estudo da incorporação e liberação de um extrato de algas

INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES Autarquia associada Universidade de So Paulo

ESTUDO DA INCORPORAO E LIBERAO DE UM EXTRATO DE ALGAS VERMELHAS EM MEMBRANAS DE HIDROGEL

RENATA HAGE AMARAL

Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Mestre em Cincias na rea de Tecnologia Nuclear Materiais Orientador: Dr. Ademar Benvolo Lugo

SO PAULO 2009

Este trabalho dedicado a todas as pessoas que

participaram de sua realizao.

Aos meus pais, David e Wilma, pelo apoio e pacincia.

Aos meus queridos amigos, pela fora e incentivo

que me deram durante este perodo.

Agradecimentos

Ao Dr. Lugo, obrigada pela oportunidade e apoio durante a realizao

deste projeto.

Sizue Ota Rogero, muito obrigada por todo apoio, incentivo e disposio

em me ajudar e ensinar nos momentos em que precisei de seus conhecimentos.

Ao Dr. Jos Roberto Rogero, obrigada pelo importante suporte dado

durante a realizao desta pesquisa.

Dra. urea S. Cruz e Rezolina Pereira dos Santos, do Instituto Adolfo

Lutz, muito obrigada pelo esforo em nos fornecer as micoplacas.

Ao Dr. Patrick Spencer, obrigada pela colaborao e apoio na parte

experimental deste trabalho.

Ao Dr. Jorge Sarkis e Helena Miho Shihomatsu pelo suporte e apoio dado

na parte experimental deste projeto.

Aos meus amigos Souza, Mara, Roberta, Carolina e Sirlene, do Laboratrio

de Biomateriais IPEN, muito obrigada pelo carinho, apoio e comprrenso.

ESTUDO DA INCORPORAO E LIBERAO DE UM EXTRATO DE ALGAS VERMELHAS EM MEMBRANAS DE HIDROGEL

Renata Hage Amaral

RESUMO

Os hidrogis esto dentre as matrizes polimricas mais utilizadas em tecnologia farmacutica em razo de sua vasta aplicao e funcionalidade, especialmente em sistema de liberao de frmacos. Tendo em vista o grande avano nas inovaes dos produtos cosmticos, tanto por meio da introduo de novos princpios ativos quanto pelas matrizes utilizadas para liberao controlada dos mesmos, o objetivo deste trabalho foi incorporar e avaliar a liberao de um princpio ativo natural, o ArctAlg, em membranas de hidrogel, de modo a obter um dispositivo de liberao para fins cosmticos. O ArctAlg um extrato aquoso que possui uma excelente ao anti-oxidante, lipoltica, anti-inflamatria e citoestimulante. Foi realizado o estudo das propriedades mecnicas, fsico-qumicas e a biocompatibilidade in vitro das membranas de hidrogis de poli(vinil-2- pirrolidona) (PVP) e poli(vinil lcool) (PVA) obtidas pela reticulao por radiao ionizante. A caracterizao fsico-qumica das matrizes polimricas foi obtida pelos ensaios de frao gel e intumescimento e o de biocompatibilidade in vitro pelo ensaio de citotoxicidade pelo mtodo de incorporao do vermelho neutro. No ensaio de frao gel tanto o hidrogel de PVP quanto o de PVA apresentaram um alto grau de reticulao. O hidrogel de PVP apresentou uma maior porcentagem de intumescimento em relao ao de PVA e no ensaio de citotoxicidade os hidrogis mostraram-se atxicos. A propriedade citoestimulante do ArctAlg foi verificada no ensaio de citoestimulao com clulas fibroblsticas de pele de coelho, em que foi evidenciado um aumento de cerca de 50% das clulas quando em contato com 0,5% do princpio ativo. As membranas de hidrogel preparadas com 3% de ArctAlg foram submetidas ao ensaio de liberao em incubadora a 37C e as alquotas coletadas durante o ensaio foram quantificadas por cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC). Os resultados obtidos na cintica de liberao mostraram que as membranas de hidrogel de PVP liberaram cerca de 50% do ArctAlg incorporado e as de PVA em cerca de 30%. No ensaio de citoestimulao do ArctAlg liberado, o dispositivo de PVP apresentou um aumento em cerca de 80% da populao celular em relao ao controle do ensaio, mostrando ser o dispositivo mais indicado para ser utilizado em processos de reparao cutnea.

IMMOBILIZATION AND RELEASE STUDY OF A RED ALGA EXTRACT IN HYDROGEL MEMBRANES

Renata Hage Amaral

ABSTRACT

In pharmaceutical technology hydrogel is the most used among the polymeric matrices due to its wide application and functionality, primarily in drug delivery system. In view of the large advance innovations in cosmetic products, both through the introduction of new active agents as the matrices used for its controlled release, the objective of this study was to evaluate the release and immobilization of a natural active agent, the Arct'Alg in hydrogel membranes to obtain a release device for cosmetics. Arct'Alg is an aqueous extract which has excellent anti-oxidant, lipolytic, anti-inflammatory and cytostimulant action. Study on mechanical and physical-chemical properties and biocompatibility in vitro of hydrogel membranes of poly(vinyl-2- pyrrolidone) (PVP) and poly(vinyl alcohol) (PVA) obtained by ionizing radiation crosslinking have been performed. The physical-chemical characterization of polymeric matrices was carried out by gel fraction and swelling tests and biocompatibility by in vitro test of cytotoxicity by using the technique of neutral red incorporation. In the gel fraction test, both the PVP and PVA hydrogel showed a high crosslinking degree. The PVP hydrogel showed a greater percentage of swelling in relation to PVA and the cytotoxicity test of the hydrogels showed non-toxicity effect. The cytostimulation property of Arct'Alg was verified by the cytostimulation test with rabbit skin cells, it was showed an increase at about 50% of the cells when in contact with 0,5% of active agent. The hydrogel membranes prepared with 3% of Arct'Alg were subjected to the release test in an incubator at 37C and aliquots collected during the test were quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The results obtained in the kinetics of release showed that the PVP hydrogel membranes released about 50% of Arct'Alg incorporated and the PVA hydrogel membranes at about 30%. In the cytostimulation test of released Arct'Alg, the PVP device showed an increase at about 80% of cell population in relation of test control, showing to be the greater device to be used in processes of skin repair.

