utilização de biocatalisadores para a obtenção de Ésteres...
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JANE ETHEL DE SOUZA SILVA
Utilização de Biocatalisadores para a Obtenção de
Ésteres Alifáticos e para a Dessulfurização de
Compostos Heterocíclicos
BLUMENAU
2006
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JANE ETHEL DE SOUZA SILVA
Utilização de Biocatalisadores para a Obtenção de
Ésteres Alifáticos e para a Dessulfurização de
Compostos Heterocíclicos
Monografia apresentada como requisito parcial
à obtenção do grau de Mestre em Química, ao
Programa de Pós Graduação em Química, do
Centro de Ciências Exatas e Naturais, da
Universidade Regional de Blumenau.
Orientador: Prof. Dr. Renato Wendhausen Jr.
Coorientador: Prof. Dr. Paulo Cesar de Jesus
BLUMENAU
2006
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação aos meus pais, irmãos
e namorado, que apostaram nos meus
estudos e me apoiaram em todos
os momentos, bons e ruins.
AGRADECIMENTOS
Como este trabalho foi realizado na FURB – Universidade Regional de
Blumenau – e em seus laboratórios, situados no campus I e no campus II (IPTB), sob a
orientação dos Professores Dr. Renato Wendhausen Jr. e Dr. Paulo César de Jesus, agradeço
inicialmente a eles e à instituição, a oportunidade de realizar este trabalho sob as suas
orientações e disponibilidade de tempo.
Ao professor Alberto, pelas análises de cromatografia gasosa com detector
de massa, e sua ajuda nas análises dos cromatogramas.
Agradeço aos demais professores e funcionários, especialmente ao Joni, pela
amizade e colaboração no decorrer deste trabalho que com certeza devem estar felizes com
esta conquista.
Gostaria ainda de agradecer à minha família, em especial aos meus pais, que
sempre estiveram aqui quando precisei. A minha irmã Líllian, ao meu irmão Luccas e ao meu
namorado Andrei.
Finalizo agradecendo à Jesus Cristo.
“A criatividade consiste em ver
o que todo mundo vê e pensar
o que ninguém pensou!”
Albert Szent-Györgyi
(PRÊMIO NOBEL EM MEDICINA)
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
CDCl3 – Clorofórmio Deuterado.
CG – Cromatografia Gasosa.
CMC – Concentração Micelar Crítica.
CO2 – Dióxido de Carbono.
DBT – Dibenzotiofeno.
DMA – Dimetilacetamida.
DMF – Dimetilformamida.
DMSO – Dimetilsulfóxido.
FMN – Flavina Mononucleotídeo.
GYM – Estreptomyces Medium.
2-HBP – 2-Hidroxibifenil.
HDS – Hidrodessulfurização.
H2O – Água.
MMS – Meio Mínimo de Sais.
NA - Nutrient Agar.
NAD+ – Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (oxidado).
NADH – Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (reduzido).
RMN de 1H – Espectrometria de Ressonância Magnética de Prótons.
S – Enxofre.
SO2 – Dióxido de Enxofre.
STr – Solução Traço.
Sol. Vit. – Solução Vitamina.
SUMÁRIO
1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.1 A BIOCATÁLISE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.1.1 Mecanismo da Ação Enzimática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.1.2 Biocatálise em Solventes Orgânicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.1.3 Aplicação de Enzimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
1.2 IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
1.2.1 Imobilização de Enzimas em Crisotila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
1.3 MICROORGANISMOS UTILIZADOS EM BIOCATÁLISE . . . . . . . . . . . . . . . 44
1.3.1 Presença de Enxofre em Combustíveis e Seus Problemas Ambientais e
Econômicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
1.3.2 Bactérias que Removem o Enxofre dos Combustíveis Fósseis . . . . . . . . . 48
1.3.2.1 Vias Metabólicas Degradativas do DBT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
1.3.3 Preparo de Meios de Cultura com Microorganismos . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
1.4 MÉTODO DE INOCULAÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
1.4.1 Meios para o Cultivo de Bactérias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
2 OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
2.1 OBJETIVO GERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
3 PARTE EXPERIMENTAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3.1 MATERIAIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3.2 EQUIPAMENTOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.3 IMOBILIZAÇÃO DAS ENZIMAS EM CRISOTILA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.3.1 Preparação do Suporte Crisotila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.3.2 Preparação do Meio Reacional para as Reações Enzimáticas . . . . . . . . . . 72
3.4 MÉTODOS EXPERIMENTAIS COM MICROORGANISMOS . . . . . . . . . . . . . 74
3.4.1 Reativação Celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.4.2 Meio NA (Nutrient Agar) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
3.4.3 Meio GYM (Streptomyces Medium) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.4.4 Preparo do Inóculo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.4.5 Preparo do Meio de Crescimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.4.6 Curva de Calibração . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.4.7 Curvas de Crescimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
3.4.8 Determinação de Massa Seca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.5 PREPARO DO MEIO DE BIOTRANSFORMAÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.5.1 Teste de Solubilidade com DBT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.5.2 Meio Nutriente para a Biotransformação em Sistema Aquoso com DBT . 80
3.5.3 Preparo do Meio Mínimo de Sais (MMS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
3.5.4 Teste de Adaptação do Microrganismo com Diferentes Ingredientes em
Meio Sólido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
81
3.5.5 Biotransformação em Sistema Aquoso com DBT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
3.5.6 Meio de Biotransformação com Adaptação do Microorganismo
Utilizando DBT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
82
3.5.7 Biotransformação em Sistema Aquoso com Tiofeno . . . . . . . . . . . . . . . . 83
3.5.8 Biotransformação utilizando 50% Solvente e 50% Água . . . . . . . . . . . . . 83
3.5.9 Biotransformação em Sistema Bifásico com DBT . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.5.10 Biotransformação em Sistema Bifásico com Tiofeno . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.5.11 Biotransformação em Meio Imobilizado em Crisotila. . . . . . . . . . . . . . . 85
3.5.12 Extração. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
3.6 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
4.1 IMOBILIZAÇÃO DE LIPASES EM SUPORTE SÓLIDO NA PRODUÇÃO DE
ÉSTERES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
87
4.1.1 Avaliação da Reutilização do Suporte Contendo Lipase Imobilizada e o
Efeito do Solvente na Biocatálise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
95
4.1.2 Caracterização dos Ésteres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.2 APLICAÇÃO DE MICROORGANISMO LIVRE E IMOBILIZADO NA
BIODESSULFURIZAÇÃO DE COMPOSTOS ORGÂNICOS PRESENTES
EM COMBUSTÍVEIS FÓSSEIS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
100
4.2.1 Pureza Microbiológica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
4.2.1.1 Pureza Microbiológica Utilizando a Técnica de Massa Seca. . . . . . . . . 103
4.2.2 Técnicas Utilizadas para a Biotransformação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
4.2.3 Biotransformação em Sistema Aquoso e Bifásico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
4.2.4 Biotransformação Utilizando um Novo Microorganismo em Sistema
Aquoso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
110
4.2.5 Biotransformação Utilizando Novos Microorganismo em Sistema
Aquoso e Bifásico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
111
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
5.1 BIOTRANSFORMAÇÕES UTILIZANDO ENZIMAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
5.2 BIOTRANSFORMAÇÕES UTILIZANDO MICROORGANISMOS . . . . . . . . . 115
6 PERSPECTIVAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
ANEXOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Estrutura tridimensional da Lysozyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
FIGURA 2 - Representação do modelo chave-fechadura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
FIGURA 3 - Modelo do encaixe induzido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
FIGURA 4 - Mecanismo proposto para as hidrolases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
FIGURA 5 - Comportamento catalítico das lipases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
FIGURA 6 - Fórmula estrutural da talidomida. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
FIGURA 7 - Exemplos de drogas resolvidas via catálise enzimática . . . . . . . . . . . 37
FIGURA 8 - Procedimentos utilizados nos últimos anos para a imobilização de
enzimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
41
FIGURA 9 - Estrutura da crisotila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
FIGURA 10 - Mecanismo da “Via de Kodama” para a degradaçãodo DBT . . . . . . . 52
FIGURA 11 - Mecanismo da “Via de Van der Afferden” para a degradaçãodo DBT 53
FIGURA 12 - Mecanismo da “Via 4S” para a degradaçãodo DBT . . . . . . . . . . . . . . 55
FIGURA 13 - Tubos com vários tipos de tampas. (a) tubo de ensaio; (b) tampa de
plástico; (c) tampa de rosca; (d) tampa de metal; (e) tampão de
algodão hidrófobo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
58
FIGURA 14 - Meio de cultura sólido acondicionado em: (a) tubo de ágar inclinado
– vista lateral; (b) tubo de ágar inclinado – vista frontal; (c) tubo de
ágar não inclinado; (d) placa de Petri; (e) erlenmeyer com ágar
inclinado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
58
FIGURA 15 - Técnicas de assepsia utilizadas para a inoculação de
microorganismos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
FIGURA 16 - Técnica de “Pour – Plate” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
FIGURA 17 - Instrumentos utilizados para inoculações. (a) alça de platina, de
níquel-cromo ou de inoculações; (b) fio ou agulha de platina, de
níquel-cromo ou de inoculação; (c) pipeta de Pasteur; (d) palito de
madeira (tipo churrasco); (e) pipeta sorológica; (f) pipetador
mecânico com bomba de plástico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
FIGURA 18 - Técnica de semeadura em estrias para a obtenção de colônias
isoladas. A figura dentro do quadro mostra a posição correta da alça
durante a semeadura. 1) Com a alça retira-se o inóculo da suspensão.
2) Inocular com a alça contendo os microorganismos a superfície do
ágar em estrias com movimentos em ziguezague, conforme esquema
em A. 3) Repetir o procedimento seguindo esquema em B. 4) Repetir
o procedimento seguindo esquema em C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
FIGURA 19 - Sistema de crisotila utilizado para realizar as reações de esterificação 74
FIGURA 20 - Modelo estrutural da superfície da crisotila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
FIGURA 21 - Acompanhamento da adsorção da lipase de Mucor javanicus a 25 oC
(265 nm), 100 mL de solução tampão fosfato pH 7,2, 200 mg de
enzima (C = 2 mg/mL), em crisotila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
89
FIGURA 22 - Curva de calibração da lipase de Mucor javanicus, 25 oC, 265 nm em
solução aquosa (y = a + b . x, a = 0,34867, b = 0,26000 e r =
0,99699) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
89
FIGURA 23 - Reação de esterificação catalisada por diferentes lipases imobilizadas
em crisotila. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
90
FIGURA 24 - Diminuição do rendimento dos lauratos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
FIGURA 25 - Porcentagem de rendimento dos lauratos de n-butila com diferentes
lipases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
94
FIGURA 26 - Espectro de infravermelho do laurato de n-pentila em filme . . . . . . . . 98
FIGURA 27 - Espectro de RMN de 1H do laurato de n-pentila em CDCl3 . . . . . . . . . 99
FIGURA 28 - Curva de calibração do microorganismo Brevibacterium citreum, 30
oC, 660 nm em solução aquosa (y = a + b . x, a = 0,05938, b =
0,057069 e r = 0,99433) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
101
FIGURA 29 - Curva de Crescimento do microorganismo Brevibacterium citreum a
30 oC. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
101
FIGURA 30 - Curva de calibração do microorganismo Corynebacterium
glutamicum 30 oC, 660 nm em solução aquosa (y = a + b . x, a =
0,03919, b = 1,18867 e r = 0,99956) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
102
FIGURA 31 - Curva de crescimento do microorganismo Corynebacterium
glutamicum a 30 oC. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
102
FIGURA 32 - Cromatograma do produto da reação de biotransformação com DBT . 107
FIGURA 33 - Cromatograma do produto da reação de biotransformação em sistema
bifásico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
109
FIGURA 34 - Cromatograma do produto da reação de biotransformação em sistema
aquoso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
109
FIGURA 35 - Cromatograma do produto da reação de biotransformação utilizando
novos microorganismos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
113
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Classificação das enzimas, segundo a IUB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
TABELA 2 - Critérios para a seleção do solvente orgânico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
TABELA 3 - Crescimento e viabilidade celular Saccharomyces cerevisiae CCT
0294 em diferentes solventes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
TABELA 4 - Enzimas utilizadas em rações para aves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
TABELA 5 - Enzimas utilizadas nas indústrias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
TABELA 6 - Meio quimicamente definido para uma bactéria heterotrófica . . . . . . 66
TABELA 7 - Composição do meio nutriente, para o crescimento de uma bactéria
heterotrófica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
67
TABELA 8 - Relação dos equipamentos utilizados com as respectivas marcas e
modelos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
TABELA 9 - Ácidos, álcoois primários e enzimas utilizadas nas reações
enzimáticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
TABELA 10 - Relação dos diferentes meios de crescimento, utilizados na curva de
crescimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
TABELA 11 - Relação dos diferentes meios sólidos de crescimento. . . . . . . . . . . . . . 81
TABELA 12 - Descrição do cromatógrafo a gás acoplamento ao detector de massa . 86
TABELA 13 - Ésteres obtidos da esterificação catalizada pela lipase de Mucor
javanicus imobilizada em crisotila a 25 oC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
91
TABELA 14 - Ésteres obtidos pela reação de esterificação do butanol-1 com ácidos
alifáticos catalisada pelas diferentes lipases imobilizadas em crisotila
a 25oC(a) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
93
TABELA 15 - Reutilização da crisotila contendo a lipase de Mucor javanicus
imobilizada e aplicada na obtenção do laurato de n-pentila a 25 oC. . .
95
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivos a avaliação da crisotila como suporte para a imobilização de lípases e microorganismos na preparação de ésteres e na remoção de enxofre de compostos heterocíclicos presentes em combustíveis fósseis. Como primeira etapa do trabalho as lipases de Cândida rugosa, Rhizopus oryzae, Pseudomonas cepacia, Mucor
javanicus e Aspergillus niger foram imobilizadas em crisotila e utilizadas na preparação de ésteres alifáticos. A quantidade de lipase adsorvida em 1g de crisotila foi de 140mg, sendo que para a lipase de Aspergillus niger a adsorção foi de 60mg. A crisotila contendo a lípase imobilizada foi transferida para um erlenmeyer com 25 mL de hexano. Quantidade equimolares (0,01 mol) dos reagentes ácidos e álcoois foi misturada e agitada em uma incubadora a 25oC por 48 horas. O rendimento dos ésteres obtidos das reações dos ácidos hexanóico, octanóico e láurico com os álcoois metanol, etanol, butan-1-ol, pentan-1-ol e octan-1-ol variaram de 41% a 97%. A enzima que apresentou melhores rendimentos foi a lipase de Mucor javanicus onde foram obtidos hexanoatos de n-alquila com rendimentos de 41% a 66%, octanoatos de n-alquila com rendimentos de 64% a 78% e lauratos de n-alquila com rendimentos de 62% a 97%. Os resultados mostraram que o aumento na cadeia carbônica do álcool e dos ácidos favoreceu a formação do éster. Foi observado que os melhores rendimentos para ésteres foram obtidos com o butan-1-ol, então o mesmo foi testado com diferentes lípases e diferentes ácidos, o qual demonstrou ótimos rendimentos em reações com as lípases de Candida rugosa (53% para o hexanoato de n-butila a 70% para o octanoato de n-butilia), Rhizopus oryzae (56% para o laurato de n-butila a 98% para o octanoato de n-butilia) e Pseudomonas cepacia (58% para o octanoato de n-butila a 85% para o laurato de n-butilia). O estudo realizado sobre o efeito do solvente, mostrou que as reações catalisadas por lipases imobilizadas em crisotila são melhor favorecidas por solventes apolares (log P >3). Quanto a reutilização do suporte, ficou evidente que após duas utilizações o rendimento diminuiu abaixo de 50%. A caracterização dos produtos foi feita em infravermelho e RMN 1H em CDCl3. Como segunda etapa, para o processo de remoção de enxofre foram utilizados microorganismos pertencentes aos gêneros: Brevibacterium sp., CCT Corynebacterium sp. e Rhodococcus erythropolis sp., onde como substratos para biodesulfurização empregou-se o dibenzotiofeno e o tiofeno. Os experimentos foram conduzidos utilizando-se técnicas especiais como, assepsia para a inoculação, crescimento celular e manutenção dos meios de cultura, imobilização de microorganismos em meio aquoso e em meio bifásico com água/N,N-Dimetilacetamida, água/N,N-Dimetilformamida, água/n-hexano e água/n-heptano, onde o substrato apresentou melhor solubilidade em n-heptano (log P ≈ 3). Nos experimentos preliminares com o crescimento celular em meio líquido, observou-se um crescimento celular em torno de 8g/L para os microorganismos testados bem como uma imobilização em crisotila na faixa de 0,5g de células por grama de crisotila, mostrando-se assim, um bom material para a imobilização dos biocatalizadores, pois mantém uma boa integridade durante os processos de biotransformação. O resultado positivo obtido para a biodegradação foi observado apenas para o dibenzotiofeno com o microorganismo Rhodococcus erythropolis CCT 1878 formando o composto bifenila. A caracterização do produto foi feita em cromatógrafo gasoso equipado com detector de massas. Palavras-chaves: Acilação enzimática, imobilização de biocatalizadores, biodesulfurização.
ABSTRACT
The present work was focused on the investigation of chrysotile as a support for the immobilization of lipase and microorganisms for ester synthesis and desulphurization of compounds present in fossil fuels. In the first part of the work, lipases from the microorganism sources: Candida rugosa, Aspegillus niger, Risopus orizae, Mucour javanicus were immobilized on chrysotile and used in the preparation of aliphatic esters. The immobilization yield was of 60 the 140 mg of enzyme per gram of chrysotile. For the experiments, 1 gram of chrysotile with the immobilized enzyme was transferred to an Erlenmeyer with 25 ml of hexane equimolar amounts (0.01 mol) of reactants acids and alcohols and the mixture were shaken in an incubator at 25°C for 48 hours. The ester yield changed from 41 to 97% in 48 hours of reaction time, depending of the acids: hexanoic; octanoic and lauric with the alcohols: methanol, ethanol, butanol-1, pentanol-1 and octanol-1. The best results were found to Mucor javanicus lipase yielding: n- alquilka hexanoate from 41 to 66%; n- alquilka octanoate from 64 to 78% and n- alquilka laurate from 62 to 97%. The size of carbon chain in the fatty acid and alcohol molecule suggests that the yiels increase as the size of carbon chain increase. It was observed that the best yields for ester synthesis were obtanined for butanol-1, so these alcohol was tested for different lipases and different acids witch showed high yields employing the lipases from Candida rugosa (53% for n-butil hexanoate to 70% for n-butil octanoate), Rhizopus orysae (56% for n-butil laurate to 98% for n-butil octanoate) e Pseudomonas cepacia (58% for n-butil octanoate to 85% for n-butil laurate). The solvent effect studies showed that less polar solvents (log P > 3) as reaction media are more suitable for immobilized lipases. For a reutilization of the immobilized biocatalyst a number of two times is enough to low the yield in 50%. The experiments of desulfurization were conducted in aqueous and biphasic aqueous/n-heptane reaction media by microorganisms of strain purified genus: Brevibacterium sp. Corynebacterium sp.
