% anisol em tolueno2x 25% DMSOltolueno2x 10% TEA em tolueno2x 25% DMSOltolueno2x MeOH seco2x toluenoTeste de ninidrina


Boc-aminoácido (2,5 vezes de excesso) +HOBt + 1 M de DIC em DCM + 25%DMSO em tolueno até cobrir a resina por30min.

Lavagem pós-acoplamento

2x 25% DMSO em tolueno2x MeOH dessecado2x tolueno2x MeOH seco2x toluenoTeste de ninidrina

B. Determinação do grau de aminoacilação e alongamento da seqüência

O grau de aminoacilação foi obtido por análise de aminoácidos do hidrolisado

total da resina (ver item 3.3,2.)

O alongamento do peptídeo foi feito segundo descrito na Tabela 3.


Introduzido o último derivado de aminoácido (N-terminal da seqüência), a Na.


Tabela 3: Protocolo de síntese de peptídeos em fase sólida a 60°C usando a

estratégia fmoc.


20% piperidina em DMF por 20 mino


2xDMF2x MeOH2x DCM2x MeOH2xDCMTeste de ninidrina


Boc-aminoácido (2,5 vezes de excesso) +TBTU com DIPEA(pH 9-10) em DFM até cobrir a resina por60 mino

Lavagem-pós acoplamento

2x DMF2x MeOH2xDCM2x MeOH2xDCMTeste de ninidrina

3.2.1.4. Oesproteção total e clivagem das resinas (Stewart & Young, 1984; Varanda

e Miranda, 1997).

A clivagem ou desligamento e a simultânea desproteção total dos peptídeos

ligados nas resinas foram feitas pelo tratamento de todas as peptidil-resinas

sintetizadas com fluoreto de hidrogênio (HF). Resumidamente, 100 mg de peptidil

resina e 1 mL de anisol [para aquelas contendo cisteina ou metionina, adicionou-se 0,5

mL de anisol e 0,5 mL de dimetilsulfeto (DMS); para aquelas que continham tirosina e

cisteina ou metionina, adicionou-se 0,5 mL de anisol, 0,25 mL de dimetilsulfeto e 0,25

mL de m-cresol] foram colocados em um frasco conectado a um sistema de HF mantido

sob alto vácuo. Após resfriamento deste frasco a -70°C, foram transferidos a ele 10 ml

do gás condensado. A reação ocorreu por 90 minutos a 4°C (para as peptidil-resinas

contendo o grupo tosil como protetor da arginina este tempo foi de 180 minutos).

Terminada a reação, o HF foi totalmente transferido para um "trap" de carbonato de

cálcio. O peptídeo bruto foi então precipitado com éter diisopropílico e filtrado

conjuntamente com a resina. Em seguida. este foi extraído usando uma solução A

(0,1% de TFA em água) e uma solução B (50% de acetronitrila em água contendo

0,09% de TFA). O extrato foi liofilizado. O material seco resultante foi pesado.


3.2.2. Obtenção dos fragmentos protegidos a serem empregados na síntese

convergente em fase sólida

Estes fragmentos foram obtidos a partir das peptidil-resinas sintéticas citadas

acima.

3.2.2.1. Desl igamento da KOR

Foram utilizadas três metodologias:

A. Hidrólise da ligação éster de oxima catalisada por base orgânica (Pichette e

col., 1997)

Em um frasco foram colocados a massa de peptidil-KOR correspondente a 17,5

~mol de peptídeo, 35 ~mol de 1,8-diazabiciclo[5,4,O]undeca-7-eno (DBU), 0,85 mL de

tetraidrofurano (THF) e 0,15 mL de H20. A mistura foi mantida sob agitação num shaker

a temperatura ambiente ou a 55°C e monitorada por RP-HPLC até 4 horas de reação

(tempos de 0, 1, 2, 3 e 4 horas). Em seguida, ela foi filtrada num funil de placa porosa.

O sobrenadante foi separado e a peptidil-KOR residual foi lavada com a mistura

THF/água, metanol e DCM, seca e submetida à hidrólise total para determinação do

seu conteúdo de aminoácidos.

B. Hidrólise da ligação éster de oxima mediante assistência por Ca2+ (Moraes e

col.,2000)

Em um frasco foram colocados massa de peptidil-KOR correspondentes a 17,5

~mol de peptídeo, 35 ~mol de acetato de cálcio, 0,85 mL de tetraidrofurano (THF) e

0,15 mL de H20. A mistura reacional foi mantida num shaker à temperatura ambiente

ou a 55°C e monitorada por RP-HPLC até 50 horas em vários intervalos de tempo (O,

4, 8, 24, 30 e 50 h). Depois de terminada a reação, a mistura reacional foi filtrada num

funil de placa porosa. O sobrenadante foi separado e a peptidil-KOR residual foi lavada

com a mistura THF/água, metanol e DCM, seca e submetida à hidrólise total para

determinação do seu conteúdo de aminoácidos.

C. Hidrólise da ligação éster de oxima catalisada por base inorgânica (Atherton e

Sheppard, 1989)

Em um frasco foram colocados 40 mg de peptidil-KOR e 600 ~L de dioxano

para inchar a resina por 10 minutos. Após o inchamento, foram acrescentados 200 mL


de uma solução gelada 1M de hidróxido de sódio em água, deixando-se a mistura

resultante reagir sob agitação magnética por 15 minutos. Foi feito o seu monitoramento

por RP-HPLC em O e 15 minutos. O sobrenadante foi separado da peptidil-KOR

residual e neutralizado com uma solução 0,1 M de ácido clorídrico. A resina foi lavada

com metano\ e DCM, seca e submetida à hidrólise total para determ inação do seu

conteúdo de am inoácidos.

3.2.2.2. Desligamento da 2-CI-Trt

A. Clivagem com ácido acético diluído (Barlos e caL, 1991)

Em um frasco foram colocados 20 mg de peptidil-KOR e 500 mL de uma mistura

de ácido acético:2,2,2 trifluoroetanol:diclorom etano (2:2:6 ou 1:2:7 ou 1:1:8, v:v:v). A

mistura resultante foi deixada reagir sob agitação magnética por 2 horas, tendo sido

analisada por RP-HPLC em O, 15, 30, 60 e 120 minutos. O sobrenadante foi separado

e a peptidil-2-CI-Trt residual foi lavada com metanol e DCM, seca e submetida à

hidrólise total para determinação do seu conteúdo de aminoácidos.

B. Clivagem com ácido trifluoroacético diluído (Barlos e cal., 1991)

Em um frasco foram colocados 20 mg de peptidil-2-CI-Trt e 500 mL de uma

solução 1% de TFA. A mistura resultante foi deixada reagir sob agitação magnética por

2 min, tendo sido analisada por RP-HPLC em O e 2 minutos. O sobrenadante foi

separado e a peptidil-2-CI-Trt residual foi lavada com metanol e DCM, seca e

submetida à hidrólise total para determinação do seu conteúdo de aminoácidos.

3.2.3. Determinação do grau de inchamento ou solvatação das peptidil-resinas

sintéticas (Ludwick e caL, 1986; Varanda e Miranda, 1997)

O método empregado consistiu em medir as variações dos volumes que sofrem

as peptidil-resinas quando imersas em diversos sistemas de solventes em relação às

variações quando imersas em metanoL Para isso, a peptidil-resina em estudo foi

colocada num frasco graduado jaquetado e lavada com metanol (5X). Em seguida, foi

adicionado metanol a ela e o volume total foi medido. O mesmo foi feito com os outros

sistemas de solventes. Entre as medições as peptidil-resinas foram lavadas com

metanol até que se reproduzisse o volume inicialmente medido nele.


Os sistemas de solventes testados foram DMF, DMSO, NMP, 20% DMSO/NMP

e 25% DMSO/tolueno. As medições foram feitas a 60°C.

3.2.4. Sínteses convergentes em temperatura ambiente e a GO°C

3.2.4.1. Acoplamento de Boc-K(2-e1-l}APS(Bzl}G-OH (FIII-OH) a H2N-

D(OcHex}PS (Bzl}H(Tos}R(Tos}IS(Bzl}D(OcHex)R(Tos)D(OcHex)Y (2-Br-l)MGWMD

(OcHex}F -MBHA (FI-MBHA)

A. Escala analítica

A peptidil-resina FI-MBHA teve o grupo Boc removido em solução de 50% de

TFA em DCM por 20 minutos quando foi lavada, neutralizada e seca. 5,84 mg (0,866

J.Lmol) foram então transferidos para um frasco de vidro contendo 1,72 J.Lmol de FIII-OH,

0,8 mg (1.72 J.Lmol) de TBTU, 500 J.LL de DMF e DIPEA até obter um pH aparente de 9

10. A mistura reacional foi deixada sob agitação num shaker a 37°C. A reação de

acoplamento foi monitorada por RP-HPLC e teste de ninidrina nos tempos de O, 4, 8,

17,21,24,30 e 48 horas.

B. Maior escala

A peptidil-resina FI-MBHA teve o grupo Boc removido em solução de 50% de

TFA em DCM por 20 minutos quando foi lavada, neutralizada e seca. 50 mg (7,415

J.Lmol) foram então transferidos para um frasco de vidro contendo 14,83 J.Lmol de FIII

OH, 5,2 mg (14,83 J.Lmol) de TBTU, 1 mL de DMF e DIPEA até obter um pH aparente

de 9-10. A mistura reacional foi deixada sob agitação num shaker a 37°C. A reação de

acoplamento foi monitorada por RP-HPLC e teste de ninidrina nos tempos O, 4, 8, 17,

21, 24, 30 e 48 horas.

C. Influência do solvente e do reagente acoplador nos acoplamentos

Seguiu-se o mesmo procedimento usado em temperatura alta (60°C), tendo o

DMF sido trocado por NMP, 25%DMSO/tolueno e 20%DMSO/NMP. Uma vez

determinado o melhor sistema de solvente, trocou-se o reagente acoplador TBTU por

BOP, EDC + HOBt e HATU.


3.2.4.2. Acoplamento de Boc-R(Tos)C(StBu)VT(tBu)Y(tBu)C(StBu)R(Pmc)G-OH

(FIIGOM-OH) a H2N-R(Tos)QC(MeBzl)R(Tos)R(Tos)LC(MeBzl)Y(2-Br-Z)K(2-C1

Z)E(MBHA)-OFm (FIGOM-MBHA)

A peptidil-resina FIGOM-MBHA teve o grupo Boc removido em solução de 50%

de TFA em DCM por 20 minutos quando foi lavada, neutralizada e seca. 20 mg (4,224

Ilmol) foram então transferidos para um frasco de vidro contendo 8,448 Ilmol de

FIIGOM-OH, 2,63 mg (8,448 Ilmol) de TBTU, 500 IlL de DMF e DIPEA até obter um pH

aparente de 9-10. A mistura reacional foi deixada sob agitação num shaker a 37°C. A

reação de acoplamento foi monitorada por RP-HPLC e teste de ninidrina nos tempos de

2,4,8, 17,24 e 27 horas.

A. Influência do reagente acoplador nos acoplamentos

Seguiu-se o mesmo procedimento em temperatura alta (60°C) trocando-se o

reagente acoplador TBTU por BOP, EDC + HOSt e HATU.

3.3. Métodos analíticos

3.3.1. Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC; Mant e

Hodges, 1991)

Estas análises foram feitas num cromatógrafo da marca Waters, o qual era

composto de duas bombas Waters 510, um detector Waters 486, um injetor Rheodyne

7125, um integrador Waters 745S Data Module e uma coluna Vydac C18 analítica (0,45

cm x 25,0 cm, 5 Ilm e 300 A).Nas análises dos peptídeos protegidos foi empregado o seguinte sistema de

solventes: A= 0,1% TFAlH20 e B= acetonitrila 90% em água contendo TFA 0,09%. Na

análise de peptídeos livres empregou-se o mesmo solvente A e acetonitrila a 60% em

água contendo TFA 0,09% como solvente S.