SUMRIO

Pgina 1 INTRODUO 10 2 OBJETIVOS 12 3 REVISO DA LITERATURA 13 3.1 Pele humana 13

3.1.1 Epiderme 14

3.1.2 Derme 16

3.1.3 Vascularizao da pele 17

3.2 Cicatrizao 18

3.3 Polmeros 20

3.3.1 Ao da radiao ionizante sobre a matria e polmeros 20

3.3.2 Reticulao e degradao de polmeros 22

3.3.3 Aplicaes biomdicas dos polmeros 25

3.3.4 Hidrogis 27

3.3.5 Poli(vinil lcool) 29

3.3.6 Poli(N-vinil-2-pirrolidona) 30

3.3.7 gar 32

3.3.8 Poli(etilenoglicol) 32

3.4 Arctalg 33

3.5 Sistema de liberao de frmacos 34

3.6 Citotoxicidade 39

3.7 Citoestimulao de fibroblastos e produo de colgeno 40

4 MATERIAIS E MTODOS 42 4.1 Materiais 42

4.1.1 Matria prima utilizada para sntese das matrizes de hidrogel 42

4.1.2 Princpio ativo 42

4.2 Mtodos 42

4.2.1 Obteno das matrizes de hidrogel 42

4.2.2 Caracterizao da matriz de hidrogel 43

4.2.2.1 Frao Gel 43

4.2.2.2 Intumescimento 44

4.2.2.3 Propriedades mecnicas 45

4.2.2.4 Citotoxicidade 46

4.2.3 Preparo do dispositivo de hidrogel 47

4.2.3.1 Citoestimulao 47

4.2.3.2 Estudo do comportamento do dipeptdeo citrulil-arginina irradiado 51

4.2.3.3 Incorporao do ArctAlg na matriz de hidrogel 52

4.2.4 Cintica de liberao e doseamento do ArctAlg 53

4.2.5 Atividade citoestimulante do ArctAlg liberado 53

5 RESULTADOS E DISCUSSO 55 5.1 Obteno das matrizes de hidrogel 55

5.2 Caracterizao da matriz de hidrogel 56

5.2.1 Frao Gel 56

5.2.2 Intumescimento 57

5.2.3 Citotoxicidade 59

5.2.4 Propriedades Mecnicas 61

5.3 Citotoxicidade do ActAlg 64

5.4 Citoestimulao 65

5.6 Estudo do comportamento do dipeptdeo irradiado 67

5.7 Obteno do dispositivo de hidrogel 69

5.8 Cintica de liberao e doseamento do ArctAlg 70

5.9 Atividade citoestimulante do ArctAlg liberado 79

6 CONCLUSO 81 7 APNDICE 82 8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 91

LISTA DE FIGURAS Pgina

FIGURA 1. Camadas da pele 13 FIGURA 2. Camadas da epiderme 14

FIGURA 3. Representao esquemtica dos plexos vasculares 17

horizontais: superficial e profundo

FIGURA 4. Formao da ligao entre as cadeias polimricas: reticulao 23

FIGURA 5. Ciso de cadeia pricipal 24

FIGURA 6. Poli(vinil lcool) 29

FIGURA 7. Poli(N-vinil-2-pirrolidona) 30

FIGURA 8. Formao do radical polimrico 31

FIGURA 9. Poli(etilenoglicol) 33

FIGURA 10. Frmula estrutural do dipeptdeo citrulil-arginina 34

FIGURA 11. Concentrao de frmaco absorvido em funo do tempo 35

FIGURA 12. Extrator de Soxhlet 44

FIGURA 13. Texturmetro da Micro System 45

FIGURA 14. Esquema da distribuio dos extratos das amostras e controle 47

na microplaca.

FIGURA 15. Esquema da distribuio das diferentes concentraes de 50

ArctAlg na microplaca 3.

FIGURA 16. Sistema de HPLC da Shimadzu 52

FIGURA 17. Matriz de hidrogel de PVP 55

FIGURA 18. Matriz de hidrogel de PVA 56

FIGURA 19. Perfil de intumescimento dos hidrogis de PVP e PVA 59

FIGURA 20. Curvas de viabilidade celular dos hidrogis de PVP e PVA 60

no ensaio de citotoxicidade pelo mtodo de incorporao do vermelho neutro

FIGURA 21. Performance da fora de trao aplicada membrana de PVP 62

FIGURA 22. Performance da fora de trao aplicada membrana de PVA 62

FIGURA 23. Curvas de viabilidade celular do ArctAlg 65

FIGURA 24. Viabilidade celular em funo da concentrao de ArctAlg 66

FIGURA 25. Cromatograma do citrulil-arginina irradiado 68

FIGURA 26. Cromatograma do citrulil-arginina no-irradiado 68

FIGURA 27. Dispositivo de hidrogel de PVA 70

FIGURA 28. Dispositivo de hidrogel de PVP 70

FIGURA 29. Cromatograma da soluo padro de citrulil-arginina 71

FIGURA 30. Cromatograma de cintica de liberao do dispositivo 72

de PVP contendo ArctAlg aps 1h de liberao.

FIGURA 31. Cromatograma do extrato da membrana controle de PVP 72

FIGURA 32. Cromatograma de cintica de liberao do dispositivo 73

de PVA contendo ArctAlg aps 1h de liberao

FIGURA 33. Cromatograma do extrato da membrana controle de PVA 73

FIGURA 34. Cromatograma da anlise em HPLC do dispositivo de 74

PVA contendo citrulil-arginina

FIGURA 35. Perfil de liberao do citrulil-arginina contido no ArctAlg do 76

dispositivo de PVP

FIGURA 36. Perfil de liberao do citrulil-arginina contido no 77

ArctAlg do dispositivo de PVA

FIGURA 37. Viabilidade celular do ArctAlg liberado na primeira 79

hora dos dispositivos de hidrogis de PVP e PVA

FIGURA 38. Viabilidade celular em funo da concentrao de 82

ArctAlg em microplaca contendo 200.000 cls/mL







FIGURA 42. Viabilidade celular em funo do uso de MEM com 86

diferenetes concentraes de SFB

FIGURA 43. Viabilidade celular em funo da concentrao de

SFB no MEM + L-15 87


ArctAlg com incubao da microplaca por 24h 88


ArctAlg com incubao da microplaca por 48 horas ensaio 1 89


ArctAlg com incubao da microplaca por 48 horas ensaio 2 90

10

1 INTRODUO

Hidrogis, ou gis contendo gua, so polmeros caracterizados pela

hidrofilicidade e insolubilidade em gua (Kudela, 1990).