Rhodococcus erythropolis sp. As model compounds dibenzothiophene and thiophene were tested. In general a maximum cell growth of 8g/L were obtained and the immobilizations experiments showed a value between 0,5 to 1 cells per gram of chrysotile. Positive results were observed just to biodegradation of dibenzothiophene with the microorganism Rhodococcus erytropolis CCT 1979. The identification of reaction product was done by gas chromatography with mass detector, showing the presence of biphenyl as a biodegradation product. As a general conclusion chrysotile showed a good ability to immobilize the biocatalyst tested as well as keep the catalyst activity under the reaction condition tested.
Key words: Enzymatic acylation, Immobilized biocatalysts, biodesulfurization
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1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
1.1 A BIOCATÁLISE
O termo biocatálise diz respeito a reações catalisadas por meios biológicos.
Os responsáveis pela catálise em sistemas biológicos são as enzimas que se formam nas
células vivas dos vegetais, dos animais e dos microorganismos e que são agentes essenciais
para a realização de reações bioquímicas. Como qualquer catalisador, as enzimas não alteram
as condições termodinâmicas de uma dada reação, elas atuam sob condições suaves,
normalmente à temperatura ambiente e em pH próximo à neutralidade. São geralmente muito
seletivas em termos dos tipos de reações catalisadas, com relação à estrutura e estereoquímica
do substrato e produto. Atuam sobre a cinética das reações, aumentando as velocidades
reacionais (sentido direto e inverso) tornando possíveis reações que seriam muito lentas na
ausência de catalisador. Dois aspectos importantes, a saber: as reações são altamente
específicas, catalisando apenas um tipo de reação e o poder catalítico é aumentado pelo fato
do substrato de uma dada enzima ser o resultado de uma reação catalisada anteriormente
(VOET, 1990). A classificação das enzimas é baseada na especificidade reacional, por
exemplo, as isomerases (reações de isomerização), hidrolases (reações de hidrólise),
oxidoredutases, hidrogenases (produção/consumo de hidrogênio) e redutases de nitra(i)to
(reações de redução de nitra(i)to), etc. A Tabela 1 mostra a classificação das enzimas
segundo a comissão para enzimas da União Internacional de Bioquímica – IUB. 1
1 Adaptado de http://www.ciagri.usp.br/ ~luagallo/Enzimas2.htm e http://members.tripod.com/medworks/Bioquimica/enzimas.html
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As enzimas são proteínas globulares e requerem muitas vezes ativadores ou
podem conter grupos ativos adicionais como, por exemplo, metaloproteínas que contêm
metais nos centros catalíticos em particular metais de transição. As enzimas ativas têm papel
fundamental na catálise de reações importantes para o funcionamento de seres vivos e em
catálise de processos industriais. Estes processos podem usar enzimas puras, parcialmente
purificadas e células de organismos que apresentem uma atividade relevante para uma dada
enzima de interesse. As células podem mesmo serem imobilizadas em um reator desenhado
para um fim específico (por exemplo, leveduras, etc.) A Figura 1 mostra a estrutura
tridimensional da Lysozyme.2
2 Adaptado de: http://www.ciagri.usp.br/~luagallo/Enzimas2.htm e http://members.tripod.com/medworks/Bioquimica/enzimas.html
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TABELA 1 – Classificação das enzimas, segundo a IUB.
ENZIMA REAÇÃO ATUAÇÃO
1. Oxidorredutases São enzimas que catalisam reações de
transferência de elétrons, ou seja,
reações de oxi-redução
(Desidrogenases e Oxidases).
CH-OH
C=O
CH-NH2
CH-NH-
NADH
NADPH
2. Transferases Enzimas que catalisam reações de
transferência de grupamentos
funcionais como grupos amina, fosfato,
acil, carboxil, etc (Quinases e
Transaminases).
Grupos com um carbono
Grupos aldeído ou cetona
Grupos acil
Grupos glicosil
Grupos fosfato
Grupos contendo enxofre
3. Hidrolases Catalisam reações de hidrólise de
ligação covalente (Peptidades).
Ésteres
Ligações glicosídicas
Ligações peptídicas
Outras ligações C-N
Anidridos de ácidos
4. Liases Catalisam a quebra de ligações
covalentes e a remoção de moléculas
de água, amônia e gás carbônico
(Dehidratases e Descarboxilases).
=C=C=
=C=O
=C=N-
5. Isomerases Catalisam reações de interconversão
entre isômeros ópticos ou geométricos
(Epimerases).
Racemases
6. Ligases Catalisam reações de formação e novas
moléculas a partir da ligação entre duas
já existentes, sempre à custa de
energia, ATP (Sintetases).
C-O
C-S
C-N
C-C
Fonte: Adaptado da http://www.ciagri.usp.br/~luagallo/Enzimas2.htm e http://members.tripod.com/medworks/Bioquimica/enzimas.html
21
Fonte: http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/462a.html
Figura 1 – Estrutura tridimensional da Lysozyme.
22
1.1.1 Mecanismo da Ação Enzimática
O princípio de um catalisador é diminuir a energia de ativação. A enzima se
liga a uma molécula de substrato (sítio de posicionamento) em uma região específica
denominada sítio de ligação. Esta região é um encaixe que apresenta um lado envolvido por
cadeias de aminoácidos que ajudam a ligar o substrato (sítio de posicionamento), e o outro
lado desta cadeia age na catálise (sítio ativo).
A especificidade da ligação enzima-substrato depende do arranjo
precisamente definido de átomos no sítio ativo. Uma das explicações para a elevada
especificidade das enzimas é que suas estruturas tridimensionais permitem um perfeito
encaixe com o substrato. Dois modelos foram propostos para explicar a especificidade
enzimática: 1- modelo chave-fechadura e o 2 – modelo do encaixe induzido (adaptado de
http://www.ciagri.usp.br/~luagallo/Enzimas.htm).
Em 1894 Emil Fischer propôs o modelo chave – fechadura para explicar a
ação enzimática. A enzima se encaixa com o substrato específico no sítio ativo, como uma
chave e fechadura que está representada na Figura 2. Sítio ativo é a região na superfície da
enzima onde ocorre a catálise, além disso, a enzima também encontra o lado específico da
cadeia, posicionando no lugar exato da ligação no processo catalítico. Muitas vezes o lado da
cadeia pode ser básico ou ácido promovendo a adição ou remoção de prótons. Em outras
circunstâncias a enzima se agrupa a um íon metálico na posição correta para a ocorrência da
catálise (adaptado de http://www.ciagri.usp.br/~luagallo/Enzimas.htm).
23
Fonte: Adaptado de http://www.ciagri.usp.br/~luagallo/Enzimas.htm
Figura 2 – Representação do modelo chave-fechadura.
Um modelo mais flexível de interação enzima-substrato é o encaixe-
induzido proposto por Koshland em 1958. Segundo Koshland, os sítios ativos dessas enzimas
não estão completamente pré-formados e a interação inicial do substrato com a enzima induz
uma alteração conformacional na enzima. Isso promove o reposicionamento dos aminoácidos
catalíticos para formar o sítio ativo e a estrutura correta para interagir com os grupos
funcionais do substrato conforme mostra a Figura 3 (adaptado de
http://www.ciagri.usp.br/~luagallo/enzimas.html).
Fonte: Adaptado de http://www.ciagri.usp.br/~luagallo/enzimas.html
Figura 3 – Modelo do encaixe induzido.
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Independente do modelo, ao completar a reação catalítica a enzima libera o
produto e retorna a forma original. O processo ocorre em duas etapas:
(1) S + E ES* (etapa reversível)
(2) ES E + P (etapa irreversível)
As hidrolases têm sido as enzimas mais utilizadas em síntese orgânica
devido a sua disponibilidade comercial e dentre elas, destaca-se as lipases. Em solvente
orgânico, as lipases catalisam a transferência de grupos acila de compostos doadores para uma
ampla faixa de compostos aceptores diferentes da água. Dependendo do tipo do doador acila e
do aceptor, as reações catalisadas por lipases incluem esterificações e transesterificações,
amidação, síntese de peptídeos e formação de lactonas macrocíclicas (BRITTO, 2004).
Destas possibilidades, a síntese e/ou transesterificação enantiosseletiva de ésteres são de
interesse porque fornecem aos químicos orgânicos sintéticos um método fácil para a
preparação de álcoois e ácidos opticamente ativos (JESUS, 1998).
O mecanismo das hidrolases que tem sido elucidado em detalhes é o da
serina-hidrolase (Figura 4)
Fonte: Faber (1997).
Figura 4 – Mecanismo proposto para as hidrolases.
Asp
O O - H N N
H is Ser
O H
R '
O
O R 2 R 2 O H E tapa 1
E tapa 2
Asp
O O N N
H is Ser
O O
R ' H H
N u
R '
O
N u
25
Embora as lipases possam hidrolisar e formar ésteres como as proteases e
esterases, seu mecanismo molecular é diferente. A diferença mais importante entre lipases e
esterases é a interação físico-química com seus substratos. Em comparação com as esterases
que mostram uma atividade “normal” segundo Michaelis-Menten, um aumento de [S] conduz
a um aumento na atividade. As lipases não mostram atividade quando a concentração de
substrato é baixa. Quando a concentração é gradualmente aumentada acima de sua
solubilidade limite, é observado um aumento repentino na sua atividade (Figura 5).
O fato de lipases não hidrolisarem substratos abaixo da concentração
micelar crítica (CMC), mas exibe uma alta atividade, acima dela tem sido chamada de
"ativação interfacial" (WONG, 1994 e JESUS, 1998).
A estabilidade das lipases como catalisadores são fortemente influenciadas
por variações de pH, temperatura e solvente, existindo uma faixa de pH e temperatura
considerados ótimos para catálise enzimática.
26
Fonte: Wong (1994) e Jesus (1998).
Figura 5 - Comportamento catalítico das lipases.
1.1.2 Biocatálise em Solventes Orgânicos
A biocatálise depende do meio no qual se encontra a enzima. Geralmente, a
biocatálise é mais favorável em meio aquoso, entretanto, estudos realizados recentemente,
[Enz]# P [EnzS]#
S
EnzFase aquosa
Fase orgânica
Enz [Enz]# [EnzS]# [Enz]# + P interface
estadoinativo
estado ativo
+S
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mostram que esses biocatalisadores podem catalisar reações, em uma ampla variedade de
solventes orgânicos (CABRAL, 2003).
Entretanto este processo é limitado, pois solventes orgânicos apresentam em
geral uma ação tóxica sobre os biocatalisadores, especialmente células vivas levando a uma
desativação biocatalítica. É necessário o estudo dos fatores que levam a tolerância de células
microbianas a solventes orgânicos para compreender o seu comportamento (RISCH, 2006).
As bioconversões em sistemas bifásicos requerem que a enzima seja
protegida do contato com o solvente, pois o mesmo pode desnaturá-la. Diferentes técnicas de
imobilização tais como ligação covalente com um suporte, por aprisionamento em uma matriz
polimérica porosa ou em gel tem sido usado para protegê-la do contato do solvente não polar,
meio no qual se realiza a biotransformação (BARROS-AIRES, 2004). Também há outra
forma de proteção para as células, que seria o controle da proporção do solvente orgânico em
relação à água.
As reações de biotransformações, associadas ao uso de biocatalisadores –
microorganismos e enzimas - tem sido desenvolvidas utilizando a água como solvente. Pois
de fato a água normalmente é o solvente mais utilizado em inúmeros estudos de cinética
enzimática. Mas, somente o uso da água restringiu muito as aplicações da biocatálise, como
também limitava a produtividade de diversos processos, principalmente os que envolvem
substratos hidrófobos. Há a constatação de que as enzimas operam in vivo em ambientes ricos
em lipídios hidrofóbicos, o que sugere que estes meios predominantemente ou quase não
aquosos poderiam ser igualmente adequados as reações de atividade biocatalítica (BARROS-
AIRES, 2004).
Principais razões para a utilização de meios não-convencionais: permitem a
solubilização de substratos ou produtos hidrofóbicos, há redução de possíveis inibidores
tóxicos por parte do substrato ou produto; o solvente pode ser selecionado de modo a
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funcionar como diluente reduzindo assim a concentração interfacial; diminuição do número
de reações secundárias melhorando a seletividade; simplificação dos processos de
recuperação de produto e de enzima devido ao baixo ponto de ebulição dos solventes;
aumento da estabilidade térmica; diminuição de riscos de contaminação microbiana; entre
outras razões também importantes (CABRAL, 2003).
A escolha do solvente a ser empregado nas reações de biocatálise possui
alguns critérios os quais se deve considerar. Os principais critérios na seleção de um solvente
orgânico estão representados na Tabela 2, onde incluem critérios físico-químicos, biológicos,
de segurança, logística e econômica. Do ponto de vista físico-químico, os aspectos mais
importantes são a capacidade de extração (coeficiente de partição) e solubilização de
substratos e/ou produtos pelo solvente orgânico, e as suas propriedades que vão determinar a
facilidade de separação das fases e a transferência de massa. O solvente orgânico deve ser
química e termicamente estável, não deve formar emulsões em meio aquoso, para facilitar a
separação de fases, a sua viscosidade deve ser reduzida, de forma a facilitar a transferência de
massa, e não ser degradado pelo biocatalisador. Do ponto de vista de segurança, o solvente
orgânico não deve apresentar toxicidade ambiental nem ser prejudicial para a saúde, e não ser
inflamável. Em termos logísticos, a sua disponibilidade deverá ser elevada e a sua reciclagem
deve ser possível. Em termos econômicos, o seu custo deve ser baixo. O critério biológico,
toxicidade do solvente orgânico para o biocatalisador é, de todos estes, o que se apresenta
mais restritivo. O efeito tóxico do solvente pode ser devido a dois processos: um resultante da
difusão de moléculas de solvente através da membrana citoplástica (toxicidade molecular); e
outro associado ao contato entre o biocatalisador e o solvente orgânico (toxicidade de fase). A
presença de solvente orgânico dissolvido na fase aquosa (toxicidade molecular) pode provocar
inibição enzimática, desnaturação de proteínas e alteração do ADN, além da modificação da
fluidez da membrana citoplasmática. A toxicidade molecular do solvente é usualmente
29
avaliada através do logaritmo do coeficiente de partição do solvente num sistema padrão n-
octanol/água (log Po/w), conhecido como parâmetro de Hansch, que é um indicador do grau de
hidrofobia do solvente. Em média solventes com log de Po/w inferior a 2 são considerados
tóxicos, enquanto aqueles com log Po/w superiores a 4 são considerados biocompatíveis,
embora os pontos de inflexão sejam dependentes do biocatalisador (CABRAL, 2003).
TABELA 2 - Critérios para a seleção do solvente orgânico.
FÍSICO QUÍMICO
- Capacidade para solubilização do substrato e do produto;
- Coeficiente de partição Log P
- Densidade;
- Pontos de fusão e de ebulição;
- Tensão Superficial;
- Viscosidade.
BIOLÓGICOS - Toxicidade para o biocatalisador.
SEGURANÇA - Toxicidade;
- Inflamabilidade.
LOGÍSTICOS - Facilidade de obtenção;
- Eliminação de resíduos.
ECONÔMICOS - Custo.
Fonte: Barros-Aires (2004).
Sabe-se que a água possui um grande efeito na atividade e estabilidade do
biocatalisador. Mesmo num meio não convencional, constituído essencialmente por uma fase
orgânica, a quantidade de água disponível no sistema influencia fortemente a atividade
catalítica da enzima. Para baixas quantidades de água, a atividade enzimática é geralmente
baixa. Normalmente a atividade aumenta com a hidratação da enzima, devido a sua ação
lubrificante, que aumenta a flexibilidade interna da enzima (CABRAL, 2003).
Conforme os experimentos realizados por Jesus (1997), na obtenção de
ésteres catalisados pela lipase de Chromobacterium viscosum imobilizada em organo-gel,
30
existe uma correlação nítida entre os valores de log P e os rendimentos dos produtos das
reações biocatalisadas, onde observou-se uma grande variação no rendimento dos ésteres
obtidos em função da polaridade do solvente (log P = 2). Os valores obtidos variaram de 88%
no rendimento do éster, quando o n-octano foi utilizado como solvente, até um valor de 7%,
quando os solventes foram o xileno e o 1,4-dioxano (log P = -0,42). Portanto os melhores
solventes para reações de esterificação catalisadas pela lipase de Chromobacterium viscosum
imobilizada no sistema de organo-gel são aqueles que possuem valores de log P maiores ou
iguais a 3,2.
Estudos realizados por Risch e colaboradores (2006), mostraram que para as
reações de bioconversão são necessários dados referentes à tolerância de células microbianas
aos solventes orgânicos, para compreender claramente o seu comportamento durante o
processo de biocatálise em meio orgânico. A Tabela 3 apresenta os resultados relativos ao
crescimento celular do Saccharomyces cerevisiae CCT 0294, que apresentou
biocompatibilidade com os solventes com log P ≥ 4,0.
31
TABELA 3 - Crescimento e viabilidade celular do Saccharomyces cerevisiae CCT 0294 em
diferentes solventes.
SOLVENTE LOG DE P CRESCIMENTO VIABILIDADE
ciclo-hexano 3,2 ND(a) +
n-hexano 3,5 ND +
n-heptano 4,0 + +
1-hexanol 1,8 ND ND
1-octanol 3,0 ND ND
1-decanol 4,0 + +
1-undecanol 4,5 + +
1-dodecanol 5,0 + +
Fonte: Risch (2006).
(a) ND: Nenhum Dado.