As condições analíticas foram: gradiente 5 - 95% de solvente S em 30 min,

fluxo de 1 mUmin e À = 210nm.

3.3.2. Análise de aminoácidos (Smillie e Nattriss, 1991)

A. Hidrólise das peptidU-resinas

As hidrólises totais das peptidil-resinas (1 mg) foram realizadas numa estação

Matenais e Métodos 34

de trabalho Pico-Tag (Waters, Millipore, Massachussets, USA) em presença de 600 f.11

de ácido clorídrico-ácido propiônico (1: 1, v/v) a 130°C por 24 ou 48 h. Após a hidrólise,

as amostras foram secas utilizando-se uma bomba de alto vácuo acoplada a um

dessecador contendo KOH para neutralizar os vapores ácidos.

B. Análise dos hidrolisados e determinação dos seus conteúdos de aminoácidos

Após diluição com tampão de análise (NaS, Beckman, USA), os conteúdos de

aminoácidos dos hidrolisados foram determinados em um analisador de aminoácidos

da Beckman ("Series 6300 High Performance Amino acid analyzer"), empregando-se o

método de derivatização pós-coluna. Neste, os aminoácidos livres são separados por

HPLC de troca iônica e detectados como produtos de reação com ninidrina (NIN-RXTM,

Beckman, USA) a 440 nm e 570 nm.

As proporções molares entre os diferentes aminoácidos detectados foram

conseguidas tomando-se como referência uma mistura padrão que contém 5 nmol de

cada um dos 19 aminoácidos detectados.

3.3.3. Medidas espectrofotométricas

As medidas espectrofotométricas foram feitas com um espectrofotômetro

Shimadzu UV-1601PC acoplado a um computador.

3.3.4. Espectrometria de massas (Voyksner, 1997)

As análises por espectrometria de massas (LC/ESI-MS) foram feitas em dois

tipos de espectrômetro de massas:

- Triplo quadrupolo modelo Quattro 11 da Micromass com fonte de ionização por

electrospray, o qual estava acoplado a um sistema de RP-HPLC da Shimadzu,

composto por duas bombas Shimadzu LC-10AD, um detector Shimadzu SDP-10AV e

um injetor Rheodyne 7125. Neste caso utilizou-se o software MassLynx™ para

WindoV'{s NT nas análises dos espectros.

- Simples quadrupolo modelo Micromass ZMD com fonte de ionização por electrospray,

o qual estava acoplado a um sistema de RP-HPLC do sistema Alliance da Waters

(2690 Separation module), um detector photodiode array 996 da Waters e um injetor

Rheodyne 7125. Neste caso utilizou-se o software MassLynx™ para Windows NT nas

análises dos espectros.

Resultados e Dicussão 35

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para o desenvolvimento do projeto tivemos inicialmente que considerar alguns

critérios no planejamento da estratégia sintética a ser explorada. O primeiro passo foi

selecionar resinas, solventes, reagentes acopladores e temperaturas a serem

utilizados. Em seguida, tivemos que decidir sobre os fragmentos a serem sintetizados e

usados como os reagentes solúveis (doadores de acila) das condensações posteriores

em temperatura alta. Para tal, foi levado em conta que não eram desejáveis peptídeos

maiores do que 15 resíduos e a possibilidade de ocorrência de racemização de

aminoácidos C-terminais durante o processo de ativação química (Albericio e coL,

1997). Assim, optamos inicialmente por fragmentos que tivessem como resíduo C

terminal a glicina (que por não ser quiral, não racemiza) ou a prolina (que por razões

estéricas desfavorece fortemente a formação de sais de oxazolona, intermediário

formado durante a reação secundária) (Benz, 1994).

Estes seriam construídos sobre as seguintes resinas:

1) KOR para o caso da síntese da colecistocinina-33 não sulfatada via estratégia t-Boc,

devido ao fato de a ligação éster de oxima formada entre ela e o peptídeo ser sensível

a ataques nucleofílicos, propriedade esta amplamente explorada na preparação de

fragmentos protegidos empregados em SCPFS convencional (DeGrado & Kaiser, 1980;

Esquema 12).

2) 2-CI-Trt para o caso da síntese do análogo de gomesina via estratégia Fmoc, devido

ao fato de a ligação peptídeo-resina ser muito ácido lábil, o que também facilita a

geração de fragmentos protegidos para a SCPFS convencional (Barlos e co!., 1991).

A decisão pela MBHA no caso dos fragmentos ainda ligados à resina que

funcionariam como receptores de acila foi feita com base na sua propriedade de formar

com os peptídeos uma ligação amida (Matsueda & Stewart, 1981). Como foi indicado

no Esquema 13, o resíduo C-terminal (ácido glutâmico) da seqüência natural da

gomesina seria acoplado à resina MBHA pela cadeia lateral para que assim, após a

clivagem e desproteção total do peptídeo, fosse gerada a glutamina presente no

análogo desejado. Tal situação facilitaria a ciclização cabeça-cauda do peptídeo

quando ainda ligado à MBHA, objetivo de um outro projeto em desenvolvimento em

nosso laboratório.

Resultados e Dicussão 36

Polímero

Boc.~·....•~.~N

H2N.terminal (ciclização)

---•• Boc·~·····~·AAo·NH.NH2

-----:l... Boc.~·...·AA1·AAo·OR

Boc·~·...·AA1·peptidil·O

• LAAn·...·~·pePtidil-cê)JEsquema 12. Desligamento do peptídeo da KOR por diversos nucleófilos

(DeGrado & Kaiser, 1980).

o Esquema 13 mostra a estratégia sintética preliminar estabelecida. Esta

deveria ser testada experimentalmente para só então vir a se tornar aquela a ser

empregada.

4.1. Síntese das peptidU·resinas desejadas

Procedeu-se então à tentativa de obter as peptidil-resinas que nos

proporcionariam os fragmentos peptídicos desejados.

As sínteses manuais das peptidil-resinas ocorreram normalmente por SPFS

passo a passo convencional (Stewart & Young, 1984; Varanda & Miranda, 1997) ou em

temperatura alta utilizando protocolos adaptados no nosso laboratório para uso rotineiro

(Varanda & Miranda, 1997). Após as aminoacilações da KOR e da 2-CI-Trt determinou

se o grau de substituição das aminoacil-resinas resultantes pelo método do ácido

pícrico (Gisin, 1972; item 111-2.1.1.) ou por análise de aminoácidos (Smillie & Nattriss,

1991, item 111-3.2). Em seguida, realizou-se o alongamento das seqüências. Uma vez

obtidas, as peptidil-resinas foram secas e pesadas. Amostragens delas foram: 1)

totalmente hidrolisadas, para determinação dos seus conteúdos de aminoácidos e

graus de substituição; 2) submetidas à clivagem/desproteção total para obtenção dos

peptídeos brutos correspondentes que foram analisados por RP-HPLC e LC/ESI-MS.

Colecistocinina-33 humana não sulfatada

Boc-R6 (Tos)MS(BzI)IVK(2-CI-Z)NLQNLD(OcHex)p18-KOR

IBoc-R(T")MS(""'VK(2rZ)NlQNlo(OeH~)P-QH

BOC-K1(2.CI-Z>r

S(BzIlG

S

.KOR I REMoçÃO 00 Boc

8Qc.K(2-CI-Z)APS(BzI)G.OH H-RaoslMS(BzOIYK<2-CI-Z}NLQNLD{OcHex)pS(BzDHaoslR(ToslIS(BzDD(OcHexlRaoslD(OcHexlY(2-Br-ZlMGWMDCOcHexlF-MBHA

I 2' CONDENSAÇÃO IBoc-K(2-CI-Z)APS(BzI)GR(Tos)MS(BzQIVK(2-CI-Z)NLQNLD(OcHex)PS(BzQH(Tos)R(Tos)IS(BzQD(OcHex)R(Tos)D(OcHex)Y(2·Br-Z)MGWMD(OcHex)F-MBHA

I

W"'-J

~CJ)c::6fg.cnCDO(;i"nc::~~

CONDENSAÇÃO I M~HA

Boc-R(Tos)C(StBu)VT(tBu)Y(tBu)C(StBu)R(Pmc)G17 R18(Tos)Q1C(MeBzI)R(Tos)R(Tos)LC(MeBzl)Y(2-Br-Z)K(2-CI-Z)E9-OFm

I CUVAGEM E DESPROTEÇÃO TOTAL

H.R10CVTYCRG17 R18Q lCRRLCYKQ9·0Fm

[Gln1]-gomesina

Boc-R10(Tos)C(StBuI)VT(tBu)Y(tBu)C(StBu)R(Pmc)G17-2 -CI-Trt

I

Esquema 13. Estratégia sintética preliminar para a SPFS convergente da colecistocinina-33 humana nêo sulfatada e da [Gln]1gomesina. A numeraçêo dos resíduos corresponde àquelas dos peptfdeos naturais.

Resultados e Discussão 38

4.1.1. Estudo preliminar da obtenção das peptidil-resinas relativas à

colecistocinina-33 não sulfatada

A. Boc-K{2-CI-Z)APS{Bzl)G-KOR

A síntese desta peptidil-resina foi realizada por SPFS passo a passo

convencional (em temperatura ambiente) via estratégia Boc usando TBTU como

reagente acoplador. O ganho de massa sobre a resina foi de 0,576 g. A análise de

aminoácidos do hidrolisado obtido mostrou um baixo conteúdo de serina que como é

sabido, é degradado parcialmente durante a hidrólise ácida. 05 outros aminoácidos

apresentaram-se na proporção molar esperada (Tabela 4). A análise por RP-HPLC

(Figura 2) e LC/ESI-MS (Figura 3) do peptídeo c1ivado e totalmente desprotegido

(bruto; 13,85 mg a partir de 48,71 mg de peptidil-resina) indicam que o peptídeo

desejado corresponde ao pico majoritário dos cromatogramas (pico 1 da Figura 2).

Observou-se também a presença de dois outros subprodutos principais, sendo um

deles o tetrapeptideo H-KAPS-OH (2) e o outro um composto cuja massa é superior a

do pentapeptídeo em 28 unidades (3).

Como a ocorrência de reações secundárias é normalmente esperada na SPFS

passo a passo (e, portanto, os peptídeos brutos dela provenientes são geralmente

acompanhados de subprodutos) e levando em conta que o produto desejado é o

componente majoritário, consideramos que a síntese em questão foi bem sucedida e

que o Boc-K(2-CI-Z)APS(Bzl)G-KOR era suficiente à realização do estudo desejado.

B. Boc-S{Bzl)H{Tos)R(Tos)IS{Bzl)D(OcHex)R{Tos)D(OcHex)Y( 2-Br-Z)MGWM

D(OcHex)F -MBHA

Este fragmento foi sintetizado por SPFS passo a passo em temperatura alta

(60°C) via estratégia t-Boc usando como reagentes acopladores DIC e HOBt. Não

houve necessidade de reacoplamentos e os tempos requeridos para os acoplamentos

e desproteções foram diminuídos sensivelmente. O ganho de massa sobre a MBHA foi

de 2,09 g.

A análise de aminoácidos da peptidil-MBHA resultante apresentou as

proporções molares esperadas (Tabela 4) e, como esperado para a hidrólise ácida

realizada, o triptofano não foi detectado, a serina e treonina foram parcialmente

destruidos, a quantidade de metionina se mostrou baixa provavelmente devido à

oxidação e conseqüente conversão em sulfóxido (Smith, 1997).

Ui'u.::::l~..'üc...,Q..