Os hidrgeis tm despertado grande interesse devido apresentarem

caractersticas interessantes como, por exemplo, a biocompatibilidade. A utilidade

dos hidrogis como biomateriais encontra-se na similaridade de suas

propriedades fsicas com aquelas dos tecidos vivos, fazendo-os teis para uma

grande variedade de aplicaes biomdicas, como curativos, implantes, lentes de

contato, matriz para imobilizao de enzimas e sistemas de liberao controlada

e/ou sustentada de princpios ativos (Peppas, 1996).

Bandagem de hidrogel base de poli(N-vinil-pirrolidona) (PVP) e

poli(etilenoglicol) (PEG) foi originalmente inventada como curativo para o

tratamento de queimadura por Rosiak e colaboradores (1989). No entanto,

atualmente, este sistema polimrico amplamente aplicado como sistema de

liberao de frmacos entre outros. O sucesso desses sistemas est relacionado

com as propriedades da matriz e a tecnologia de fabricao das mesmas.

Inicialmente os sistemas de liberao de frmacos foram desenvolvidos

para rotas tradicionais de administrao, como oral e intravenoso, porm,

recentemente ocorreu um aumento nas pesquisas que visam utilizao de rotas

consideradas no tradicionais como nasal, ocular, pulmonar, vaginal, retal e

transdrmica (ZHANG et al., 2004).

Durante dcadas a pele tem sido utilizada como via de administrao

de substncias dermatologicamente ativas, ou seja, com ao farmacolgica nos

tecidos da pele. Nessas terapias considera-se que as molculas do frmaco

difundem-se para o tecido no local da aplicao para produzir seus efeitos

teraputicos (Chien, 1987).

Uma das principais aplicaes das membranas de hidrogel sobre o

tecido cutneo lesionado, por serem flexveis, no txicas e possibilitarem a

aplicao tpica de frmacos por meio da membrana (Rosiak, 1991).

11

Tendo em foco o desenvolvimento de um novo produto para a

regenerao cutnea, na rea cosmtica, este trabalho teve por objetivo o estudo

da incorporao e liberao de um princpio ativo natural, o ArctAlg, em

membranas de hidrogel. Este princpio ativo foi escolhido por possuir em sua

composio o dipeptdeo citrulil-arginina que apresenta propriedades biolgicas

como ao anti-oxidante, citoestimulante, lipoltica e anti-inflamatria. A escolha

de hidrogis de PVP e PVA como matrizes para incorporar e liberar este princpio

ativo foi motivada pela comprovada biocompatibilidade e alto grau de

intumescimento dos mesmos. Partindo do pressuposto de que o princpio ativo

no se liga ao polmero, realizou-se o ensaio de liberao do ArctAlg a partir dos

hidrogis para verificar o seu perfil de liberao e uma possvel viabilidade

comercial deste dispositivo.

12

2 OBJETIVOS

O objetivo principal deste trabalho foi o estudo da incorporao do

ArctAlg em membranas de hidrogel de poli(N-vinil-pirrolidona) (PVP) e poli(vinil

lcool) (PVA) obtidas pela radiao ionizante e cintica de liberao do mesmo.

Para alcanar este objetivo foram realizadas as seguintes etapas:

Caracterizar o hidrogel de PVP e PVA;

Estudar a incorporao do ArctAlg na matriz polimrica;

Analisar a liberao in vitro do ArctAlg;

Verificar in vitro a propriedade de citoestimulao do ArctAlg em cultura

de clulas fibroblsticas.

13

3 REVISO DA LITERATURA

3.1 Pele humana

A pele o maior rgo do corpo humano, ocupando rea mdia de 2

m2, o que corresponde a cerca de 10 a 15% do peso total corporal (Leonardi &

Matheus, 2008). Ela formada por tecidos de origem ectodrmica e mesodrmica

que se arranjam em trs camadas distintas: a epiderme, a derme e a hipoderme.

Esta ltima no considerada por muitos autores como parte integrante da pele,

embora seja estudada dentro do sistema tegumentar (Sousa & Vargas, 2004).

As camadas da pele humana esto ilustradas na FIG. 1

FIGURA 1. Camadas da pele.

O tegumento, mesmo sem restringir a maleabilidade do corpo humano,

constitui uma barreira eficiente contra agresses exgenas, de natureza qumica

ou biolgica e impede a perda de gua e de protenas para o exterior. A pele

tambm age como rgo sensorial, participa do sistema imunolgico e exerce

outras funes, como a regulao da temperatura corprea, a produo de

vitamina D3, a excreo de eletrlitos e outras substncias e confere uma

proteo relativa para os rgos internos (Sousa & Vargas, 2004).

14

A espessura da pele varia dependendo da rea do corpo, sendo a pele

mais espessa encontrada nas regies sujeitas a presses e atritos constantes

(Ribeiro, 2006).

3.1.1 Epiderme

A epiderme, de origem ectodrmica, um epitlio de revestimento

estratificado e pavimentoso por possuir vrias camadas de clulas que vo se

achatando medida que se tornam mais superficiais. Como todo epitlio, as

clulas da epiderme se renovam indefinidamente devido a uma atividade mittica

contnua. A principal funo da epiderme produzir queratina, uma protena

fibrosa malevel, responsvel pela impermeabilidade cutnea, e as clulas que

esto envolvidas nesta funo so denominadas queratincitos (Sousa & Vargas,

2004).

As camadas que formam a epiderme so conhecidas como basal,

espinhosa, granulosa e crnea (FIG. 2). Uma quinta camada, a lcida,

encontrada entre as camadas crnea e granulosa na palma das mos e sola dos

ps, conferindo maior espessamento da pele nestas regies (pele espessa), ao

contrrio das demais regies do corpo onde a pele mais fina (pele delgada)

(Ribeiro, 2006).