1.1.3 Aplicação de Enzimas na Indústria
O grande potencial de aplicação das enzimas no desenvolvimento de
processos de síntese é hoje uma constante realidade. Há algumas décadas atrás, dizia-se que
as enzimas só funcionavam em meios aquosos. Através de estudos recentes, na área de
biocatálise, foi comprovado que as enzimas possuem atividade em meios não convencionais -
meios orgânicos, e/ou imobilizada, permitindo assim, a aplicação de biocatalisadores em
diversos tipos de reações de síntese orgânica, no qual pretende que sejam encontrados cada
vez mais métodos simples e eficientes de imobilização e que produzam biocatalisadores
altamente ativos e estáveis (MIRANDA, 2004).
As enzimas apresentam várias propriedades que as tornam atrativas como
catalisadores para biotransformações, dentre elas, se destacam: alta especificidade; obtenção
32
de produtos puros; alta capacidade de regeneração, sem sofrer degradação e facilidade para
recuperação do produto quando se utiliza enzimas imobilizadas, o que reduz o consumo de
energia (BRITO, 2004).
Dentre os vários tipos de enzimas já conhecidas, as enzimas hidrolíticas
(proteases, celulases, amilases e lipases) são as mais freqüentemente usadas na química
orgânica. São várias as razões que as tornam uma opção atrativa, na qual se pode citar sua
ampla disponibilidade, baixo custo, não necessita de cofatores, ampla especificidade para
substratos, atuam em condições suaves de pH e temperatura, apresentam especificidade,
regiosseletividade, quimiosseletividade e enantiosseletividade. Possuem também a habilidade
de catalisar reações de esterificações, transesterificações (acidólise, interesterificação,
alcoólise), aminólise e tiotransesterificação em solvente orgânico anidro, sistema bifásico e
em solução micelar com alta especificidade (OLIVEIRA, 2000).
Nos últimos anos, com o intuito de aumentar a atividade catalítica de
lipases, foram apresentados vários procedimentos de imobilização ou modificações na
estrutura nativa. Estes métodos de imobilização requerem uma interação fraca ou a formação
de ligações covalentes entre a lipase e o suporte, sendo, que estes processos envolvem
diferentes graus de complexidade e eficiência (DIAS, 2006).
A aplicação de biocatalisadores na indústria é objeto de muitas
investigações, pois a habilidade de conduzir transformações químicas que são impossíveis ou
impraticáveis, especialmente na área de obtenção de compostos enantiomericamente puros;
aliada à necessidade de mudar os catalisadores hoje existentes (geralmente constituídos de
metais pesados ou de transição, altamente nocivos ao ambiente) por catálises "ambientalmente
corretas", tornam o uso de biocatalisadores um dos maiores desafios da síntese orgânica na
atualidade (MORAN, 2002). Entretanto, devido à alta atividade catalítica em comparação
com os catalisadores convencionais, e ao fato de atuarem com alta eficiência em condições
33
reacionais bastante suaves. A utilização de novas técnicas reacionais tem sido crescente nos
últimos vinte anos e, com isso, novas informações teóricas e aplicações práticas estão
surgindo. O uso de biocatalisadores na forma livre ou imobilizado também é crescente em
escala industrial, especialmente nas indústrias de:
► Rações: o uso de enzimas em rações para aves tem aumentado, pois é
considerada uma forma de reduzir a contaminação ambiental com nutrientes nas excretas, tais
como o fósforo, nitrogênio, cobre e zinco, além da preocupação cada vez maior com a adição
de aditivos antimicrobianos nas rações. Portanto, as enzimas aumentam a disgestibilidade dos
alimentos e o desempenho das aves como também de outros animais domésticos. A escolha
do tipo de enzima a ser utilizada vai depender do tipo de substrato que se deseja trabalhar,
veja a Tabela 4 (Adaptado de: http://www.bichoonline.com.br/artigos/aa0041.htm).
34
TABELA 4 – Enzimas utilizadas em rações para aves.
ENZIMA SUBSTRATO EFEITOS
Xilanase Arabinoxilanas Redução da viscosidade da digesta.
Glucanases b-glucanos Redução da viscosidade da digesta.
Menor umidade na cama.
Pectinases Pectinas Redução da viscosidade da digesta.
Celulases Celulose Degradação da celulose e liberação de
nutrientes.
Proteases Proteínas Suplementação das enzimas endógenas.
Degradação mais eficiente de proteínas.
Amilases Amido Suplementação das enzimas endógenas.
Degradação mais eficiente do amido.
Fitase Ácido Fítico Melhora a utilização do fósforo dos vegetais.
Remoção do ácido fítico.
Galactosidases Galactosídios Remoção de galactosídios.
Lipases Lipídios e Ácidos
Graxos
Melhora a utilização de gorduras animais e
vegetais.
Fonte: Adaptado de: http://www.bichoonline.com.br/artigos/aa0041.htm
► Fruticultura: o Brasil apresenta uma diversidade muito grande de frutas
regionais nas regiões Norte e Nordeste e dentre estas se destaca o cupuaçu, que é considerado
uma fruta exótica e de grande potencial comercial nos mercados do Sudeste e também dos
países europeus. A polpa tem sido utilizada como matéria-prima para o néctar, sorvetes,
geléias purês e polpa enlatada. No processo de extração da polpa são utilizados acessórios
como facas, colheres ou tesouras de uso doméstico, devido à forte aderência da mesma ao
caroço, causando baixo rendimento no produto final. Com a finalidade de aumentar o
rendimento durante o processo de extração da polpa de cupuaçu, adicionou-se a polpa da fruta
dois tipos de preparações enzimáticas de ação pectinolítica, a Citrozym-L e a Rohament PL.
Sendo que o maior rendimento foi de 60% com a Citrozym-L, que é um composto
35
concentrado enzimático pectinolítico altamente concentrado e constituído de pectinases,
celulase, arabinases e produzidos por Aspergillus niger. Entretanto, para a enzima Rohament
PL que é um composto constituído apenas de pectinase, o seu rendimento variou de 43% a
57% (BASTOS, 2002).
► Panificação: a panificação é talvez uma das artes culinárias mais antigas.
A etapa decisiva na panificação é a fermentação, onde esta definirá a consistência, a aeração e
a leveza da massa. Este processo depende fundamentalmente da ação das leveduras, pois estas
transformam os açúcares dispaníveis na massa em álcool e gás carbônico, sendo este último o
reponsável pelo crescimento da massa. As transformações microbianas, aquelas mediadas por
fermento de pão, tem sido muito empregadas desde os primórdios da humanidade para
produção de pão, de laticínios e bebidas alcoólicas. O mais popular e atual biocatalisador
utilizado pelos químicos orgânicos é o Saccharomyces cerevisiae – fermento de pão de
padaria e/ou padeiro – pois, tem baixo custo, fácil acesso, bons rendimentos químicos,
facilidade de manuseio e não requer uso de cofatores (FURIGO, 2006).
► Farmacêutica: sabe-se a maioria dos compostos nos organismos vivos
são quirais, incluindo o DNA, as enzimas, os anticorpos, os hormônios e que cada
enantiômero compreende características diferentes.
Em nosso cotidiano, as drogas quirais fazem parte da realidade das
indústrias farmacêuticas. Algumas delas são novidades, mas muitas são apenas enantiômeros
puros obtidos de misturas racêmicas, onde hoje, são conhecidos e comercializados como
fármacos genéricos (MINATTI, 2006). A atividade dos fármacos depende da quiralidade, por
exemplo, a talidomida, um fármaco que causou a má formação de milhares de fetos, quando
administrada, na década de 1960, a várias gestantes (SILVA, 2001). Descobriu-se que apenas
um dos enantiômeros, entretanto, causava a má formação congênita, enquanto que o outro não
era prejudicial. A Figura 6 apresenta a fórmula estrutural da talidomida (MINATTI, 2006).
36
Fonte: Minatti (2006).
Figura 6 - Fórmula estrutural da talidomida.
Com o desenvolvimento da química farmacêutica, a estrutura básica dos
produtos ativos vem sendo modificada no sentido de descobrirem novas moléculas, mais
simples que contivessem a porção estrutural responsável pela atividade biológica presente na
molécula natural. Rapidamente foram sendo acrescentados resultados, envolvendo as relações
entre a estrutura molecular e as propriedades biológicas, possibilitando o planejamento e o
desenvolvimento de novas substâncias bioativas (PINHEIRO, 1998). A utilização de lipases
para sintetizar drogas em sua forma enantiomericamente pura está se tornando um caminho
importante na química da biotransformação e na síntese orgânica, pois tem envolvido
conversão assimétrica, um dos temas centrais da síntese orgânica moderna (SILVA, 2001).
As indústrias farmacêuticas têm demonstrado grande interesse nesta área,
visto que a atividade biológica de muitas drogas comercializadas na forma racêmica, muitas
vezes reside em um único enantiômero. As lipases (triglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são
enzimas hidrolíticas que hidrolisam triglicerídeos em ácidos graxos livres e glicerol. Elas têm
atraído à atenção de químicos orgânicos, devido a suas propriedades enantiosseletivas na
síntese orgânica e também por causa de sua versatilidade catalítica, disponibilidade comercial,
37
baixo custo além de não requererem cofatores (CARVALHO, 2005). A Figura 7 mostra
alguns exemplos de drogas que foram resolvidas via catálise enzimática.
1,4-benzodioxano Castanospermina Atenolol (agente cardiovascular) (usado no combate ao câncer) (tratamento de hipertensão e angina)
Fonte: Silva (2001).
Figura 8 - Exemplos de drogas resolvidas via catálise enzimática.
O microorganismo Saccharomyces cerevisiae, é um biocatalisador bastante
utilizado em reações químicas, por exemplo, em reações de reduções enantiosseletivas de
cetonas, onde apresentou boa atividade enzimática que pode ser observa pelo rendimento
obtido que foi >80% e o excelente excesso enantiomérico foi >99%, mas sendo que estes
valores dependem da eletrofilicidade da carbonila e da presença de substituintes ativantes;
quanto ao meio reacional (caldo biológico), é necessário certo controle de pH, temperatura e
de aditivos presentes que facilitam os mecanismos e aumentando o rendimento e o excesso
enantiomérico (RODRIGUES, 2001).
Como a grande quantidade de aplicações, o uso de enzimas ainda é restrito no
Brasil. Alguns especialistas observaram que houve uma grande disseminação no uso de
enzimas de origem animal, vegetal ou microbiano como aditivos ou até mesmo como
catalisadores de processos industriais (CAMPANATO, 2002). Elas estão correntemente
empregadas na formulação de detergentes, em diversas etapas produtivas da indústria de
alimentos, nas indústrias farmacêuticas, têxteis, celulose e papel, algumas indústrias de síntese
OH
O
OH
N
OHHHO
HO
OH
CH 2 CONH 2
O OH
NH
38
química entre outras. Na Tabela 5, está representada, algumas das utilizações de enzimas nas
indústrias.
TABELA 5 – Enzimas utilizadas nas indústrias.
INDÚSTRIA APLICAÇÃO
Laticínio
Hidrólise da gordura do leite.
Aumento do aroma, da qualidade e da vida de
prateleira.
Cervejaria Aumento do aroma e aceleração do processo
fermentativo.
Molhos e Condimentos Aumento de propriedades funcionais da gema de
ovo.
Processamento de Carnes Desenvolvimento de aromas e redução no conteúdo
de gorduras.
Óleos e Gorduras Transesterificação de óleos.
Química Fina Síntese de ésteres e resolução de recematos.
Detergentes Hidrólise de gorduras.
Farmacêutica Auxiliares de digestão.
Médica Determinação de lipídeos no sangue (biosenssores).
Couro Remoção de gordura da matéria-prima.
Tratamento de Resíduos Decomposição de lipídeos de efluentes.
Fonte: Adaptado de Pastore (2003).
As aplicações ambientais de enzimas podem-se referir ao emprego como
catalisadores de processos que substituem as técnicas de produção que geram poluentes
nocivos. Tratando-se do desenvolvimento das chamadas tecnologias limpas, que reduzem
drasticamente o impacto ambiental de uma dada atividade industrial como, por exemplo, a
biodegradação de compostos derivados do petróleo (IZUMI, 2001). A enzima tirosinase, por
exemplo, catalisa a oxidação de fenóis que são poluentes encontrados em diversas águas
industriais, onde por sua vez, sofrem polimerização formando produtos que conferem
39
coloração escura à água, mas que podem formar precipitados ou então serem absorvidos com
facilidade, quando removidos da água e geram um afluente clarificado com baixo nível de
fenóis residuais.
O Brasil ainda encontra-se atrasado nas pesquisas e aplicações de enzimas
quando comparado ao desenvolvimento mundial, mas isto está se revertendo, pois dados
estatísticos mostram que enquanto a nossa importação decresce, a exportação aumenta
(CAMPANATO, 2002).
1.2 IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
As enzimas estão sujeitas a inativação por fatores químicos, físicos ou
biológicos, podendo ocorrer quando estocadas ou durante o uso. Há assim, uma necessidade
de estabilizar a enzima contra inativação para utilizá-la em meio orgânico. Faz-se então
necessário o emprego de um método para que a mesma não perca sua atividade catalítica e
sua estereosseletividade. Frente a este problema, novas técnicas vêm sendo desenvolvidas
para fornecer estabilidade para as enzimas e facilitar sua recuperação. Uma das grandes
vantagens da imobilização é poder utilizar o catalisador repetidamente sem considerável perda
da atividade catalítica (JESUS, 1998).
Alguns sistemas que já foram utilizados para imobilizar enzimas são
Eupergit C, celite, quitosana e quitina, Chromosorb e Sepharose, microemulsão, organo-gel,
crisotila, polímeros entre outros. A Figura 8 mostra alguns procedimentos que vêm sendo
utilizados nos últimos anos para imobilizar enzimas (DALLA-VECCHIA, 2004).
A imobilização do biocatalisador em um suporte (sem prejuízo de sua
atividade por um razoável período de tempo) pode assegurar sua repetida utilização ou mesmo
40
possibilitar o uso em reatores contínuos, resultando em economia nos processos industriais.
Assim, de modo geral, a utilização de biocatalisadores imobilizados além de diminuir o custo
por análise, aumenta a rapidez e a exatidão do processo. Nos processos sintéticos, a facilidade
de extração dos produtos do meio reacional aliada à estabilidade do biocatalisador em reações
de longa duração (ou com substratos nocivos) são de grande interesse nas biotransformações.
Neste sentido, a técnica de imobilização em diferentes suportes é uma das mais utilizadas na
biocatálise, sendo bastante aplicada para mediar reações de interesse sintético em solventes
orgânicos (MORAN, 1994).
Dentre os suportes utilizados para a imobilização de enzimas com aplicação
em meio orgânico, a crisotila tem se mostrado uma alternativa muito interessante, uma vez
que ela é encontrada em abundância no Brasil, sendo massivamente usada na construção civil,
nas indústrias de confecção de roupas e de bebidas, e tem se mostrado um excelente
adsorvedor devida a sua uniformidade estrutural em suas fibras (JESUS, 1998).
41
Fonte: Dalla-Vecchia (2004).
Figura 8 - Procedimentos utilizados nos últimos anos para a imobilização de enzimas.
1.2.1 Imobilização de Enzimas em Crisotila
Matéria prima barata e abundante no Brasil, a crisotila (Figura 9), uma das
principais fontes de asbesto, surge como um novo suporte de biocatalisadores.
42
Fonte: Wendhausen (1998).
Figura 9 – Estrutura da crisotila.
A crisotila é um silicato magnesiano hidratado do grupo das serpentinas,
apresentando como formula molecular Mg3(Si2O5)(OH)4, onde possui 43% de MgO, 44,1%
de SiO2, 12,9 % de H2O. A estrutura da crisotila consiste de uma camada de sílica tetraédrica
que é coberta com uma camada de hidróxido de magnésio (brucita). A brucita é ligada à
camada de sílica por dois dos três grupos MgO (JESUS, 1998).
Atualmente vem-se estudando a utilização da crisotila como um novo
suporte para adsorção de proteínas, analisando os possíveis efeitos biológicos induzidos por
estas fibras. Comerlato e colaboradores, descreveram em 1995 que para a crisotila não foram
encontrados estudos de sua utilização como suporte para a imobilização de enzimas, existindo
apenas patentes no que se referem a imobilização de enzimas em asbestos. Com base nesta
informação, Comerlato (1995) estudou o comportamento da urease e invertase quando
adsorvidas neste suporte obtendo-se bons resultados.
Moran (1994) e Comerlato (1995) têm estudado a imobilização de fermento
de pão em crisotila e sua aplicação na redução enantiosseletiva de compostos carbonílicos
43
como os azidopropiofenonas, obtendo os azidoálcoois syn e anti com bons rendimentos e
bons excessos enantioméricos. Outros trabalhos que foram estudados utilizando fermento de
pão imobilizado em crisotila foram: a redução de fenilcetonas; redução de α-
haloacetofenonas; e a síntese enantiosseletiva de (R)-(−)1-feniletanolaminas (JESUS, 1998).
Wendhausen (2005) estudou o comportamento de células de
Micobacterium NRR em sistema bifásico. Nascimento (1996) tem utilizado a crisotila na
imobilização da lipase de Candida cilindracea, e utilizado na esterificação de álcoois
primários alifáticos em meio orgânico com sucesso. Recentemente, Silva (2001), tem
imobilizado lipases em crisotila e aplicado na resolução de álcoois secundários racêmicos
com bons resultados, mostrando assim que as lipases imobilizadas neste suporte mantêm sua
enantiosseletividade. Portanto, a crisotila trata-se de um suporte viável para o
desenvolvimento de estudos de imobilização de biocatalisadores e sua aplicação em síntese
orgânica.
Para Ranulfo (2003), a crisotila é considerada um bom suporte mineral para
a imobilização de células de levedura, empregadas na fermentação alcoólica. Neste estudo foi
investigada a função catalítica da presença de crisotila em fermentações alcoólicas com
células de Saccharomyces cerevisiae. As fermentações alcoólicas em batelada conduzidas
com leveduras imobilizadas sobre o suporte apresentaram aumento de até 27 % na velocidade
inicial de conversão de açúcares a etanol mais CO2, em relação ao sistema controle sem
presença de crisotila. Já nas fermentações contínuas com presença de crisotila em seu leito
ocorreu aumento da produção de etanol nas diversas taxas de diluições investigadas, em
relação a uma fermentação contínua sem crisotila, tomada como padrão. Esse aumento foi
mais acentuado quanto maior a taxa de diluição. Estudos foram conduzidos em processos
contínuos em biorreatores de leito empacotados mostrando uma conversão de Wendhausen
(2001).
