estudo da obtenÇÃo de biocatalisadores com … · proteção a cada minuto. obrigada senhor, por...

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ESTUDO DA OBTENO DE BIOCATALISADORES COM MATRIZES

DE ALGINATO DE CLCIO VISANDO A PRODUO DE BIODIESEL

VNEA FERREIRA TRRES TEIXEIRA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ

FEVEREIRO - 2011

ii



VNEA FERREIRA TORRES TEIXEIRA

Dissertao apresentada ao Centro de Cincias e Tecnologias Agropecurias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigncias para obteno do titulo de Mestre em Produo Vegetal.

Orientador: Prof. Ndia Rosa Pereira

Co-orientador: Prof. Victor Haber Perez

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ FEVEREIRO 2011

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VNEA FERREIRA TORRES TEIXEIRA

Dissertao apresentada ao Centro de Cincias e Tecnologias Agropecurias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigncias para obteno do titulo de Mestre em Produo Vegetal.

Orientadora: Prof. Dr. Ndia Rosa Pereira

Aprovada em 23 de fevereiro de 2011

Comisso Examinadora:

Prof. Walter Ruggeri Waldman (D.S., Cincia dos Materiais) UFSCAR - SP

Prof. Rubn Jesus Snchez Rodrguez (D.S., Cincia dos Materias) UENF - RJ

Prof. Victor Haber Prez (Co-orientador) (D.S., Engenharia de Processos) UENF -

RJ

Prof. Nadia Rosa Pereira (Orientador) (D.S., Engenharia Quimica) UENF - RJ

iv

Dedico... s minhas filhas, Laura e Julia

v

Muitas so Senhor meu Deus, as maravilhas que tens operado para comigo, eu quisera

anunci-las e manifest-las, mas so mais do que se podem contar (Salmos 40.5)

AGRADECIMENTOS

Agradeo ao meu Senhor e salvador Jesus Cristo, por seu grande amor e

proteo a cada minuto. Obrigada Senhor, por me amar tanto e por me presentear

constantemente como tens feito. Eu tambm o amo muito, no pelo que tens feito

na minha vida, mas por tudo que tu s. Essa conquista envolveu muitas lutas e

muito aprendizado que me fizeram crescer e te conhecer ainda mais de perto.

Agradeo a minha famlia, minha amada famlia. sem vocs eu no teria

conseguido. Meu esposo, companheiro inseparvel, que sempre me apoiou e que

soube, com muito amor, compreender a minha ausncia e encher de ateno e

carinho as nossas princesas quando eu no podia estar por perto. Minhas

Tchutchucas, Laurinha e Juju, como eu amo vocs! Sei como foi difcil tambm

para vocs, o que por muitas vezes me fez pensar em desistir, mas sabia que essa

conquista seria importante para ns. Obrigado minhas lindas! Amores de mame!

Meus amados papito e mami. Vocs so os grandes responsveis por eu ter

chegado at aqui. Vocs, com muita sabedoria, souberam me dar razes e asas.

Obrigada por estarem sempre presentes e serem to dedicados a nossa famlia.

Obrigada pelas oraes, pelos conselhos e por manterem os meus tanques de

amor sempre repletos. Amo muito vocs!

minha irm e melhor amiga Ksia, que mesmo estando distante

fisicamente, soube me apoiar, me encorajar e ouvir os meus desabafos nos

momentos difceis.

Obrigado ao meu grande amigo Paulo Henrique, para mim, Paulo Henrico

(super cunhado), pelo inscansvel apoio na vida acadmica. Voc um grande

profissional. Seus conselhos e suas orientaes sempre fizeram diferena na minha

vida. Obrigado de corao por tudo.

Ao meu amado irmo Jansen e a Glaucy, minha irm do corao, pelo apoio

e carinho que sempre recebo de vocs, Amo vocs!

vi

A minha Tia Rute, tio Darci e Rosane que tenho certeza que nunca se

esquecem de orar por mim e me abenoam constantemente com palavras de

carinho e muito incentivo. Amo vocs!

Aos meus companheiros de trabalho, Ana Luiza, Geraldo e Waldinia, que ao

longo da caminhada se tornaram amigos. Vocs fazem parte desse trabalho.

Obrigada de corao.

minha parceira e grande amiga Juliana, que viveu junto comigo essa

experincia. Obrigada amiga, por tudo.

Ao meu co-orientador e amigo Victor, por seu constante apoiou e incentivo e

por sua grande participao no desenvolvimento deste trabalho. Admiro o tamanho

do seu corao, que sem medir esforos, est sempre pronto a ajudar. Que Deus te

ilumine, sempre. Obrigada.

minha orientadora Nadia, pela confiana, compreenso e conhecimentos

compartilhados. Reconheo e admiro o seu profissionalismo e sua inteligncia.

Sinto-me privilegiada por ter sido sua primeira orientada e tenho certeza que fao

parte do inicio da caminhada brilhante de uma excelente pesquisadora. Obrigada

por tudo.

Aos amigos de laboratrio, velin, Lara, Clara, Natalia, Shaline, Lorena, Joo

e Simone pelo companheirismo e apoio.

Ao amigo Accio, pela grande ajuda nas anlises de Absoro Atmica.

Aos professores Rubn e Walter, pela parceria no desenvolvimento do

trabalho e por terem aceitado fazerem parte da banca avaliadora desta dissertao.

UENF pelo suporte financeiro e oportunidade de desenvolver este trabalho.

Enfim, a todos que de alguma forma contriburam, de maneira direta ou

indireta, para que este projeto fosse realizado. Que Deus a todos abenoe rica e

abundantemente.

vii

NDICE

1. INTRODUO ................................................................................................................. 3

2. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 4

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ..................................................................... 5

3. REVISO BIBLIOGRFICA ............................................................................................ 5

3.1 CATLISE ENZIMTICA ......................................................................... 5

3.2 LIPASES ............................................................................................. 7

3.3 SUPORTES PARA IMOBILIZAO ............................................................ 8

3.4 ALGINATOS ......................................................................................... 9

3.4.1 Fonte de Obteno .............................................................................................. 9

3.4.2 Constituio Qumica e Fsica do alginato ........................................................ 10

3.4.3 Caractersticas dos Gis de Alginato ................................................................ 11

3.4.4 Produo das Partculas de Alginato de Clcio ................................................ 14

3.4.5 Produo dos suportes hbridos de alginato com quitosana............................. 16

3.5 IMOBILIZAO ................................................................................... 17

3.5.1 Tipos de imobilizao ........................................................................................ 18

4. MATERIAIS E MTODOS ............................................................................................. 22

4.1 MATERIAIS........................................................................................ 22

4.2 MTODOS ........................................................................................ 23

4.2.1 Preparao dos suportes de alginato ................................................................ 23

4.2.2 Cintica de gelificao ....................................................................................... 24

4.2.3 Preparao dos suportes de alginato com ferro ............................................... 25

4.2.4 Produo dos suportes hbridos de alginato com quitosana............................. 26

4.2.5 Secagem das partculas de Alginato ................................................................. 26

4.2.6 Imobilizao enzimtica..................................................................................... 27

4.2.7 Caracterizao dos suportes ............................................................................. 29

4.2.8 Caracterizao dos derivados imobilizados ...................................................... 31

5. RESULTADOS E DISCUSSO ..................................................................................... 33

5.1 ESTUDO DAS CONDIES DE PRODUO DAS PARTCULAS DE ALGINATO 33

5.1.1 Cintica de gelificao ....................................................................................... 35

5.1.2 Preparao dos suportes................................................................................... 41

5.1.3 Produo dos suportes hbridos de alginato ..................................................... 43

5.1.4 Secagem ............................................................................................................ 45

5.2 CARACTERIZAO DOS SUPORTES PARA IMOBILIZAO ........................ 48

5.2.1 Resistncia a agitao....................................................................................... 48

5.2.2 Solubilidade dos suportes em diferentes meios ................................................ 48

viii

5.2.3 Anlise granulomtrica ...................................................................................... 49

5.2.4 Anlise Termogravimtrica ................................................................................ 51

5.2.5 Morfologia .......................................................................................................... 55

5.2.6 Imobilizao ....................................................................................................... 57

5.3 CARACTERIZAO FSICA DOS BIOCATALISADORES IMOBILIZADOS .......... 57

6. CONCLUSO ................................................................................................................. 68

7. RECOMENDAES PARA TRABALHOS FUTUROS ................................................ 69

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................................. 70

1

RESUMO

TEIXEIRA, V.F.T. MSc.; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; Fevereiro de 2011; Estudo da obteno de biocatalisadores com matrizes de alginato de clcio visando a produo de biodiesel; Professora Orientadora: Ndia Rosa Pereira, D.Sc.; Professor Co-orientador: Victor Haber Perez, D.Sc.; Banca Avaliadora: Rubn Jesus Snchez Rodriguez, D.Sc.; Walter Ruggeri Waldman, D.Sc.; Victor Haber Prez, D.Sc.

Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de biocatalisadores com

propriedades magnticas visando aplicaes futuras na produo de biodiesel em

biorreatores assistidos por campos eletromagnticos. O trabalho experimental

envolveu a preparao de suportes de alginato de clcio e hbridos de alginato de

clcio/quitosana com incluso de partculas magnticas seguida da imobilizao

de lpases nestes suportes. Os suportes foram produzidos pelo mtodo de

gotejamento em soluo de cloreto de clcio. No desenvolvimento do trabalho

foram estudadas as condies operacionais que permitissem a obteno de

suportes com boa rigidez, esfericidade e tamanho uniforme; o processo de

gelificao das partculas de alginato de clcio por meio da cintica de troca

inica dos ons envolvidos na formao do gel; a cintica de secagem dos

suportes sob diferentes condies de temperatura e o efeito do teor de ferro nos

suportes atravs de testes operacionais em biorreator assistido por campo

eletromagntico. Os suportes produzidos foram caracterizados quanto a:

umidade, resistncia a agitao, solubilidade, degradao trmica, distribuio

granulomtrica e morfologia. Os biocatalisadores imobilizados foram preparados

utilizando uma lpase comercial de Pseudomonas fluorescences (lpase AK) por

trs diferentes procedimentos de imobilizao: aprisionamento em gel, adsoro

fsica e ligao covalente. No primeiro caso, os rendimentos de imobilizao

foram menores que 10%, provavelmente devido a limitaes difusionais, enquanto

que os derivados imobilizados por interao direta da enzima com os suportes

(adsoro fsica e ligao covalente) apresentaram rendimentos da ordem de

30% e as melhores atividades hidrolticas foram alcanadas pelos derivados

imobilizados por ligao covalente nos suportes de alginato com quitosana

ativados com glutaraldedo, os quais alcanaram rendimentos da ordem de 50%.