3oUI,Qc( 2

oTempo (mln)

Resultados e Discussllo 39

30

Figura 2. Análise por RP-HPLC do bruto resultante da clivagem da resina e

desproteção total de Boc-K(2-C1-Z)APS(Bzl)G-KOR. Condições: Solvente A:

0,1%TFAlágua, solvente B: 10% acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30

minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, À: 210 nm.

A análise por RP-HPLC (Figura 4) do peptídeo clivado e totalmente

desprotegido (bruto; 23,05 mg a partir de 52,58 mg de peptidil-resina) mostrou a

presença de quatro componentes principais. A análise por LC/ESI-MS (Figura 5)

indicou que o composto majoritário (1 da Figura 4) correspondia ao peptídeo desejado

e que os componentes 2, 3 e 4 apresentavam além das massas iguais ao do desejado,

massa de seu análogo oxidado nas metioninas. Estes resultados sugeriram que a

síntese forneceu como produtos: SHRISDRDYMGWMD (componente 1),

SHRISDRDYM(O)GWM(O)D e três estereoisômeros (presentes nos componentes 2, 3

e 4). A ocorrência de racemização e oxidação de metionina é inerente ao processo de

SPFS passo a passo convencional, porém o uso da temperatura alta pode ter

intensificado estas reações secundárias.

C. Boc-R(Tos)MS(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNLD(OcHex)P-KOR

Este fragmento foi sintetizado por SPFS passo a passo convencional (em

temperatura ambiente) via estratégia t-Boc usando TBTU como reagente acoplador. A

análise de aminoácidos da peptidil-resina indicou que a seqüência resultante não

continha a prolina nem o ácido áspartico ou uma das asparaginas (Tabela 4). A análise

Resultados e Discuss§o 40

por RP-HPLC do peptídeo bruto (8,48 mg) resultante da clivagem e desproteção total

de 50,31 mg de peptidil-resina confirmou que a síntese não foi boa (dados não

mostrados).

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7.41

9.312iilm1

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1.. H-KAPS-OH G!.. t9fi. [M+Ht .. 214 2}4 .' . .

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Figura 3. Análise por LC/ESI-MS do bruto resultante da clivagem da resina e

desproteção total de Boc-K(2-CI-Z)APS(Bzl)G-KOR. Condições: Solvente A:

0,1%TFNágua, solvente B: 10% acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30

minutos, fluxo: 1 mUmin, 1..: 210 nm, capilar: 3 kV, cone: 37 kV, modo de ionização: ES+.


Tabela 4. Conteúdo de aminoácidos das peptidil-resinas derivadas da hCCK-33

não sulfatada

Peptidil-resina Conteúdo (esperado) observado

Fragmento 5 aminoácidos-KORSer (1,OO) 0,30; Pro (1,00) 1,00; Gly (1,00)

1,00; Ala (1,00) 1,23; Lys (1,00) 1,00

Asp (3,00) 3,17; Ser (1,00) 0,4; Gly (1,00)

Fragmento 15 aminoácidos-MBHA1,00; Met (2,00) 1,37; lIe (1,00) 1,00; Tyr

(1,00) 1,03; Phe (1,00) 1,10; His (1,00) 1,00;

Arg (2,00) 2,03; Trp (*).

Asx (2,00) 2,00; Pro (1,00) O, Gln (1,00) 1,05;

Fragmento 13 aminoácidos-MBHASer (1,00) O; Vai (1,00) 1,00; Met (1,00) 0,90;

lIe (1,00) 1,10; Leu (2,00) 1,45; Lys (1,00)

1,10; Arg (1,00) 1,10

Asp (4,OO) 4,70; Ser (1,00) 1,00; Pro (1,00)

Fragmento 17 aminoácidos-MBHA0,95; Gly (1,00) 1,05; Met (2,00) 1,65; lIe

(1,00) 1,00; Tyr (1,00) 1,05; Phe (1,00) 1,15;

His (1,00) 1,05; Arg (2,00) 2,30; Trp (*)

Asn (2,00) 1,55; Ser (1,00) 0,20; Gln (1,00)

Fragmento 11 aminoácidos-KOR0,95; Vai (1,00) 1,00; Met (1,00) 0,85; lIe

(1,00) 1,00; Leu (2,00) 1,60; Lys (1,00) 1,25;

Arg (1,00) 1,45

(*) Não detectado

A análise por LC/ESI-MS confirmou a deleção da prolina e do ácido aspártico no

peptídeo (primeiro e segundo aminoácidos acoplados na resina KOR,

respectivamente), devido à formação de dicetopiperazina (DCP; Esquema 14) durante

a neutralização in situ no acoplamento da leucina (terceiro aminoácido da seqüência). A

formação de DCP é uma outra reação secundária usual da SPFS passo a passo

convencional seqüência-dependente (Stewart & Young, 1984) que pode ser favorecida

pela presença do éster de oxima formado entre a glicina ou a prolina com a KOR

(Albericio e col., 1997).

Em função destes resultados negativos definimos que esta não era uma boa

estratégia sintética. Assim, optamos por modificá-Ia segundo o Esquema 15.


2

3

oTempo (mln)

30

Figura 4. Análise por RP-HPLC do produto bruto resultante da clivagem da resina

e desproteçio total de Boc-S(Bzl)H(Tos)R(Tos)IS(Bzl)D(OcHex)R(Tos)D(OcHex)Y

(2-Br-Z)MGWMD(OcHex)F-MBHA. Condições: Solvente A: 0,1%TFNágua, solvente B: 60%

acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin,

atenuação: 512, À.: 210 nm.

+Ho_t~1:::--

I"""#'

O·/N~

H2N-Asp(OcHex)-Pro-KOR Dicetopiperazina KOR

(dipeptideo cíclico)

Esquema 14. Formação de dicetopiperazina (DCP) durante o alongamento do

peptídeo sobre a resina oxima de Kaiser.


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Figura 5. Análise por LC/ESI-MS do produto da clivagem da resina e desproteção

total de Boc-5(Bzl)H(Tos)R(Tos)IS(Bzl)D(OcHex)R(Tos)D(OcHex)Y(2-Br

Z)MGWMD(Oc-Hex)F-MBHA. Condições: Solvente A: 0,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila

em água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, À: 210 nm, capilar: 3

kV, cone: 37 kV, modo de ionização: ES+.

~

Colecistocinina-33 humana não sulfatada

Boc·R6 (Tos)MS(Bzl)IVK(2-CI.Z)NLONL16·KOR

~Cf)s:::-Q)

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2'CONDENSAÇAo

Boc·K(2-CI-Z)APS(BzI)GR(Tos)MS(BzI)IVK(2·CI·Z)NLONLD(OcHex)PS(BzI)H(Tos)R(Tos)IS(BzI)D(OcHex)R(Tos)D(OcHex)Y(2·Br·Z)MGWMD(OcHex)F·MBHA

I

Boc·K1(2.CI-Z>rS(BzQG5·KOR

Boo-Ka-W'jes'",DG-OH

Esquema 15: Estratégia sintética final para a tentativa de SPFS convergente da colecistocinina-33 humana não sulfatada

ÀJ:o.


4.1.2. Obtenção das peptidil-resinas relativas à colecistocinina-33 não sulfatada.

Como é possível observar, manteve-se o fragmento de 5 aminoácidos e

concebeu-se o novo fragmento central contendo 11 aminoácidos, sendo o resíduo C

terminal a Leu (que tem uma cadeia lateral pequena e não funcionalizada; Benz, 1994).

Assim, o fragmento de 15 aminoácidos ligado na resina MBHA foi também alongado

pelo acoplamento de uma prolina seguida do ácido aspártico (o que o converteu em um

fragmento de 17 resíduos de aminoácidos).

A. Boc-D(OcHex)PS(Bzl)H(Tos)R(Tos)IS(Bzl)D(OcHex)R(To s)D(OcHex)Y{2-Br-

Z)MGWMD{OcHex)F-MBHA

Ambos os derivados de aminoácidos foram acoplados mediante ativação por

DIC e HOBt. A análise de aminoácidos da peptidil-MBHA resultante (bruto; 27,96 mg a

partir de 50,64 mg) apresentou as proporções molares esperadas (Tabela 4). Como foi

mostrado na Figura 3, o fragmento de 15 aminoácidos continha estereoisêmeros e

contaminante decorrente da oxidação das metioninas que também foram detectados

pela análise por RP-HPLC e LC/ESI-MS (Figuras 6 e 7) no novo fragmento de 17

aminoácidos.

1

o 30Tempo (mln)

Figura 6. Análise por RP-HPLC do bruto resultante da clivagem da resina e

desproteção total de Boc-D(OcHex)PS (Bzl)H(Tos)R(Tos)IS(Bzl)D(OcHex)R(Tos)

D(OcHex)Y(2-Br-Z)MGWMD(OcHex)F -MBHA. Condições: Solvente A: 0,1 %TFAlágua,

solvente B: 60% acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1

mUmin, atenuação: 256, Â.: 210 nm.

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(pepUdeo desejado oxidado[M+3HJ'3 (peptldeo desejado oxidado

[M+2HJ"

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H·OPSHRISDRDYMGWMDF·NH,tl (peplldeo desejado, [M+2HJ")

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Figura 7. Análise por LC/ESI-MS do produto bruto resultante da clivagem da

resina e desproteção total de Boc-D(OcHex)PS(Bzl)H(Tos)R(Tos)IS(Bzl)D(OcHex)

R(Tos)D(OcHex)Y(2-Br-Z)MGWMD(OcHex)F-MBHA. Condições: Solvente A: 0,1%

TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30

minutos, fluxo: 1 mUmin, Â: 210 nm, capilar: 3 kV, cone: 37 kV, modo de ionização: ES+.


B. Boc-R(Tos) MS(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-KOR

Esta peptidil-resina foi sintetizada por SPFS convencional (em temperatura

ambiente) utilizando como reagente acoplador o TBTU, sendo o ganho de massa de

617,52 mg. A aná~ise de aminoácidos do hidrolisado total !l1ostrou que as proporções

molares da leucina e asparagina apresentaram-se baixas, sugerindo que a reação de

formação de dicetopiperazina possa novamente ter ocorrido em alta porcentagem

(Tabela 4).

As análises por RP-HPLC (Figura 8) e LC/ESI-MS (Figura 9) do peptídeo bruto

obtido (39,45 mg a partir de 101,77 mg de peptidil-resina) indicaram que o componente

majoritário (pico 1 da Figura 8) corresponde ao peptídeo desejado, os subprodutos 3 e

4 a H-RMSIVKNLQ-OH e o componente 2 a H-RMSIVK-OH formado após a primeira

reação de dicetopiperazina. De fato, para o acoplamento do terceiro aminoácido

(glutamina) foram necessárias aproximadamente 24 horas.

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$.11'ijC<li 2.D.. 3o.. 4.DcC

oTempo (mln)

30

Figura 8. Análise por RP-HPLC do produto bruto resultante da clivagem da resina

e desproteção total de Boc-R(Tos)MS(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-KOR. Condições:

Solvente A: 0,1 %TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5

95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 256, À.: 210 nm.

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Resultados e Discussão 4B

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H·RMSM<NLQ-OH[M+H)'

1017,

H-RMSIVKNLONL-QH(peptrdeo desejado, (M+H]-)


resina e desproteção total de Boc-R(Tos) MS(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-KOR.