FIGURA 2. Camadas da epiderme

15

As clulas da epiderme constituem um sistema dinmico, ou seja,

esto em constante renovao, desde sua juno com a derme at a sua

superfcie cutnea, onde se efetua uma descamao permanente (Leonardi &

Matheus, 2008).

O estrato basal chamado tambm de estrato germinativo, por conter

clulas em diviso. As clulas recm produzidas migram em direo s camadas

superiores da epiderme, com a finalidade de substituir as que descamaram. Logo,

na camada germinativa originam-se as clulas epidrmicas, que vo pouco a

pouco ganhando a superfcie, sofrendo modificaes graduais na forma e na

composio qumica, at se tornarem anucleadas (na camada crnea) e se

esfoliarem. H, assim, um deslocamento permanente e repetido de clulas, que

da camada basal atingem gradualmente a superfcie da epiderme para se

desprenderem j mortas (Leonardi & Matheus, 2008).

O ciclo de queratinizao, ou corneificao, consiste nesta

transformao das clulas epiteliais em clulas crneas. A pele elimina

diariamente cerca de 6 a 14g de clulas mortas, que so substitudas por outras

clulas epidrmicas, as quais gradualmente se queratinizam (Leonardi &

Matheus, 2008).

O tempo que um queratincito basal leva para se tornar um

queratincito crneo duas semanas, e o mesmo perodo de tempo gasto para

que o queratincito crneo venha a descamar. Portanto, a epiderme tem a sua

populao queratinoctica renovada a cada quatro semanas, em condies

habituais (Sousa & Vargas, 2004).

Acima da camada basal encontra-se a espinhosa, formada por vrias

fileiras de clulas, sendo as mais profundas polidricas e as superficiais mais

achatadas (Ribeiro, 2006). Apresentam prolongamentos citoplasmticos na forma

de espinhos que formam pontes entre as clulas adjacentes chamadas

desmossomos, os quais so responsveis pela manuteno da integridade da

epiderme. Entre esses prolongamentos h um espao preenchido com tecido

fluido que separa as clulas vizinhas e permite que nutrientes e oxignio

difundam-se em direo s demais camadas da epiderme (Barry, 1983).

Os corpos lamelares, reconhecidos como o primeiro sinal de

queratinizao, surgem no estrato espinhoso. Esses grnulos contm lipdeos

16

como ceramidas, cidos graxos e colesterol, alm de proteases, fosfatases

cidas, lpases e glicosidases (Baumann &Weisberg, 2002).

A camada granulosa, com a espessura de duas ou trs camadas de

clulas carregadas em grnulos de querato-hialina, situa-se entre a camada

crnea e a camada espinhosa (Ribeiro, 2006).

Esta regio da epiderme a responsvel pela formao da bicamada

de lipdeos presente entre as fileiras de clulas corneificadas que formam a

camada crnea. Esta estrutura lamelar tem como funo prevenir a desidratao

das camadas subjacentes da epiderme, formar barreira e oferecer resistncia

absoro percutnea, alm de atuar como cimento, fixando as clulas

queratinizadas umas s outras, impedindo o seu desprendimento (Ribeiro, 2006).

A ltima camada da epiderme, a crnea, o resultado final do

processo de diferenciao celular pelo qual passam os queratincitos e que

comea na camada germinativa ou basal (Ribeiro, 2006).

A poro menos permevel da epiderme o estrato crneo, onde as

clulas so mais queratinizadas e o teor de lipdeos mais elevado. Depois que

uma molcula atravessa este estrato no h outra barreira difuso para outras

camadas da pele (Leonardi & Matheus, 2008).

As clulas do estrato crneo so muito ricas em queratina e no

possuem ncleo e nenhuma organela. Embora seja uma membrana muito fina, o

estrato comporta-se como uma eficiente barreira, protegendo nosso corpo da

desidratao. Os lipdeos disponveis neste estrato formam membranas lamelares

intercelulares que retm gua, conservando a superfcie da nossa pele saudvel e

macia (Leonardi & Matheus, 2008).

3.1.2 Derme

A derme consiste em um tecido resistente e elstico que proporciona

resistncia fsica ao corpo frente a agresses mecnicas, fornece nutrientes

epiderme e abriga os apndices cutneos, vasos sanguneos e linfticos, clulas

de natureza conjuntiva e de origem sangunea (Ribeiro, 2006).

dividida em duas regies, a poro superior conhecida como derme

papilar, sendo a camada inferior epiderme e que apresenta maior densidade de

elementos vasculares, e a outra logo abaixo, a derme reticular que possui maiores

feixes de fibras colgenas (Baumann &Weisberg, 2002).

17

O colgeno sintetizado no retculo endoplasmtico do fibroblasto,

iniciado pelo pr-colgeno que por ao de peptidases se transforma em

tropocolgeno, rico em aminocidos lisina e prolina, que sofrem hidroxilao para

transformar o tropocolgeno em colgeno, este rico em hidroxilisina e

hidroxiprolina. Fazem parte desta reao bioqumica os cofatores silcio orgnico,

cido ascrbico, magnsio e clcio (Leonardi & Matheus, 2008).

As fibras elsticas permitem extensa deformao da pele, que retorna

passivamente ao estado original quando suspensa a fora aplicada (Ribeiro,

2006). Essas fibras esto reunidas em feixes de microfibrilas compostas de

fibrilina. A fibrilina forma um molde, sobre o qual a elastina depositada. As fibras

elsticas esto localizadas na periferia dos feixes de fibras colgenas e formam

uma rede estrutural na derme e, juntamente com o colgeno, respondem pelas

propriedades mecnicas dos tecidos conectivos (Baumann &Weisberg, 2002).

3.1.3 Vascularizao da pele

A derme possui dois plexos vasculares horizontais, um superficial e

outro profundo (FIG. 3). Esta rede vascular de fundamental importncia para a

nutrio da epiderme, que no vascularizada (Ribeiro, 2006).

FIGURA 3. Representao esquemtica dos plexos vasculares horizontais:

superficial e profundo.

O plexo superficial situa-se na poro superficial da derme reticular,

com arterolas pequenas, de camada muscular descontnua, e delas partem alas

18

capilares com sangue arterial que ascendem at o topo de cada papila drmica e

retornam como papilares venosos (Sousa & Vargas, 2004).

