ESTUDO DA NEFROTOXICIDADE DE VENENOS DE SERPENTES

BOTRÓPICAS DO NORDESTE DO BRASIL

Gdayllon Cavalcante Meneses

Universidade Federal do CearáDepartamento de Análises clínicas-

FFOELaboratório de Cultivo Celular

INTRODUÇÃO

O Brasil é um país com características climáticas e geográficas muito variadas, possuindo assim uma ampla diversidade biológica.

Pesquisas com toxinas de origem animal

apresentam-se como potencial fonte de futuros agentes terapêuticos e têm contribuído muito na compreensão de mecanismos fisiopatológicos de doenças (Mortari et al.2007).

SERPENTES DA FAUNA BRASILEIRA

Espécies Peçonhentas

Elapidae

Micrurus

Viperidae

Bothrops

Bothrops erythromela

s

Bothrops insularis

Crotalus Lachesis

COMPOSIÇÃO DOS VENENOS DE SERPENTES

VENENO

Componentes Protéicos

Propriedades enzimáticas

Não enzimáticas

Componentes Não

Protéicos

Orgânicos Não orgânicos

FOSFOLIPASES A2

CLASSIFICAÇÃO:

PLA2

Intracelulares ou citosólicas

Independentes de Ca+2

Extracelulares ou secretórias

Tipo I Tipo II

(Asp-49 PLA2s) (Lys-49 PLA2s) (Ser-49 PLA2s)

Tipo III

(Ownby, 1999; Lomonte, 2003).

ENVENENAMENTOS POR SERPENTES BOTRÓPICAS

As características importantes são sério dano muscular, hemorragia e coagulopatia;

A insuficiência renal, insuficiência respiratória e choque podem ocorrer nos casos mais graves (Bjarnason; Fox, 1994; Kamiguti et al., 1996; Gutiérrez, 2002; White, 2005);

A etiopatogenia da lesão renal tem sido atribuída à nefrotoxicidade direta da peçonha, miólise, hemólise, hipotensão, coagulação capilar glomerular, ação tóxica vascular e até mesmo reações de hipersensibilidade à toxina ou ao soro antiofídico (Pinho et al., 2000).

JUSTIFICATIVA

Os acidentes ofídicos representam um sério problema de saúde pública nos países tropicais, pela frequência com que ocorrem e pela morbimortalidade que ocasionam (Pinho et al., 2000);

O gênero Bothrops possui ampla distribuição e corresponde ao grupo de serpentes peçonhentas mais importantes em número de espécies e densidade populacional (Queiroz et al.,

2008);

A importância fisiológica do rim e a patogênese da IRA;

JUSTIFICATIVA

Quanto a linhagem de células MDCK e mesangiais;

A resposta a injúrias de células tubulares renais; Qual a importância do estudo do mecanismo

apoptótico?

OBJETIVO GERAL

Avaliar os efeitos dos venenos das serpentes B. erythromelas, Bothrops insularis e suas frações fosfolipase A2 sobre linhagens de células renais, podendo contribuir para a descoberta de ferramentas farmacológicas e/ou elucidar os mecanismos de nefrotoxicidade.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Estudar o efeito dos venenos e frações das serpentes Bothrops erythromelas, Bothrops insularis e suas frações fosfolipase A2 em células mesangiais e tubulares renais;

Determinar o efeito dos venenos e frações sobre a viabilidade e proliferação das linhagens celulares em estudo;

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar o potencial apoptótico do veneno e suas frações;

Investigar a expressão das proteínas pró-apoptóticas (FAS, Bax e caspase 3) e anti-apoptóticas (BclxL) em células renais;

Investigar os possíveis mediadores

envolvidos no efeito renal.

METODOLOGIA

CULTIVO CELULAR (MDCK):

Meio de cultura RPMI 1640 + 10% de SBF;

100 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina;

Serão mantidas a uma temperatura de 37 ºC em estufa contendo 5% de CO2 .

METODOLOGIA

CULTIVO CELULAR (Mesangiais):

Meio de cultura RPMI 1640 + 20% de SBF + 2% de glicose;

100 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina;

Serão mantidas a uma temperatura de 37 ºC em estufa contendo 5% de CO2 .

METODOLOGIA

Armazenar em meio sem SBF por 24h para a obtenção de células na fase G0 do ciclo celular;

Retirar as células das garrafas utilizando tripsina-EDTA;

As células serão então quantificadas em câmara de Neubauer e subcultivadas (1-2x105céls/ml) permitindo o crescimento confluente por 24h.

METODOLOGIA

Ensaios de Viabilidade e Proliferação Celulares

MTT;

Lactato Desidrogenase;

MTT

Leitura em espectrofotômetro

LACTATO DESIDROGENASE

Avaliar a integridade de membrana no processo de morte celular;

Análise da liberação da enzima LDH, através da sua atividade enzimática.

AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR POR APOPTOSE

1) Detecção da Externalização de Fosfatidilserina;

2) Determinação do potencial transmembrânico mitocondrial;

3) Isolamento de RNA total;

4) Reação de Transcriptase reversa;

5) Reação em cadeia de polimerase (PCR);

6) Eletroforese em gel de agarose.

DETECÇÃO DA EXTERNALIZAÇÃO DE FOSFATIDILSERINA

Novas descobertas do processo apoptótico estão surgindo com a descoberta de novos parâmetros, Um deles é a dosagem de fosfatidilserina (PS);

Mudanças na estrutura da membrana plasmática como forma de sinalização;

A Anexina V é uma proteína de ligação para fosfolipídeos que pertence a família das Anexinas. Na presença de íons de cálcio ela exibe alta afinidade para a ligação seletiva a fosfatidilserina.

DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO MITOCONDRIAL

Rodamina é um nome genérico para uma família de compostos orgânicos, corantes chamados fluoronas;

A rodamina-123 (Rh-123) é um fluorocromo específico para a marcação mitocondrial em células vivas;

Alterações ao nível da integridade mitocondrial podem ser detectadas através do aumento da fluorescência verde citosólica, indiciando uma difusão da Rh-123 da mitocôndria para o citosol (Johnson et al., 1980).

ISOLAMENTO DE RNA TOTAL

Serão isolados utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) seguindo o protocolo descrito pelo fabricante:

SEPARAÇÃO PRECIPITAÇÃO ANÁLISE EM ESPECTROFOTÔMETRO

REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE

Extração do RNA Total feita para a formação do cDNA na reação de Transcriptase Reversa;

É feita então a ampificação do cDNA;

Analisar a expressão gênica dos diversos mediadores celulares pró-apoptóticos (FAS, Bax e caspase 3) e anti-apoptóticos (BclxL) .

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

DETERMINAÇÃO DE MEDIADORES EM CULTURA DE CÉLULAS RENAIS

Determinação de nitrito;

Determinação de TNF-α;

Qual a importância da determinação desses mediadores?

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Serão realizados três experimentos independentes, em triplicata, para cada ensaio.

As médias obtidas em cada experimento serão comparadas utilizando o teste t ou ANOVA, seguido do teste de Bonferroni, quando apropriado, usando o software Prism GraphPad versão 5.0. Valores de p < 0,05 serão considerados para a análise.

OBRIGADO!