2

ABSTRACT

TEIXEIRA, V.F.T. MSc.; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; February, 2011; Study about the obtainment of biocatalysts with calcium alginate matrices in order to produce biodiesel; Teacher Advisor: Ndia Rosa Pereira, D.Sc.; Teacher Co-advisor: Victor Haber Perez, D.Sc.; Banking Appraiser: Rubn Jesus Snchez Rodriguez, D.Sc.; Walter Ruggeri Waldman, D.Sc.; Victor Haber Prez, D.Sc.

This work presents a study about magnetic biocatalysts development seeking its

applications on the biodiesel production in bioreactors assisted by electromagnetic

fields. The experimental efforts were towards the preparation of supports of

calcium alginate and calcium alginate/chitosan beads with addition of magnetic

particles and the immobilization of lipases on these supports. The beads were

produced by the dripping method in solution of calcium chloride. About this issue

it was investigated the following: a) operational conditions to attain supports with

good rigidity, spherical shape and uniform size; b) the process of gelification of

calcium alginate beads through ionic exchange kinetics of the involved ions in the

gel formation; c) drying kinetics of the supports under natural convection at

different temperature and alginate concentration and d) effect of magnetic particles

into the supports through operational tests in the bioreactor assisted by

electromagnetic field. The supports were characterized in terms of their moisture

content, resistance to agitation, solubility, thermogravimetric degradation,

morphology and size distribution. The immobilized biocatalysts were prepared

using a commercial lipase from P. fluorescences (lipase AK) for three different

immobilization procedures: entrapping, physical adsorption and covalent binding.

In the first case, the immobilization yields were lower than 10%, probably due to

diffusion limitations, while the immobilized biocatalysts by direct interaction

between enzyme and supports, i.e., physical adsorption and/ or covalent binding,

reached coupling yield around 30%. In addition, immobilization method by

covalent binding in alginate-chitosan supports activated with glutaraldehyde

presented coupling yield more than 50% and consequently the highest hydrolytic

activities.

3

1. INTRODUO

Nos ltimos anos, pode-se observar uma intensa atividade a nvel mundial

pelo uso de energias renovveis em virtude dos graves problemas associados

emisso de gases poluentes que resultam no aquecimento global. Neste contexto,

a obteno de biocombustveis (etanol, biodiesel, etc.) se apresenta como uma

alternativa muito atrativa em substituio aos combustveis fsseis. Esse

interesse se justifica pelo fato dos biocombustveis serem uma alternativa menos

agressiva ao meio ambiente, economicamente competitivos alm de serem

biodegradveis e derivados de matrias-primas renovveis de ocorrncia natural

(Felizardo, 2003; Ferrari et al., 2005).

A tecnologia mundialmente estabelecida para a produo industrial de

biodiesel baseia-se na transformao qumica (alcolise) de leos vegetais com

um lcool (geralmente o metanol) usando catalisadores cidos ou bsicos, que

atuam na quebra de molculas de triglicerdeos gerando uma mistura de steres

de cidos graxos, denominada biodiesel (Marchetti et al., 2007). Apesar do bom

rendimento proporcionado por essa via, o uso de catalisadores qumicos gera

problemas ao meio ambiente e dificuldades de recuperao e purificao do

produto final (Ferrari et al., 2005). Estas dificuldades justificam o grande nmero

de pesquisas em busca de vias alternativas como a substituio do metanol

(obtido do petrleo) por etanol e o uso de catalisadores enzimticos

(biocatalisadores) que possuem alta seletividade e formam um produto final com

maior grau de pureza.

Na busca por novas tecnologias, tem-se pesquisado a utilizao de

catalisadores biolgicos imobilizados em suportes diversos. Estes apresentam

como vantagens facilidade de separao e reutilizao tornando sua utilizao

bastante promissora. Muitas pesquisas tm sido realizadas com relao aos tipos

de materiais utilizados como suporte e aos diferentes mtodos de imobilizao de

enzimas e clulas que podem ser utilizados (Moraes et al., 2002; Lagoa e

Rodrigues, 2009; Wang et al., 2005).

Vrios grupos de pesquisa no Brasil e no mundo tm trabalhado

intensamente em atividades de pesquisa para o desenvolvimento de

biocatalisadores a partir de enzimas ou clulas imobilizadas em matrizes de

http://www.google.com.br/dictionary?source=translation&hl=pt-BR&q=&langpair=pt|en

4

diferentes origens para utilizao em diversos processos fermentativos e em

reaes de esterificao para produo de biodiesel.

Dentre os diversos materiais utilizados como suportes, destaca-se a

utilizao do alginato que um polmero biodegradvel facilmente encontrado na

natureza e sua utilizao como suporte para imobilizao de enzimas e clulas

dentre outras aplicaes tem sido alvo de muitos estudos. O alginato, quando em

contato com ctions divalentes, forma um gel com caractersticas interessantes

como, uniformidade, biocompatibilidade e porosidade da matriz formada.

Este trabalho prope o desenvolvimento de suportes de alginato de clcio

com caractersticas magnticas para imobilizao de enzimas lpases visando a

utilizao dos biocatalisadores obtidos em processo de produo de biodiesel por

mtodo no convencional utilizando reatores assistidos por campo

eletromagnticos. Estes reatores podem alcanar maiores taxas de reao sob

menores resistncias transferncia de calor e massa. Quando um campo

magntico externo aplicado a um reator que contenha catalisadores

magnticos, possvel modificar a distribuio das partculas e com isso alcanar

condies mais eficientes de contato entre estas e o meio reacional, resultando

em maiores taxas de reao. Para que isso acontea imprescindvel que o

biocatalisador apresente permeabilidade magntica, as quais podem ser

conferidas pela incorporao de partculas magnticas (por exemplo, magnetita

ou ferro metlico) na matriz porosa. Portanto, a proposta deste trabalho tem como

objetivo o estudo da obteno de biocatalisadores heterogneos formados por

partculas de alginato de clcio e hbridos de alginato com incorporao de ferro

metlico para imobilizao de enzimas visando sua utilizao em processo de

produo de biodiesel nestes reatores assistidos por campo magntico.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Estudo da produo de suportes de alginato de clcio com propriedades

magnticas, para imobilizao de lipase, visando produo de biodiesel em

bioreatores assistidos por campo eletromagntico.

5

2.2 Objetivos especficos

1. Determinar as condies de produo das partculas de alginato de

clcio pelo mtodo de gotejamento, visando obteno de suportes

rgidos, com boa esfericidade e tamanho uniforme;

2. Produzir suportes de alginato e hbridos de alginato/quitosana e

alginato/quitosana com incorporao de ferro;

3. Determinar a cintica de gelificao dos suportes de alginato de

clcio;

4. Caracterizar os suportes produzidos com relao a: umidade,

resistncia a agitao, solubilidade, granulometria, morfologia e

estabilidade trmica.

5. Testar a imobilizao da lpase de Pseudomonas fluorences nas

partculas produzidas por aprisionamento, por adsoro fsica e por

ligao covalente com e sem ativador.

6. Caracterizar os biocatalisadores com relao morfologia, atividade

enzimtica e eficincia de imobilizao.

3. REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 Catlise enzimtica

Tecnicamente, o biodiesel definido como steres alqulicos de cidos

graxos, obtidos na reao de transesterificao de qualquer triglicerdeo (leos e

gorduras vegetais ou animais) com lcool de cadeia curta (Pinto et al., 2005).

A produo de biodiesel economicamente competitiva devido a utilizao

de fontes renovveis de matria-prima e catalisadores de baixo custo, alm deste

combustvel ser tecnicamente e ambientalmente aceitvel. Os mtodos para a

obteno de biodiesel podem diferenciar na escolha da matria-prima e na via de

obteno. A transesterificao o processo mais utilizado atualmente e pode ser

definida como sendo a etapa de converso de triglicerdeos, na presena de

6

catalisador, em uma mistura de steres alqulicos de cidos graxos (biodiesel) e

glicerina (

Figura 1). Na reao de transesterificao podem ser usados catalisadores

qumicos (cidos ou bsicos) ou catalisadores enzimticos (Ferrari et al., 2005).

Figura 1. Reao de transesterificao (Moreira, 2007).

Atualmente os processos industriais de produo de biodiesel utilizam

catalisadores qumicos como o hidrxido de sdio e potssio, devido ao maior

rendimento em steres em menor tempo de reao. Todavia, este processo

apresenta alguns problemas, dentre eles a reao de saponificao ocasionada

pela presena de gua na matria-prima e cidos graxos livres e a necessidade

de passos adicionais de neutralizao e lavagem para reduo dos teores de

substncias indesejveis no biodiesel pronto, alm de no permitir a recuperao

do catalisador utilizado. Neste sentido a catlise enzimtica, utilizando lipases,

aparece como uma opo promissora na produo do biodiesel (Moreau et al.,

2008). O processo de transesterificao enzimtica, se otimizado, oferece

inmeras vantagens ao processo qumico, pois permite maior controle sobre a

distribuio posicional dos cidos graxos no produto final, devido seletividade e

regioespecificidade das lipases (Bornscheuer, 1998; De Castro et al., 2004). A

Tabela 1 apresenta as vantagens e desvantagens dos processos de obteno de

biodiesel por via qumica e enzimtica.

7

Tabela 1: Catlise qumica X catlise enzimtica (Nascimento et al., 2001).