O plexo profundo situa-se na base da derme reticular e composto por

arterolas e vnulas de parede muscular contnua. H ntima ligao dos dois

plexos, pois das arterolas do plexo profundo, sobem vasos que se ligam no plexo

superficial (Sousa & Vargas, 2004).

3.2 Cicatrizao

O processo de cicatrizao se d fundamentalmente no tecido

conjuntivo, no qual diversos fatores de ordem geral ou local intervm em sua

constituio e funo. A cicatriz consiste na substituio do tecido lesado por

tecido conjuntivo neoformado, indicado como cicatricial (Guirro, 2002).

A reparao cutnea constituda por uma sucesso de fenmenos

complexos e estreitamente ligados, que podem ser classificados em diferentes

etapas ou fases (Guirro, 2002):

Fase inflamatria: Fase inicial e fundamental do processo de reparo que dura

em mdia 72 horas desencadeada pela leso, independentemente de seu

agente etiolgico. Numa primeira etapa, observa-se uma vasoconstrio, que

fugaz, seguida pela liberao de substncias vasoativas (histamina,

serotonina, 5-hidroxi-triptamina, cininas, plasmina, calicrena e prostaglandinas

PgE1 e PgE2), capazes de promover aumento da permeabilidade vascular. O

fluido originado do exudato principalmente o plasma, que coagula,

delimitando o processo.

Fase de latncia: Essa fase assim denominada em virtude de se acreditar

inicialmente que havia uma interrupo na cicatrizao, porm atualmente

sabe-se que uma fase bastante ativa. Substncias denominadas fatores de

crescimento (cininas) esto aumentadas em nvel srico em torno do sexto

dia, e atuam em diversas fases da proliferao celular.

Fase de fibroplasia (biossntese do colgeno): a ao de macrfagos inicia a

transio para essa segunda fase do reparo da leso em que se desenvolve a

formao do tecido de granulao. O tecido de granulao consiste de uma

19

densa populao de macrfagos, fibroblastos e novos vasos, embebidos em

uma matriz frouxa de colgeno, fibronectina e cido hialurnico.

Fase de contrao: Fase dinmica que objetiva a reduo da superfcie

cruenta, produzindo a aproximao das bordas da leso, contribuindo para o

fechamento da mesma. Esta fase tem incio entre o stimo e o dcimo quarto

dias de leso.

A cicatrizao processa-se na maioria das vezes de forma rpida e

satisfatria. No entanto, fatores como estado nutricional, doena preexistente, uso

de vestimenta, exposio terapia com radiao, lcool e fumo podem influenciar

neste processo de regenerao da pele (Sousa & Vargas, 2004).

O processo de cicatrizao pode ser classificado segundo o tipo e a

quantidade de tecido em cicatrizao por primeira inteno e cicatrizao por

segunda inteno. A primeira ocorre em casos de incises cirrgicas limpas no-

infectadas, cujas bordas so aproximadas por suturas. A leso provoca a morte

de um nmero limitado de clulas epiteliais e do tecido conjuntivo, alm da

ruptura da continuidade da membrana basal epitelial. A reao inflamatria mais

branda e ao final do processo observa-se uma cicatriz formada por tecido

conjuntivo destitudo de infiltrado inflamatrio recoberto por uma epiderme intacta.

Cicatrizao por segunda inteno ocorre quando h uma perda extensa de

clulas e tecido que deve ser preenchida, como na ulcerao inflamatria,

formao de abscesso e em feridas superficiais que geram grandes defeitos.

Observa-se uma reao inflamatria mais intensa e so necessrias a

regenerao das clulas parenquimatosas e a formao de um tecido de

granulao abundante para completar o reparo tecidual. Grandes feridas de

superfcie podem sofrer contrao, um efeito possivelmente causado pela

presena de miofibroblastos, que resulta na reduo do tamanho da leso ao final

do processo cicatricial (Cotran et al., 2000).

As cicatrizes podem ser classificadas em (Sousa & Vargas, 2004):

Atrficas: leses lisas, planas, retrteis, sem sulcos, poros e plos,

acompanhadas de discromia.

20

Hipertrficas: leses discrmicas, fibrticas, lisas, salientes, sem sulcos,

poros e plos. So limitadas rea do processo cicatricial inicial, seu

tamanho tende a diminuir ao longo dos anos.

Queloidianas: salientes, duras, com superfcie lisa e brilhante, de colorao

rsea ou castanha e que apresenta dor e/ou prurido.

3.3 Polmeros 3.3.1 Ao da radiao ionizante sobre a matria e polmeros

A qumica das radiaes consiste no estudo dos efeitos qumicos

produzidos quando a matria exposta radiao de energia alta, ou tambm

denominada, radiao ionizante. Geralmente, os tipos de radiao mais

conhecidos so aqueles produzidos pela decomposio de ncleos radioativos

(radiao , e ), partculas reativas de alta energia (eltrons, prtons, etc.) e

radiao eletromagntica de onda curta (raios X) (Spinks & Woods, 1990).

Quando a radiao eletromagntica interage com a matria ocorrem

vrios processos de atenuao, sendo os trs principais: efeito fotoeltrico, efeito

Compton e produo de pares (Spinks & Woods, 1990).

Efeito fotoeltrico: ocorre principalmente com ftons de baixa energia

(menor que 1 MeV), que interagem predominantemente pelo efeito

fotoeltrico. Neste tipo de interao, toda a energia do fton transferida

para um nico eltron atmico, que ejetado com uma energia igual

diferena entre a energia do fton e a energia de ligao do eltron ao

tomo. A ocorrncia de interaes fotoeltricas mais provvel em

materiais com nmero atmico elevado e para ftons de baixa energia.

Efeito Compton: ocorre quando um fton interage com um eltron que pode

estar fracamente ligado ou livre, sendo que o eltron acelerado e o fton

defletido com energia reduzida. A energia do fton incidente dividida

entre o fton espalhado e o eltron. A interao Compton ocorre

21

predominantemente para ftons com energia entre 1 e 5 MeV em materiais

com elevado nmero atmico .