Condições: Solvente A: 0,1%TFA/água, solvente B: 60% acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA,

gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, À.: 210 nm, capilar: 3 kV, cone: 37 kV, modo de

ionização: ES+.


resina em presença de HF e "scavengers" para a obtenção do peptídeo bruto livre e

avaliação da síntese realizada não foi feita porque estas condições não são

apropriadas a peptidil-resinas sintetizadas pela química Fmoc (Atherton e Sheppard,

1989). De fato, a remoção total dos grupos Pmc, protetores do grupo guanido da

arginina, requer água no meio reacional não compatível com o uso de HF. Assim,

apenas a determinação do conteúdo de aminoácidos da peptidil-resina obtida foi

realizada (Tabela 5). Os resultados sugeriram que a síntese foi bem sucedida.

1

Ui11.:::I$.!!uc

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o Tempo (mln) 30

Figura 10. Análise por RP-HPLC do produto bruto resultante da clivagem da

resina e desproteção total de Boc-R(Tos)QC(MeBzl)R(Tos)R(Tos)LC(MeBzl)Y(2

Br-Z)K(2-CI-Z)E(MBHA)-OFm. Condições: Solvente A: O,1%TFNâgua, solvente B: 60%

acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin,

atenuação: 256, À: 210 nm.

4.1.4. Determinação dos graus de solvatação das peptidil-resinas sintetizadas

A determinação das propriedades de solvatação de peptidil-resinas é

fundamental em SPFS. De fato, a eficiência dos diferentes passos sintéticos pode ser

grandemente influenciada pelo grau de difusão dos reagentes através das malhas da

resina (Kent, 1988; Fields e Nobre, 1990; Cilli e col., 1996). Neste trabalho este

conhecimento foi necessário para a decisão das condições experimentais mais

adequadas à geração dos peptídeos protegidos a partir das resinas sobre as quais


foram construídos e para os acoplamentos entre estes doadores de acUa e os

peptídeos ligados à MBHA (receptores de acUa).

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Figura 11. Análise por LC/ESI-MS do produto bruto resultante da clivagern da

resina e desproteção total de Boc-R(Tos)QC(MeBzl)R(Tos)R(Tos)LC(MeBzl)Y(2

Br-Z)K(2-CI-Z)E(MBHA)-OFrn. Condições: Solvente A: 0,1%TFNágua, solvente B: 60%

acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA. gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, 1..: 210

nm, capilar: 3 kV. cone: 37 kV. modo de ionização: ES+


Por estas razões e diante do nosso interesse em empregar temperaturas altas

para agilizar estes processos, determinamos as propriedades de inchamento ou

solvatação a 60°C das peptidil-resinas em solventes ou misturas compatíveis com o

uso desta temperatura: DMF, DMSO, 20% DMSO/NMP, 25% DMSO/tolueno e NMP.

A Figura 12 mostra que: 1) a resina KOR se solvata melhor em 20%

DMSO/NMP, 25% DMSO/tolueno e NMP em comparação com DMF e DMSO; 2) todos

os solventes solvataram bem a resina MBHA, sendo o NMP o mais eficiente deles; 3) o

DMSO, 20% DMSO/NMP, 25% DMSO/tolueno e o NMP incham igualmente a 2-CI-Trt;

4) os valores obtidos para DMF a 3r e 60°C são praticamente idênticos, evidenciando

que o aumento da temperatura pouco afetou estas propriedades.

Os resultados da análise das peptidil-resinas da CCK-33 não sulfatada

indicaram que os melhores solventes foram: 20% DMSO/NMP, 25% DMSO/tolueno e

NMP. Novamente não se observou diferença significativa nos valores obtidos em DMF

a 37° e 60°C (Figura 13).

No caso das peptidil-resinas derivadas do [Gln1]-gomesina, ficou evidente que a

peptidil-MBHA se solvata nos solventes e misturas testadas, sendo o 20%DMSO INMP

ligeiramente superior. A peptidil-2-CI-Trt apresentou comportamento similar, porém não

se solvatou bem em DMSO (Figura 14).

4.1.5. Geração de fragmentos protegidos que funcionariam como doadores de

acila

Além de fornecer a proporção molar entre os resíduos contidos nas peptidil

resinas sintetizadas, a análise de aminoácidos também possibilitou a determinação dos

conteúdos peptídicos (graus de substituição; GS) das mesmas. A Tabela 6 descreve os

valores obtidos e os compara com os graus de aminoacilação das resinas de partida.

Como era esperado, observou-se que os GS diminuem conforme as cadeias peptídicas

crescem: quanto maior é o fragmento, menor é o grau de substituição da peptidil-resina

resultante. É importante mencionar, entretanto, que boa parte dos graus de

aminoacilação foram obtidos usando métodos diversos à análise de aminoácidos.

O conhecimento dos GS das peptidil-resinas sintetizadas era importante para a

quantificação das porcentagens de desligamento dos peptídeos protegidos (doadores

de acila) a partir das peptidil-KOR ou peptidil-2-CI-Trt preparadas e para o cálculo das

quantidades de peptidil-MBHA (receptores de acila) a serem empregadas nos

acoplamentos entre fragmentos.


Tabela 6: Grau de substituição das aminoacil-resinas de partida e das peptidil

resinas derivadas da CCK-33 não sulfatada e de [Gln]1-gomesina.

Peptidil-resina Grau de Grau de Substituição

amhloacilação da peptidil-resina c

h~,CI<-33 nãosulfatada, ...•,"', 1ii;'.t

< .t

Fragmento 17 aminoácidos -0,67 mmol/g a 0,1483 mmol/g c

MBHA

Fragmento 11 aminoácidos-0,4170 mmol/g b 0,2452 mmol/g ç

KOR

Fragmento 5 aminoácidos-0,687 mmol/g ç 0,3696 mmol/g ç

KOR

Análogo de gomesina ~ ". >; ~

" , ,,' , .... ' '. ',; . "i;/'

Fragmento 10 aminoácidos-0,67 mmol/g a 0,2112 mmol/g ç

MBHA

Fragmento 8 aminoácidos-0,6089 mmollg b 0,1068 mmol/g ç

2-CI-Trtb c

a Dado do fabncante. Determinado pelo teste de áCido pfcnco. Determinado por análise de

aminoácidos.

4.1.5.1. Hidrólise da ligação éster de oxima catalisada por DBU, NaOH ou

assistida por íons cálcio.

A obtenção dos peptídeos protegidos a partir das peptidil-KOR correspondentes

envolveu um estudo comparativo da hidrólise da ligação oxima em mistura THF/água

contendo DBU (Pichette e col., 1997) ou cálcio (esta metodologia está sendo

desenvolvida em nosso laboratório e consiste no uso de acetato de cálcio como aditivo

da hidrólise do éster de oxima; Moraes e col., 2001) e em mistura de uma solução de

NaOH 1M e dioxano (vlv, 1:3; Atherton e Sheppard, 1989). Como controle para as

reações mediadas por DBU e Ca+2 foi feita uma outra THF/água que não continha estes

mediadores.

A. Boc-K(2-CI-Z)APS(Bzl)G-OH

ü desligamento deste peptídeo da KüR em presença de NaOH foi mais rápido

fornecendo o produto nos primeiros 15 minutos (Figuras 150). Os rendimentos

reacionais (calculados a partir das diferenças entre os GS pré- e pós-tratamento) estão


mostrados na Tabela 7. Os altos valores (90%) apresentados podem estar associados

ao fato de o aminoácido ligado na resina ser a glicina que tem cadeia lateral pequena e

permite uma maior acessibilidade da ligação ao nucleófilo (água).

Igualmente, nas reações em presença de Ca+2 observou-se a formação de um

produto com tempo de retenção na coluna de RP-HPLC idêntico ao daquele obtido

pelas outras duas metodologias (Figura 15C). Este, entretanto, foi desligado da KOR

mais lentamente e com menor rendimento (Tabela 7).

As análises por RP·HPLC e LC/ESI-MS destes três tipos de hidrólise da ligação

oxima da peptidil-KOR em questão confirmaram que o componente majoritário 1

correspondia ao fragmento protegido desejado [Boc-K(2-CI-Z)APS(Bzl)G-OH). Os

subprodutos detectados devem ser decorrentes da síntese ou mesmo do uso das

condições reacionais de desligamento do peptídeo da resina citadas acima. Como

majoritariamente obtivemos o pentapeptídeo protegido desejado, a identificação de

cada um deles não foi priorizada.

B. Boe-R(Tos)MS(Bzl)IVK(2CIZ)NLQNL-oH

Os rendimentos das reações de desligamento deste peptídeo protegido a partir

da peptidil-KOR através da hidrólise da ligação oxima estão descritos na Tabela 7.

As análises por RP-HPLC dos meios reacionais indicaram a presença de muitos

subprodutos em todas as reações (Figura 16), mas não a do fragmento protegido

desejado. As análises por LC/ESI-MS indicaram que muitos destes subprodutos eram

derivados de reação de formação de dicetopiperazina (OCP) e de oxidação da

metionina (Tabela 8). As análises de aminoácidos das peptidil-KOR remanescentes

indicaram que mesmo após exposição a DBU, NaOH e Ca2+ o peptídeo desejado

permaneceu ligado na resina e que somente foram desligados os subprodutos da

síntese.

Fez-se ainda uma tentativa de trocar a mistura THF/água por NMP/água e

aumentar o tempo de reação. Igualmente, não se conseguiu desligar o fragmento

protegido desejado (dados não mostrados).

A 50 h

I B IOBU11 4 h.

íii rl...:J :J~ ~• .!!g g

1 1

1I..! .!c c

o 30 O 30

Tempo (mln) Tempo (mln)

C 50 h D I I 15 min

íii íii... I ...:J :J~ ~.!! .!!" gc

1 ~11 I J I I ~I lã'C c

fi)

iâ

o 30 O 30

I~Tempo (mln) Tempo (min)

()

Figura 15. Análise por RP-HPLC dos produtos da hidrólise da ligação oxima de Boc-K(2-CI-Z)APS(Bzl)G-KOR a 60°C. ~

I~Condições: Solvente A: 0,1 %TFAlágua, solvente B: 90% acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin,

atenuação: 512, À: 210 nm. A) Controle, B) DBU, C) Ca+2 e D) NaOH..~

A 50 h BDeu 4 h.

üiu.::l~.!!ll!!

I. ..5 /l~i

-JL~~

~::l~

1.!C

Figura 16. Análise por RP-HPLC dos produtos da hidrólise da ligação oxima de Boc-R(Tos)MS(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-KOR

a 60°C. Condições: Solvente A: 0,1 %TFNágua, solvente B: 90% acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1

mUmin, atenuação: 512, À: 210 nm. A) Controle, B) DBU, C) Ca+2 e D) NaOH.

t

~~

~::l~

iC

o

o

c

Tempo (mln)

Tempo (mln)

30

50 h

30

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jC

o

o

o

Tempo (mln)

Tempo (mln)

4 3 2

30

•15min

30

fi~CD

i'a:(1)

i&.o

I~

Tabela 7: Rendimentos das hidrólises da ligação oxima das peptidil-KOR.

T.A.: temperatura ambiente; a Tempo de reação: 50 h, D Tempo de reação: 4 h, c Tempo de reação: 15 mino

Boc-K(2-CI-Z)APS(Bzl)G-KOR

Boc-R(Tos)MS(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-KOR

18

9

20

5

92

20

95

36

49

15

59

26

95

27 ::tJmi~(1)

c~.

()

~8fto

s


Em conjunto estes resultados nos fizeram suspeitar que a geração de peptídos

protegidos a partir de peptidil-KOR nem sempre é trivial. A literatura disponível,

entretanto, não descreve estas dificuldades e simplesmente apresenta a resina KOR e

os 'procedimentos de mediação da hidrólise do éster de oxima mediados por NaOH e

DBU como totalmente adequados a este propósito (Atherton e Sheppard, 1989;

Pichette e col., 1997).