Processo Vantagens Desvantagens

Qumico

Simplicidade Alto rendimento Curto tempo de reao

Dificuldade de separao do catalisador

Impossibilidade de reutilizao do catalisador

Dificuldade de utilizao do etanol hidratado

Obteno de produtos com menor grau de pureza

Enzimtico

Facilidade de separao do catalisador (suporte)

Obteno de produtos com maior grau de pureza

Possibilidade de utilizar etanol hidratado na reao

Longo tempo de reao Baixo rendimento Custo das enzimas

3.2 Lipases

As lipases (triglicerol acil-hidrolases. E.C 3.1.1.3) so classificadas como

enzimas hidrolticas que atuam na interface orgnico-aquosa, catalisando a

hidrlise de ligaes ster-carboxlicas de acilglicerois liberando cidos orgnicos

e glicerol. (De Castro et al., 2004). Elas no requerem co-fatores, so

regioespecficas e atuam em uma larga faixa de pH (Dalla-vecchia et al., 2004).

As lipases so encontradas largamente distribudas na natureza em

animais (lpases lcteas e lipase pancretica), vegetais (extradas da soja, do

centeio e do algodo) e as microbianas (leveduras, fungos e bactrias) (Paques;

Macedo, 2005). As lipases provenientes de micro-organismos so as mais

utilizadas industrialmente porque alm de apresentarem procedimentos mais

simples de isolamento so, geralmente, mais estveis e com propriedades mais

diversificadas que as lipases de outras fontes. Estas enzimas so em sua maioria

extracelulares, o que favorece sua extrao, isolamento e purificao (Brockman,

1984). Nos ltimos anos, muitos trabalhos foram apresentados na literatura com o

intuito de viabilizar a utilizao de lipases em processos industriais. Dentre eles,

destacam-se os estudos dos procedimentos de imobilizao enzimtica os quais

envolvem diferentes graus de complexidade e eficincia. Moreira (2007) estudou

o desempenho de diferentes lipases na reao de transesterificao enzimtica

8

do leo de palma com etanol visando produo de biodiesel. Entre as lipases

testadas, a lipase de Pseudomonas fluorescens teve um desempenho destacado

com relao a atividade de transesterificao, convertendo 90,98% do leo de

palma nos steres etlicos correspondentes em 72h.

Lipase AK AMANO 20 uma preparao enzimtica produzida por um

nico processo de fermentao de uma linhagem selecionada de Pseudomonas

fluorescences. Como a maioria das lipases microbianas, as preparaes

comerciais disponveis destas lpases possuem preferncia estereoqumica para

hidrlise de steres de alcois secundrios (Faber, 1997). A lipase AK AMANO

20 tem uma elevada atividade lipoltica e estabilidade trmica (Amano Enzyme,

2006) e possui sete resduos de lisina em sua estrutura (Palomo et al., 2005).

O mecanismo de ao das lpases baseado nas reaes de ativao

interfacial e umas das principais dificuldades na compreenso dos mecanismos

de hidrlise esto relacionadas ao fato de que a atividade das lpases depende

das propriedades fsicas da emulso, ou seja, da disposio de substratos

disponveis lpase (Brockman, 1984). O mtodo mais utilizado para determinar a

atividade das lpases a titulao dos cidos graxos formados pela hidrlise do

triglicerdeo produzidos em uma emulso (leo/gua) estabilizada com um agente

tensoativo (Soares et al., 1999). A goma arbica o agente mais utilizado,

conduzindo elevada atividade lipoltica (Verger, 1997). A lipase na ausncia de

tensoativos se encontra em uma conformao fechada, com seu stio cataltico

indisponvel. Com a adio de tensoativos, ela adquire uma conformao aberta,

atingindo mxima atividade cataltica (Fernandez-Lorente et al., 2007).

3.3 Suportes para imobilizao

A escolha e o uso adequado dos suportes de imobilizao so

fundamentais para que se consiga alcanar todas as vantagens oferecidas pela

utilizao de biocatalisadores imobilizados, que so facilidade de recuperao,

reutilizao da enzima e a melhoria das propriedades desejveis como

estabilidade frente s condies reacionais e seletividade (Villeneuve et al., 2000;

Dalla-Vecchia et al., 2004)

9

As principais caractersticas a serem observadas na seleo de um suporte

para imobilizao de enzimas so: rea superficial, permeabilidade, capacidade

de regenerao, solubilidade, morfologia, composio, resistncia mecnica,

custo dentre outras, destacando-se a importncia da avaliao das possibilidades

de regenerao e reutilizao do material analisado (Dalla-Vecchia et al, 2004).

Para a reutilizao de derivados imobilizados, geralmente, h a

necessidade do uso de operaes como filtrao, centrifugao e agitao que

requerem do suporte boa resistncia mecnica. A estabilidade trmica tambm

uma caracterstica importante, visto que suportes sensveis termicamente, quando

submetidos a variaes de temperatura, podem sofrer distores ou modificaes

em sua estrutura, destruindo o stio ativo da enzima (Kennedy,1987).

Segundo Messing (1975), os suportes para imobilizao de enzimas

podem ser classificados conforme sua composio podendo ser orgnicos e

inorgnicos e quanto a sua morfologia como porosos, no porosos e de estrutura

de gel (Dalla-Vecchia et al, 2004). Apesar dos suportes inorgnicos apresentarem

uma srie de vantagens em relao aos suportes orgnicos como: elevada

resistncia mecnica, estabilidade trmica, fcil regenerao por processo de

pirlise e resistncia em uma larga faixa de temperatura, presso e pH, a

utilizao de suportes orgnicos no campo da imobilizao de biocatalisadores

tem se destacado, provavelmente devido grande variedade de grupos

funcionais reativos que podem ser introduzidos nos suportes orgnicos

(Kennedy, 1987) e por apresentarem baixo custo e serem facilmente degradados

no causando danos ao meio ambiente. Dentre os suportes orgnicos naturais

mais utilizados na imobilizao de enzimas destacam-se a agarose, o alginato, a

quitosana e os polieletrlitos de quitosana vistos pelo grande nmero de trabalhos

encontrados na literatura (Torres et al., 2003; Mendes et al., 2006; Mateo et al.,

2007; Rodrigues et al., 2008; Adriano et al., 2008).

3.4 Alginatos

3.4.1 Fonte de Obteno

O alginato um biopolmero, derivado do cido algnico, encontrado na

natureza, extrado principalmente de algas marinhas marrons, pertencentes

10

classe Phaeophiceae, que constituem a principal fonte de obteno de alginatos.

Existe uma grande variedade de espcies que variam em tamanho, forma, assim

como em porcentagem e qualidade do alginato que produzem, sendo que as

principais algas utilizadas para a produo comercial de alginatos so espcies

de Macrocystis, Laminaria e Ascophyllum (Mchugh, 1987).

3.4.2 Constituio Qumica e Fsica do alginato

O cido algnico um polissacardeo que contm, naturalmente, grupos

carboxlicos em cada constituinte residual, e possui vrias habilidades funcionais

(Ikeda et al., 2000). Uma importante propriedade a sua capacidade de reagir

com ctions polivalentes, especialmente ons clcio, para produzir gis fortes ou

polmeros insolveis (Grant et al., 1973; King, 1983).

Os alginatos so constitudos por duas unidades monomricas, o acido -

D-manurnico (M) e o cido -L-cido gulurnico (G) e possuem grande variao

em sua composio e estrutura sequencial (Figura 2). Esses cidos so unidos

por ligaes glicosdicas entre os carbonos 1,4 das unidades monomricas (King,

1983; Moe et al., 1995). Estes monmeros so organizados em blocos ao longo

da cadeia, que podem ser compostos por blocos de homopolmeros (GG e MM)

junto com blocos alternados (MG) na mesma molcula, o que pode ser visto na

Figura 3. As configuraes espaciais que os blocos M e G adotam,

juntamente com a proporo, distribuio e comprimento destes blocos,

determinam as propriedades fsicas e qumicas do alginato (Smidsrd, 1974).

Figura 2: Estrutura Qumica do alginato (Kimica, 2007).

11

As diferentes sequncias de blocos MG e GG que iro determinar a

flexibilidade da cadeia, influenciando na solubilidade e estabilidade do gel que

ser formado. Blocos MG, por exemplo, formam cadeias mais flexveis e mais

solveis em pHs baixos e a estabilidade do gel est diretamente relacionada ao

contedo de blocos G (Ertesvg e Valla, 1998).

Segmento de bloco M-M

Segmento de bloco G-G

Segmento de bloco M-G

Figura 3: Estrutura dos blocos que constituem a molcula de alginato. M: cido

manurnico e G: cido gulurnico (Kimica, 2007).

Quanto maior o peso molecular de um alginato solvel, maior a viscosidade

de sua soluo. O alginato de sdio, que possui viscosidade de 200-400 mPa.s,

chamado de alginato de "mdia viscosidade" e possui uma maior aplicao

comercial.

3.4.3 Caractersticas dos Gis de Alginato

Solues de alginato possuem a capacidade de reagir com muitos ctions

di e trivalente e formar gis que se formam em temperatura ambiente ou em

12

qualquer temperatura at 100 C. Esses gis, possuem aplicaes em diversos

setores tecnolgicos, particularmente quando o clcio usado como on

divalente. Allen et al., (1963) classificaram o cloreto de clcio como o agente

gelificante mais efetivo. O efeito desses ons estabelecer ligao entre as

cadeias de alginato atravs de interaes inicas. Essa estrutura reticulada

formada tem uma grande capacidade de reter gua, formando assim um gel muito

estvel.

Solues de alginato tambm podem formar gis ao serem

cuidadosamente acidificadas, os quais, ao contrrio do gel de clcio, so mais

frgeis e possuem muitas aplicaes na indstria de alimentos por darem a

sensao de derretimento quando levados boca (Morris, 1985).