Produo de pares: a produo de pares envolve a completa absoro de

um fton nos arredores de um ncleo atmico ou, menos freqentemente,

um eltron com formao de duas partculas, um eltron e um psitron. A

produo de pares no ocorre com ftons de energia menor que 1,02 MeV

(Spinks & Woods, 1990).

A interao da radiao ionizante com a matria promove eventos

fsico-qumicos, em nvel atmico, os quais so complexos e podem ser divididos

em trs etapas consecutivas e distintas: etapa fsica, etapa fsico-qumica e etapa

qumica (Farhataziz & Rodgers, 1987).

Na etapa fsica (10-18 a 10-15s), devido ao da radiao sobre a

matria, ocorre transferncia de energia. Esta energia transferida provoca

excitaes eletrnicas e ionizao. As espcies primrias formadas com alta

energia so muito instveis, sofrendo reaes secundrias (Farhataziz &

Rodgers, 1987).

Na etapa fsico-qumica (10-15 a 10-11s) ocorre a formao de espcies

secundrias reativas (H+, radicais livres, etc.) que podem se originar de uma nica

reao ou podem resultar de uma sucesso complexa de reaes (Farhataziz &

Rodgers, 1987).

A etapa qumica (10-11s em diante) se inicia quando o sistema

restabelece o equilbrio trmico que havia sido alterado pela transferncia de

energia da radiao. As espcies reativas continuam a reagir entre si e com

outras espcies vizinhas. O tempo de durao desta etapa depende do meio

(slido, lquido, etc.) em que a radiao vai interagir (Farhataziz & Rodgers,

1987).

As mudanas qumicas produzidas em um polmero quando exposto

radiao no so muito diferentes das observadas em compostos de massa molar

baixo (Charlesby, 1960). Nem todas as molculas polimricas possuem o mesmo

tamanho, e muitas de suas propriedades no esto relacionadas somente com a

massa molar, mas com sua distribuio (Farhataziz & Rodgers, 1987).

Basicamente, na irradiao de polmeros, os objetivos so a

modificao das propriedades fsicas como o comportamento mecnico,

condutividade, ponto de fuso, entre outros (Farhataziz & Rodgers, 1987).

22

Os principais efeitos da radiao sobre os polmeros so: ciso da

cadeia principal, com conseqente reduo da massa molar; reticulao, com

conseqente aumento da massa molar (podendo formar uma rede tridimensional

insolvel) e formao de insaturaes. Como conseqncia da modificao

estrutural do polmero irradiado pode ser verificada alteraes de suas

caractersticas morfolgicas como, por exemplo, perda da cristalinidade e

alterao de cor (Reichmanis & ODonnell, 1989).

A reticulao de materiais polimricos pode ser iniciada por uma

dissociao do hidrognio ou por um radical que abstrai um hidrognio de uma

cadeia polimrica prxima formando um stio reativo adicional. Para cada

excitao-ionizao, um radical polimrico e um tomo de hidrognio so

formados. Estes tomos de hidrognio podem retirar outro hidrognio e formar um

radical polimrico adicional, ou tambm percorrer uma longa distncia e sofrer

vrias colises antes de abstrair um segundo hidrognio, produzindo radicais

polimricos em outros locais (Bradley, 1984).

Alguns polmeros, aps exposio radiao de alta energia, mostram

um aumento na massa molar, levando a formao de uma rede tridimensional

(reticulao), j outros mostram uma reduo na sua massa molar, ocorrendo

mudanas na viscosidade e propriedades mecnicas. Estas mudanas podem ser

devido a uma ciso na cadeia principal, induzida pela radiao, ocorrendo um

rearranjo dos tomos perto do ponto de ruptura para estabilizar os grupos finais

(degradao) (Charlesby, 1960).

As modificaes causadas pela radiao ionizante em polmeros

dependem das condies de processo, ou seja, tipo de radiao, presena de

oxignio ou diferentes atmosferas, aditivos, solventes, grau de cristalinidade e

homogeneidade do material polimrico que ir absorver a energia, etc (Clegg &

Collyer, 1964).

3.3.2 Reticulao e degradao de polmeros

A radiao ionizante pode produzir a ciso ou reticulao de molculas

polimricas, levando a diminuio ou o aumento do peso molecular (Clough &

Shalaby, 1991).

23

Na reticulao ocorre uma ligao entre as cadeias polimricas (FIG.4)

formando uma rede tridimensional (Charlesby, 1960). Dentre os mecanismos

propostos para a reticulao pode-se citar os seguintes (Schnabel, 1981):

Quebra da ligao C-H de uma cadeia polimrica com a formao de um

tomo de hidrognio seguido da retirada de um segundo tomo de uma

molcula prxima formando hidrognio molecular (H2). Sendo assim, os

dois radicais polimricos combinam-se formando uma reticulao;

Migrao de radicais produzidos pela quebra das ligaes C-H ao longo

das cadeias polimricas at que duas delas tornem-se adjacentes e se

unam formando a reticulao;

Estes processos podem ocorrer de forma individual ou

concomitantemente. Apesar de nenhuma destas explicaes ser completamente

aceita, admite-se que para cada excitao ou ionizao, um radical polimrico e

um tomo de hidrognio, devido a sua energia cintica, produzem radicais

polimricos secundrios. Pares de radicais adjacentes, formados pela radiao ou

por tomos de hidrognio, podem unir-se (Schnabel, 1981).

FIGURA 4. Formao da ligao entre as cadeias polimricas: reticulao.

O fator mais importante que influencia na capacidade de

intumescimento do hidrogel a reticulao. Os hidrogis altamente reticulados

possuem uma estrutura mais apertada diminuindo o intumescimento em

comparao com hidrogis menos reticulados. A reticulao diminui a mobilidade

24

da cadeia polimrica, por isso diminui a capacidade de intumescimento do

hidrogel (Peppas, et al., 2000).

O uso da radiao de alta energia para promover a reticulao entre

molculas adjacentes do polmero uma das principais aplicaes industriais das

radiaes (Farhataziz & Rodgers, 1987).

O termo degradao polimrica usado para denotar as mudanas

nas propriedades fsicas causadas por reaes qumicas envolvendo ciso de

cadeia na macromolcula (Schnabel, 1981). A degradao polimrica consiste na

reduo da massa molar do polmero e de mudanas em sua estrutura qumica

(ODonnell, 1991).