Tabela 8: Análise por E51/M5 dos produtos da reação de hidrólise do éster de

oxima de Boc-R(Tos)M5(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-KOR

DBU ou NaOH

(*) E o íon majoritário

3

2

4

5

76

23

8

4

--Condiçõesceacionais'

Reação controle e empresença do Ca2

+

Experimentos prevlos realizados em nosso laboratório indicaram que o

desligamento de um tripeptídeo ligado à KOR contendo a leucina como resíduo C

terminal fornecia rendimentos baixos (Proti e Miranda, 2002). Como já citado, pouco

sobre o assunto é encontrado na literatura.

Assim, decidiu-se fazer um estudo mais detalhado deste problema sintetizando

novamente o peptídeo com interrupções freqüentes no crescimento da cadeia (3°, 6° e

9° resíduos a partir do C-terminal) para análise de aminoácidos da peptidil-KOR

resultante, desligamento do peptídeo protegido da KOR e sua análise por RP-HPLC e

LC/ESI-MS.


Em comparação com o acoplamento do primeiro aminoácido à KOR que levou a

um grau de aminoacilação de 0,827 mmol/g, o GS do tripeptidil-KOR foi drasticamente

menor (- 50%). Isto ocorreu devido à formação de dicetopiperazina (a presença de

glutamina ou asparagina como terceiro aminoácido na seqüência pode favorecer; Benz,

1994). Como era esperado para qualquer síntese pelo método da fase sólida, à medida

que a seqüência é alongada o grau de substituição diminue. A undecapeptidil-KOR

obtida foi clivada da resina e desprotegida totalmente em presença de HF para

avaliação do processo sintético. A análise do peptídeo bruto por RP-HPLC e LC/ESI

MS forneceu perfil e resultados similares aos mostrados na Figuras 8 e 9,

evidenciando que a síntese foi novamente bem sucedida.

As análises por RP-HPLC e LC/ESI-MS dos produtos brutos obtidos a partir da

hidrólise da ligação oxima das tripeptidil-, hexapeptidil-, nonapeptidi 1- e undecapeptidil

KOR (Tabela 9) mostraram que as reações forneceram apenas o tri- e o hexapeptídeo

majoritariamente (Figura 17). A Tabela 10 lista os vários subprodutos formados.

Tabela 9. Estudo do desligamento da Boc-R(Tos)MS(Bzl)IVK(2-eI-Z)NLQNL-OH.

GS Iniciai: GS da peptldll-reslna antes do desligamento do peptldeo;

GS final: GS da peptidil-resina remanescente.

Peptídeo protegido GSlnlclal GS flnal Rendimento

Boc-NLQ-OH 0,451 0,034 92,5

Boc-K(2-CI-Z)NLQNL-OH 0,366 0,318 13,0

Boc-5(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-oH 0,385 0,354 8,0

Boc-R(Tos)MS(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-oH 0,307 0,281 8,5... ..

o procedimento que utiliza 1-hidroxipiperidina/Zno não foi utilizado para estas

reações pelas seguintes razões: 1) o peptídeo continha metionina que envena o

catalisador (Benz, 1994) ; 2) a 1-hidroxipiperidina não é comercial e não dispúnhamos

de tempo hábil para sintetizá-Ia.

Pela literatura de síntese convergente deduz-se que escolher o tamanho dos

fragmentos é uma tarefa difícil (L1oyd-Williams e coL, 1993; Benz, 1994). Não existe

discussão sobre os problemas na sua obtenção na forma protegida, pois geralmente se

emprega fragmentos protegidos pequenos (até um máximo de 10 aminoácidos; Benz,

1994) para aumentar as suas solubilidades durante os acoplamentos. Entretanto,

alguns poucos trabalhos descrevem o emprego de fragmentos protegidos contendo

Figura 17. Análise por RP-HPLC dos produtos da hidrólise dos fragmentos: A) Boc-QNL-KOR, B) Boc-K(2-CI

Z)NLQNL-KOR, C) Boc-5(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-KOR e D) Boc-R(Tos)S(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-KOR.

Condições: Solvente A: O,1%TFAlágua, solvente B: 90% acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos,

fluxo: 1 mUmin, atenuação: 256, À: 210 nm.

íê:::I$~

I<

o

o

cTempo (mln)

Tempo (mln)

30

30

íê:::I$~g

j<

o

o

oTempo (min)

Tempo (min)

30

30

i'CI)

t~CD

~gEo~


mais de 15 aminoácidos em acoplamentos bem sucedidos (Gisin e coL, 1972, 1981;

Kaiser e coL, 1989; Kubiak e coL, 1987).

Tabela 10: Analise por ESI/MS dos produtos da reação de hidrólise doéster de oxima das peptidil-resinas Boc-QNL-KOR, Boc-K(2-CI-Z)NLQNLKOR, Boc-5(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-KOR e Boc-R(Tos)MS(Bzl)IVK(2-CIZ)NLQNL-KOR.

.Peptidil-resina ~. Estrutura provável

dets ,..~,.

pipnafig.

.,

,. , t ~ 17 , ,

1 Boc-QNL-OHBoc-QNL-KOR 2 Boc-Q-OH

3 Boc-QNLL-OH1 Boc-K(2-CI-Z)NLQNL-OH2 Boc-K(2-CI-Z)NL-OH

Boc-K(2-CI-Z)NLQNL-KOR 3 Boc-K(2-CI-Z)-OH(*)Boc-K(2-CI-Z)NLQNLL-OH

4 Boc-K(2-CI-Z)NLQ-OH1 Boc-S(BzI)IVK(2-CI-Z}NL-OH

Boc-S(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-KOR 2 Boc-S(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-OH3 Boc-S(Bzl}IVK(2-CI-Z)NLQ-OH4 Boc-S(BzI)IVK(2-CI-Z}NLQN-OH1 Boc-R(Tos)M(O)S(Bzl)IVK(2-CI-Z)NL-OH

Boc-R(Tos}M(O)S(Bzl)IVK(2-CI-Z}-OH2 Boc-R(Tos)M(O)S(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQ-OH

Boc-R(Tos)MS(Bzl)IVK(2-CI-Z)NLQNL-KOR Boc-R(Tos)MS(BzI)IVK(2-CI-Z}N-OH3 Boc-R(Tos)M(O)S(Bzl}IV-OH

Boc-R(Tos)M(O)S(Bzl)l-OH4 Boc-R(Tos}M(O}S(Bzl}-OH

* E o íon ma'oritário( )

Estes resultados confirmaram que a geração de fragmentos protegidos a partir

de peptidil-KOR nem sempre é trivial e que o assunto demanda estudos sistemáticos

não disponíveis na literatura.

É importante lembrar que muitas das reações de hidrólise da ligação oxima de

peptidil-resinas aqui descritas foram realizadas em temperatura superior a 50°C. Isto é

inédito e se justifica pelo nosso interesse em investigar os benefícios, limitações e

desvantagens do uso de temperaturas elevadas em síntese de peptídeos (Varanda &

Miranda, 1997; Souza, 2000; Rivier & Miranda, 2001; Souza e coL, 2003).


c} Boc-R(Tos}C(StBu}VT(tBu}Y(tBu}C(StBu}R(Pmc}G-OH

Como foi citado anteriormente, a primeira síntese da peptidil-KOR

correspondente ao fragmento da [Gln1]-gomesina não foi bem sucedida apresentando

muitos subprodutos. Assim, decidiu-se repetir a síntese usando a estratégia Fmoc na

resina 2-CI-Trt. Esta resina é extremamente ácido lábil, o que permite desligar

peptídeos dela na forma totalmente protegida (Barlos e col, 1989).

Para isto lançou-se mão de dois tipos de procedimento recomendados na

literatura (Barlos e col., 1991): aquele que utiliza uma solução 1% de TFA e outro mais

brando que utiliza ácido acético, TFE e OCM nas proporções 2:2:6, 1:2:7 e 1:1:8 (v/v/v).

Os valores de GS das peptidil-resinas remanescentes indicaram que ambos levaram ao

desligamento total do peptídeo.

As análises dos meios reacionais por RP-HPLC (Figura 18) e LC/ESI-MS

(Figura 19; exemplo de um dos brutos analisados porque todos forneceram resultados

idênticos) evidenciaram a presença do produto nos primeiros 15 minutos para o caso

da misturas de AcOH: TFE: OCM. Todos os perfis apresentaram o mesmo componente

principal 1, o qual corresponde ao fragmento protegido desejado Boc

R(Tos)C(StBu}VT(tBu)Y(tBu)C(StBu)R(Pmc)G-OH. O componente 2 corresponde ao

peptídeo com perda dos dois primeiros aminoácidos via formação de dicetopiperazina

(OCP) [Boc-R(Tos)C(StBu)VT(tBu)Y(tBu}C(StBu)-OH] e o componente 3 ao [Boc

R(Tos)C(StBu)VT(tBu)Y(tBu)-OH].

Estes dados demonstraram que o desligamento de peptídeos da 2-CI-Trt na sua

forma protegida parece ser simples e bem mais trivial do que da KOR.

4.1.6. Acoplamento dos fragmentos protegidos (doadores de acila) às peptidil

MBHA (receptores de acila)

4.1.6.1. hCCK-33 não sulfatada

Na impossibilidade de no tempo disponível reàizar um estudo que possibilitasse

obter o fragmento central de 11 resíduos na sua forma protegida e tendo em mãos os

fragmentos N-terminal protegido (5 resíduos) e o lrterminal protegido (17 resíduos)

ligado na MBHA, foram feitas tentativas de acoplamento entre eles. Estas nos

permitiriam atingir um dos objetivos do trabalho: investigar se esta etapa da SCPFS

poderia ser agilizada pelo emprego de temperatura alia.

A B

ie~oSc

Io(

ij

Io(

Figura 18. Análise por RP-HPLC dos produtos da hidrólise da ligação éster de Boe

R(Tos)C(StBu)VT(tBu)Y(tBu)C(StBu)R(Pmc)G-2-CI-Trt. Condições: Coluna C4, Solvente A: O,1%TFAlágua, solvente B: 90%

acetonitrila em água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 40-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, 1..: 210 nm.

A)1%TFAlDCM, B) AcOH: TFE: DCM (2:2:3, v:v:v), C) AcOH: TFE: DCM (1:2:7, v:v:v) e D) AcOH: TFE: DCM (1:1:8, v:v:v) ..1St

i'~

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30

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Tempo (minI

Tempo (minI

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lj 12IIIl Boe-R(Tos)C(StBu)VT(tBu)Y(tBu)C{SIBu)-OHI ~~

~I

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[M+2Ht'

jBoc-R(Tos)C{SIBu)VT(tBu)Y(tBu)C{StBu)R(Pmc)G-OH

[M+Ht

J i i ,.TilJ1. I, i i i ,'i 1 ,li

f'3:ll:r1\.11~(3XIlOlI3Ill('UI2l~""'~Onl3lll:2Wí

'(Dl' 1 Boe-R(Tos)C(StSu)VT(tSu)Y(tSu)-OH[M+Ht

Lm..mlDl 70J lID ~1D)!!"",,1\41lXX1~""""5~I"":!~""'1!'1~~·"""'ic:'!!!!'· ~f!T'DJ.!:". .,....1lDl~~iJlll~·.......1lDJ~·.~. .,....1IIXI±"............:laX)'!',. ...,...21(D~"-Z1Xl"""<\o"...:zm........"-·XD~·.,""....."'_'*

Figura 19. Análise por LC/ESI-MS do produto bruto resultante da hidrólise da

ligação éster de Boc-R(Tos)C(StBu)VT(tBu)Y(tBu)C(StBu)R(Prnc)G-2-CI-Trt

(exemplo de um dos brutos analisados porque todos forneceram resultados idênticos).