Para que o alginato tenha a capacidade de formar um gel ele precisa ter

um nmero suficiente de monmeros gulurnicos que se alinham lado a lado

formando uma estrutura parecida com um bero, que tem a dimenso ideal para

acomodar em seu interior um ction (geralmente Ca2+), gerando uma estrutura

dimrica. Os grupos carboxlicos de alginato tm afinidade por uma vasta

variedade de ctions e quando em contato com solues aquosas de metais

divalentes, suas caractersticas mudam significativamente. Um modelo utilizado

para descrever a formao do gel de alginato de clcio o modelo egg-box

(caixa de ovo), que considera a associao de duas ou mais cadeias resultando

em uma estrutura bidimensional similar a uma caixa de ovo, como descrita na

Figura 4, onde nos interstcios encontram-se os ons clcio (Grant et al.,

1973).

Figura 4: Rearranjo das cadeias de alginato com clcio (Zambon et al., 2002).

13

O modelo egg-box permite verificar a importncia das unidades G na

gelificao do alginato. Alginatos contendo maiores concentraes de blocos GG

formam gis mais rgidos e resistentes. Os blocos M tambm formam ligaes

intermoleculares, embora sejam menos efetivos que os blocos G, portanto a

formao e a fora do gel esto diretamente ligadas com a quantidade de

resduos G e o comprimento mdio destes blocos. Quanto maior o contedo de

blocos G, maior o potencial de formao de gel e maior sua fora.

A estrutura do gel de alginato governada no somente pela concentrao

e estrutura qumica do material do gel, mas tambm pela cintica de formao do

mesmo, que depende da concentrao do ction, da fora inica e do pH. A

afinidade entre ons metlicos e o alginato varia de acordo com as propriedades

dos ons, como raio inico, efeitos estricos, fora inica e eletronegatividade.

Segundo Davis et al (2003) a seletividade do alginato por ons metlicos

divalentes a seguinte:

Mg < Mn= Fe < Co < Ni < Zn < Ca < Cd < Sr < Cu < Pb < Ba

A diferente afinidade por ons metlicos faz com que o alginato seja

utilizado em processos de tratamento de efluentes contaminados atravs de troca

inica entre os ons divalentes, que esto ligados s molculas do cido, pelos

ons que se encontram na soluo aquosa que possuem maior afinidade pelo

alginato. A troca inica um processo de adsoro de espcies inicas

acompanhado simultaneamente pelo processo de dessoro de outras espcies

inicas em quantidades equivalentes. No decorrer dos processos, ocorre a

competio entre os ons, sendo que a espcie ligante a de maior afinidade ao

trocador inico. Outros fatores tambm podem influenciar na gelificao do

alginato como: a concentrao do alginato, presena de impurezas, concentrao

e natureza dos ons gelificantes e mtodo de preparao.

A literatura descreve dois mtodos convencionais para o preparo de gis

de alginato de clcio que sero descritos a seguir.

14

3.4.3.1 Mtodo da gelificao interna

Smidsrod e Draget (1997) descrevem o mtodo da gelificao interna

baseados na liberao controlada de on clcio, proveniente da dissociao dos

seus sais. Para que a ligao no ocorra muito rapidamente, os ons clcio so

adicionados na forma de CaCO3 insolvel, CaSO4 levemente solvel ou

complexados com agente quelante como EDTA ou citrato. medida que o clcio

ionizado na soluo interage com polmeros de cido algnico, mais sal ser

solubilizado, resultando na formao de um gel homogneo. Alteraes no pH ou

temperatura tambm podem ser utilizadas para controlar a liberao de ons de

clcio por toda a soluo de alginato.

3.4.3.2 Mtodo de difuso

O mtodo de formao de gis por difuso tambm chamado de mtodo

de gelificao rpida. A formao do gel se d por atomizao ou gotejamento da

soluo de alginato de sdio em uma soluo contendo ons clcio, formando

partculas nicas e independentes. Nesta tcnica criada uma zona de

gelificao da superfcie em direo ao centro do gel. A homogeneidade do gel

pode ser alcanada com alginato de alta massa molar e altas concentraes de

ons gelificantes (Smidsrod e Draget, 1997).

3.4.4 Produo das Partculas de Alginato de Clcio

A produo das partculas de alginato de clcio pode ser feita por

diferentes tcnicas, sendo que a mais utilizada por difuso pelos mtodos de

atomizao ou gotejamento da soluo de alginato de sdio em soluo

gelificante contendo ons clcio. Na atomizao a soluo de alginato de sdio

atomizada atravs de um bico atomizador, na soluo de cloreto de clcio. As

partculas formadas por atomizao possuem dimetros menores que 0,2mm

sendo que a viscosidade e temperatura da soluo de alginato de sdio, a

presso do gs inerte; o dimetro de abertura do bico atomizador e a altura entre

15

o bico atomizador e a soluo de CaCl2 so fatores que precisam ser controlados

por exercerem grande influncia no tamanho e caractersticas das partculas

produzidas (Tu et al., 2005 e Fundueanu et al., 1999). Para obteno de

partculas de dimetros maiores utiliza-se o mtodo de gotejamento. Nesta

tcnica, a soluo de alginato de sdio gotejada em soluo de clcio (ou outro

ction divalente de maior afinidade) sob constante agitao (agitador magntico).

Aps o perodo de agitao e contato, a difuso do clcio nos interstcios das

gotas de alginato forma partculas de alta viscosidade e insolveis em gua

(Fundueanu et al., 1999; Daz et al., 2007; Papageorgiou et al., 2006).

Fundueanu et al., (1999) aps inmeras tentativas obtiveram partculas de

dimetro entre 1000 e 1400 m e de boa esfericidade. Atravs de seu trabalho

verifica-se que a altura do bico de gotejamento um dos critrios mais

importantes para a obteno de partculas com boa esfericidade, pois, para

baixas alturas, as partculas apresentaram uma cauda acentuada.

Welter (2009) testou diferentes concentraes para soluo de alginato de

sdio e diferentes alturas referente distncia percorrida pela gota. Para as

condies analisadas, foi concludo que a concentrao de alginato de sdio de

2% e altura do bico de gotejamento de 30 cm foram as condies mais

adequadas para produo de partculas esfricas.

Vreeker et al. (2008) realizaram um estudo para avaliar a capacidade de

reidratao de partculas de alginato de clcio secas. As esferas foram produzidas

pelo mtodo de gotejamento, utilizando seringa de 500 mL para gotejar a soluo

de alginato de sdio 1% em soluo de cloreto de clcio 1%. As partculas foram

produzidas utilizando alginato com alta concentrao de blocos G (alto G) e com

alginatos de baixa concentrao de blocos G (baixo G). A reidratao das esferas

de alginato de clcio secas em ar temperatura ambiente com umidade relativa

de 11% foi testada em gua destilada e em solues salinas de diferentes

concentraes. As partculas produzidas a partir do alginato com alto G

apresentaram menores taxas de reidratao que as de baixo G, porm para

ambas a massa das partculas hidratadas foi maior que a massa inicial. As taxas

de reidratao aumentaram com o aumento da concentrao do sal e no ocorreu

reidratao em gua pura para nenhuma das partculas, o que sugere que a

reidratao das partculas de alginato de clcio depende da fora inica do meio

de reidratao e que as zonas de juno formadas durante a secagem so

16

estveis em gua pura impedindo a entrada de gua. Durante a reidratao, ons

clcio foram liberados para a soluo circundante e esta liberao ocorreu antes

de iniciado o aumento de volume das partculas.

3.4.5 Produo dos suportes hbridos de alginato com quitosana

Os suportes de alginato com quitosana so produzidos com o objetivo de

se obter hidrogis mais versteis, com diferentes estruturas qumicas e fsicas, o

que pode melhorar a sua atuao em uma determinada aplicao (Berger et al.,

2004). O complexo quitosana-alginato formado por interaes inicas entre os

grupos carboxlicos do alginato e os grupos amino da quitosana (Figura 5) (Tapia

et al., 2004). O alginato por ser insolvel em pH cido atua minimizando a

solubilidade da quitosana nestes meios, fazendo com que o complexo

alginato/quitosana possa ser usado em uma ampla faixa de pH (George e

Abraham, 2006). A estabilidade qumica e fsica dos hidrogis de alginato pode

ser aumentada por modificao qumica empregando agentes funcionais. Essa

modificao pode ser realizada com diferentes espcies qumicas tais como

glutaraldeido, epicloridina, glioxal, formaldedo e outros (Mendes et al., 2006).

Figura 5: Sistema alginato/quitosana (Finotelli, 2006).

Ca+2

17

3.5 Imobilizao

A imobilizao de enzimas tem sido considerada como uma alternativa

vivel e de grande aplicao. Muitas snteses qumicas apresentam melhores

taxas de converso quando realizadas utilizando biocatalizadores, tais como

enzimas ou clulas ntegras, no lugar dos catalisadores qumicos convencionais.

Um importante diferencial da catlise enzimtica a especificidade com que as

enzimas atuam Para realizar tais processos em mdia e grande escala

importante que esses biocatalizadores contenham altas concentraes de

enzimas e que possam ser recuperados ao final do processo para reutilizao

(Van Der Padt, 1993).

O processo de imobilizao se caracteriza por restringir a mobilidade da

enzima em um definido espao, provendo altas concentraes das mesmas, com

preservao de sua atividade cataltica (Guisn, 2006). Biocatalisadores tm sido

amplamente utilizados em diversos processos, seja em escala laboratorial ou

industrial. H muitos anos esforos intensivos tm sido empreendidos no

desenvolvimento de biocatalizadores utilizando tcnicas que permitam o seu uso

repetido ou em processos contnuos. As principais vantagens obtidas pelo

processo de imobilizao so o aumento da estabilidade trmica do biocatalisador

e possibilidade de recuperao e reutilizao sem perda significativa da sua

atividade cataltica (Guisn, 2006). As principais desvantagens so a alterao da

conformao nativa na enzima; o custo do suporte e a atividade durante o

processo de imobilizao (Arroyo, 1998). A seleo do mtodo de imobilizao

deve ser baseada em parmetros como atividade recuperada do derivado

imobilizado; caractersticas de regenerao e inativao; custo do procedimento

de imobilizao e a finalidade desejada para a enzima imobilizada (Malcata et al.,

1990).