A ciso de cadeia (FIG. 5) um efeito importante da radiao sobre os

polmeros. As reaes de competio entre a ciso de cadeia e a reticulao

ocorrem simultaneamente em muitos sistemas polimricos, a predominncia de

uma dessas reaes ir depender das condies de irradiao e da estrutura

qumica do polmero. Apesar das reaes de ciso ser geralmente consideradas

uma deteriorao, alguns produtos industriais usam esta reao de degradao

para produzir produtos comerciais (Bradley, 1984).

FIGURA 5. Ciso de cadeia pricipal

Em materiais como a celulose, o poliisobutileno e o polipropileno a

ciso da cadeia, ou reduo da massa molar predominante. J em poliamidas,

poliacrilatos e polivinil lcool, a reao de reticulao a predominante (Bradley,

1984).

O polmero pode sofrer degradao por outros processos, como a

degradao qumica, enzimtica, mecnica, biodegradao, etc., alm da

degradao por meio da radiao (Schnabel, 1981).

25

3.3.3 Aplicaes biomdicas dos polmeros

Atualmente, o maior grupo de materiais usados para fins biomdicos

so os polmeros, que podem ser utilizados separadamente ou em combinaes

com outros materiais (Rosiak et al.,1995).

A aplicao de polmeros sintticos na rea mdica tem crescido

substancialmente nos ltimos 30 anos. Na TAB. 1 so mostradas algumas das

aplicaes dos polmeros sintticos na medicina (Peppas et al., 2000).

TABELA 1: Aplicaes biomdicas dos polmeros.

Instrumentos Sistemas com funo

mdicos Sistemas substituintes ou melhoradores de partes do corpo teraputica

cirrgicos Externamente Internamente

Lentes de contato Prteses ortopdicas

Seringas Sistema de liberao de

Coraes artificiais Implantes cardiovasculares frmacos

Bombas de insulina "Stents"

Catteres Biosensores Rins artificiais Mamoplastia Fgados artificiais Reconstruo maxilofacial

Curativos Bombas de insulina Peles artificiais Reconstruo das cordas Vocais Reconstruo de rgos Sexuais

Suturas Tendes artificiais Cartilagem articular

O polmero para ser considerado um biomaterial deve preencher

alguns requisitos como (Rosiak et al.,1995):

no-toxicidade: os materiais no devem ser pirognicos ou carcinognicos e

no devem provocar inflamaes crnicas;

26

funcionalidade: os biomateriais devem substituir temporariamente ou para a

vida toda os rgos e tecidos que esto com suas funes comprometidas;

estril: devem ser facilmente esterilizveis em autoclave ou radiao ionizante;

biocompatibilidade: o biomaterial deve causar o mnimo de stress ao

organismo receptor, ou seja, no causar nenhum dano as clulas e tecidos.

Polmeros so molculas de cadeia longa que consiste de um nmero

de pequenas unidades repetidas, as quais se denominam monmeros. Vrios

tipos de polmeros so utilizados em aplicaes biomdicas como os

homopolmeros e os copolmeros (Visser et al.,1996).

A radiao ionizante produz ons e radicais livres que podem iniciar a

polimerizao ou a copolimerizao em monmeros e degradao e reticulao

em polmeros (Schnabel, 1981). O uso da radiao ionizante para a formao de

biomateriais polimricos possui algumas vantagens como (Rosiak, 1991):

reticulao e esterilizao simultnea do produto;

O processo de reticulao pode ocorrer em uma ampla faixa de temperatura

sem necessitar de um aquecimento para ocorrer reao no sistema;

Propriedades fsicas e/ou qumicas do produto final podem ser obtidas pelo

ajuste da intensidade e tipo de radiao, tempo de irradiao (dose), etc.

O curativo de hidrogel a base de PVP utilizado em queimaduras e

ulceraes da pele utiliza a radiao ionizante para obter a reticulao do

polmero e simultnea esterilizao do produto (Rosiak, 1991).

H tambm outros tipos de hidrogis utilizados como curativos

reportados na literatura, hidrogis de PVP e PVA (Razzak et al., 2001) e de poli

xido de etileno (PEO) e PVA (Yoshii et al., 1999) obtidos por radiao gama, e

de PVA intumescidos com quitosana (Rodas et al., 2005) so alguns exemplos.

Desde a dcada de 1980, folhas de silicone na forma de gel tm sido

testadas no tratamento de escaras hipertrficas e quelides apresentando bons

27

resultados. Estudos demonstraram que as bandagens de silicone em gel so

seguras e efetivas para essa aplicao, podendo ser especialmente teis para

crianas e outros pacientes intolerantes dor e a outros procedimentos (Valenta

& Auner, 2004).

Outro produto muito utilizado no tratamento de feridas que requeiram

enxerto o Integra. Ele constitudo por membrana de colgeno que quando

colocado sobre a ferida sofre invaso dos vasos sanguneos promovendo sua

vascularizao. Aps algum tempo esta membrana degradada pelo organismo e

substituda por tecido do prprio paciente (Jones et al., 2002).

3.3.4 Hidrogel

Hidrogis, ou gis contendo gua, so polmeros caracterizados pela

hidrofilicidade e insolubilidade em gua. Na gua, eles intumescem at atingir o

equilbrio preservando a sua forma (Kudela, 1990).

A hidrofilicidade do hidrogel devido a presena de grupos hidroflicos

em gua como OH, -COOH, -CONH, etc. A insolubilidade e estabilidade de sua

forma em gua so devido a presena da rede tridimensional (Kudela, 1990).

Os hidrogis podem ser classificados em vrios tipos, dependendo do

seu mtodo de preparo, carga inica, ou caractersticas fsicas estruturais

(Peppas, 1996).

A sntese do hidrogel pode ser a partir de qualquer polmero hidroflico

que possa ser reticulado formando uma rede tridimensional. A reticulao pode

ser feita por reao qumica, radiao ionizante ou interaes fsicas (Gehrke &

Lee, 1990).

A reticulao por reao qumica necessita de um agente iniciador.