Condições: Coluna: C4, Solvente A: O,1%TFNágua, solvente 8: 90% acetonitrila em água contendo

0,09% de TFA, gradiente: 40-95%8 em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, 11.: 210 nm, capilar: 3 kV, cone: 37 kV,

modo de ionização: ES+


Primeiramente, a peptidil-MBHA de 17 resíduos foi alongada por SPFS passo a

passo convencional com os 5 aminoácidos que levariam ao padrão de 22 resíduos a

ser obtido após clivagem da resina e desproteção total. Este foi analisado por RP

HPLC (Figura 20) e LC/ESI-MS (Figura 21) e apresentou apenas quatro componentes:

o majoritário 1 que corresponde ao peptídeo desejado de 22 aminoácidos, 2, 3 e 4 que

correspondem aos seus análogos oxidados e estereoisômeros. Estes contaminantes já

estavam presentes no material bruto resultante da síntese do fragmento C-terminal de

17 aminoácidos sobre a MBHA.

Ui"....~ ~ 2~.!!!uc 4<ClI.Q..o114(

oTempo(mIn)

30


resina e desproteção total de Boc-K(2-CI-Z)APS(Bzl)GD(OcHex)PS(Bzl)H(Tos)

R(Tos)IS(Bzl)D(OcHex)R(Tos)D(OcHex)Y(2-Br-z)MGWMD(OcHex)F-MBHA (padrão

da SPFS passo a passo). Condições: Solvente A: O,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em

água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, À.: 210

nm.

a) Influência da temperatura na eficiência de acoplamento

Tendo disponível o padrão, foram realizadas reações de acoplamento entre

fragmentos protegidos de 5 e 17 resíduos a 3rC e 60°C utilizando a abordagem

clássica. Para tal, foram empregados a DMF como solvente e o TBTU como agente

acoplador, sendo as reações monitoradas pelo teste de ninidrina e análise do meio

reacional por RP-HPLC.

Resufados eDiscussão 69

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....131'

pepllleo oxidado nas duas metionirias[M+2H)"

H-KAPSGIIPSHRISDRDYMGWMDF-NH,(~o desejado, [M+2H]")

,~

peptrdeo oxidado na. duas metioninas

til [M+3H]" ~eo oxidado nas duas metioninas[M+2Hr'

..

....

H-KAPSGDPSHRISDRDYMGWMDF-NH,(peptrdeo desejado, [M+3Hr')

H-KAPSGDPSHRISDRDYMGWMDF-NH,(peptrdeo desejado, [M+3Hr')

'uH~llil,,"~ 3Df17.23'ÍlSncM>.'400l


resina e desproteção total de Boc-K(2-eI-Z)APS(Bzl)GD(OcHex)PS(Bzl)H(Tos)

R(Tos)IS(Bzl)D(OcHex)R(Tos)D(OcHex)Y( 2-Br-Z)MGWMD(OcHex)F- MBHA (padrão

da SPFS passo a passo). Condições: Solvente A: 0,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em

água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mtJmin, À.: 210 nm, capilar. 3 kV,

cone: 37 kV, modo de ionização: ES+.


No caso da reação feita a 3rC o monitoramento se deu por 48 horas, momento

em que o teste de ninidrina mostrou-se negativo indicando que não havia mais grupos

amino livres (a reação tinha sido completada). A peptidil-MBHA foi filtrada, lavada, seca

e submetida à divagem e desproteção total para comparação por RP-HPLC e LC/E81

MS do peptídeo bruto obtido com o padrão de 22 resíduos citado acima (Figuras 22 e

23). Estas indicaram que na verdade a reação não tinha sido completada, pois ficou

clara a presença no peptídeo bruto do componente 5 que correspondia ao fragmento C

terminal de 17 resíduos (receptor de acila). Os componentes 2, 3 e 4 correspondiam

aos estereoisômeros do peptídeo desejado e aos análogos dele oxidados em uma ou

nas duas metioninas já presentes no receptor de acila.

Ui'LL:J~ 32..Ü 5c...,g...o• 4,gOI(

oTempo (mln)

30


resina e desproteção total da peptidil-resina Boc-K(2-CI

Z)APS(Bzl)GD(OcHex)PS(Bzl)H(Tos)R(Tos)IS(Bzl)D(OcHex)R(Tos)D(OcHex)Y(2-Br

Z)MGWMD(OcHex)F-MBHA sintetizada por SCPFS em DMF a 37°C na presença de

TBTU. Condições: Solvente A: 0,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em água contendo 0,09% de

TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, Â.: 210 nm.


7 uiRxacoDl_DMF'_TBTU_37C {07JJ7..oJ)

1

11.21'

17:11210nm

Ao'4.T3e6

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peptldeo oxidado nas duas metioninas(M+3Hf'

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(peptldeo desejado, [M+3Hr'l

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F.a~t~~==c:=~~peptldeo oxidado nas duas metioninas(peptldeo desejado, [M+3Hf'l (M+3HJ"

9'll,fiI!812 ,80 ll1I 7J3~781 fIli!?l llBlIM857 r111 ~,1Ql ,143,1171





TBTU. Condições: Solvente A: O,1%TFNágua. solvente B: 60% acetonitrila em água contendo 0,09% de

TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, 1..: 210 nm, capilar. 3 kV, cone: 37 kV, modo de

ionização: ES+.


o acoplamento realizado a eo°c foi monitorado por 21 horas apesar de o teste

de ninidrina ter sido negativo desde 8h de reação. As análises por RP-HPLC e LC/ESI

MS do peptídeo clivado da resina e totalmente desprotegido (Figuras 24 e 25)

forneceram perfis e espectros semelhantes ao do peptídeo padrão. O componente

majoritário 1 correspondia ao peptídeo desejado. Entretanto, este componente era

contaminado por quantidades mínimas do análogo oxidado nas duas metioninas. Os

outros componentes 2, 3 e 4 apresentavam, de forma semelhante ao padrão,

estereoisômeros do peptídeo e seus análogos oxidados em uma ou nas duas

metioninas.

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4c....Q..o•.Qcc

oTempo (mln)

30



Z)APS(Bzl)GD(OcHex)PS(Bzl)H(Tos)R(Tos)IS(Bzl}D(OcHex}R(Tos}D(OcHex}Y(2-Br

Z}MGWMD(OcHex}F-MBHA sintetizada por SCPFS em DMF a 60°C na presença de


TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, À.: 210 nm.

Este conjunto de resultados indicou que o emprego da alta temperatura agilizou

grandemente o acoplamento entre Boc-K(2-CI-Z)APS(Bzl)G-OH e D(OcHex)PS(Bzl)

H(Tos)R(Tos)IS(Bzl)D(OcHex)R(Tos)D(OcHex)Y(2-Br-Z)MGWMD(OcHex)F-MBHA em

DMF mediado por TBTU conforme desejado (48 para 8h para teste negativo de ninidri-

Resultados ,8 Discussão 73

"...

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peptldeo oxidado nas duas metianinas[M+2Ht'

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H-KAPSGDPSHRISDRDYMGWMDF-NH,(peptldeo desejado. [M+2Ht')

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pepUdeo oxidado em uma meUonina[M+3Ht'

peptldeo oxidado nas duas meUoninas[M+3Ht'

H-KAPSGDPSHRISDRDYMGWMDF-NH,(pepUdeo desejado. [M+3H]'')

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(pepUdeo desejado, [M+3Ht') pepUdeo oxidado nas duas metianinas[M+3Ht'

RGti':P_cM=_1BlU_iD;(07.à7~311(1áaQ~~

H-KAPSGDPSHRISDRDYMGWMDF-NH,(peptldeo desejado, [M+3H]'')





TBTU. Condições: Solvente A: O,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em água contendo 0,09% de

TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, Â.: 210 nm, capilar: 3 kV, cone: 37 kV, modo de

ionização: ES+


drina), levando a uma peptidil-MBHA que fornece o peptídeo livre de 22 resíduos de

qualidade similar à do obtido por SPFS passo a passo.

b) Influência do solvente na eficiência do acoplamento

Foram feitas outras reações em solventes ou misturas que solvataram melhor a

peptidil-MBHA, tais como 25%DMSO/tolueno, 20%DMSO/NMP e NMP. O tempo de

reação de 21 horas foi mantido para comparar a qualidade dos produtos com aquela

reação feita em DMF. De maneira geral, as análises por RP-HPLC e LC/ESI-MS dos

peptídeos livres brutos obtidos após acoplamento, clivagem da resina e desproteção

total mostraram que as reações não foram completadas em 21 horas.

1

oTempo (min)

30




Z) MGWMD(OcHex)F -MBHA sintetizada por SCPFS em 25%DMSO/tolueno a 60°C

na presença de TBTU. Condições: Solvente A: 0,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em

água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, Â.: 210

nm.

Resultados e DiscusslJo 75

1."17.•

2',OnmAn1

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peptldeo oxidado em uma metianinaIM+3H]"

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H-KAPSGDPSHRISDRDYMGWMOF-NH, peptldeo oxidado em uma meliInina(peptldeo desejado, [M+3Hr'l [M+3Hf'

llIi _ 7l413í7ll!1iIll : .. wr _1014 ,1l/'f •

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(Fragm 17 aa., [M+3Hr')

$'6 . 871 'lal T.S17f!I1. SIl,.




Z)MGWMD(OcHex)F-MBHA sintetizada por SCPFS em 25%DMSO/tolueno a 60°C

na presença de TBTU. Condições: Solvente A: 0,1%lFNágua, solvente B: 60% acetonitrila em

água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, À.: 210 nm, capilar: 3 kV,

cone: 37 kV, modo de ionização: ES+,

ResuJtados e Discussão 76

1

êii11.=>~..,uc

'IV.Q...ol/I.Qc:(

oTempo (mln)

30




Z)MGWMD(OcHex)F-MBHA sintetizada por SCPFS em 20%DMSO/NMP a 60°C na

presença de TBTU. Condições: Solvente A: O,1%TFNágua, solvente B: 60% acetonitrila em água

contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, À.: 210 nm.

As Figuras 26 e 27 indicam que o peptldeo bruto obtido via acoplamento em

25% DMSO/tolueno contém o componente 1 que corresponde ao peptídeo desejado, o

2 que corresponde ao fragmento receptor de acila, e o 3 que corresponde a uma

mistura do peptídeo desejado oxidado em uma metionina e aos estereoisômeros do

fragmento receptor de acila. As Figuras 28 e 29 mostram que o peptídeo bruto obtido

via acoplamento em 20% DMSO/NMP contém um componente majoritário 1 que

correspondente ao fragmento receptor de acíla, o componente 2 que corresponde ao

peptídeo desejado de 22 resíduos, e o componente 3 que corresponde aos análogos

do peptídeo desejado e do fragmento receptor de acila oxidados em uma ou nas duas

metioninas.


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-,-

1'Ca ••.

10" H-DPSHRISDRDYMGWMDF-NH,oxidado em uma meUonina, [M+2HI")

1CIDH-DPSHRISDRDYMGWMDF-NH,

(Fragm 17 aa" [M+2HI"),-.1OJj . 'laD .,1(1) '1!D 1ZD 1:lII> ftD ~ 'ICXl .Wl) -i5!lf"

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H-KAPSGDPSHRISDRDYMGWMDF.NH,(pepUdeo desejado, [M+3HI''l

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81, peptldeo oxidado em uma metionina[M+3HI"

H-DPSHRISDRDYMGWMDF-NH, oxid_ em umameUonina (Fragm 17 aa., [M+2Ht")

""" peplldeo oxidado nas duas metioni",[M+3HI"

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peplldeo oxidado em uma metionina[M+3HI"

~_~at.~Snfoot\=CQ;o,,_peplldeo oxidado em uma metionina

[M+3HI1.I":.... _

Figura 29. Anãlise por LC/ESI-MS do produto bruto resultante da clivagem da



Z)MGWMD(OcHex)F-MBHA sintetizada por SCPFS em 200f0DMSO/NMP a 60°C na

presença de TBTU. Condições: Solvente A: O,1%TFAlágua, solvente B: 60% acelonitrila em água

contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, J...: 210 nm, capilar. 3 kV,

cone: 37 kV, modo de ionização: ES+


3

1

oTempo (mln)

4

30




Z)MGWMD(OcHex)F-MBHA sintetizada por SCPFS em NMP a 60°C na presença de


TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, t..: 210 nm.