44
Pinha (2006) utilizou não só neste estudo de bioprocessos, mas, como em
outros também, o ácido clavulânico imobilizado em crisotila. O ácido clavulânico é produzido
pela bactéria filamentosa Streptomyces clavuligerus, sendo um potente inibidor de β-
lactamases, enzimas responsáveis pela perda da atividade antibacteriana. Foi avaliada a
imobilização do microorganismo em sistemas com diferentes concentrações de crisotila e
verificado que quanto maior a concentração de crisotila empregada melhor à imobilização, no
entanto, isso não refletiu numa maior produção de ácido clavulânico quando comparado ao
ensaio em branco.
1.3 MICROORGANISMOS UTILIZADOS EM BIOCATÁLISE
As aplicações de enzimas e microorganismos em síntese orgânica
promoveram um grande desenvolvimento na biocatálise. Contudo, ainda que a habilidade das
enzimas e dos microorganismos para agir como catalisadores quirais específicos sejam
conhecidos, principalmente pela indústria farmacêutica, os procedimentos bioquímicos apenas
tornaram-se aceitos como técnicas experimentais rotineiras em laboratórios de síntese
orgânica nos últimos anos (MORAN, 1994).
Nas indústrias têxteis, os processos de tratamento dos efluentes líquidos
estão fundamentados na operação de sistemas físico-químicos de precipitação-coagulação,
seguidos de tratamento biológico via sistema de lodos ativados. Este processo infelizmente
apresenta o inconveniente de ser bastante sensível à composição do efluente (cargas de
choque), além de produzir um grande volume de lodo. Por estes entre vários outros motivos,
são estudadas novas alternativas de processos de tratamento biológicos e enzimáticos
aplicados à biotecnologia aplicada à indústria têxtil. Estes novos processos utilizam
45
microorganismos capazes de degradar de maneira eficiente um grande número de poluentes a
um baixo custo operacional para o adequado tratamento de efluentes têxteis, como por
exemplo, o Bacillus subtillis foi adaptado em meio de cultura artificial com a finalidade de
biodegradar corantes do tipo "azo". Bactérias, como Pseudomonas sp e Sphingomonas sp,
também têm sido reportadas na degradação de corantes, os fungos de decomposição branca,
como o Phanerochaete chrysosporium, Pleorotus ostreatus, Trametes versicolor, Trametes
hirsuta e outros, são conhecidos por degradarem vários tipos de corantes têxteis. Outros
fungos que produzem enzimas que agem sobre compostos recalcitrantes específicos
aumentando sua biodegradabilidade ou removendo-os por precipitação, um exemplo é a
enzima tirosinase, obtida através de cogumelos Agaricus bispora. Uma alternativa recente
para o tratamento de efluentes e compostos resistentes à degradação é o uso de agentes
quelantes naturais, produzidos por alguns fungos e bactérias, onde estes demonstraram
resultados muito interessantes (UEDA, 2004).
De acordo com os estudos de Kamida (2005), referente à biodegradação de
efluente têxtil por Pleurotus sajor-caju, foi verificada que houve produção de enzimas
ligninolíticas, quando os fungos foram incubados em bagaço de cana contendo efluente têxtil.
Este fato confirmou que as estas enzimas estão envolvidas no processo de descoloração e que
têm influência neste processo, pois apresentam atividade em todo o período de incubação
estudado. As duas linhagens de Pleurotus sajor-caju, apresentaram potencial para serem
empregadas em bioprocessos para remoção de cor de efluentes têxteis ou no tratamento de
resíduos sólidos coloridos, necessitando apenas de um melhor entendimento dos mecanismos
utilizados por estes fungos para o desenvolvimento de tecnologias.
Uma ampla aplicação dos microorganismos é na biodessulfurização
catalítica das frações do petróleo, onde esta é uma oferta interessante, para a substituição do
processo de hidrodessulfurização (HDS). Este processo poderia substituir com muitas
46
vantagens o processo de hidrodessulfurização, pois microorganismos com alta atividade e
seletivos aos substratos poderiam operar em condições brandas de reação. Diversos estudos
demonstram que bactérias, como aquelas pertencentes ao gênero Rhodococos erythropolis D-
1, Mycobacterium phlei WU-F1, Bacillus subtilis WU-S2B e outros, conseguem remover o
enxofre dos compostos policíclicos (KIRIMURA, 2002). Investigações de degradação
microbial do benzotiofeno e do dibenzotiofeno (DBT) têm centralizado a atenção de vários
pesquisadores na caracterização pela degradação bioquímica das reações e o processo de
dessulfurização microbial, para remover o enxofre do petróleo (ANNWEILER, 2001). Desse
modo, o caminho utilizado envolve a oxidação do DBT e a mineralização do carbono do
DBT, em vez de reduzir o valor energético do combustível (GROSSMAN, 2001).
Vários microorganismos já foram descritos na literatura com atividade para
a completa degradação do DBT, resultando finalmente no 2-hidroxibifenil (2-HBP). Um dos
caminhos é a via “4S”, onde ligações de carbono são deixadas intactas e o alto valor
energético do combustível é mantido. Os microorganismos Rhodococcus sp. IGTS8 (ATCC
53968), Corynebacterium SY-1, Rhodococcus erythropolis D-17, Paenibacillus e Gordona
CYKS1 foram descritos como seletivos para a dessulfurização do DBT em 2-HBP
(MAGHSOUDI, 2001). Outros microorganismos como Brevibacterium sp. e Pseudomonas
sp. são citados por realizarem a degradação do DBT (SETTI, 1997).
1.3.1 Presença de Enxofre em Combustíveis e Seus Problemas Ambientais e Econômicos
Dos combustíveis fósseis, o petróleo e o carvão são os mais importantes,
pois, além de possuírem uma composição complexa, apresentam quatro famílias de
compostos, os hidrocarbonetos alifáticos, cíclicos, aromáticos e moléculas contendo átomos
47
de azoto, enxofre ou oxigênio na sua estrutura (ALVES, 1999). Os compostos orgânicos
contendo enxofre (S) constituem uma pequena, mas importante fração do petróleo bruto. A
presença de enxofre não é desejável após o processo de refino do petróleo, pois causa
corrosão nos equipamentos que utilizam combustíveis derivados do petróleo e também porque
na combustão destes combustíveis ocorre a liberação de dióxido de enxofre (SO2) que é um
dos principais poluentes atmosféricos e responsável pela acidez nas chuvas. Quando presente
em concentrações superiores a 100 ppm, o SO2 é prejudicial ao homem, provocando irritações
nas mucosas. Exposições breves em concentrações na ordem de 400–500 ppm são fatídicas, já
que provoca a dilatação das membranas mucosas e espasmos dos músculos dos brônquios. O
reino vegetal também é bastante sensível ao SO2, pois, plantas expostas a concentrações de
apenas 1-2 ppm sofrem graves danos em poucas horas (ALVES, 1999). O gás SO2 liberado
pela utilização de combustíveis de petróleo, causa pequenos, médios e grandes problemas
econômicos, como acontece, por exemplo, a ação das chuvas ácidas sobre estátuas, edifícios,
pontes e outros, onde o reparo da corrosão nestas obras é de elevado custo para o estado,
município e particulares, bem como em motores automotivos e equipamentos em geral.
Uma vez que os países mais industrializados consomem cada vez mais
combustíveis fósseis, pode-se chegar à conclusão de que a emissão de enxofre para a
atmosfera constitui um dos problemas ambientais e econômicos da atualidade. Esta questão
poderá se agravar ainda mais, se não forem tomadas às devidas precauções em relação à
diminuição do teor de enxofre dos combustíveis fósseis (ALVES, 1999).
A remoção do enxofre do carvão, do petróleo e seus derivados, antes da sua
combustão, seria uma das estratégias para diminuir os níveis de emissão de SO2 para a
atmosfera (DENOME, 1994). Atualmente, nas refinarias, são utilizados processos físicos e
químicos, como a hidrodessulfurização (HDS), para a remoção do enxofre inorgânico. Este
tratamento tem custo muito elevado, envolvendo catalisadores químicos sob condições
48
extremas como altas temperaturas e altas pressões. O enxofre associado a compostos
orgânicos é bastante difícil de ser removido por esses processos, já que se encontra ligado
covalentemente a matrizes complexas.
1.3.2 Bactérias que Removem o Enxofre dos Combustíveis Fósseis
Para Melo (1997), a palavra biodegradação significa quebra de componentes
do petróleo para componentes de menor peso molecular ou mais polar, e a biodegradação do
petróleo por populações naturais de microorganismos representa um dos mecanismos
primários pelo qual os compostos poluentes são eliminados do meio ambiente.
Os estudos realizados sobre biodessulfurização tiveram início nas décadas
de 50 e 60, mas sem resultados significativos. Só nesta última década é que esta área mostrou
um desenvolvimento significativo. Foram selecionadas bactérias com a capacidade de utilizar
o enxofre presente em hidrocarbonetos poliaromáticos pertencentes a diferentes gêneros
como, por exemplo, Brevibacterium sp. (AFFERDEN, 1990), Corynebacterium sp.
(MAGHSOUDI, 2000), Rhodococcus sp. (MAGHSOUDI, 2001), Paenibacillus sp. (IZUMI,
2000), Pseudomonas sp. (VAN KEULEN, 1998), Gordonia sp. (CHANG, 2001) e Bacillus
sp.(KIRIMURA, 2000).
Existem ainda microorganismos capazes de se proliferar em variados
ambientes diferenciados por extremas temperaturas, salinidade ou valores de pH, que até onde
sabemos inviabilizariam qualquer tipo de vida. Estes seres que vivem em ambientes extremos
são chamados de extremófilos, isto é, são microorganismos à prova de agressões ambientais
extremas (SANTOS, 2004).
49
Lugares terrestres, aparentemente inabitáveis, são de fato povoados por
microorganismos que parecem muito bem adaptados à agressividade dos ambientes. A aridez
e salinidade do deserto, as gélidas calotas polares, os infernos sulfurosos, a lama negra super
aquecida das fossas abissais e os campos radioativos. Através destes fatos pode-se afirmar que
a vida existe em plena expansão (SANTOS, 2004).
De acordo com Santos (2004), os microorganismos podem ser classificados
como - halófilos adaptados a ambientes salinos, termófilos e hipertermófilos adaptados a
elevadas temperaturas, acidófilos e alcalófilos adaptados a extremos de pH e
microorganismos radiorresistentes que possuem resistência a radiações.
As condições ambientais extremas obrigaram os microorganismos a
desenvolverem elementos celulares e estratégias bioquímicas para sua sobrevivência. Devido
às características excêntricas destes microorganismos, seus componentes moleculares
possuem muitas propriedades que os tornam especialmente adequados para a utilização em
processos industriais, no qual é um excelente recurso para o desenvolvimento de novas
aplicações biotecnológicas que se espera revolucionar o nosso cotidiano e o avanço do
conhecimento (SANTOS, 2004).
O petróleo e o carvão são substratos complexos e o fato de termos um
microorganismo capaz de metabolizar o dibenzotiofeno (DBT) em condições laboratoriais
não significa que este é capaz de remover o enxofre orgânico presente nesses combustíveis
fósseis. A utilização de microorganismos e enzimas livres ou imobilizadas tem sido objeto de
patentes para aplicação em processos de biodessulfurização (ALVES, 1999).
Várias tentativas têm sido feitas para o desenvolvimento do processo
biotecnológico empregando bactérias aeróbicas e anaeróbicas. Para se obter um processo de
biodessulfurização competitivo com o processo físico-químico, isto é, a hidrodessulfurização
(HDS), o processo biotecnológico tem seguido três passos importantes: 1) separação do óleo
50
cru; 2) conversão, isto é, transformação biocatalítica utilizando um biocatalisador para
facilitar a seletividade do processo de dessulfurização; 3) finalizando, como o óleo cru é
separado por biocatálise, então ocorre a formação de bioprodutos. A biocatálise utiliza células
de enzimas isoladas e/ou na forma imobilizada. O uso de enzimas isoladas é vantajoso desde
que evite a formação de outros subprodutos mediante a contaminação destas, no caso não
haveria seletividade na biodessulfurização. O fato é que o microorganismo aeróbico degrada
quase todos os compostos constituídos de óleo. Hoje, há importantes limitações para a
aplicação industrial do processo de biodessulfurização, que está associado com o alto custo da
biocatálise e com a quantidade de volume da fase orgânica e da fase aquosa (SETTI, 1997).
Convencionalmente, o processo de HDS utilizado pela indústria de refinaria
não remove completamente compostos heterocíclicos organosulfurosos como, por exemplo, o
DBT que está presente no meio de destilação. A biodessulfurização (BDS) tem sido
considerada uma possível alternativa para a HDS do óleo diesel, já existem alguns
procedimentos com microorganismos aeróbicos que são capazes de uma oxidação específica
da ligação covalente do enxofre do DBT, onde a ligação carbono-carbono é quebrada e o
DBT é convertido a 2-hidroxibifenil (2-HBP) e sulfito (ABBAD-ANDALOUSSI, 2002 e
SCHILLIHG, 2002).
Alguns microorganismos seletivos dessulfurizam o DBT mostrando como
produto o sulfato e o 2-HBP. Uma remoção seletiva do enxofre dos compostos orgânicos é
desejável para a prática de um novo ponto de vista, pois um valioso combustível rico em
carbonos é guardado para posterior dessulfurização. A dessulfurização do óleo, com células
imobilizadas tem mostrado algumas vantagens: facilidade na separação da biocatálise com o
óleo tratado, relativamente alta proporção de óleo/água e baixo risco de contaminação. Chang
(2001) descreveu um novo processo de dessulfurização, empregando células imobilizadas em
celite um biosuporte e dois microorganismos dessulfurizantes.
51
Um processo completo de dessulfurização de compostos de enxofre-
orgânico em combustíveis fósseis deve ser estabilizado devido ao dióxido de enxofre que se
forma na combustão do óleo fóssil, sendo este um grande causador de poluição ambiental.
Recentemente, a biodessulfurização do óleo diesel com microorganismos sofreu um
desenvolvimento marcante, junto com a química da HDS (ODA, 2002).
1.3.2.1 Vias Metabólicas Degradativas do DBT
Kodama e seus colaboradores em 1973, analisaram duas espécies de
Pseudomonas sp., onde puderam verificar que o DBT era parcialmente degradado através de
sucessivas oxidações por um mecanismo similar ao da degradação do naftaleno (DENOME,
1993).
Na via de Kodama, apresentada na Figura 10, o ataque ao anel benzênico
ocorre nas posições 2 e 3 do DBT. Como geralmente os compostos análogos ao DBT
presentes nos combustíveis fósseis, alquila ou arila nessas posições, esses compostos não
poderão ser degradados por esta via. O produto final do DBT ainda contém o átomo de
enxofre, apresentando níveis de toxicidade biológica semelhantes ao substrato inicial
(GALLANGHER, 1993).
Van Afferden, em 1990, propôs uma via metabólica diferente (Figura 11),
utilizando como microorganismo a Brevibacterium sp. na qual o DBT é convertido a benzoato
e sulfito que por sua vez é oxidado a sulfato, por oxidação abiótica. O benzoato é por sua vez,
totalmente mineralizado a dióxido de carbono (CO2) e água (H2O). Assim, o DBT é usado
como nutriente pela bactéria como fonte de carbono e enxofre (VAN AFFERDEN, 1993).
Esta via de degradação do DBT não tem grande interesse em termos de técnica de
52
biodessulfurização de combustíveis fósseis, já que a mineralização completa da estrutura
carbonada implicará necessariamente em uma diminuição da energia química dos
combustíveis (ALVES, 1999).
Fonte: Gallangher (1993).
Figura 10 – Mecanismo da “Via de Kodama” para a degradaçõ do DBT.
OH
OH
O COOH
OH
S
S
OH
CHO
S
S
53
Fonte: Van Afferden (1993).
Figura 11 – Mecanismo da “Via de Van der Afferden” para a degradação do DBT.
S
S O
O O S
S O O O H O H H
S O 2 H O H O H
S O 2 H O H
O C O O H
S O 3 - S O 4 - C O O H
H 2 O + C O 2
54
Uma terceira via metabólica, que está representada na Figura 12, é a via
sulfóxido-sulfona-sulfonato-sulfato, normalmente denominado “4S”. Trata-se de uma via
específica para a remoção do átomo de enxofre presente no DBT, em que o grupo tiofênico
sofre um ataque oxidativo progressivo. Esta via envolve um sistema multienzimático, com
três atividades diferentes (GRAY, 1996). A primeira enzima é uma monooxigenase do DBT,
que oxida o DBT a 5,5’-dióxido de DBT em dois passos; a segunda enzima é também uma
monooxigenase que converte o 5,5’-dióxido de DBT em 2’-hidroxibifenilo-2-sulfinato e
finalmente uma liase que catalisa a quebra da ligação C-S transformando o 2’-hidroxibifenilo-
2-sulfinato em dois produtos finais, 2-hidroxibifenilo (2-HBP) e sulfato. As duas primeiras
enzimas da via requerem oxigênio molecular, NADH e FMN como cofatores, tornando assim
este processo mais caro.
Esta via “4S” é útil para metabolizar o DBT, pois o átomo de enxofre, que é
potencialmente tóxico, é retirado do composto sob a forma de um produto tratável (sulfato),
apresentando uma pequena perda de seu valor energético. As linhagens utilizadoras desta via
poderão constituir uma ferramenta biológica de fundamental importância no tratamento em
larga escala dos combustíveis fósseis, caso se consiga obter biocatalisadores de elevada
estabilidade em ambiente industrial (WANG, 1994).
55
Fonte: Gray (1996).
Figura 12 – Mecanismo da “Via 4S” para a degradação do DBT.