A eficincia do processo de imobilizao pode ser avaliada pela

capacidade do suporte e do mtodo utilizado em aprisionar a maior quantidade de

enzimas possvel. Diferentes mtodos de imobilizao tm sido utilizados na

obteno de sistemas eficientes para utilizao nos processos biotecnolgicos em

reatores industriais, tornando-os economicamente viveis e apresentando melhor

produtividade. Porm, a escolha de uma matriz adequada para a imobilizao

de fundamental importncia para a obteno do produto desejado (Petre et al.,

18

1999). A porosidade, o tamanho dos poros e o grau de hidrofobicidade da matriz

interferem na intensidade da adeso celular (Silva et al., 2006).

O gel de alginato de clcio apresenta caractersticas interessantes como

resistncia mecnica, uniformidade, biocompatibilidade e porosidade da matriz

formada, o que tem despertado grande interesse no uso deste material como

suporte para imobilizao de enzimas e clulas dentre outras aplicaes. A

imobilizao de enzimas por aprisionamento em gel de alginato de clcio oferece

vantagens como simplicidade, baixo custo e a imobilizao pode ser realizada sob

condies moderadas (Gryta, 2002).

A utilizao de biocatalizadores heterogneos na produo de biodiesel

surge como uma alternativa bastante vivel porque alm de evitar o problema de

saponificao, gerado pela catlise qumica, possvel a utilizao do etanol

hidratado na reao e os produtos obtidos apresentam maior grau de pureza.

Pode-se encontrar na literatura muitos trabalhos que utilizam lpases imobilizadas

em diferentes matrizes porosas, para produo de biodiesel. Cruz Jr. (2000)

imobilizou lpases em matriz de quitosana para obteno de biodiesel por

transesterificao de leo de mamona e obteve valores de converso de steres

etlicos superiores a 90%.

3.5.1 Tipos de imobilizao

Na literatura, encontram-se muitos mtodos descritos e utilizados para

imobilizao de enzimas. As tcnicas de imobilizao podem ser classificadas em

naturais e artificiais. As naturais incluem a formao de biofilmes e a

adeso/adsoro de enzimas em suportes sintticos ou naturais e ocorrem

espontaneamente por meio de interaes eletrostticas. As artificiais incluem a

encapsulao ou aprisionamento em matrizes polimricas como o alginato ou

atravs de ligaes covalentes utilizando-se agentes ligantes multifuncionais

como o glutaraldeido ou carbodiimida (Figura 6).

Figura 6. Esquema mostrando os diferentes mtodos para imobilizao de enzimas com

destaque para os mtodos de

covalente no suporte (Dalla

3.5.1.1 Imobilizao por aprisionamento em matriz

O mecanismo clssico de imobilizao por aprisionamento a mistura de

enzimas ou clulas microbianas com um composto polimrico com cargas

negativas como o alginato, pectato, ou outro polmero orgnico. Esta mistura

gotejada em uma soluo

resultam na formao de um gel consistente e insolvel, o qual imobiliza

ou o microrganismo. O tamanho da barreira de conteno formada em torno das

enzimas ir depender da velocidade de fluxo, da

polimrica, da concentrao da soluo inica e do tempo de imerso nesta

soluo na qual o gel ser formado

Essa tcnica apresenta como vantagem o fato da enzima no interagir

quimicamente com o polmero evitando,

tcnica apresenta total eficincia de imobilizao. Contudo, a velocidade de

difuso dos substratos e produtos atravs da membrana pode ser um problema.

As enzimas encapsuladas apresentam atividade mais elevada em su

baixa massa molar, pois estes compostos se difundem pela membrana e se

aproximam com mais facilidade do stio ativo do biocatalisador

Esquema mostrando os diferentes mtodos para imobilizao de enzimas com

destaque para os mtodos de encapsulao (ou aprisionamento) em matriz

alla-Vecchia et al, 2004).

Imobilizao por aprisionamento em matriz polimrica




gotejada em uma soluo gelificante para formao de ligaes inicas, que

resultam na formao de um gel consistente e insolvel, o qual imobiliza

o microrganismo. O tamanho da barreira de conteno formada em torno das

ir depender da velocidade de fluxo, da densidade da soluo


soluo na qual o gel ser formado (Wang et al., 2005).


quimicamente com o polmero evitando, assim, a desnaturao



As enzimas encapsuladas apresentam atividade mais elevada em su


aproximam com mais facilidade do stio ativo do biocatalisador

19

Esquema mostrando os diferentes mtodos para imobilizao de enzimas com

em matriz e por ligao

polimrica




ligaes inicas, que

resultam na formao de um gel consistente e insolvel, o qual imobiliza a enzima

o microrganismo. O tamanho da barreira de conteno formada em torno das

densidade da soluo



assim, a desnaturao; e em geral esta



As enzimas encapsuladas apresentam atividade mais elevada em substratos de


aproximam com mais facilidade do stio ativo do biocatalisador (Dalla-Vecchia et

20

al, 2004). Moraes et al.(2002) estudaram a produo de isomaltulose a partir de

sacarose, utilizando-se clulas de Erwinia sp. D12 imobilizadas em alginato de

clcio, em colunas de leito empacotado e obtiveram em torno de 50% de

converso, usando solues de sacarose entre 20-30% a 35 C.

Tanriseven e Dogan, (2001) imobilizaram a enzima de Saccharomyces

cereisiae por aprisionamento em matriz de alginato. A imobilizao resultou em

87% de atividade recuperada nos suportes midos, permanecendo inalterada por

36 dias.

Li et al., 2003, imobilizaram a bactria Klebsiella sp. LX3 produtora de

enzima denominada isomaltulose sintase, capaz de converter sacarose em

isomaltulose e trealulose, por aprisionamento em gel de alginato de clcio 2%

(p/v). Utilizaram soluo 10% de sacarose como substrato e obtiveram 87% de

isomaltulose, 11,6% de trealulose e 1% de glicose.

Como visto, muitos relatos so encontrados na literatura de trabalhos que

obtiveram excelentes resultados utilizando enzimas ou clulas integras

imobilizadas em matrizes de alginato de clcio, por aprisionamento, para

utilizao em processos fermentativos, nos quais o substrato aquoso, no

havendo a necessidade de retirada de umidade dos suportes. Segundo Lagoa e

Rodrigues (2009), os suportes de alginato de clcio hidratados (forma de gel)

apresentam estrutura altamente porosa quando observados por microscopia

eletrnica de varredura aps preparao da amostra por meio de tcnicas

especiais que preservam a arquitetura do gel, o que facilita a difuso do substrato

no interior do suporte at contato com a enzima imobilizada, garantindo os altos

rendimentos alcanados. No entanto, aps secagem, apresentam baixa

porosidade, com poros localizados prximos superfcie e ncleo compacto o

que pode dificultar os fenmenos de transferncia de massa e interferir na

atividade final do biocatalisador.

3.5.1.2 Imobilizao por Adsoro fsica

A adsoro fsica de enzima em suportes uma tcnica de imobilizao

antiga e muito utilizada. A enzima imobilizada em um suporte slido por

interaes de Van der Walls, ligaes de hidrognio ou inicas.

21

Neste mtodo, a quantidade de enzima imobilizada bem como sua

atividade aps imobilizao depende da natureza do suporte utilizado e de suas

caractersticas como: tamanho, rea superficial, caracter hidrofbico/ hidroflico e

composio qumica. A porosidade do suporte importante e melhora a

eficincia de imobilizao por que a enzima fica adsorvida no interior dos poros,

sendo que a quantidade de enzima adsorvida depende do tamanho dos poros e

da concentrao enzimtica (Villeneuve et al., 2000).

Estudos reportados na literatura mostram que um pr-tratamento do

suporte com aditivos ou solventes orgnicos, ou o uso destes durante o processo

de imobilizao melhora a eficincia do processo. Kogusi et al., (1995)

imobilizaram lipase de Pseudomonas fluorescens em resina de troca inica

Dowex 66 sem um pr-tratamento do suporte e obtiveram baixos rendimentos de

imobilizao. Porm, ao adicionarem 50% de um solvente polar (etanol ou iso-

propanol) alcanaram rendimentos da ordem de 96 a 97%. Da mesma forma

Montero et al., (1993) observaram que o pr-tratamento do suporte com solvente

orgnico afetou a adsoro da lipase de Candida rugosa melhorando sua

atividade na hidrlise de azeite de oliva. Os autores sugeriram que o solvente

polar absorve as molculas de gua do suporte, favorecendo a adsoro da

protena.

3.5.1.3 Imobilizao por ligao covalente

A imobilizao por ligao covalente envolve a formao de ligaes

covalentes entre os grupos funcionais presentes na superfcie do suporte e os

grupos funcionais dos resduos de aminocidos da enzima os quais, geralmente,

no esto envolvidos no stio ativo da enzima.

Em alguns casos, guando os grupos funcionais do suporte no possuem a

capacidade de ligarem enzima, eles precisam passar por um procedimento de

ativao (reticulao), no qual seus grupos funcionais so ativados por reagentes

especficos como, por exemplo, o glutaraldeido, que introduz um grupo carbonila,

altamente susceptvel a reaes com os grupos nucleoflicos da enzima. A

imobilizao covalente evita o fenmeno de dessoro, diminui a velocidade de

desativao espontnea e resiste a valores extremos de pH e temperatura.

(Cardoso et al., 2009).

22

importante que as condies de ativao sejam bem estabelecidas

porque a eficincia deste procedimento diretamente proporcional ao tipo e

concentrao do agente de reticulao, tempo de contato e temperatura (Berger

et al., 2004). Algumas estratgias tm sido utilizadas na tentativa de se proteger o

sitio ativo das enzimas durante os processos de imobilizao, dentre elas,

destaca-se a utilizao do polietilenoglicol (PEG-1500), que tem sido

extensivamente utilizado como um modificador de protenas (Sharma et al.,

(2001) e Soares et al., (2003).

A Figura 7 mostra as reaes envolvidas no mtodo de imobilizao

covalente em suportes aminopropilados. Naturalmente estes suportes no

conseguem se ligar enzima e por isso precisam passar pela etapa de ativao,

que introduz grupamentos aldedos em sua superfcie para ento se ligarem

enzima.