As Figuras 30 e 31 revelam que o peptídeo bruto obtido via acoplamento em

NMP contém o componente 1 que corresponde ao peptídeo desejado, o 2 que

corresponde aos análogos do peptídeo desejado oxidados em uma metionina, o 3 que

corresponde ao fragmento C-terminal receptor de acila (reagente) e o 4 que apresenta

massa correspondente a do peptídeo desejado acrescida de 114 unidades e cuja

estrutura não foi deduzida.

Estes resultados, portanto, indicam que o solvente tem grande influência na

eficiência da formação de ligação peptrdica mediada por TBTU a 60°C. O melhor dos

solventes testados foi a DMF.


~...1imJI~. :m(17:5qan~~ , .

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resina e desproteção total da peptidil-resina Boc-K{2-CI

Z}APS{Bzl}GD{OcHex}PS{Bzl}H{Tos}R(Tos}IS(Bzl}D{OcHex}R{Tos}D{OcHex}Y{2-Br

Z}MGWMD{OcHex}F-MBHA sintetizada por SCPFS em NMP a 60°C na presença de

TBTU. Condições: Solvente A: O,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em água contendo 0,09% de

TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, À.: 210 nm, capilar: 3 kV. cone: 37 kV, modo de

ionização: ES+

Resultados 6 Discuss§o 80

c) Influência do agente ativador ou acoplador na eficiência do acoplamento

Este estudo consistiu em realizar as reações de acoplamento por 21 h usando a

DMF como solvente e o BOP (sal de fosfônio), a mistura EDC (carbodiimida)/HOBt e o

HATU (sal de urônio) como agentes ativadores ou acopladores.

As Figuras 32 e 33 mostram que a reação usando BOP não foi completada. Foi

detectada no peptídeo bruto resultante a presença do fragmento receptor de acila

(reagente, componente 1), do peptídeo de 22 resíduos desejado (componente 2) e dos

análogos do fragmento receptor de acila oxidado em uma ou duas metioninas

(componentes 3-5).

As Figuras 34 e 35 demonstram que na reação que utitizou EDC/HOBt não

ocorreu acoplamento entre os fragmentos, pois o receptor de acila (componente 1) e

seus análogos oxidados em uma (2) ou duas metioninas (3) estão presentes no

peptídeo livre bruto obtido.

oTempo (mln)

30




Z)MGWMD(OcHex)F-MBHA sintetizada por SCPFS em DMF a 6O-C na presença de

BOP. Condições: Solvente A: O,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em água contendo 0,09% de

TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, À: 210 nm.

Resultados e DiscusslJo 81

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H·DPSHRISDRDYMGWMDF·NH, oxidado em _G metioninas (Fragm 17 aa., [M+2HJ")

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H-DPSHRISDRDYMGWMDF-NH, oxidado _duasaa;,~metioninas CFraam 17 aa.. IM+2Hl".

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H-KAPSGDPSHRISDRDYMGWMDF.NH,(pepUdeo desejado, [M+3HJ'')

__ _11M .'7!I 1CIlI5 .. 1101 1"'1~ "


resina e desproteção total da peptidil-resina Boc:-K(2-CI


Z)MGWMD(OcHex)F-MBHA sintetizada por SCPFS em DMF a GO°C na presença de

BOP. Condições: Solvente A: O,1%TFNágua, solvente B: 60% acetonitrila em água contendo 0,09% de

TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin. À.: 210 nm, capilar: 3 kV, cone: 37 kV, modo de

ionização: ES+


As análises por RP-HPLC (Figura 36) e LC/ESI-MS (Figura 37) da reação

mediada por HATU mostram que a eficiência do acoplamento foi muito baixa. Observa

se que o componente 1 corresponde ao receptor de acila (reagente), o componente 2

corresponde ao peptídeo desejado de 22 aminoácidos, o 3 corresponde aos análogos

do receptor de acila oxidados em uma metionina e o 4 refere-se ao análogo do receptor

de acila oxidado nas duas metioninas e ao análogo do peptídeo desejado oxidado em

uma metionina.

Estes resultados nos permitiram concluir que a combinação de DMF, TBTU e

60°C foi a mais adequada ao acoplamento estudado.

oTempo (mln)

30





EDC/HOBt. Condições: Solvente A: 0,1%TFAlágua, solvente 8: 60% acetonitrila em água contendo

0,09% de TFA, gradiente: 5-95%8 em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, À: 210 nm.






EDC/HOBt. Condições: Solvente A: 0,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetmitrila em água contendo

0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, À: 210 nm. capilar: 3 kV, cone: 37 kV,

modo de ionização: ES+

Resultados e Discussao 84

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(i)

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o 30

Tempo (min)





HATU. Condições: Solvente A: 0,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em água contendo 0,09% de

TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, À: 210 nm.

4.1.6.2. [Gln1] gomesina

Para o acoplamento entre o fragmento C-terminal ligado na resina MBHA pela

cadeia lateral do ácido glutâmico de 10 resíduos (receptor de acila) e o outro fragmento

protegido de 8 aminoácidos obtido a partir do desligamento da resina 2-CI-Trt (doador

de aeila) foi empregada a DMF como solvente (este foi considerado o melhor solvente

nos acoplamentos dos fragmentos da hCCK-33 não sulfatada).

a) Efeito da temperatura de reação sobre a eficiência do acoplamento

Inicialmente, foram realizadas duas tentativas empregando TBTU como agente

acoplador: uma a 37°C e outra a 60°C, sendo ambas monitoradas por ninidrina até que

o teste desse negativo (3rC: 27 h; 60°C: 4h).

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i

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7.aeo$





HATU. Condições: Solvente A: 0,1%TFAlágua, solvente 8: 60% acetonitrila em água contendo 0,09%

de TFA, gradiente: 5-95%8 em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, À: 210 nm, capilar: 3 kV, cone: 37 kV, modo de

ionização: ES+.


As Figuras 38-41 mostram os resultados das análises por RP-HPLC e LC/ESI

MS dos peptídeos brutos obtidos a partir das peptidl-resinas resultantes dos

acoplamentos. Como é possível observar, ambos contém o produto desejado de 18

resíduos. Este, porém, apresenta os grupos Pmc na arginina e StBu nas cisteinas que

provinham do fragmento doador de acila. Foi surpreendente observar a presença ainda

do grupam ento StBu nas cisteinas, já que após c1ivagem da resina e desproteção total

em HF as peptidil-resinas foram tratadas com uma solução de 2-mercaptoetanol:DMF

(1 :1) por 5 horas e segundo Eritja e col. (1987) este tipo de tratam ento remove

completamente este grupamento do peptídeo.

Os dados das Figuras 38 e 39 indicaram que o componente 1 corresponde ao

peptídeo desejado protegido com Pmc na Arg17 e StBu nas Cys11 e 15, mas com as

cisteinas 2 e 6 livres e reduzidas; o componente 2 corresponde ao mesmo produto em

forma semicíclica por formação de ponte dissulfeto intramolecular provavelmente entre

Cys 2 e 6.

2

oTempo (min)

30

Figura 38. Análise por RP-HPLC do produto bruto resultante da elivagem da

resina e desproteção total da peptidil-resina Boe

R(Tos)C(StBu)VT(tBu)Y(tBu)C(StBu)R(Pme)GR(Tos)QC(MeBzl)R(Tos)R(Tos)LC(St

Bu)Y(2-Br-Z)K(2-CI-Z)E(MBHA)-OFm sintetizada por SCPFS em DMF a 37°C na

presença de TBTU. Condições: Solvente A: 0,1%TFAlágua, solvenle 8: 60% acetonitrila em água

contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%8 em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, À.: 210 nm.


20uL~itrr'_T6T~3UF(2i"G-03) b

2'1l)l'n• AI"9.7Se6

12.»

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H,RC(S)VTYC(S)R(Pmc)GROCRRLCYKa-OFm(monomero, [M+4Hr'>

Produto semlclclico[M+12Ht12

produto, [M+6H)"

J '2.00 ...co .OO~OO tti.t» dI» ,.(1)> 1&1» U »-1» 12:1» ~ai "tIJ' â'oo2QiiLA,;""Ü_~T9nt37_fF'(V.lGai)b·m (11,. '=.lM'\ :w.tQ

Figura 39. Análise por LC/ESI-MS do produto bruto resultante da elivagem da


R(Tos)C(StBu)VT(tBu)Y(tBu)C(StBu)R(Prne)GR(Tos)QC(MeBzl)R(Tos)R(Tos)LC(St


presença de TBTU. Condições: Solvente A: O,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em água

contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, 1..: 210 nm, capilar: 3 kV,

cone: 37 kV, modo de ionização: ES+.


Os dados das Figuras 40 e 41 indicaram que o componente 1 corresponde ao

peptídeo protegido com Pmc na Arg17 e com StBu nas Cys11 e 15; o componente 2

corresponde ao peptídeo com a ponte dissulfeto intramolecular entre Cys 2 e 6

(semicíclico), o componente 3 corresponde possivelmente ao dímero do peptídeo, o

componente 4 corresponde ao fragmento de 10 resíduos receptor de acila e

componente 5 corresponde ao dímero entre o receptor de acila na sua forma livre e o

receptor de acila acetilado.

Novamente, estes resultados revelaram que a temperatura alta agilizou o

acoplamento desejado gerando o peptidil-resina de 18 resíduos. O fato de os peptrdos

brutos conterem componentes parcialmente protegidos ou ciclizados via ponte

dissulfeto deriva do processo de clivagem da resina e desproteção total em HF.

1

o

2

3

30Tempo (mln)





presença de TBTU. Condições: Solvente A: O,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em água

contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, À: 210 nm.


...."...

H-RC(S)VTYC(S)R(Pmc)GRQCRRLCYKa-oFm(dImero, [M+6HI"l

_.

1'111

H-RC(S)VTYC(S)R(Pmc)GRQCRRLCYKO.QFm(semiciciico, [M+4H)'')

H-RC(S)VTYC(S)R(Pmc)GRQCRRLCYKQ.QFm(monomero, [M+4HJ"l

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Produto- (semiclclico. [M+6Hr' )

D.l.~_G:n1..18IVJD_H'(27-'oalIbZ5(11.ei!Q~3CScq

..a:iCG:n1..l1ll4..IIlft'(21.1Olqb2II~~_lIJ

pmduIo, [M+8H)"

Jl<q:LQ;m_18IV_1Ilft'121·1Olqb -i1&!V1)ànGIot\,~ .'lI),

I Dlmero do fragmento de 10 aa acetilado comoutro no acelillldo, [M+2Hr'

Figura 41. Análise por LC/ESI-MS do produto bruto resultante da elivagem da




presença de TBTU. Condições: Solvente A: O,1%TFNágua. solvente B: 60% acetonitrila em água

contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, À.: 210 nm, capilar: 3 kV,



b) Efeito do agente acoplador na eficiência do acoplamento

As reações foram feitas em alta temperatura (60°C) por 4 h trocando o TBTU

pelos agentes acopladores EDC+ HOBt ou HATU.