S
S O
NADH + O 2 + H +
H 2 O + NAD + DBT mooxigenase
DIBENZOTIOFENO
5 - ÓXIDO DE DIBENZOTIFENO
DBT mooxigenase NADH + O 2 + H +
H 2 O + NAD +
S O O
5,5 - ÓXIDO DE DIBENZOTIFENO
NAD + NADH + 1 / 2 O 2
DBT - 5,5-dióxido monooxigenase
OH - SOO -
H 2 O H 2 SO 3 -
HO
2'-HIDROXIBIFENILO-2-SULFINATO
2'-h idroxibifenilo-2-sulfinate sulfinoliase
2-HIDROXIBIFENILO
SO 4 4-
VIA ASSIM ILATÓRIA DO ENXOFRE
56
1.3.3 Preparo de Meios de Cultura com Microrganismos
Para Borzani (2001), meio de cultura é o que se pode chamar a um conjunto
de nutrientes necessários para que ocorra a multiplicação ou manutenção dos
microorganismos. Chang (2001) e Magashoudi (2001) utilizaram o seguinte procedimento de
meio de cultura em seus estudos com microorganismos: 1- meio mínimo de sal; 2 - tampão
pH 7,0; 3 - DBT (precursor); 4 - óleo diesel tratado por HDS, etc., tanto para a extração,
cultivo e manutenção destes.
O meio de cultura pode ser utilizado para o crescimento, para a manutenção
ou mesmo para o transporte de microorganismos. Antes de se preparar um meio de cultura, é
necessária uma esterilização do material que é utilizado até os nutrientes que servem para a
alimentação dos microorganismos, para que estes fiquem isentos de qualquer organismo vivo.
Os métodos para a esterilização dos meios de cultura variam conforme as características do
próprio meio.
Para podermos cultivar um microorganismo é necessário preparar um
inóculo (inóculo é a adição de uma pequena quantidade contendo células vivas de uma
bactéria e quando esta é adicionada ao meio estéril chamamos de inoculação). Conforme
Borzani (2001), após a inoculação, o meio de cultura é incubado por tempo determinado
(aproximadamente 24 horas), sob condições apropriadas de oxigenação, temperatura, etc.,
pois é neste período que ocorre a multiplicação do microorganismo dando origem a uma
cultura. Para favorecer crescimento é necessário conhecer previamente as características
fisiológicas do microorganismo estudado.
Conforme o estado físico, os meios de cultura têm usos específicos e devem
ser acondicionados de forma apropriada. Os meios de cultura podem ser líquidos, sólidos ou
57
semi-sólidos. Os meios sólidos diferem dos meios líquidos pelo seu aspecto gelatinoso,
devido à presença de ágar ou gelatina. O ágar é mais utilizado devido as suas propriedades,
como por exemplo, não é atacado por microorganismos e também não se liquefaz a uma
temperatura de 30 oC a 35 oC, que é a temperatura onde a maioria dos microorganismos
desenvolvem. Alguns meios de cultura sólidos não contêm ágar ou gelatina. “Um exemplo é o
meio de Dorset contendo ovo, meio usado para a manutenção de mycobacterium tuberculosis”
(BORZANI, 2001). Os meios de cultura líquidos podem ser acondicionados em tubos ou
frascos com tampas plásticas ou metálicas, de rosca, de encaixe ou de algodão envolvido em
gaze, veja a Figura 13.
Já os meios sólidos podem ser condicionados em tubos ou frascos na
posição horizontal ou inclinada, ou em placas de Petri de vidro ou de plástico do tipo
descartáveis ou reutilizáveis, como demonstrado na Figura 14. O meio líquido pode ser
esterilizado juntamente com o frasco, ou seja, pode estar dentro do tubo ou do frasco. Com o
meio sólido já não é o mesmo processo, pois para se obter uma placa com meio de cultura
sólido, este deve ser previamente esterilizado em frasco apropriado e a seguir, quando ainda
líquido (temperatura em torno dos 50oC), derramado dentro de uma placa esterilizada. Mas,
ao preparar o meio de cultura do tipo sólido e inclinado, estes poderão ser esterilizados dentro
do tubo a ser utilizado, e após esterilização, ficará inclinado até seu resfriamento (BORZANI,
2001).
58
Fonte: Borzani (2001).
Figura 13 – Tubos com vários tipos de tampas. (a) tubo de ensaio; (b) tampa de plástico; (c)
tampa de rosca; (d) tampa de metal; (e) tampão de algodão hidrófobo.
Fonte: Borzani (2001).
Figura 14 – Meio de cultura sólido acondicionado em: (a) tubo de ágar inclinado – vista
lateral; (b) tubo de ágar inclinado – vista frontal; (c) tubo de ágar não inclinado;
(d) placa de Petri; (e) erlenmeyer com ágar inclinado.
Para Borzani (2001), os meios de cultura devem ser utilizados de acordo
com os objetivos do experimento. A composição química de um meio de cultura pode variar
59
em uma ordem de grandeza quase infinita. Por exemplo, ao cultivar uma bactéria
quimiolitotrófica, pode-se recorrer a um meio de cultura contendo simplesmente uma solução
de sais inorgânicos tendo o CO2 como fonte de carbono. Já uma bactéria quimiorganotrófica,
como a E. coli, necessita da presença de um substrato orgânico como fonte de energia e
carbono. Muitos microorganismos são capazes de crescer e multiplicar em meio de cultura
basal, outros muito exigentes, só crescerão se ao meio basal forem acrescentados outros
nutrientes, que chamamos de meio de enriquecimento. Os meios de enriquecimento são
utilizados apenas para promover o crescimento de um determinado microorganismo e/ou
inibir o crescimento de outros. Para não esquecermos, os meios de cultura devem ser
preparados e esterilizados seguindo procedimentos básicos como as técnicas de assepsia.
As técnicas de assepsia impedem a contaminação de instrumentos e meios
de cultura antes e durante o seu manuseio. Esta técnica envolve os procedimentos
responsáveis pela esterilização de instrumentos a serem utilizados e os procedimentos
responsáveis pela manutenção da condição de esterilidade. Dessa forma, frascos esterilizados
devem ser mantidos sempre fechados, sendo abertos pelo menor tempo necessário para a sua
utilização. Para evitar a contaminação de um material, seja este estéril ou um frasco contendo
uma cultura pura, a borda do tubo deve ser rapidamente passada na chama do bico de Bunsen
imediatamente após a sua abertura e antes de ser fechado, conforme a Figura 15 (c e e). Essa
prática evita que eventuais organismos vivos, presentes nessa região, caiam dentro do frasco,
contaminando o meio ou a cultura. Esse procedimento chama-se flambagem e deve ser
utilizado durante a retirada de amostras, inoculações ou semeaduras em meios estéreis. Há a
necessidade de adotar um sistema seguro para que a tampa não fique exposta à contaminação,
para isso aconselha-se o uso do dedo mínimo para segurar a tampa do tubo durante todo o
tempo de manuseio, que está demonstrada na Figura 15 (c, d e e) (BORZANI, 2001).
60
Para evitar a contaminação de um meio de cultura sólido, contido em placa,
existem várias técnicas de assepsia apropriadas, como a tampa da placa deve ser mantida
sobre a bancada com a borda para cima, o mais próxima possível da chama do bico de
Bunsen, enquanto a placa contendo o meio de cultura é segurada com a mão esquerda perto da
chama, veja a Figura 15 b. Como alternativa, pode ser utilizado o procedimento descrito na
Figura 16, onde a tampa é aberta sem a separação total da base da placa (BORZANI, 2001).
61
(a) Flambar a alça até o rubro. (b) Encostar levemente a alça na colônia isolada.
Tampar a placa em seguida.
(c) Tirar, com o dedo mínimo, a tampa do tubo. (d) Inocular a amostra com movimentos de
Flambar a boca do tubo. ziguezague sobre a superfície do
ágar inclinado.
(e) Flambar a boca do tubo antes de fechar. (f) Flambar a alça ou o fio
imediatamente
após o uso.
Fonte: Borzani (2001).
Figura 15 – Técnicas de assepsia utilizadas para a inoculação de microorganismos.
62
Fonte: Borzani (2001).
Figura 16 – Técnica de “Pour – Plate”.
As técnicas que envolvem a transferência de microorganismos de um local
para o outro– inocular ou repicar - utilizam os seguintes instrumentos: alça e fio agulha de
platina ou níquel-cromo e pipetas de Pasteur e sorológica, mostrados na Figura 18. Esses
instrumentos são encontrados atualmente na forma reciclável ou na forma esterilizada e
descartável com gotas de volumes pré-determinados. Palitos longos de madeira também
podem ser utilizados desde que previamente esterilizados em forno ou autoclave. A alça e o
fio devem ser esterilizados imediatamente antes e após o seu uso, para isso, as partes
metálicas devem permanecer na chama do bico de Bunsen até atingir o rubro, veja a Figura
17 (a e f). Antes do contato com a cultura, a fim de impedir a destruição dos
microorganismos, a alça ou o fio devem ser esfriados em superfície estéril (superfície interna
do tubo ou da placa) ou no ambiente, desde que trabalhando em câmara de fluxo de ar.
Atenção com a flambagem, pois esta técnica não deve ser utilizada quando os líquidos
utilizados têm características inflamáveis (BORZANI, 2001).
63
Fonte: Borzani (2001).
Figura 17 – Instrumentos utilizados para inoculações. (a) alça de platina, de níquel-cromo ou
de inoculações; (b) fio ou agulha de platina, de níquel-cromo ou de inoculação;
(c) pipeta de Pasteur; (d) palito de madeira (tipo churrasco); (e) pipeta
sorológica; (f) pipetador mecânico com bomba de plástico.
1.4 MÉTODO DE INOCULAÇÃO
De acordo com Borzani (2001), quando uma alça estéril é mergulhada em
uma suspensão contendo microorganismos e a seguir retirada do meio, forma-se uma película
líquida circular em volta de alça, contendo um determinado número de microorganismos.
Essa alçada é chamada de inóculo, onde, o tamanho do inóculo vai depender de dois fatores
controláveis: concentração de células na suspensão e diâmetro da alça. O fio de platina pode
ser um instrumento para inocular suspensões, uma vez que um pequeno volume de líquido
64
fica aderido ao metal. A pipeta de Pasteur e a pipeta sorológica podem ser usadas para
inocular volumes variáveis conforme a sua calibragem e segurança no trabalho.
A técnica de inoculação que se refere a este trabalho é a preparação de
inóculos sólidos em meios líquidos. A alça ou fio de platina podem ser usados para retirar
pequenas quantidades de material sólido (microorganismos), provenientes de uma colônia em
meio de cultura sólida. Basta tocar a alça ou o fio no material (quantidade ou o número de
microorganismos retidos na superfície da alça ou do fio não é mensurável), e estes estarão
contendo os microorganismos que posteriormente são mergulhados no meio líquido e
lentamente agitados para a liberação do inóculo (BORZANI, 2001).
A parir do inóculo faz-se a semeadura de colônias isoladas ou a semeadura
em estrias. Nessa técnica o inóculo é progressivamente espalhado, de forma a promover a
separação de células na superfície do meio sólido. A Figura 18 mostra a seqüência de
procedimentos a serem seguidos para a obtenção de colônias isoladas, lembrando que durante
a semeadura em estrias a alça deve ser mantida na posição correta, a fim de evitar rasuras no
ágar. Entre cada estria, A, B ou C, a alça deve ser flambada para eliminar os microorganismos
remanescentes na mesma. Como o método parte do princípio de que cada célula origina uma
colônia, após a incubação por tempo determinado, o espaço onde as células tiverem sido
suficientemente separadas umas das outras apresentará colônias isoladas. Sendo que cada
colônia isolada corresponde a uma cultura pura (BORZANI, 2001).
65
Fonte: Borzani (2001).
Figura 18 – Técnica de semeadura em estrias para a obtenção de colônias isoladas. A figura
dentro do quadro mostra a posição correta da alça durante a semeadura. 1) Com
a alça retira-se o inóculo da suspensão. 2) Inocular com a alça contendo os
microorganismos a superfície do ágar em estrias com movimentos em
ziguezague, conforme esquema em A. 3) Repetir o procedimento seguindo
esquema em B. 4) Repetir o procedimento seguindo esquema em C.
1.4.1 Meios para o Cultivo de Bactérias
Os meios escolhidos para o cultivo de bactérias específicas normalmente
imitam o meio natural das mesmas. Se a glicose é um constituinte comum de um nicho
bacteriano, então o açúcar é adicionado ao meio de cultura. O meio a ser selecionado tem que
ser de acordo com o tipo de bactéria.
66
Os compostos orgânicos exigidos pelas bactérias heterotróficas variam em
tipo e número de um grupo de bactérias para outro. As Escherichia coli podem crescer muito
bem em meios que contenham um único composto orgânico, como o açúcar mais os íons
inorgânicos. O meio quimicamente definido para tais bactérias está no Tabela 6. Enquanto
que outras bactérias necessitam de 20 aminoácidos e várias vitaminas para crescer. Estes meio
complexos contêm uma grande variedade de substâncias orgânicas preparadas a partir de
materiais naturais e, portanto, não são quimicamente definidos. A Tabela 7 mostra a
composição de um meio complexo típico utilizado para o cultivo de bactérias heterotróficas
(PELCZAR, 1997).
TABELA 6 - Meio quimicamente definido para uma bactéria heterotrófica.
INGREDIENTES (a) FUNÇÃO QUANTIDADE
Glicose Fonte de energia e de carbono. 1g
NH4H2PO4 Fonte de nitrogênio, tampão e íons essenciais. 5g
K2HPO4 Tampão e íons essenciais. 1g
NaCl Íons essenciais. 5g
MgSO4 . 7 H2O Íons essenciais. 0,2g
Água Solvente. 1000mL
Fonte: Pelczar (1997).
(a) Os ingredientes acima representam os constituintes mínimos em um meio para uma bactéria não-fastidiosa tal como o
tipo selvagem de Escherichia coli. Para uma espécie fastidiosa, tal como o Lactobacillus acidophilus, substâncias adicionais
tais como aminoácidos e vitaminas têm sido adicionados ao meio.
67
Tabela 7 – Composição do meio nutriente, para o crescimento de uma bactéria heterotrófica.
INGREDIENTES (a) FUNÇÃO QUANTIDADE
Extrato de Carne
Substância hidrossolúvel de tecido animal:
carboidratos, compostos de nitrogênio orgânico,
vitaminas e sais.
3g
Peptona Nitrogênio orgânico, algumas vitaminas. 5g
Cloreto de Sódio Íons e requerimentos osmóticos. 8g
Água Solvente. 1000mL
Fonte: Pelczar (1997).
(a) Se um meio solidificado é requerido, ágar (15g) é adicionado; o meio é então chamado ágar nutriente.
68
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
� Imobilizar enzimas (lipases) de linhagens purificadas em suporte sólido (crisotila) e
aplicar no processo de biocatálise, para a preparação de ésteres;
� biodegradar compostos de enxofre presentes em combustíveis fósseis, utilizando
diferentes microorganismos imobilizados em suporte sólido (crisotila) e em meio livre
com sistema aquoso e bifásico.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
� Imobilizar as lipases de Mucor javanicus, Pseudomonas cepacia, Candida rugosa,
Aspergillus niger e Rhizopus oryzae em crisotila e avaliar sua estabilidade e atividade
catalítica;
� estudar reações de esterificação, utilizando as diferentes lipases imobilizadas em
crisotila na obtenção de ésteres alifáticos;
� avaliar a influência de diferentes solventes orgânicos na atividade catalítica das lipases
utilizadas;
69
� avaliar a reutilização do suporte contendo o biocatalisador imobilizado em reações de
esterificação;
� aprender técnicas relacionadas a reativação, crescimento e manutenção de
microorganismos;
� estudar o crescimento celular através de curvas de crescimento;
� analisar a ação de microorganismos sobre compostos de enxofre presentes em
derivados de petróleo através de biodegradação;
� conduzir a biodessulfurização em sistema aquoso e bifásico;
� conduzir a biodessulfurização com microorganismos imobilizados em crisotila;
� otimizar as condições reacionais a fim de obter o máximo de biodegradação.
70
3 PARTE EXPERIMENTAL
3.1 MATERIAIS
As enzimas utilizadas no desenvolvimento do trabalho foram, a lipase
Amano 10 (Mucor javanicus) com atividade específica de 10.000 u/g de sólido, a lipase
Amano PS (Pseudomonas cepacia) com atividade específica de 30.000 u/g de sólido, a lipase
AY Amano 30 (Candida rugosa), com atividade específica de 30.000 u/g de sólido, a lipase A
Amano 12 (Aspergillus niger) com atividade específica de 12.000 u/g de sólido e a lipase F-
AP 15 (Rhizopus oryzaes) com atividade específica de 150.000 u/g de sólido, todas com
procedência da Amano Enzyme USA Co.. Os microorganismos utilizados no
desenvolvimento do trabalho são pertencentes ao gênero Brevibacterium sp., CCT 3020 e
CCT 3019 (Brevibacterium citreum e Brevibacterium linens), Corynebacterium sp., CCT
2736 (Corynebacterium glutamicum), Rhodococcus erythropolis sp., (CCT 7429 e CCT 1878)
todos com procedência da Fundação André Tosello, Campinas, São Paulo. Os reagentes e
solventes empregados foram: acetato de etila, acetona, cicloexano, etanol, heptano, hexano,
N,N-dimetilacetamida e N,N-dimetilsulfóxido de procedência da Vetec. Como composto
modelo para a biodesulfurização empregou-se o dibenzotiofeno e o tiofeno, de procedência da
Fluka. Os álcoois primários pentan-1-ol, octan-1-ol, butan-1-ol, metanol e etanol absoluto, e
os ácidos hexanóico, octanóico e láurico foram de procedência da Vetec. A crisotila tipo 5RL
foi de procedência da Mineradora Sama (Goiás).
71
3.2 EQUIPAMENTOS
Os equipamentos utilizados estão representados na Tabela 8.
TABELA 8 - Relação dos equipamentos utilizados com as respectivas marcas e modelos.
EQUIPAMENTO MARCA MODELO
Agitador magnético Microquímica MQAMA -301
Aquecedor Microquímica MQ AMA – 301
Autoclave Vertical Phoenix -
Balança semi-analítica Gehaka BG-200
Balança Analítica Gehaka AG-200
Centrífuga Fanem 206-BL
Cromatógrafo gasoso Shimadzu 14 B
Cromatógrafo líquido Varian Pro Star
Espectrofotômetro de UV/Vis Varian Cary 50 Bio
Espectrofotômetro de Infravermelho Shimadzu Prestige 21
Estufa de Secagem Fanem 315 D
Evaporador Rotatório Büchi RE 120
Incubadora com agitação orbital Tecnal TE-420
Ultra-Som de 25 kHz Odontobras 2840-D
Vortex (agitador de tubos) Microquímica MQAMA 301
Fonte: Dados primários (2006).