Os hidrogis formados por reticulao devem ser isentos de agentes de

reticulao que no reagiram e para isso precisam passar por diversas etapas de

lavagem.

Figura 7: Reao de suportes aminopropilados para imobilizao covalente,

usando o glutaraldeido como agente de ativao (Cardoso et al., 2009).

4. MATERIAIS E MTODOS

4.1 Materiais

A enzima utilizada neste trabalho foi lpase microbiana comercial de

Pseudomonas fluorescences (Lipase AK) produzidas pela Amano

Pharmaceuticals.

23

Foram utilizados na produo dos suportes para imobilizao: alginato de

sdio comercial Protanal LF 20/40 fornecido pela FMC BioPolymer, cujas

especificaes do fabricante so: massa molecular de 200.000 400.000g.mol-1,

viscosidade 198mPa.s (1% (m/v) soluo aquosa 20C) e pH 6,7 (1% soluo

aquosa 20C), quitosana de alto massa molecular e cloreto de clcio dihidratado

PA adquiridos da Sigma-Aldrich e glutaraldeido 25% da Vetec. Todos os outros

reagentes utilizados foram de grau analtico.

Os reagentes utilizados no processo de imobilizao foram: hexano, etanol

PA e polietilenoglicol (PEG 1500) (Vetec); acetona, hidrxido de potssio,

indicador cido-base (fenolftalena) e goma arbica em p (Sigma-Aldrich), azeite

de oliva comercial com baixo teor de acidez e gua destilada para a realizao da

atividade hidroltica da enzima.

4.2 Mtodos

4.2.1 Preparao dos suportes de alginato

As solues de alginato de sdio foram preparadas adicionando-se o

alginato em p diretamente em gua destilada, ficando a mistura sob agitao

magntica por 6 horas para total dissoluo dos grnulos formados. A soluo

formada foi sonicada por 10 minutos para retirada de bolhas previamente

produo das partculas.

As partculas de alginato foram obtidas por gotejamento da soluo aquosa

de alginato de sdio em soluo gelificante de cloreto de clcio 0,1Molar. Para

isto, foi utilizado um sistema de gotejamento da soluo de alginato de sdio

(Figura 8), composto por um tubo de ao inox com 0,7 mm de dimetro de sada,

denominado bico gotejador, uma bomba peristltica Bomba Peristltica

MasterFlex Cole-Parmer - modelo 7553-70 para bombeamento da soluo de

alginato de sdio at o bico gotejador e sistema de agitao magntica da

soluo gelificante. As gotas formadas caram diretamente em um bquer

contendo soluo de cloreto de clcio 0,1 Molar, sob agitao magntica, para

gelificao por troca inica dos ons sdio por clcio. As partculas formadas

foram retiradas da soluo com auxlio de uma peneira, lavadas abundantemente

24

em banho de gua corrente e secas superficialmente com papel toalha. Em

seguida, foram secas em estufa a 100C, sob presso atmosfrica, at umidade

de equilbrio.

Segundo Torres (2006), dentre os parmetros que influenciam no tamanho

da gota formada esto a temperatura e concentrao da soluo de alginato de

sdio (viscosidade), vazo de bombeamento da bomba peristltica e altura

percorrida pela gota at contato com a soluo gelificante. Baseados nestes

parmetros foram testados trs concentraes (1%, 2% e 3%) de soluo aquosa

de alginato de sdio, trs vazes de escoamento da soluo de alginato de sdio

(4,2; 3,0 e 1,7mL/min), sendo que para cada vazo foram testadas trs alturas de

gotejamento (18, 24 e 30cm).

Figura 8: Esquema geral do sistema experimental empregado na preparao de

partculas de alginato de clcio. 1- Soluo de alginato de sdio; 2- Bomba peristltica; 3-

Bico gotejador; 4- Soluo de cloreto de clcio; 5- Agitador magntico.

4.2.2 Cintica de gelificao

Foram preparadas partculas de alginato de clcio nas concentraes de

1%, 2% e 3%. O acompanhamento da cintica de liberao de sdio e adsoro

de clcio foi feito por meio da quantificao de ons sdio e clcio nas partculas

por fotometria de chama e por absoro atmica (amostras previamente

digeridas) em diferentes tempos de imerso em soluo de clcio. Para cada

25

tempo, foram produzidas 20 partculas em 50 mL de soluo de cloreto de clcio

0,1 molar. A quantificao dos ons foi realizada nos tempos 10, 20, 30, 45, 60,

120, 180, 240, 300 e 1440 minutos de imerso em soluo gelificante. Em cada

tempo determinado as partculas foram escorridas e lavadas abundantemente

com gua destilada. Depois de pesadas foram digeridas em capela de exausto

com aquecimento, acido ntrico e perxido de hidrognio (conforme mtodo da

AOAC, 2000). A soluo resultante da digesto (aproximadamente 1 mL) foi

diluda para 50 mL e realizada a leitura de sdio e clcio em equipamento de

absoro atmica. Todo este procedimento foi realizado para cada concentrao

de alginato de sdio em triplicata.

Os dados experimentais resultantes da cintica de troca inica foram

submetidos anlise estatstica para avaliar a significncia estatstica da varivel

tempo nas concentraes de ons Ca2+ absorvido pelas partculas de alginato.

Foi realizada uma Anlise de Varincia (ANOVA) para um nvel de confiana de

95% (p < 0,05), seguida de um Teste de Tukey, para comparao entre as

mdias.

4.2.3 Preparao dos suportes de alginato com ferro

Preparou-se uma soluo aquosa de alginato de sdio 2% (p/v) e aps

completa solubilizao do alginato adicionou-se ferro metlico em p nas

concentraes de 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1% (p/v).

A homogeneizao do ferro na soluo de alginato foi feita por agitao

com basto de polietileno e por tratamento ultrassnico usando banho de

ultrassom a uma frequncia de 40khz, com potncia de 100 W temperatura

ambiente. As partculas foram produzidas por gotejamento da soluo de alginato

com ferro em soluo gelificante de cloreto de clcio conforme descrito no item

4.2.1. As partculas com diferentes concentraes de ferro foram testadas em

reator assistido por campo magntico, sob diferentes condies de vazo do ar e

induo magntica, para verificar a resposta dos suportes ao campo magntico

aplicado. Este teste foi utilizado para determinar a concentrao de ferro a ser

utilizada na produo dos biocatalisadores, visando sua utilizao em reao de

biodiesel no referido reator.

26

4.2.4 Produo dos suportes hbridos de alginato com quitosana

Aps determinadas as condies de produo de suportes de alginato,

com e sem ferro, foram produzidos suportes hbridos de alginato e quitosana com

e sem incorporao de ferro. Estas partculas foram sintetizadas segundo

metodologia descrita por Methal et al (2000) com modificaes. Inicialmente,

preparou-se uma soluo de quitosana 1% (p/v) em acido actico 5% (v/v). A esta

soluo adicionou-se soluo de cloreto de clcio para concentrao final de 0,1

molar de clcio e 0,5% (p/v) de quitosana. Os suportes foram produzidos

gotejando-se a soluo de alginato de sdio 2% (com ferro e sem ferro) na

soluo de cloreto de clcio com quitosana onde permaneceram por 1h, sob

agitao magntica, para gelificao dos suportes.

4.2.5 Secagem das partculas de Alginato

Para a realizao do estudo da cintica de secagem dos suportes de

alginato utilizou-se secagem em estufa convencional sem circulao de ar por ser

um processo que simula o tipo de secagem comumente utilizado nos trabalhos de

laboratrio que utilizam alginato.

Inicialmente, determinou-se a umidade do material mido por

termogravimetria em estufa presso atmosfrica na temperatura de 105C at a

amostra atingir peso constante. Realizou-se o acompanhamento da perda de

massa dos suportes preparados com alginato a 1, 2 e 3% a 100C para

verificao da interferncia dessas concentraes na cintica de secagem do

material. Os suportes preparados com alginato a 2% foram secos nas

temperaturas de 70, 100 e 120C para estudo da cintica de secagem nestas

condies. Realizou-se tambm a secagem dos suportes de alginato 2% com

incorporao de ferro e dos suportes hbridos de alginato 2% com quitosana.

As amostras foram colocadas em cadinhos posicionados em sentido

diagonal no interior da estufa, ficando uma amostra posicionada na frente, uma no

centro e outra no fundo da estufa, na tentativa de minimizar os problemas

relacionados s possveis diferenas de temperatura e circulao de ar, visto que

a distribuio espacial dentro da estufa exerce influncia na secagem das

27

amostras. Utilizou-se amostras de aproximadamente 4 gramas para

acompanhamento da perda de massa durante 240 minutos.

4.2.6 Imobilizao enzimtica

Foram testados diferentes mtodos de imobilizao da lpase AK nos

suportes produzidos, tais mtodos foram escolhidos de acordo com as

caractersticas de cada suporte e o principal objetivo foi comparar a eficincia de

imobilizao dos diferentes biocatalisadores. Nos suportes de alginato (puro e

com ferro) foram testados os mtodos de imobilizao por aprisionamento e por

adsoro fsica / ligao covalente e nos suportes hbridos de alginato (alginato e

quitosana puro e com ferro) foi testada a imobilizao por ligao covalente com

presena de ativador.

4.2.6.1 Por aprisionamento

Foi adicionada lpase AK em p nas concentraes 5mg/mL, 10mg/mL e

15mg/mL (massa de enzima/ volume soluo alginato) diretamente em 200 mL de

soluo de alginato de sdio 2%. Aps homogeneizao manual com basto de

polietileno, as partculas foram produzidas por gotejamento da soluo aquosa de

alginato de sdio em soluo gelificante de cloreto de clcio 0,1 molar no sistema

descrito no item 4.2.1, com vazo de 3,0 mL/min e altura de 24 cm e tempo de

imerso das partculas de 1 hora. As partculas gelificadas foram lavadas

exaustivamente com gua destilada e secas a vcuo temperatura ambiente. O

mesmo procedimento foi realizado para a imobilizao da enzima por

aprisionamento nos suportes de alginato com magnetita. A magnetita foi

adicionada na concentrao de 0,6% (concentrao determinada no estudo

realizado com partculas com diferentes concentraes de ferro no reator

assistido por campo magntico) na soluo de alginato de sdio e enzima.