A reação feita com BOP a 60°C também forneceu teste de ninidrina negativo

após 4 horas, porém, as análises por RP-HPLC e LC/E81-M8 (Figuras 42 e 43)

indicaram que o peptfdeo bruto resultante de clivagem da resina e desproteção total do

produto de acoplamento continha o fragmento receptor de acila de 10 resfduos

(componente 4) este fragmento acetilado nas formas monomérica e dimérica

(componente 5). Igualmente ao caso anterior, se observou a presença do peptfdeo em

sua forma monomérica (componente 1), semicfclica (componente 2) e dimérica

(componente 3). A acetilação do fragmento receptor de acila deve ter acontecido

devido a traços de ácido acético residual presente no fragmento doador de acila, que

foi desligado da resina 2-CI-Trt usando uma mistura que continha AcOH.

1

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30


resina e desproteção total da peptidil-resina Boc

R(Tos)C(StBu)VT(tBu)Y(tBu)C(StBu)R(Pmc)GR(Tos)QC(MeBzl)R(Tos)R(Tos)LC(St


presença de BOP. Condições: Solvente A: O,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em água

contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, Â.: 210 nm.


",M t.U J'" 3M 4. 27.. a.a

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Ac-RQCRRLCYKQ-OFmDlmero ou ••miclclico,

[M+2Hr'

Ac-RQCRRLCYKQ-OFmFragmento de 10 aa acetilado, [M+2H]'2

: H-RQCRRLCYKQ-OFm[M+2H]"

H-RC(S)VTYC(S)R(Pmc)GRQCRRLCYKQ-OFm(••micldico, [M+4HJ~

H-RC(S)VTYC(S)R(Pmc)GRQCRRLCYKQ-OFm(monomero, [M+4Hr~

Ac-RQCRRLCYKQ-OFm[M+3H]"



R(Tos)C(StBu)VT(tBu)Y(tBu)C(StBu)R(Pmc)GR(Tos)QC(MeBzl)R(Tos)R(Tos)l..C(St

Bu)Y(2-Br-Z)K(2-CI-Z)E(MBHA)-OFm sintetizada por SCPFS em DMF a 6O"C na

presença de BOP. Condições: Solvente A: O,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em água

contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, À.: 210 nm, capilar. 3 kV,



A reação feita com EDC + HOBt também forneceu teste de ninidrina negativo

após 4 horas, mas as análises por RP-HPLC e LC/ESI-MS (Figuras 44 e 45) do

peptídeo confirmaram que a reação ainda não tinha sido completada neste tempo. A

presença no material bruto resultante do peptídeo na sua forma monomérica

(componente 1), semicíclica (componente 2) e dimérica (componente 3) ficou evidente,

assim como a do fragmento receptor de acila de 10 aminoácidos nas formas

monomérica (componente 4) e acetilada monomérica e dimérica ou semicíclica

(componente 5).

A reação feita em presença de HATU a 60°C apresentou teste de ninidrina

negativo após 4 h. As análises por RP-HPLC e LC/ESI-MS (Figuras 46 e 47) indicaram

que o peptídeo bruto obtido a partir da peptidil-MBHA resultante do acoplamento

contém o componente desejado na sua forma monomérica (componente 1), semicíclica

(componente 2) e dimérica (componente 4), assim como o fragmento receptor de acila

de 10 aminoácidos nas formas monomérica (componente 5) e acetilada (componente

6). Não foi possível deduzir a estrutura do componente 3.

1

o

2

30Tempo (minI





presença de EDC/HOBt. Condições: Solvente A: 0,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em

água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, 1..: 210

nm.


210rm. "M1;0_

Im I. ,_ ..

H-RC(S)VTYC(S)R(Pmc)GRQCRRLCYKQ-OFm(dlmero, [M+6H]"J

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produto, [M+6HJ"

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H-RC(S)VTYC(S)R(Pmc)GRQCRRlCYKQ-OFm(HlTiclcllco, [M+4H)")

Ac·RQCRRlCYKQ-OFm[M+3tf'

Ac·RQCRRLCYKQ-OFmFragmento de 1088 acetilado, [M+2H]"

',.,."

CU' el IIDI»' 'IIIICC'

Figura 45. Análise por LC/ESI-MS do produto bruto resultante da cllvagem da


R(Tos)C(StB u)VT(tBu)Y(tBu)C(StBu)R(Pmc)GR(Tos)QC(M eBzl)R(Tos)R(Tos)LC(St

Bu)Y(2-Br-Z)K(2-eI-Z)E(MBHA)-OFm sintetizada por SCPFS em DMF a 60°C na

presença de EDC/HOBt. Condições: Solvente A: 0,1%TFNãgua, solvente B: 60% acetonitrila em

água contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, À.: 210 nm, capilar: 3 kV.

cone: 37 kV, modo de ionizaçAo: ES+


úi '\u.::::l~ai'üc<ai-eo.,

5.aOI( • 6

o 30

Tempo (mln)





presença de HATU. Condições: Solvente A: O,1%TFAlágua, solvente B: 60% acetonitrila em água

contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, atenuação: 512, À: 210 nm.

A partir dos resultados obtidos neste estudo pOde ser concluido que, assim

como ocorreu para o acoplamento envolvendo os fragmentos da hCCK-33 não

sulfatada, o uso combinado de DMF, TBTU e 60°C foi adequado para o acoplamento

dos fragmentos do [Gln1]-gomesina.

Como citado na Introdução, as SCPFS da proteina l3-amiloide (42 residuos;

Hendrix e col., 1992), da toxina 11 de Androctonus australis (64 residuos; Grandas e

coL, 1989), da proteina À-Cra (66 residuos; Atherton e coL, 1990) e da a-protimosina

(109 residuos; Barlos e coL, 1991) já foram descritas. Além delas, também foram

relatadas as SCPFS do fragmento 8-33 do fator natriurético atrial de rato (Lyle e col.,

1987), de [Se~, Vale, GI/3]-calcitonina humana (Sarlos e col, 1993), da região

correspondente à repetição 3 da proteina Tau-2 humana (L1oyd-Williams e coL, 1997),

do fator inibitório da migração de macrófagos de rato (Kaiser e Voelter, 1997), do

glicopeptideo anfifilico do dominio de reconhecimento homofilico da caderina 1 epitelial

(Habermann e Kunz, 1998), da proteina doce Mabinlina 11 (Kohmura e Ariyoshi, 1998),

da calcitonina de salmão I (Gatos e Tzavara, 2001) e do fragmento 13()..145 do

glicopeptideo tipo mucina (Ichiyanagi e coL, 2002).

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presença de HATU. Condições: Solvente A: O,1%TFNágua, solvente B: 60% acetonitrila em água

contendo 0,09% de TFA, gradiente: 5-95%B em 30 minutos, fluxo: 1 mUmin, Â: 210 nm, capiar. 3 kV,


Rastllados a Discussão 96

As eficácias dos acoplamentos realizados se mostraram dependentes dos

sistemas de solventes e agentes acopladores. Por sua vez, as eficiências destes são

dependentes das seqüências dos fragmentos a serem acoplados. De fato, na SCPFS

da toxina 11 de Androctonl.,lS australis se utilizou DCC/HOBt como agente acoplador

(que é conhecida por minimizar racemização) e DMF como solvente, obtendo-se

rendimentos de acoplamento superiores a 90% (Grandas e col., 1989). Hendrix e

colaboradores (1992) estudando o acoplamento de Boo-S(Bzl)NK(2-CI-Z)GAIIG-OH a

H2N-LMVGGWIA-resina usaram vários solventes e mostraram que o melhor resultado

foi obtido usando BOP como agente acoplador e a mistura 15% DMSO/NMP como

solvente. Eles atribuíram este resultado à solvatação eficiente e conseqüente

desagregação da peptidil-resina.

Exemplos de uso de sais de urônio como agente acoplador nestas

condensações são escassos (Benz, 1994, L1oyd-Williams e col., 1997). BarJos e Gatos

(1999) mostraram que a mistura TBTU:HOBt:DIPEA em DMSO produziu 35% de

racemização durante a condensação dos fragmentos 87-94 e 95-109 da a.-protimosina

e que esta porcentagem é significativamente reduzida quando a reação é feita em

presença de carbodiimidas e aditivos ácidos em DMSO (ao contrário dos fragmentos da

hCCK-33 não sulfatada empregados no presente trabalho, os utilizados por eles não

continham metioninas). Mihala e col. (2001) estudando o acoplamento em fase sólida

entre os segmentos repetitivos VGVAPG da elastina humana encontraram que a

combinação da mistura clorofórmio:fenol ( 3:1, v: v) e EDC/HODhbt foi a mais

adequada.

Nossos resultados também indicam a dependência acima discutida. Por outro

lado, como nenhum destes autores empregou temperatura alta para agilizar os

acoplamentos realizados, nem tentou sintetizar os peptídeos com os quais

trabalhamos, se torna dificil comparar os resultados acima apresentados e discutidos

dos deles.

Conclusões 97

5. CONCLUSÕES

Os dados aqui apresentados nos permitem concluir que:

1) o conhecimento do grau de solvatação das peptidil-resinas auxilia na escolha do

sistema de solventes a ser empregado na geração dos doadores de acila

(desligamento dos peptídeos protegidos correspondentes) e nos seus acoplamentos

aos receptores de acila;

2) a geração de doadores de acila a partir de peptidil-KOR não é trivial como sugere a

literatura (o fragmento 6-19 da hCCK-33 na forma protegida não foi obtido) e deve ser

melhor estudada. O tamanho e a seqüência peptídica parecem estar diretamente

relacionados à eficiência do processo;

3) o uso de alta temperatura agiliza o processo;

4) a geração de doadores de acila a partir de peptidil-2-CI-Trt empregando 1%TFA em

DCM e misturas AcOH:TFE:DCM é simples e eficiente;

5) o uso combinado de DMF, do agente acoplador TBTU e de 60°C levou à agilização

dos acoplamentos convergentes realizados, fornecendo os peptídeos desejados com

boa qualidade em tempos relativamente menores. Este é um meio bastante barato de

maximizar os acoplamentos;

6) vantagens e desvantagens da SCPFS em alta temperatura devem ser melhor

avaliadas;

7) a SCPFS também apresenta limitações e problemas a serem oontornados, o que

demanda exploração sistemática empregando seqüências peptidicas e resinas

variadas.

Referências Bibliográficas 98

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CURRICULUM VITAE

Nome: CÉSAR MANUEL REMUZGO RUIZ

Nacionalidade: Peruano

Naturalidade: Lima - Peru

Local e Data de Nascimento: Lima, 13 Dezembro de 1975

E-mail: [email protected]

[email protected]

FORMAÇÃO ACADÊMICA

. 1 grau: Colégio Particular Católica las Mercedes, Lima-Peru.

. 2 grau: Colégio Nacional Nuestra Senora de Guadalupe, Lima - Peru.

. Graduação:

Bacharel em Biologia pela Faculdade de Ciências Naturales y Matemáticas da

Universidad Nacional Federico Villarreal, Lima - Peru, 1998.

ESTÁGIOS REALIZADOS

De 02/1998 a 12/2000 no Laboratório de Biologia Molecular da Faculdade de

Ciências Biológicas da Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM),

Lima, Perú, sob orientação do Dr. Armando Yarlequé Chocas.

Participação nos seguintes projetos:

1. Diferencias bioquímicas en la intoxicación causada por los venenos de

las serpientes corales Micrurus spixii y Micrurus surinamensis.

2. Estudio de una miotoxina dei veneno de la serpiente Bothrops brazili.

3. Caracterización bioquímica de los venenos de las serpientes corales

Micrurus spixii y Micrurus surinamensis.

CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO

Curso de Especialização em Toxinologia pelo Centro de Estúdios de

estudo da síntese convergente de peptídeos em fase sólida

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