72
3.3 IMOBILIZAÇÃO DAS ENZIMAS EM CRISOTILA
3.3.1 Preparação do Suporte Crisotila
O tratamento dado a crisotila bruta seguiu a metodologia empregada por
Nascimento (1996). A crisotila bruta foi colocada em uma peneira e lavada com jatos de água
até a água sair com aparência limpa. Logo em seguida a crisotila foi colocada em um
recipiente com tampão em pH = 7,2 e agitada por aproximadamente 45 minutos e então foi
filtrado a vácuo e secado em estufa. Foi pesado 1g de crisotila em um erlenmeyer de 125 mL
e adicionado 200 mg de lipase em 100 mL de tampão fosfato pH 7,2, e agitado a mistura por
24h. Durante este procedimento, alíquotas foram retiradas e acompanhado o pelo processo de
adsorção por leitura de absorbância das enzimas, no seu comprimento de onde máximo em
um espectrofotômetro de UV-visível (Candida rugosa 257,0 nm, Aspergillus niger 275,0 nm,
Rhizopus oryzae 276,0 nm, Mucor javanicus 265,0 nm, Pseudomonas cepacia 263 nm)
determinando assim a quantidade de biocatalisadores adsorvidos no suporte.
3.3.2 Preparação do Meio Reacional para as Reações Enzimáticas
A crisotila contendo as enzimas imobilizadas foi separada em secções
regulares e removidas para um erlenmeyer contendo 25 mL de hexano ou outro solvente
orgânico de interesse.
As reações foram realizadas adicionando ao erlenmeyer contendo 1 g de
crisotila quantidades equimolares de solvente orgânico e 0,01mol de substrato ácido e álcool.
73
As reações foram realizadas a 25ºC em uma incubadora termostatizada com agitação orbital
por 48 horas.
As reações foram acompanhadas por cromatografia em camada delgada
(ccd) utilizando como eluente uma mistura de hexano-acetato de etila (15:1). Os produtos
foram isolados por cromatografia em coluna utilizando sílica gel 60 (70-230 mesh) e por
cromatografia utilizando um funil com placa poroza sinterizada e sílica para cromatografia em
camada delgada sendo que para a confirmação da pureza do produto foram realizadas analises
de RMN de 1H.
Todas as reações foram realizadas nas mesmas condições experimentais
utilizando crisotila sem enzima adsorvida. Os substratos ácidos, álcoois primários e as
enzimas utilizadas no trabalho estão listados na Tabela 9.
TABELA 9 – Ácidos, álcoois primários e enzimas utilizadas nas reações enzimáticas.
ÁCIDOS ÁLCOOIS ENZIMAS (Lipases de)
Ácido Hexanóico
Ácido Octanóico
Ácido Láurico
Metanol
Etanol
Butan-1-ol
Pentan-1-ol
Octan-1-ol
Candida rugosa
Pseudomonas cepacia
Mucor javanicus
Rhizopus oryzae
Aspergillus niger
Fonte: Dados primários (2001).
A Figura 20 mostra o sistema contendo a crisotila com enzima imobilizada
onde as reações foram realizadas, adicionando-se os reagentes e monitorando a formação dos
produtos por métodos cromatográficos.
74
Fonte: Jesus (1998).
Figura 19 – Sistema de crisotila utilizado para realizar as reações de esterificação.
3.4 MÉTODOS EXPERIMENTAIS COM MICROORGANISMOS
Serão relatados a seguir alguns procedimentos da literatura que foram
tomados como base para os experimentos com microorganismos imobilizados em crisotila e
em meio livre na remoção de enxofre de compostos heterocíclicos.
3.4.1 Reativação Celular
O material empregado – erlenmeyer, alça de platina, pipetas - na reativação
celular foi esterilizado em autoclave, flambado e desinfetado com uma gaze embebida em
álcool 70%. A ampola foi envolvida em um chumaço de gaze, onde foi segurando firmemente
com ambas as mãos, quebrando a ampola na altura do risco. Fez-se então a retirada da porção
reagentes produtos
solvente orgânico Crisotila
contendo enzima
75
superior da ampola próximo ao bico de Bunsen e removido o tampão de algodão e com o
auxílio de uma pinça, adicionou-se cerca de 0,2 mL de água destilada com o auxílio de uma
pipeta de Pasteur. Esta reativação celular seguiu a metodologia indicada pela Fundação André
Tosello de Campinas – São Paulo.
Para bactérias e leveduras o procedimento seguido foi: produziu-se uma
suspensão das células, deixando-a rehidratar por aproximadamente, 10 a 15 minutos em água
peptonada. Em seguida repicou-se com a ajuda de uma alça de platina para os meios sólidos
de manutenção sejam placas de petri ou tubos de ágar inclinados. Após um período de
incubação de 72 horas em incubadora a temperatura controlada para o crescimento celular.
3.4.2 Meio NA (Nutrient Agar)
Foram pesados 3,0 g de glicose, 3,0 g de extrato de levedura, 3,0 g de estrato
de carne, 5,0 g de peptona, 20 g de ágar e 1000 mL de água destilada. Esta mistura foi
solubilizada com um leve aquecimento. O meio foi esterilizado em uma autoclave a 120 oC. O
conteúdo foi transferido ainda quente para os tubos de ensaio ou para placas de Petri, também
previamente esterilizadas. Depois de resfriado os frascos, os microorganismos foram
transferidos para as placas através do repique com uma alça de platina, em meio estéril. O
frasco foi colocado na incubadora por 36 horas.
76
3.4.3 Meio GYM (Streptomyces Medium)
Foram pesados 4,0 g de glicose, 4,0 g de extrato de levedura, 10,0 g de
extrato de malte, 2,0 g de carbonato de cálcio, 12,0 g de ágar e 1000 mL de água destilada.
Todos estes ingredientes foram misturados e solubilizados com um leve aquecimento. O meio
foi esterilizado em uma autoclave a 120 oC. O conteúdo foi transferido ainda quente para os
tubos de ensaio ou placas de Petri, também esterilizados previamente. Depois de resfriado os
frascos, os microorganismos foram transferidos para as placas através do repique com uma
alça de platina, em meio estéril. O frasco foi colocado na incubadora por 36 horas.
3.4.4 Preparo do Inóculo
Para o preparo do inóculo, foram pesados 3,0 g de glicose, 3,0 g de extrato
de levedura, 3,0 g de estrato de carne, 5,0 g de peptona e 1000 mL de água destilada. Esta
mistura foi solubilizada com um leve aquecimento. O meio foi esterilizado em uma autoclave
a 120 oC. Depois de resfriado o frasco que continha a mistura, adicionou-se certa quantidade
de microorganismos, correspondente a duas ou três alçadas de platina. O frasco foi colocado
na incubadora por 24 horas.
Para a otimização do processo, foi realizada uma modificação no preparo do
inóculo, onde à mistura foi acrescentado 200 mL de meio mínimo de sais, 20 mL de DMSO
como fonte de enxofre.
77
3.4.5 Preparo do Meio de Crescimento
Para o meio de crescimento, foi pesado inicialmente 3,0 g de glicose, 3,0 g
de extrato de levedura, 3,0 g de estrato de carne, 5,0 g de peptona e 1000 mL de água
destilada. Esta mistura foi toda solubilizada com um leve aquecimento. O meio foi
esterilizado em uma autoclave a 120 oC. Depois de resfriado o frasco com o meio, foi
adicionado 100 mL de microorganismo, proveniente do inóculo recém preparado. O frasco foi
colocado na incubadora por 48 horas.
Para a otimização do processo, foi realizada uma modificação no preparo do
meio de crescimento, onde à mistura foi acrescentado 200 mL de meio MMS, 20 mL de
DMSO como fonte de enxofre.
Para aumentar ainda mais a quantidade de microorganismos crescidos,
utilizou-se o meio de crescimento modificado, juntamente com uma aeração forçada (bomba
de aquário) durante todo o seu tempo de crescimento (48 horas).
3.4.6 Curva de Calibração
Os microrganismos após crescimento e centrifugação foram preparadas
diluições de concentrações com massa de células conhecidas, destas soluções tomou-se um
alíquota de 3 mL (volume da cubeta) e a leitura foi realizada em um espectrofotômetro de
UV-visível num comprimento de onda de 600 nm, onde é possível acompanhar o crescimento
celular.
78
3.4.7 Curvas de Crescimento
Prepararam-se diferentes meios de crescimento para os microorganismos, na
intenção de avaliar qual é o mais eficaz. O experimento foi acompanhado por
espectrofotômetro UV-visível num comprimento de onda de 600 nm. Os demais meios
preparados estão listados na Tabela 10.
Tabela 10 – Relação dos diferentes meios de crescimento, utilizados na curva de crescimento.
Meio Tampão
(pH=7,0)
DMSO
(15%) Peptona
Extrato de
Carne
Ext. de
levedura Glicose Água (dest.)
1 X X
2 X X X X X
3 X X X X X
4 X
5 X X X X X X
6 X X
7 X X
8 X X
9 X X
10 X X
11 X X X X X
12 X X X X X X
Fonte: Dados primários (2006).
Depois de acompanhado o crescimento dos microorganismos em diferentes
meios, foi realizado uma seleção dos melhores resultados, para posterior aplicação em reações
de biotransformação, tendo como substrato o DBT (100 ppm).
79
3.4.8 Determinação de Massa Seca
Pesou-se uma membrana seca de 0,45 mesh. Após o término do tempo (48
horas) de crescimento do microorganismo, retirou-se três alíquotas de 5 mL cada, onde foram
filtradas de maneira individual e em seguida, colocadas em uma estufa para secagem numa
temperatura de aproximadamente 60 oC. Após ter atingido o peso constante, foi determinada a
massa total em gramas de microorganismo por L.
Um outro método empregado foi que após ter atingido às 48 horas de meio
de crescimento retirou-se três alíquotas (para posterior média) de 3,0 mL que em seguida,
foram transferidas para o papel alumínio previamente pesado. Após ter atingido o peso
constante, foi determinada a massa total em gramas de microorganismo por L.
3.5 PREPARO DO MEIO DE BIOTRANSFORMAÇÃO
3.5.1 Teste de Solubilidade com DBT
O teste de solubilidade com DBT foi iniciado pesando-se 500 ppm do
mesmo e em seguida, este foi dissolvido em 5 mL de solvente que dentre os quais foram:
água, acetona, DMSO, n-hexano, etanol, cicloexano, n-heptano e DMF.
80
3.5.2 Meio Nutriente para a Biotransformação em Sistema Aquoso com DBT
No preparo do meio de biotransformação em sistema aquoso foi pesado 0,9
g de glicose, 0,9 g de extrato de carne, 500 ppm de DBT e 300 mL de água destilada. Todo o
meio foi autoclavado a 120 oC. O microorganismo obtido após a centrifugação do meio de
crescimento, foi adicionado ao meio recém-preparado. O frasco foi colocado na incubadora
por 96 horas a 30 º C e 150 rpm.
3.5.3 Preparo do Meio Mínimo de Sais (MMS)
Inicialmente foram pesados 2,0 g de NH4Cl; 4,5 g de K2PO4; 1,5 g de
NaH2PO4; 0,2 g de MgCl2; 0,02 g de CaCl2; e misturados com 1 mL de solução traço (100 mg
de FeCl2 . 7H2O; 250 mg de CoCl2 . 6H2O; 144 mg de ZnCl2; 100 mg de MnCl2; 24 mg de
NiCl2; 5 mg de CuCl2; 36 mg de Na2MoO4 . 2H2O e 30 mg de H3BO3 - para 1 L de água
destilada) e 1 mL de solução de vitamina (0,025 mg de ácido fólico; 2,0 mg de riboflavina;
0,05 mg de ácido lipóico; 1,0 mg de biotina; 3,5 mg de ácido nicotinico; 3,0 mg de cloreto de
tiamina; 2,0 mg de ácido p-aminobenzóico; 1 mg de clorto de piridoxal; 1,0 mg de
pantotenato de cálcio; 0,5 mg de vitamina B12; 2,5 mg de niacina e 2,5 mg de inositol - para 1
L de água destilada) para uma solução final 1 L.
81
3.5.4 Teste de Adaptação do Microrganismo com Diferentes Ingredientes em Meio Sólido
Prepararam-se diferentes placas de crescimento para os microorganismos, na
intenção de avaliar sua eficácia, levando em consideração um período de 30 dias para sua
adaptação. Os meios sólidos preparados estão listados na Tabela 11.
Tabela 11 - Relação dos diferentes meios sólidos de crescimento.
PLACA Meio NA STr (a) Sol Vit (b) DMSO DBT
1 X X X X
2 X X
3 X X
4 X X X X
5 X
6 X X
7 X X
8 X X X
9 X X X
10 X X X X
Fonte: Dados primários (2006).
(a) Solução Traço; (b) Solução Vitammina.
Após o período de adaptação, todas as placas de crescimento, ficaram em
observação por 48 horas e uma incubadora na temperatura de 37 oC.
82
3.5.5 Biotransformação em Sistema Aquoso com DBT
Para o preparo do meio de biotransformação em sistema aquoso foi pesado
0,20 g de glicose, 0,15 g de extrato de carne, 54 e 11 mM DBT e 50 mL de tampão com pH
7,0. Todo o meio foi autoclavado a 120 oC. O microorganismo obtido após a centrifugação do
meio de crescimento, foi adicionado ao meio recém-preparado. O frasco foi colocado na
incubadora por 96 horas a 150 rpm.
Neste mesmo meio de biotransformação, foi realizada uma renovação diária
de microorganismos e colocados em uma incubadora com agitação de 150 rpm por 216 horas
(uma semana). Todos os dias eram adicionados microorganismos previamente cultivados e
centrifugados. O resultado foi acompanhado por cromatografia em placa e revelada em
câmara de iodo e/ou ultravioleta.
3.5.6 Meio de Biotransformação com Adaptação do Microorganismo Utilizando DBT
Neste teste foi feito um fortalecimento do microorganismo, onde foi
utilizado tampão fosfato (pH 7,0), meio NA sem peptona e 11 mM de DBT diluído em etanol
(5%). O microorganismo foi colocado em reação por de 456 horas (quinze dias) nas condições
de a 37 oC e 150 rpm. A cada 48 horas o meio de crescimento era centrifugado, a solução era
dispensada e o sólido era transferido para um novo meio NA sem peptona, onde era
acrescentado mais 11 mM de DBT. O crescimento dos microorganismos (Brevibacterium
citreum e Brevibacterium linens) foi acompanhado por um espectrofotômetro UV-visível em
600 nm. Seus resultados foram acompanhados por cromatografia em placa e reveladas em
câmara de iodo e/ou ultravioleta.
83
3.5.7 Biotransformação em Sistema Aquoso com Tiofeno
Foi pesado 0,20 g de sacarose e 0,20 g de extrato de levedura e solubilizado
num volume de 21 mL de tampão pH 7,0. Todo o meio foi autoclavado e após seu
resfriamento, foi adicionado o microorganismo e 22 mM de Tiofeno. Logo após, o frasco
contendo o meio reacional foi colocado em uma incubadora com 150 rpm de agitação por 96
horas. Esta reação de biotransformação foi acompanhada com uma reação padrão (branco) e
seu resultado foi acompanhado por cromatografia em placa e revelada em câmara de iodo
e/ou ultravioleta.
3.5.8 Biotransformação utilizando 50% Solvente e 50% Água.
Foi solubilizado 9,21 mM de DBT em 25 mL de acetona, N,N-Dimetil
Acetamida e N,N – Dimetilformamida e depois foi colocado num volume reacional de 50 mL,
onde cada frasco continha apenas 0,20 g de sacarose e 0,15 g de extrato de carne. Em seguida
foram colocados em uma incubadora por 96 horas com 150 rpm de agitação. Com relação ao
enxofre foram efetuadas leituras de UV-visível em um comprimento de onda de 326 nm.
Após a biotransformação, foi realizado um repique dos microorganismos em
placas de petri contendo apenas o meio NA, para verificar a sua resistência aos diferentes
meios referenciados acima. Os resultados foram acompanhados por cromatografia em placa e
reveladas em câmara de iodo e/ou ultravioleta.
84
3.5.9 Biotransformação em Sistema Bifásico com DBT
Foi pesado 11 mM de DBT, 0,075 g de sacarose e 0,075 g de extrato de
carne e solubilizado num volume de 21 mL de tampão pH 7,0 e 4 mL de heptano (15%). Todo
o meio foi autoclavado, inclusive o DBT e o heptano. Após o resfriamento do frasco, foram
adicionados os microorganismos e em seguida colocado na incubadora com 150 rpm de
agitação por 216 horas (uma semana).
A mesma reação foi realizada utilizando uma porcentagem menor de
solvente orgânico, apenas 10% de heptano (volume reacional). O frasco foi colocado na
incubadora sob as mesmas condições reacionais relatadas acima. Os resultados foram
acompanhados por cromatografia em placa (revelada em câmara de iodo e/ou ultravioleta) e
uma solução padrão (branco).
Estas duas reações foram repetidas, onde após a autoclavagem é que foram
adicionados os microorganismos e o DBT já solubilizado em heptano.
3.5.10 Biotransformação em Sistema Bifásico com Tiofeno
Foi pesado 22 mM de Tiofeno e dissolvido em 10% de n-heptano (volume
reacional), 0,20 g de sacarose e 0,20 g de extrato de levedura e solubilizado num volume de
21 mL de tampão pH 7,0. Todo o meio foi autoclavado, inclusive o DBT e o heptano. Após o
resfriamento do frasco, foram adicionados os microorganismos e em seguida colocado na
incubadora com 150 rpm de agitação por 96 horas. A biotransformação foi acompanha com
uma reação padrão (branco), e seu resultado foi acompanhado por cromatografia em placa e
revelada em câmara de iodo e/ou ultravioleta.
85
3.5.11 Biotransformação em Meio Imobilizado em Crisotila
Neste teste foi realizado o fortalecimento do microorganismo. Foi pesado 1
g de crisotila (previamente tamponada em pH 7,0), 11 mM de DBT e diluído em 5% de etanol
(volume reacional), meio NA sem peptona e 50 mL de tampão fosfato pH 7,0. O
microorganismo usado foi o Brevebacterium citreum. O meio reacional foi colocado em uma
incubadora com 150 rpm e a 37 oC.