28

4.2.6.2 Por ligao covalente sem presena de ativador

Os suportes de alginato secos ficaram imersos em hexano (razo da massa

de suporte : soluo de hexano de 1:10) sob agitao por 2 horas. Adicionou-se a

soluo enzimtica na concentrao 5mg/mL na proporo 10 mL de soluo

para cada grama de suporte. O sistema ficou sob agitao por 4 horas

temperatura ambiente seguido de contato esttico por um perodo de 18 horas a

4C. Os derivados imobilizados foram recuperados por filtrao a vcuo, com

sucessivas lavagens com gua destilada e armazenados em geladeira.

4.2.6.3 Por ligao covalente com presena de ativador

Quando os grupos funcionais do suporte no possuem a capacidade de se

ligarem enzima, os suportes precisam passar por um procedimento de ativao,

no qual seus grupos funcionais so ativados por reagentes especficos como, por

exemplo, o glutaraldeido, que introduz um grupo aldedo, altamente susceptvel a

reaes com os grupos nucleoflicos da enzima. Devido s caractersticas

qumicas da quitosana presente nos suportes hbridos de alginato e quitosana,

estes suportes precisaram passar por uma etapa inicial de ativao para posterior

imobilizao.

Os suportes hbridos foram inicialmente ativados com glutaraldeido. Para a

ativao, os suportes foram embebidos em soluo de glutaraldeido 2,5% (v/v)

em tampo fosfato de sdio 0,1 Molar e pH 7 por 1 hora a 25C sob agitao

branda (razo massa de suportes : volume total de 1:10). Aps este perodo, o

suporte foi lavado exaustivamente com gua destilada sendo em seguida levado

estufa (60C) por 2 horas (Paula et al., 2008).

Os suportes previamente ativados foram embebidos em hexano em uma

razo de 1:10 e mantidos sob agitao branda por 2 horas. Aps este perodo,

para cada grama de suporte ativado (matria seca), foram adicionados 50mg de

lpase AK em p e 0,1mL de soluo aquosa contendo 5mg/mL de

polietilenoglicol (PEG-1500). As suspenses contendo enzima e suportes foram

mantidas sob suave agitao temperatura ambiente por 2 horas, seguido de

armazenamento sem agitao por um perodo adicional de 18 horas a 4C. Os

29

derivados imobilizados foram recuperados por filtrao a vcuo, com sucessivas

lavagens com gua destilada e armazenados em geladeira.

4.2.7 Caracterizao dos suportes

Os suportes de alginato puros, alginato com ferro e alginato com quitosana

foram caracterizados quanto umidade, resistncia mecnica e trmica,

solubilidade, granulometria e morfologia.

4.2.7.1 Determinao de Umidade

A umidade dos suportes foi determinada pelo mtodo gravimtrico em

estufa de conveco natural a 105C at peso constante.

4.2.7.2 Resistncia a agitao

A resistncia mecnica dos suportes a agitao foi determinada por imerso

de exatamente 1g de suporte seco em 200 mL de gua destilada por um perodo

de 72 horas sob agitao vigorosa temperatura ambiente. Os suportes foram

retirados da gua com o auxlio de peneira metlica, secos at peso constante em

estufa convencional a 105C e em seguida pesados para verificao de perda de

massa por comparao com a massa inicial.

Segundo a metodologia proposta por Alzate (2008), a resistncia pode ser

divida em trs categorias de acordo com a perda de massa do suporte seco

(considerando a massa antes e depois do teste de agitao), as quais esto

apresentadas na Tabela 2.

.

Tabela 2: Resistncia a agitao dos suportes segundo Alzate (2008)

Resistncia a agitao Satisfatria Moderada Insatisfatria

Perda de massa (%) < 2 2 a 5 > 5

30

4.2.7.3 Solubilidade dos suportes em diferentes meios

A solubilidade dos suportes foi avaliada por imerso de 1g de suporte seco

em 100 mL de diferentes solventes, durante 72 horas, a 25C sob agitao

branda. Em seguida os suportes foram filtrados a vcuo e lavados com gua

destilada. Foi realizada uma avaliao visual e microscpica do estado de

conservao da estrutura dos suportes. Os diferentes meios foram gua, hexano,

etanol, cido actico e mistura de etanol anidro com leo vegetal na proporo

1:1.

4.2.7.4 Distribuio granulomtrica

A distribuio de tamanhos das partculas de alginato de clcio com e sem

incorporao de ferro foi determinada pelo mtodo de difrao a laser usando um

Analisador de partculas modelo SALD-3101 (SHIMADZU) que permite analisar

uma ampla faixa de tamanhos de partculas entre 0.05 e 3000 m de dimetro.

A metodologia de anlise consiste em dispersar uma massa de partculas

em um sistema de amostragem em fase aquosa constitudo por uma espcie de

banho termosttico, equipado com uma bomba para ajuste do fluxo de ar que

movimenta as partculas atravs de um nico sistema tico e nica fonte de luz,

sendo o princpio da medio o espalhamento desta luz ao incidir sobre as

partculas em suspenso.

4.2.7.5 Anlise morfolgica

A anlise da morfologia dos suportes e biocatalisadores foi realizada com

auxlio da microscopia ptica (MO) e da Microscopia Eletrnica de Varredura

(MEV). Para anlise por microscopia ptica, as partculas secas foram colocadas

em placa de petri e analisadas usando estereoscpio com cmera digital

acoplada. A microscopia eletrnica de varredura foi realizada em equipamento da

marca SHIMADZU, sendo as amostras metalizadas com ouro e as imagens

geradas a partir de eltrons secundrios sob vcuo. Esta tcnica essencialmente

31

permite investigar aspectos morfolgicos dos materiais, utilizando principalmente

detalhes da imagem topogrfica da superfcie examinada.

4.2.7.6 Anlise termogravimtrica (TGA)

Termogravimetria a tcnica na qual a mudana da massa de uma

substncia (em atmosfera controlada) medida em funo da temperatura, esta

submetida a uma programao controlada (Edith, 1997). uma tcnica muito

utilizada na caracterizao do perfil de degradao de polmeros. A exposio

temperatura elevada pode, algumas vezes, alterar a estrutura qumica e, por

consequncia, as propriedades dos materiais.

A anlise termogravimtrica (TGA) foi empregada para caracterizar os

suportes de alginato de clcio com e sem a incorporao de ferro. As anlises

foram conduzidas usando o Sistema Termogravimtrico SDT 2960 (TA

Instruments) com uma balana de termo sensibilidade de 0,1 g. As amostras

secas (aprox. 16,0 mg) foram analisadas sob atmosfera dinmica de nitrognio

(P.A.) com fluxo de 100 mL.min-1, entre 20 e 1150C, operando com uma taxa de

aquecimento de 20C min-1. Os dados foram processados usando o software

Universal V3 System Analysis (TA Instruments).

4.2.8 Caracterizao dos derivados imobilizados

Os biocatalisadores imobilizados foram caracterizados quanto

atividade enzimtica recuperada e eficincia de imobilizao.

4.2.8.1 Determinao da atividade hidroltica

A atividade enzimtica da enzima livre e imobilizada foi determinada pelo

mtodo de hidrlise de azeite de oliva de acordo com a metodologia adaptada de

Soares et al (1999). Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de

enzima necessria para liberar 1mol de cido graxo por minuto de reao.

32

Foram misturados 5 mL de uma emulso de azeite de oliva (50% azeite:

gua e 2,5% de gama arbica) e 4 mL de tampo fosfato 0,1M pH 7,0. A fim de

garantir homogeneizao do meio, o sistema reacional foi mantido sob agitao

(150 rpm) a 37C por 10 minutos. Em seguida adicionou-se a amostra que ficou

sob agitao de 200rpm durante o tempo determinado para a reao. Aps o

perodo de incubao, adicionou-se 10 mL de uma mistura de etanol e acetona

(1:1) com o objetivo de cessar a reao. A amostra foi titulada com soluo de

KOH (0,02 N) com o auxlio de um agitador magntico e indicador fenolftalena. O

volume gasto na titulao foi anotado para realizao dos clculos. A atividade foi

calculada considerando o volume gasto na titulao segundo a equao (1).

(1)

Em que: A atividade hidroltica em U/g sendo U definida como unidades de

atividade em mols/ min; Va, Vb so volumes de KOH gastos na titulao da

amostra e do branco em mL, respectivamente; CKOH a concentrao da soluo

de KOH usada na titulao em mol/L; t tempo de incubao em min; m a

massa de biocatalizador adicionado usada em g.

4.2.8.2 Clculo do rendimento de imobilizao

O rendimento de imobilizao (j) foi calculado com base na atividade

enzimtica oferecida e a atividade enzimtica residual presente no meio reacional

aps o processo de imobilizao, como mostra a equao (2).

Em que: Uo a atividade oferecida no incio da imobilizao (U/g) e Uf a

atividade residual presente no sobrenadante aps a imobilizao (U/g).

33

4.2.8.3 Clculo da atividade recuperada

O clculo da atividade recuperada foi determinado pela relao entre a

atividade contida nos biocatalisadores e as atividades inicial e final presentes no

sobrenadante, conforme mostrado na equao (3).

3)

Em que: AR a atividade recuperada (%); Us a atividade hidroltica contida no

derivado imobilizado (U/g); Uo a atividade oferecida no incio da imobilizao

(U/g) e Uf a atividade residual presente no sobrenadante aps a imobilizao

(U/g).

5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Estudo das condies de produo das partculas de alginato

Foram realizados experimentos para verificar os parmetros que influenciam

nas caractersticas fsicas das partculas produzidas por gotejamento, visando

determinao das condies experimentais que proporcionem a produo de

partculas com boa esfericidade e com distribuio granulomtrica uniforme ou

estreita. Posteriormente, foi realizado um estudo para determinao da

capacidade de troca inica e do tempo necessrio para total gelificao das

partculas.