A cada 48 horas a crisotila contida no meio de crescimento era filtrada em
uma peneira de 250 mesh e a solução era dispensada. A crisotila era transferida para um novo
meio NA sem peptona, onde era acrescentado mais 11 mM de DBT. Esta reação durou 456
horas (quinze dias). O crescimento do microorganismo foi acompanhado por um
espectrofotômetro UV-visível em 600 nm.
Todos os produtos das biotransformações foram acompanhados por placas
de cromatografia e reveladas em câmaras de iodo e/ou ultravioleta.
3.5.12 Extração
A extração da parte orgânica do meio aquoso foi realizada utilizando-se um
funil de separação. Fez-se quatro extrações com 20 mL de éter etílico em cada uma. Após a
extração, foi adicionado sulfato de magnésio anidro (MgSO4) no material extraído, onde foi
retirado qualquer excesso de água. Realizou-se, então, uma filtração simples para a remoção
do MgSO4. Foram feitas algumas lavagens com éter etílico para retirar qualquer resto de
produto que tenha ficado retido no MgSO4. Depois, este produto foi levemente concentrado
no evaporador rotatório, apenas para diminuir o volume de éter etílico.
86
3.6 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS
A Tabela 12 mostra a descrição das condições para as análises
cromatográficas.
TABELA 12 – Descrição do cromatógrafo a gás acoplamento ao detector de massa.
Equipamento Cromatógrafo a Gás (CG)
Detector de Massa (EM)
Modelo CG – Varian CP 3800
EM – Varian Saturn 2000
Coluna CP-Sil 18 CB Law Bleed
Temperatura Injetor 250 oC
Temperatura Detector Transfer line 240 oC
Rampa de Aquecimento 150 oC (2 minutos) - 250 oC @ 8 oC/minuto (15,5
minutos)
Gás de Arraste He (fluxo 1 mL/minuto)
87
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste trabalho foram utilizadas enzimas e microorganismos para a
preparação de ésteres e na biodessulfurização de compostos orgânicos. Para uma melhor
descrição dos resultados obtidos o trabalho será dividido em duas partes, a saber:
- Imobilização de lipases em crisotila e aplicação na preparação de ésteres.
- Imobilização de enzimas e microorganismos em crisotila e aplicação na
remoção de enxofre de compostos heterocíclicos.
4.1 IMOBILIZAÇÃO DE LIPASES EM CRISOTILA E APLICAÇÃO NA PREPARAÇÃO
DE ÉSTERES
Inicialmente foi acompanhado o processo de imobilização das diferentes
lipases em crisotila verificando o comportamento da adsorção destas enzimas no suporte na
temperatura de 25 oC. A Figura 20 mostra um modelo da superfície da crisotila, onde
possivelmente ocorre a imobilização da enzima na crisotila.
88
Fonte: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-40422003000500014.
Figura 20 – Modelo estrutural da superfície da crisotila.
A adsorção foi acompanhada pela diminuição do valor de absorbância das
lipases em estudo durante 24 horas. A Figura 21 mostra o comportamento da curva para a
lipase de Mucor javanicus. Sendo que o valor obtido para a adsorção desta lipase em crisotila
foi de 70%. Este valor foi determinado pela curva de calibração já preparado inicialmente
(Figura 22).
89
Figura 21 – Acompanhamento da adsorção da lipase de Mucor javanicus a 25 oC (265 nm),
100 mL de solução tampão fosfato pH 7,2, 200 mg de enzima (C = 2 mg/mL),
em crisotila.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Abs
C (g/L)
Figura 22 – Curva de calibração da lipase de Mucor javanicus, 25 oC, 265 nm em solução
aquosa (y = a + b . x, a = 0,01554, b = 0,85284 e r = 0,99947).
0 50 100 150 200 250
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Abs (nm
)
Tempo (min)
90
As demais cinéticas e curvas de calibração obtidas apresentaram resultados
similares a da lipase de Mucor javanicus, com exceção da lípase de Aspergillu niger cuja
quantidade adsorvida foi de 30% apenas.
Uma vez verificado que as lipases de Mucor javanicus, Rhizopus oryzae,
Candida rugosa, Aspergillus niger e Pseudomonas cepacia ficaram adsorvidas na crisotila,
utilizou-se o suporte para catalisar as reações de esterificação dos ácidos hexanóico, octanóico
e láurico com os álcoois pentan-1-ol, butan-1-ol, octan-1-ol, metanol e etanol (Figura 23).
Figura 23 – Reação de esterificação catalisada por diferentes lipases imobilizadas em
crisotila.
A Tabela 13 mostra os resultados obtidos na esterificação dos diferentes
ácidos e álcoois catalisados pela lípase de Mucor javanicus imobilizada em crisotila.
91
TABELA 13 – Ésteres obtidos da esterificação catalizada pela lipase de Mucor Javanicus
imobilizada em crisotila a 25 oC.
ÁCIDOS ÉSTERES RENDIMENTO (%)(b)
Hexanoato de metila 49
Hexanoato de etila 41
Hexanoato de n-butila 64 Hexanóico
Hexanoato de n-pentila 66
Octanoato de metila 64
Octanoato de etila 69
Octanoato de n-butila 76
Octanoato de n-pentila 77
Octanóico
Octanoato de n-octila 78
Laurato de metila 62
Laurato de etila 65
Laurato de n-butila 97
Laurato de n-pentila 82
Láurico
Laurato de n-octila 84
(a) Condições de reação: tempo 2 dias, 25 oC, 25 mL de hexano e concentração dos substratos 0,01 mol (1:1) , solvente
hexano (sob agitação). (b) Rendimento dos ésteres isolados por cromatografia usando como eluente uma mistura de hexano :
acetato de etila (15:1).
Pode-se observar no Tabela 13 que os resultados de rendimento obtidos
para os ésteres foram bons, de 41% a 97% com uma primeira avaliação da metodologia
empregada. Considerando a cadeia dos ácidos, os melhores resultados foram obtidos com o
ácido láurico, com rendimentos de 62 % a 97 %. Quando passamos a avaliar a cadeia do
álcool para os lauratos obtidos, observamos que após quatro carbonos, ocorre uma pequena
diminuição no rendimento. A Figura 24 mostra este comportamento.
92
Figura 24 – Diminuição do rendimento dos lauratos.
Para os demais ésteres obtidos (octanoatos e hexanoatos) um aumento na
cadeia do álcool aumenta linearmente o rendimento. Se pensarmos em termos da formação do
complexo acil-enzima, observamos que pelos resultados obtidos, ácidos de cadeia carbônica
com mais de oito carbonos são melhores substratos para as lipases. Jesus e colaboradores em
1997, já demonstraram este perfil de escolha das lipases quando utilizaram diferentes lipases
imobilizadas em organo-gel em reações de esterificação.
Considerando que o melhor rendimento foi com o butanol-1, o mesmo foi
utilizado na reação de esterificação com diferentes ácidos e lípase. Na Tabela 14, estão os
resultados da esterificação do álcool alifático butanol-1 com diferentes ácidos catalisada pelas
lipases de Rhizopus oryzae, Aspergillus niger, Candida rugosa e Pseudomonas cepacia
imobilizadas na crisotila.
RENDIMENTO dos LAURATOS
0
20
40
60
80
100
120
C1 C2 C4 C5 C8
Tamanho da Cadeia Carbônica do Álcool
Ren
dim
ento
(%)
93
TABELA 14 – Ésteres obtidos pela reação de esterificação do álcool butanol-1 com ácidos
alifáticos catalisada pelas diferentes lipases imobilizadas em crisotila a
25oC.(a)
Lipase Ácido Éster Rendimento (%) Rf (b)
Hexanóico Hexanoato de n-Butila 76,00 0,52
Octanóico Octanoato de n-Butila 98,00 0,73
Rhizopus oryzae Láurico Laurato de n-Butila 56,00 0,75
Hexanócio Hexanoato de n-Butila Traços 0,50
Octanóico Octanoato de n-Butila Traços 0,57
Aspergillus
niger Láurico Laurato de n-Butila Traços 0,50
Hexanóico Hexanoato de n-Butila 53,00 0,63
Octanóico Octanoato de n-Butila 70,00 0,65
Candida
rugosa Láurico Laurato de n-Butila 68,00 0,55
Hexanóico Hexanoato de n-Butila 71,00 0,62
Octanóico Octanoato de n-Butila 58,00 0,67 Pseudomonas
cepacia Láurico Laurato de n-Butila 85,00 0,52
(a) Condições de reação: tempo 2 dias, 25 oC, 25 mL de hexano e concentração dos substratos 0,01 mol (1:1) (sob agitação).
(b) Rf = índice de retenção do éster avaliado em ccd usando como eluente uma mistura de hexano / acetato de etila (15:1).
Os resultados da Tabela 14 demonstram que a lipase de Aspergillus niger
não catalisou as reações de esterificação nas condições estudadas (25 oC e 0,01 mol de
substrato 1:1) e as lipases de Candida rugosa, Rhizopus oryzae, Pseudomonas cepacia e
Mucor javanicus demonstraram ser melhor catalisadores para a formação de ésteres quando
imobilizadas em crisotila. A baixa performance catalítica da lipase de Aspergillus niger pode
ser atribuída a pequena quantidade de lipase adsorvida em crisotila (60 mg) e ainda sua baixa
atividade catalítica.
94
Para as reações catalisadas pelas lipases de Rhizopus oryzaes, Pseudomonas
cepacia e Candida rugosa a variação do rendimento não segue uma ordem crescente, de
acordo com o aumento da cadeia hidrocarbônica do ácido.
Analisando a Tabela 14, os ésteres obtidos pela reação do ácido láurico com
o álcool butanol-1 (laurato de n-butila) catalisada por diferentes lipases, demonstrou ser um
bom substrato, pois reagiu com todas as lipases apresentando bons rendimentos (Rhizopus
oryzae 56,00%, Candida rugosa 68,00%, Pseudomonas cepacia 85,00% e Mucor javanicus
97,00%), conforme demonstrado na Figura 25. Foi realizada também a reação utilizando
crisotila com enzima adsorvida e nenhum produto formado foi observado.
Figura 25 - Porcentagem de rendimento dos lauratos de n-butila com diferentes lipases.
1 2 3 40
20
40
60
80
100 Mucor javanicus
Pseudomonas cepacia
Candida rugosa
Rhizopus oryzae
Rendim
ento
(%
)
Lipases
95
4.1.1 Avaliação da Reutilização do Suporte Contendo Lipase Imobilizada e o Efeito do
Solvente na Biocatálise
Um importante parâmetro para ser avaliado que se utiliza uma preparação
enzimática de uma enzima imobilizada em um suporte, está na verificação da preservação da
atividade catalítica do biocatalisador e a retenção desta atividade por um período prolongado
de tempo.
Para este estudo foi realizada a reação de esterificação do pentanol-1 com o
ácido láurico, para testar a reutilização do suporte com a lipase de Mucor javanicus
imobilizada, e os resultados podem ser observados na Tabela 15.
TABELA 15 – Reutilização da crisotila contendo a lipase de Mucor javanicus imobilizada e
aplicada na obtenção do laurato de n-pentila a 25oC.(a)
ÁLCOOL ÉSTER UTILIZAÇÃO RENDIMENTO (%) RF (b)
1 82,00 0,88
2 80,00 0,88
3 25,00 0,60
Pentan-1-ol
Laurato de n-
Pentila
4 24,00 0,60
(a) Condições de reação: tempo 2 dias, 25 oC, 25 mL de hexano e concentração dos substratos 0,01 mol (1:1) (sob agitação).
(b) Rf = índice de retenção do éster avaliado em ccd usando como eluente uma mistura de hexano / acetato de etila (15:1).
Os resultados da Tabela 15 demonstram que após a segunda utilização do
suporte (crisotila + lipase de Mucor javanicus + pentan-1-ol + ácido láurico), ocorreu uma
diminuição no rendimento do laurato de n-pentila. Pela pouca utilização do biocatalisador
imobilizado foi investigado se estava ocorrendo dessorção ou lixiviação e nenhum dos dois
96
processos foi observado. Provavelmente após a catálise pode estar ocorrendo modificação na
estrutura da lipase imobilizada causando uma inativação parcial.
Para comparar o efeito da imobilização das lipases para a reação de
esterificação do ácido láurico e butan-1-ol, foi repetido nas mesmas condições experimentais,
48 horas e 25 oC, usando as lipases livres em hexano e nenhum produto foi observado.
Ahmad e colaboradores (1998) têm demonstrado que solventes orgânicos
podem afetar a reação pela interação direta com a enzima. Enzimas necessitam de uma
pequena quantidade de água para manter seu estado conformacional tridimensional ativo.
O desempenho catalítico da lipase de Mucor javanicus para a produção do
laurato de n-pentila em diferentes solventes orgânicos foi observado, utilizando o Log P e sua
polaridade (Log P = coeficiente de partição entre octan-1-ol e água). Na maioria dos casos, a
atividade enzimática é relativamente baixa em solventes hidrofílicos, com log P < 2;
moderado em solventes, com log P entre 2 e 4; e alto em solventes apolares, com log P > 4
(RISCH, 2006). O laurato de n-pentila apresentou um rendimento de 82% em hexano (log P =
3,5), 70% em cicloexano (log P = 3,2), 68% em tolueno (log P = 2,5) e não houve formação
de éster em diclorometano (log P = 0,93), acetona (log P = -0,23) e acetonitrila (log P = -0,33)
como observado.
4.1.2 Caracterização dos Ésteres
Os ésteres obtidos foram caracterizados por métodos espectroscópicos. A
Figura 26 mostra o espectro de IV para o laurato de n-pentila, onde pode-se observar em
1737 cm-1 uma banda característica de carbonila de ésteres alifáticos e saturados. Na região de
1300 – 1000 cm-1, aparecem duas vibrações de deformação axial assimétrica acopladas, que
97
correspondem a C-C(=O)-C e O-C-C, sendo a primeira a mais importante, absorve fortemente
na região 1210 – 1163 cm-1, esta banda é mais larga e mais forte. As vibrações que aparecem
na região de 3000 – 2840 cm-1 representam as vibrações de deformação axial de C-H alifático.
Os demais ésteres obtidos apresentaram espectros similares com carbonila de éster em 1735
cm-1.
O espectro de RMN de 1H para o laurato de n-pentila em CDCl3. Observa-se
um triplete em 4,1 ppm que corresponde aos prótons metilênicos (-CH2OOC) ligados ao
oxigênio do grupo éster. Os demais prótons estão distribuídos conforme a estrutura do éster
colocada na Figura 27.
98
Figura 26 – Espectro de infravermelho do laurato de n-pentila em filme.
99
Figura 27 – Espectro de RMN de 1H do laurato de n-pentila em CDCl3
O
O
*
*
9
(a)
(b)(d) 3(e)(e)
(a) (b) (c)
(e)
100
4.2 APLICAÇÃO DE MICROORGANISMO LIVRE E IMOBILIZADO NA
BIODESSULFURIZAÇÃO DE COMPOSTOS ORGÂNICOS PRESENTES EM
COMBUSTÍVEIS FÓSSEIS
4.2.1 Pureza Microbiológica e Crescimento Celular
Para o início dos experimentos foi necessária a abertura das ampolas que
continham os microorganismos, onde estes seguem toda uma metodologia específica
envolvendo técnicas de assepsia (item 1.3.3), para evitar a contaminação dos
microorganismos, preservando assim a sua pureza desde a sua reativação celular até a sua
manutenção. Para a confirmação da pureza dos microorganismos foram observadas as placas
de crescimento.
Verificada a pureza e a hidratação dos microorganismos nas placas de
crescimento fez-se então curvas de calibração e de crescimento para a determinação da
quantidade de microorganismos crescidos. Estes experimentos foram realizados com os
seguintes microorganismos: Brevibacterium citreum, na qual sua massa seca foi de 8,3 g/L
(Figura 28 e 29); Brevibacterium linens sua massa seca obtida foi de 8,1 g/L e com o
Corynebacterium glutamicum onde a massa seca obtida foi de 5,6 g/L (Figura 30 e 31).
Todas as leituras foram feitas num espectrofotômetro de UV-visível num comprimento de
onda de 660 nm, onde pode-se observar o crescimento dos microorganismos.
101
Figura 28 - Curva de calibração do microorganismo Brevibacterium citreum, 30 oC, 660 nm
em solução aquosa (y = a + b . x, a = 0,05938, b = 0,057069 e r = 0,99433).
Figura 29 – Curva de Crescimento do microorganismo Brevibacterium citreum a 30 oC.
Curva de Calibração do Brevibacterium citreum
0
1
2
3
4
5
6
7
8
1 2 3 4 5 6 7
Concentração (g/L)
Abs
orbâ
ncia
(660
nm
)
Curva de Crescimento do Brevibacterium citreum
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
1 2 3 4 5 6 7
Tempo (horas)
Con
cent
raçã
o (g
/L)
102
Figura 30 - Curva de calibração do microorganismo Corynebacterium glutamicum 30 oC, 660
nm em solução aquosa (y = a + b . x, a = 0,03919, b = 1,18867 e r = 0,99956).
FIGURA 31 – Curva de crescimento do microorganismo Corynebacterium glutamicum a 30 oC.
Curva de Calibração do Corynebacterium
glutamicum
0
1
2
3
4
5
6
7
1 2 3 4 5 6
Concentração (g/L)
Abs
orbâ
ncia
(660
nm)
Curva de Crescimento do Corynebacterium
glutamicum
0
0,5
1
1,5
2
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tempo (horas)
Con
entr
ação
(g/L
)
103
4.2.1.1 Pureza Microbiológica Utilizando a Técnica de Massa Seca
Já com os microorganismos Rhodococcus erythropolis (CCT 7429) e a
Rhodococcus erythropolis (CCT 1878), a determinação das curvas de calibração, foram feitas
através de outra técnica, tão precisa quanto a anterior e que proporciona maior rapidez na
obtenção dos resultados - determinação de massa seca - onde não é necessário fazer a curva
de calibração. Portanto, as massas secas obtidas foram de 9,2 g/L para Rhodococcus
erythropolis (CCT 7429) e 8,9 g/L para a Rhodococcus erythropolis (CCT 1878).
4.2.2 Técnicas Utilizadas para a Biotransformação
Para a iniciação dos ensaios de biodegradação foi necessário reconhecer
alguns aspectos:
1 – A determinação de massa seca de cada microorganismo, para termos
conhecimento da quantidade de células adicionadas ao meio reacional de biotransformação.
2 – Solubilidade do precursor: como o DBT apresenta pouca solubilidade
em água foi realizado um teste de solubilidade do mesmo em: acetona, N,N-dimetilsulfóxido
(DMSO), N,N-dimetilformamida (DMF), n-hexano, etanol, cicloexano, heptano e N,N-
dimetilacetamida (DMA). A solubilidade do DBT em acetato de etila foi muito baixa,
apresentando a formação de flocos; quando adicionado ao n-hexano, cicloexano e etanol, sua
solubilidade foi parcial, sendo total, somente após três minutos de aplicação no ultra-som. A
solubilidade foi ótima quando testada em acetona, DMSO, DMA, DMF e n-heptano,
confirmando assim a solubilidade de 500 ppm do DBT em todos os solventes. Após a
realização dos testes de solubilidade, foram efetuados experimentos referentes à saturação do
104
DBT (1000 ppm) dissolvido em acetona e etanol (5 mL) e esta solução foi adicionada a 50
mL de água. No caso da acetona, 3,5 mL desta solução foi adicionada a 50 mL de água,
enquanto para o etanol, 1,0 mL deste contendo, o DBT foi adicionado para os 50 mL de água.
Acima destas quantidades, a solução ficou turva, demonstrando que parte do DBT foi
insolúvel.
3 – A viabilidade do solvente em relação à sua toxicidade é resultante da
difusão de moléculas de solvente através da membrana citoplástica (toxicidade molecular), a
outra é associada ao contato entre o biocatalisador e o solvente orgânico (toxicidade de fase).
Nesse caso, a capacidade para solubilização do substrato e do produto tem que ser compatível
coeficiente de partição (Log Po/w ≥ 7) para evitar o máximo possível a formação de emulsões.
A densidade, os pontos de fusão e de ebulição, a tensão superficial, a viscosidade, a
inflamabilidade, a facilidade de obtenção; a eliminação de resíduos e o custo que é o critério
mais importante.
No primeiro ensaio de biotransformação foi utilizado o microorganismo
Brevibacterium citreum em meio NA aquoso, sem a presença de ágar, e como substrato foi
utilizado o DBT, onde o mesmo foi adicionado antes da autoclavagem. Neste caso, foi
observada a formação de um aglomerado com alto grau de dureza, demonstrando assim que o
DBT possui uma solubilidade bastante reduzida em água. Para as reações foram preparados
dois meios: um contendo microorganismos na forma livre e o outro com microorganismos
imobilizados em crisotila como suporte. O tempo de reação foi de 67 horas em uma
incubadora com agitação de 150 rpm a uma temperatura de 30 oC. O acompanhamento de
ambas as reações foram feitas por cromatografia de placa utilizando como eluente hexano e
acetato de etila (50:50). Houve formação de produto conforme demonstrado na Figura 32.
Entretanto, uma análise dos procedimentos experimentais demonstrou que estes produtos não
foram formados pela ação do microorganismo, e sim por uma catálise química, que ocorre na
105
presença de metais, altas temperaturas e pressões. Logo após este resultado, foi realizado um
experimento onde o DBT era adicionado após a autoclavagem, e não durante a mesma. Neste
caso, não foi detectada a formação de produto pelo método de biotransformação. Ainda
referente a estes experimentos, os resultados demonstraram que o método de imobilização
com crisotila é viável, uma vez que se notou um bom crescimento e completa imobilização
neste suporte. Cabe lembrar que todos os experimentos relatados foram realizados em
duplicata.
Dando continuidade aos experimentos, foram preparados dois meios
reacionais em sistema monofásico, onde cada um continha meio NA sem ágar e sem peptona.
Em um caso empregou-se DBT dissolvido em acetona e no outro, DBT dissolvido em etanol,
sendo este adicionado ao meio após a autoclavagem. Nestes ensaios foram utilizados
microorganismos na forma livre, tempo reacional de 96 horas e incubada a 30 oC com
agitação de 150 rpm. Através da cromatografia de placa pôde-se observar que não houve
formação de produto. Como não houve catálise, testou-se também a solubilidade do DBT
(1000 ppm) em DMSO e DMF (5 mL) num volume total de 50 mL completado com água.
Para ambas as soluções de DBT em DMSO e DMA foram utilizados no máximo 3,0 mL para
50 mL de água. Após esta quantidade, a solução ficou turva. Desta forma, foram preparados
dois meios reacionais contendo NA, sem ágar e peptona, e com DBT dissolvido em DMSO e
em DMA, que foram adicionados ao meio após autoclavagem. Novamente foram empregados
microorganismos na forma livre. Através da cromatografia de placa pôde-se observar que não
houve formação de produtos.
Como em nenhuma das tentativas empregando-se meios aquosos, ou
sistemas monofásicos contendo um solvente capaz de solubilizar o DBT, observaram-se
reações de degradação do composto contendo enxofre, decidiu-se por avaliar a toxidade do
solvente orgânico sobre os microorganismos. Fez-se então um repique dos microorganismos
106
após as reações citadas. Após um tempo de incubação foi possível visualizar que os
microorganismos haviam sobrevivido ao meio, mas sua reprodução foi inibida pelo uso destes
solventes.
Também foram realizados testes em sistema bifásico, utilizando o heptano
(15 %) com DBT (50 ppm) dissolvido num volume reacional de 25 mL, meio NA sem ágar e
sem peptona, tempo reacional de 144 horas e incubada a 30 oC com agitação de 150 rpm.
Uma vez mais, não houve formação de produtos.
A fim de verificar se o meio reacional utilizado não estava de acordo com as
condições necessárias para a efetiva ação do microorganismo sobre o DBT, buscou-se na
literatura mais informações sobre os meios reacionais. Com base nos dados obtidos, foram
preparadas 10 placas de crescimento do microorganismo (em duplicata), cada qual com uma
composição diferente, já descrita no item 3.5.4. A placa de número 10 foi a que apresentou o
melhor resultado. A partir deste resultado adotou-se este meio como o melhor meio para o
crescimento do Brevibacterium citreum. Como o meio de crescimento em placa foi otimizado,
tentou-se também melhorar o inóculo e o meio de crescimento em solução aquosa. Assim,
adotou-se a composição da placa 10, retirando-se o ágar, sendo que o tempo de reação
permaneceu em 24 horas para o inóculo e 48 horas para o meio de crescimento em solução,
pode-se observar que houve um aumento na quantidade de microorganismo nesta nova
situação.
A partir dos resultados obtidos com o teste de solubilidade do DBT com
acetona, DMSO, DMA e n-heptano foram ótimos solventes. Fez-se, então, um meio de
biotransformação com os mesmos, conforme descrito no item 3.5.1. O acompanhamento da
reação foi por cromatografia de placa, onde não se obteve nenhum sinal de produto formado.
Como a quantidade de solvente foi muito alta, após a reação, fez-se o repique dos
microorganismos em placas de crescimento para verificar se haviam sobrevivido ao meio.
107
Como resposta ao experimento, eles cresceram bem, significando que, apesar do meio estar
saturado pelo solvente eles não fizeram a biotransformação, mas sobreviveram.
Figura 32 – Cromatograma do produto da reação de hidrodessulfurização (HDS).
108
4.2.3 Biotransformação em Sistema Aquoso e Bifásico
Após a análise dos resultados obtidos anteriormente, partiu-se para um meio
de biotransformação em sistema bifásico, conforme item 3.5.9. Em outro frasco foi preparado
o mesmo meio reacional, utilizando somente meio aquoso monofásico (aquoso). As reações
foram acompanhadas por cromatografia em camada delgada, onde, o resultado da reação em
sistema bifásico apresentou uma pequena mancha, podendo ser interpretada como produto. Já
a reação em sistema aquoso, não apresentou nenhuma mancha de produto. Tendo estes
resultados, as amostras foram analisadas pela técnica de cromatografia gasosa (CG), havendo
a confirmação do produto formado conforme demonstrado na Figura 33.
Apesar de a reação em meio aquoso ter fornecido um resultado nada
apreciável, foi mantido seu meio reacional e a cada 24 horas eram acrescentados
microorganismos novos, tentando assim fortalecer seu meio com quantidades maiores de
microorganismo. A reação foi acompanhada por cromatografia em placa e após 168 horas de
reação foi feita a extração da reação e posteriormente enviada para análise de CG, onde o
resultado comprovado pelo cromatograma foi negativo, Figura 34.
109
Figura 33 – Cromatograma do produto da reação de biotransformação em sistema
bifásico.
Figura 34 – Cromatograma do produto da reação de biotransformação em sistema aquoso.
110
4.2.4 Biotransformação Utilizando um Novo Microorganismo em Sistema Aquoso
Como a literatura faz referência a outros microorganismos, realizamos testes
utilizando o microorganismo Corynebacterium glutamicum. Após a abertura da ampola e
reativação deste microorganismo, foram preparados vários meios de crescimento, onde, de
acordo com CHANG (2001), foi realizado o crescimento do microorganismo em meios
contendo fontes de enxofre, a fim de desenvolver nos microorganismos, enzimas com
capacidade de utilizar compostos de enxofre como fonte de energia (DMSO). Dos 12 ensaios
realizados, constatou-se através das curvas de crescimento que os meios 2, 3 e 5, foram os
melhores, já relatados no item 3.4.8. Assim sendo, fez-se modificações desde o preparo do
inóculo até o meio de biotransformação. As condições de reação para os meios de
biotransformação modificado foi o mesmo para todos os frascos 30 oC, 150 rpm e 96 horas
em uma incubadora. O tempo de reação foi acompanhado por cromatografia em placa e
reveladas em câmara de iodo e/ou ultravioleta, onde houve a confirmação da não formação de
produto.
Como os resultados não eram nada apreciáveis, então abrimos uma outra
ampola, onde realizamos novos testes com estes dois outros microorganismos
Corynebacterium glutamicum e Breibacterium linens. Seguindo a literatura, ao meio de
biotransformação foi adicionada aeração forçada (bomba de aquário) e os experimentos foram
realizados utilizando como precursores o DBT e o tiofeno em meio livre e bifásico, utilizando
como solvente o n-heptano. No preparo dos inóculos e dos meios de crescimento, foi mantida
a receita enviada pela Fundação André Tosello de Campinas-São Paulo, onde foi acrescentado
ainda o MMS. As condições de incubação foram mantidas, sendo 24 horas para o inóculo e 48
horas para o meio de crescimento com aeração forçada, 30 oC. A biotransformação dos
111
mesmos está descrita no item 3.4.5. O processo foi acompanhado por cromatografia em placa,
onde não apresentou resultado positivo.
4.2.5 Biotransformação Utilizando Novos Microorganismos em Sistema Aquoso e Bifásico
Com os quatro microorganismos selecionados, Corynebacterium
glutamicum, Breibacterium linens, Rhodococcus erythropolis (CCT 7429) e Rhodococcus
erythropolis (CCT 1878), foram realizados os seguintes experimentos: preparo dos inóculos
(24 horas) e preparo dos meios de crescimento (48 horas). Todas as biotransformações foram
realizadas apenas em sistema aquoso tendo sido adotado o seguinte procedimento para cada
microorganismo [Brevibacterium linens, Corynebacterium e Rhodococcus erythropolis (CCT
7429)]. Estes três microorganismos possuem o mesmo meio NA de crescimento. O
microorganismo Rhodococcus erythropolis (CCT 1878) foi o único testado que possuiu o
meio de crescimento GYM. Em todas estas reações de biotransformação foram realizadas em
sistema aquoso contendo 11 mM de DBT como substrato, onde seus resultados são
acompanhados por cromatografia em placa, do qual não foi obtido qualquer resultado
positivo, inclusive quando comparados com a sua reação padrão.
Após todos estes experimentos e, de acordo com a literatura consultada,
realizamos testes em sistema bifásico utilizando como solvente o n-heptano e os
microorganismos empregados foram Rhodococcus erythropolis (CCT 7429) e Rhodococcus
erythropolis (CCT 1878), onde os precursores foram o DBT e o tiofeno. O preparo do inóculo
continha meio NA para o Rhodococcus 7429 e meio GYM para o Rhodococcus 1878, num
volume reacional de 50 mL com 24 horas de agitação a 150 rpm e 30 oC. Para o preparo do
meio de crescimento, foram utilizados os mesmos ingredientes que no preparo do inóculo,
112
mais 25 mL de inóculo. O tempo de crescimento foi de 48 horas em agitação a 150 rpm e 30
oC. Após o crescimento as soluções foram centrifugadas e os microorganismos transferidos
para o meio de biotransformação. Meio reacional NA: 0,15g de glicose, 0,15g de extrato de
carne, 11 mM de DBT e volume reacional completado para 50 mL de tampão pH 7,0. O meio
reacional foi autoclavado contendo o DBT e após o seu resfriamento foi adicionado 5,0 mL de
n-heptano, e em outro frasco, o DBT que já estava solubilizado em 5,0 mL de n-heptano, foi
adicionado ao meio reacional somente após a autoclavagem e resfriamento do mesmo. Meio
reacional GYM: 0,20g de glicose, 0,20g de extrato de levedura, 11 mM de DBT e um volume
reacional de 50 mL de tampão pH 7,2. O meio reacional foi autoclavado contendo o DBT e
após o seu resfriamento foi adicionado 5,0 mL de n-heptano, e em outro frasco, o DBT que já
estava solubilizado em 5,0 mL de n-heptano, foi adicionado ao meio reacional somente após a
autoclavagem e resfriamento do mesmo. Todos estes experimentos foram repetidos
igualmente, trocando o precursor 11 mM de DBT por 22 mM de tiofeno. Todas as reações de
biotransformação foram acompanhadas por cromatografia em placa e comparadas à sua
reação padrão. Partindo destas análises, foi selecionada uma amostra, que apresentou mancha
na placa cromatográfica, fornecendo assim o indício de um subproduto. Logo após, esta
amostra foi enviada para uma análise mais precisa de CG com acoplador de massa, onde o
resultado confirmou a presença do subproduto, que é um derivado do DBT – biphenila – que
consta na Figura 35. Portanto se compararmos o cromatograma da Figuras 33 com o
cromatograma da Figura 35, pode-se observar que já haviam indícios da obtenção de um
subproduto derivado do DBT pelo processo de biodegração, mas que não foram identificados
os picos de massa do mesmo.
113
Figura 35 – Cromatograma do produto da reação de biotransformação utiizando novos
microorganismos.
114
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A partir dos resultados obtidos podem-se chegar ás seguintes considerações:
5.1 BIOTRANSFORMAÇÕES UTILIZANDO ENZIMAS
► Lipases podem ser imobilizadas em crisotila e manter suas propriedades catalíticas.
► As enzimas imobilizadas em crisotila se mostraram estáveis em solvente orgânico, não
observando dessorção neste meio.
► O melhor rendimento que se obteve até agora foi com o laurato de n-butila (97,00 %)
com a lipase de Mucor javanicus imobilizada em crisotila.
► A lipase Aspergillus niger não apresentou reação nas condições de temperatura e
concentração molar (0,01 mol) estudadas.
► O sistema pode ser reutilizado apenas uma vez, sendo que após a segunda utilização
do suporte os rendimentos são inferiores a 30 %.
► O método utilizado é uma alternativa viável para a produção de ésteres, sendo um
método simples e prático.
115
5.2 BIOTRANSFORMAÇÕES UTILIZANDO MICROORGANISMOS
► A partir dos experimentos realizados, deve-se levar em consideração todo um
aprendizado, desde as técnicas de assepsia, abertura da ampola de microorganismos,
preparação dos meios – rehidratação, inóculo, meio de crescimento, meio de cultura, meio de
biotransformação – o seu comportamento – curvas de crescimento – e também, o seu meio de
sobrevivência.
► O microorganismo Brevibacterium citreum pode ser imobilizado em crisotila, pois
apresentaram um crescimento de 8,3 g/L e completa imobilização neste suporte conforme foi
quantificado (observado pela ausência de turbidez do meio).
► Em meio livre, os microorganismos: Corynebacterium glutamicum com massa seca de
5,6 g/L; Rhodococcus erythropolis (CCT 7429) com massa seca de 9,2 g/L e o Rhodococcus
erythropolis (CCT 1878) com massa seca de 8,9 g/L, cresceram aproximadamente o dobro,
utilizando o meio de crescimento com aeração forçada.
► Dentre os testes de solubilidade, os substratos e os produtos demonstraram ser
compatíveis com o solvente (n-heptano), que por sua vez tem coeficiente de partição Log de
Po/w ≥ 7.
116
► Houve formação de um subproduto, proveniente da oxidação do dibenzotiofeno, mas a
catálise ocorreu durante a autoclavagem do meio reacional (HDS). Ou seja, houve catálise
química, e não biológica conforme desejado.
► A otimização das condições de reprodução e crescimento dos microorganismos
demonstrou que estes são vulneráveis a solventes orgânicos, sendo que alguns, mas, poucos
microorganismos sobrevivem a um meio saturado.
► Em sistema aquoso, os microorganismos Brevibacterium citreum, Brevibacterium
linens, Corynebacterium glutamicum e Rhodococcus erythropolis (CCT 7429), apesar de
terem sido testados de várias maneiras e passado por vários processos de otimização, não
apresentaram qualquer resultado positivo.
► Em sistema bifásico, os microorganismos Brevibacterium citreum, Brevibacterium
linens, Corynebacterium glutamicum e Rhodococcus erythropolis (CCT 7429), apesar de
terem sido testados de várias maneiras e passado por vários processos de otimização, não
apresentaram qualquer resultado positivo.
► O microorganismo Rhodococcus erythropolis (CCT 1878) apresentou resultado
positivo, que foi a formação de um subproduto, proveniente da oxidação do dibenzotiofeno
via catálise biológica. O produto obtido desta oxidação foi o biphenila.
117
► A metodologia utilizada é uma alternativa viável para a degradação do dibenzotiofeno,
sendo que, para o tiofeno, não foi obtido qualquer resultado satisfatório.
118
6 PERSPECTIVAS
São as seguintes as perspectivas para a continuação deste trabalho:
► Testar outros microorganismos no processo de biodessulfurização do DBT e do
tiofeno;
► Testar o emprego de microorganismos na forma imobilizada como método de
degradação contínua de derivados de petróleo;
► Investigar sistemas bifásicos contendo solventes orgânicos como meios de
biodessulfurização.
► Testar substratos de cadeia aberta contendo enxofre.
119
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