Para a produo das partculas de alginato de clcio temperatura

ambiente, foram testadas trs concentraes (1%, 2% e 3% p/v) de soluo

aquosa de alginato de sdio. Para cada concentrao de alginato de sdio

utilizada foram testadas trs alturas de gotejamento (18, 24 e 30 cm), sendo

necessria a realizao de ajustes na vazo de escoamento da bomba

peristltica. As vazes utilizadas para o gotejamento das solues de alginato de

sdio 1, 2 e 3% foram de 4,2; 3,0 e 1,7mL/min, respectivamente. O aumento da

concentrao do alginato leva a um aumento da viscosidade da soluo que

exerce grande interferncia no processo de formao das gotas em uma mesma

temperatura. Segundo Torres (2006), o dimetro de abertura do bico gotejador e

34

a temperatura da soluo de alginato de sdio (consequentemente na viscosidade

da soluo) interferem no tamanho da gota formada. Para um mesmo dimetro de

abertura do bico, solues de maior viscosidade formam gotas maiores. Foi

possvel observar que a altura do bico de gotejamento at o contato com a

soluo gelificante de cloreto de clcio foi uma das principais variveis na

obteno de partculas de boa esfericidade. A altura percorrida pela gota

determina a velocidade no momento de impacto da partcula com a superfcie da

soluo gelificante de modo que para menores alturas, as partculas

apresentaram uma cauda acentuada e para maiores alturas, houve a formao

de partculas achatadas, conforme mostrado na Tabela 3. Para as diferentes

concentraes da soluo de alginato de sdio (diferentes viscosidades), foi

necessrio se fazer ajustes de vazo da bomba peristltica de forma que, quanto

maior a vazo da bomba, menos uniformes foram as partculas produzidas.

Portanto, para a produo de partculas uniformes utilizou-se baixas vazes. As

partculas de alginato de clcio midas formadas apresentaram formato esfrico,

com dimetro da ordem de 4 a 5 mm .

Tabela 3: Ensaios para obteno de partculas com boa esfericidade por

gotejamento.

Ensaio

CAlginato de

Sdio

(% mssica)

Altura do bico gotejador*

(cm)

Forma

1

1%

18 Esfrica

24 Esfrica

30 Achatada

2

2%

18 Formao de cauda

24 Esfrica

30 Achatada

3

3%

18 Formao de cauda

24 Esfrica

30 Achatada

*Altura do trajeto percorrido pela gota

Para todas as condies analisadas, o ensaio 2, no qual foi utilizado

concentrao mssica de 2%, vazo da bomba peristltica de 3,0mL/mim e altura

do bico de gotejamento de

nestas condies apresentaram boa esfericidade, dimetro mdio de 4 a 5 mm

(partculas midas) e dimetro md

Figura 9: Fotografias digitais dos suportes de alginato

5.1.1 Cintica de gelificao

O estudo da cintica de gelificao das partculas de alginato de clcio foi

realizado com o objetivo de determinar exatamente o tempo necessrio para que

ocorra a total gelificao destas partculas.

sdio so liberados para a soluo gelificante enquanto

estrutura do polmero para a formao do gel

estudo do processo de gelificao do alginato para determinao da cintica de

entrada dos ons clcio e cons

Avaliou-se tambm neste estudo a interferncia

gelificao como: a concentrao da soluo de alginato de sdio e a

incorporao de ons ferro na estrutura do alginato

O presente estudo foi realizado atravs da quantificao dos ons sdio e

clcio presentes nas partculas de alginato ao longo do tempo de gelifica

realizada em equipamento de absoro atmica.

quantificao dos ons s

tempo de gelificao.



do bico de gotejamento de 24 cm, foi o mais adequado. Os suportes preparados


(partculas midas) e dimetro mdio entre 1 e 2 mm depois de seco

digitais dos suportes de alginato sem ferro e com ferro,

secos em estufa convencional a 100C.

Cintica de gelificao



ocorra a total gelificao destas partculas. Durante o processo de gelificao ons

dos para a soluo gelificante enquanto os ons clcio se ligam a

polmero para a formao do gel. Neste contex


entrada dos ons clcio e consequente determinao do tempo de gelificao.

se tambm neste estudo a interferncia de duas variveis no processo de


incorporao de ons ferro na estrutura do alginato.

estudo foi realizado atravs da quantificao dos ons sdio e

clcio presentes nas partculas de alginato ao longo do tempo de gelifica

realizada em equipamento de absoro atmica. Inicialmente

quantificao dos ons sdio nas partculas de alginato 1, 2 e 3%

tempo de gelificao. Os resultados mostraram que,

35



cm, foi o mais adequado. Os suportes preparados


io entre 1 e 2 mm depois de secos.

sem ferro e com ferro, hidratados e



Durante o processo de gelificao ons

ons clcio se ligam a

. Neste contexto, realizou-se um


ente determinao do tempo de gelificao.

de duas variveis no processo de


estudo foi realizado atravs da quantificao dos ons sdio e

clcio presentes nas partculas de alginato ao longo do tempo de gelificao,

Inicialmente, fez-se a

1, 2 e 3% ao longo do

independente da

36

concentrao de alginato utilizada, praticamente todo o sdio presente nas

partculas foi liberado durante o processo de gelificao (Figura 10).

0 50 100 150 200 250 300 350 400

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

Alginato 1% Alginato 2% Alginato 3%

Na

(mg/

kg-1)

Tempo (min)

Figura 10: Cintica de reduo de ons sdio nas partculas de alginato 1, 2 e 3% ao

longo do tempo de gelificao.

De acordo com Blandino et al (1999), na formao de partculas de alginato

pelo mtodo de gotejamento, o processo de formao do gel comea

imediatamente aps o contato da soluo de alginato de sdio (em formato de

gota) com a soluo catinica. Neste momento, forma-se instantaneamente uma

membrana capsular que vai aumentando sua espessura medida que os ons

clcio difundem em direo ao centro da gota. Estes autores, estudaram a

influncia da concentrao de alginato de sdio e cloreto de clcio na cintica de

gelificao de membranas de alginato de clcio formadas pelo mtodo de

extruso e observaram que o processo de formao do gel controlado pela

difuso dos ons clcio. Em razo de o clcio ser um ction metlico menor que a

molcula do polmero ele que se difunde atravs da cadeia do alginato se

ligando aos stios de ligao do polmero que esto livres.

37

0 50 100 150 200 250 300

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

A lg inato 1% A lg inato 2% A lg inato 3%

Ca(

mg/

kg-1)

Tem po(m in)

Figura 10. Cintica de absoro de ons clcio nas partculas de alginato 1, 2 e 3% ao

longo do tempo de gelificao.

A figura 11 mostra a cintica de absoro de ons clcio pelas partculas de

alginato ao longo do tempo de gelificao. Inicialmente, possvel observar um

rpido aumento na concentrao dos ons clcio, indicando um intenso processo

de difuso na fase inicial de formao do gel. Isso ocorre porque o gradiente de

concentrao existente entre as solues favorece a difuso dos ons clcio que

se ligam rapidamente aos stios de ligao da cadeia polimrica que esto

desocupados. medida que estes stios vo sendo ocupados, nas regies mais

externas, os ons clcio precisam se difundir atravs do gel que j est formado

para ento se ligar aos stios que ainda esto livres na zona de gelificao mais

interna, o que provoca uma diminuio na velocidade de formao do gel.

Na figura 10, uma comparao entre as curvas permite dizer que as

concentraes de ons clcio absorvidos pelas partculas de alginato 2% so

consideravelmente maiores que para alginato 1%. No entanto, o mesmo no

acontece quando a concentrao do alginato elevada de 2% para 3%, no qual

possvel observar um discreto aumento da concentrao do clcio. Possivelmente

este fenmeno se justifique pelo fato de que, com o aumento da concentrao do

alginato, aumenta-se tambm o nmero de stios de ligao por unidade de

volume na regio superficial das partculas, o que pode dificultar a difuso dos

ons clcio por esta membrana superficial j reticulada.

A cintica de gelificao das partculas de alginato com ferro permitiu

verificar a influncia da incorporao do ferro no processo de formao do gel. Os

38

resultados ilustrados na figura 12, mostram uma discreta diferena entre as

concentraes de sdio liberado das partculas de alginato com ferro e sem ferro

que tambm podem ser resultado de dificuldades difusionais provocadas pela

presena do ferro na estrutura do alginato. No entanto, as diferenas existentes

entre as concentraes de clcio absorvido por estas partculas so claras e bem

expressivas (Figura 13).

-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

Alginato 2% Alginato 2% +Fe

C N

a (m

ol/K

g)

Tempo(m in)

Figura 12. Cintica de liberao de ons sdio das partculas de alginato 2% e alginato 2% com ferro.

0 50 100 150 200 250 300

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

Alginate 2%+Fe 0,6% Alginate 2%C

Cal

cio

(mol

/Kg)

Tempo (min)

Figura 13. Cintica de absoro de ons clcio pelas partculas de alginato 2% e

alginato 2% com ferro.

39

Na tentativa de tentar entender estas diferenas, algumas hipteses so

levantadas e discutidas. Segundo Davis et al (2003), o alginato possui afinidade

qumica pelos ons ferro divalentes, que de forma semelhante ao clcio, se ligam

aos stios de ligao do alginato formando gel. Durante o processo de produo,

percebeu-se a ocorrncia de oxidao de ferro ao longo do processo de

gelificao o que leva a possibilidade da ocorrncia de possveis trocas entre os

ons clcio j ligados aos stios de ligao com os ons ferro ou at mesmo a

ligao direta dos ons ferro, oxidados nos stios de ligao ainda desocupados.

Porm, a princpio, o ferro presente nas partculas no est na forma de ons e

por isso a possibilidade de ligao qumica com o suporte seria mnima.

estudo da obtenÇÃo de biocatalisadores com … · proteção a cada minuto. obrigada senhor, por...

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