Este agente normalmente liga as cadeias de massa molar maior atravs de seus

grupos multifuncionais. Um segundo mtodo utilizado a reao de

copolimerizao entre um ou mais monmeros e um monmero multifuncional,

que presente em menor quantidade. Outro mtodo utilizado envolve o uso da

combinao de um monmero e uma cadeia polimrica linear que so reticulados

por um agente qumico (Peppas, 1996).

A formao de hidrogis via radiao ionizante pode ser definida como

resultado de combinao mtua de macrorradicais. Estes macrorradicais so

produtos obtidos pela interao da radiao com a matria prima, formando

28

produtos reativos como ons e estados excitados, que perdem sua energia

formando radicais livres. Se estes radicais estiverem localizados em cadeias

polimricas diferentes e posicionados favoravelmente, podem sofrer

recombinaes havendo a formao de ligao covalente entre as cadeias

(Rosiak & Olejniczak, 1993).

Na reticulao por radiao ionizante ocorre a interconeco das

cadeias polimricas longas por meio de ligaes covalentes. Nos hidrogis fsicos

(gis reversveis, pseudogis) tambm formada uma rede tridimensional, mas

as cadeias polimricas individuais so conectadas por pontes de hidrognio ou

interaes eletrostticas. Neste caso normalmente possvel converter este tipo

de hidrogel em uma soluo homogenia. Os exemplos clssicos de alguns so

gelatina e gar (Rosiak, 1991).

O processo de formao de hidrogis por radiao ionizante possui

algumas vantagens, como por exemplo, obter a reticulao e esterilizao

simultnea do produto, possibilidade de reticulao em temperaturas baixas e

ausncia de iniciadores qumicos (Rosiak et al.,1995).

A habilidade de absorver gua e ons, sem perder sua forma e suas

propriedades mecnicas uma das principais caractersticas do hidrogel. Outra

propriedade importante de alguns hidrogis a biocompatibilidade em contato

com o sangue, fluidos corpreos e tecidos vivos (Rosiak, 1991).

As propriedades fsicas dos hidrogis fazem com que eles tenham uma

ampla aplicao no campo biomdico e farmacutico, sendo utilizados como

curativos, lentes de contato, matrizes para imobilizao de enzimas e sistemas de

liberao de frmacos (Peppas, 1996).

Um dos hidrogis mais utilizados o PHEMA. Este foi apresentado

como um material biolgico por Wichterle e Lim em 1960. A estrutura do PHEMA

permite um contedo de gua similar ao do tecido vivo. Este hidrogel inerte ao

organismo, resistente a degradao e no absorvido pelo corpo (Peppas, 1996).

Rosiak e colaboradores (1989) desenvolveram um sistema polimrico

base de poli(N-vinil-pirrolidona) (PVP), polietilenoglicol (PEG) e gar, reticulado

por feixe de eltrons de alta energia, com excelentes caractersticas para ser

utilizado como curativo. O hidrogel de PVP, produzido pela irradiao de sua

soluo aquosa, tem sido aplicado no tratamento de queimaduras, ulceraes da

pele, curativo ps-operatrio, etc.

29

A tecnologia de produo dos curativos de hidrogel via radiao

ionizante possui algumas vantagens em relao ao por processo qumico, pois

alm de ser uma tecnologia mais simples, fcil e limpa (sem resduos) o produto

final completamente esterilizado (Rosiak, 1991).

Alm do hidrogel produzido por Rosiak e colaboradores (1991), existem

outros tipos de curativo de hidrogel comercializados como o Vigilon e Kik gel.

Estes tambm so esterilizados utilizando a tcnica de irradiao (Razzak et al.,

2001).

Os hidrogis tambm tm sido utilizados amplamente no

desenvolvimento de sistema de liberao controlada de frmacos, podendo liber-

lo de acordo com os estmulos do ambiente, devido a uma mudana de pH ou de

temperatura, por exemplo. Esta classe de hidrogis sensveis a estmulos,

tambm chamada de hidrogis inteligentes. Hidrogis de poliacrilameda e

quitosana sensveis a variao de pH (Bonina et al., 2004) e hidrogis de gelatina

e dextrano sensveis a estmulos duplos (Kurissawa & Yui, 1998) so alguns

exemplos.

3.3.5 Poli(vinil lcool)

O poli(vinil lcool) (PVA) produzido pela hidrlise controlada do

poli(vinil acetato). So produzidos PVA de massa molar varivel e com diferentes

graus de hidrlise, sendo que este ir determinar a solubilidade em gua do

polmero resultante (Ulrich, 1982).

A descoberta do PVA (FIG. 6) foi em 1924 quando Herrman e Haehnel

adicionaram lcali em uma soluo de poli(vinil acetato) e obtiveram o poli(vinil

lcool), mas foi em 1927 que foi realizado a sua primeira publicao cientfica

(Marten, 1989).

FIGURA 6. Poli(vinil lcool)

30

Os filmes de PVA possuem uma excelente resistncia a ruptura e

abraso. As propriedades mecnicas deste polmero dependem do grau de

hidrlise, massa molar e umidade relativa (Marten, 1989).

O PVA solvel em solventes hidroflicos e altamente polares, como a

gua. A viscosidade das solues de PVA dependente principalmente da massa

molar, concentrao, grau de hidrlise e temperatura. Materiais com alto grau de

hidrlise tm uma maior viscosidade e podem at formar gel (Marten, 1989).

A excelente resistncia qumica e propriedades fsicas do PVA fazem

com que ele tenha um amplo uso industrial. Ele muito utilizado na produo de

poli(vinil butiral), em fibras, adesivos, papel, etc. (Marten, 1989).

3.3.6 Poli(N-vinil-2-pirrolidona)

Polivinilamidas so polmeros anfotricos, altamente polares, que esto

sendo estudados desde 1930. Os polmeros derivados de estruturas cclicas so

os mais importantes, como o poli(N-vinil-2-pirrolidona), tambm chamado de

polivinilpirrolidona, povidone ou PVP (Barabas, 1989).

O PVP (FIG. 7) produzido pela polimerizao do N-vinil-pirrolidona

iniciada por um radical livre. Ele utilizado em formulaes cosmticas, na

indstria txtil, em adesivos, etc (Ulrich, 1982).

Este polmero apresenta uma combinao de propriedades, incluindo

solubilidade em gua e em solventes orgnicos, baixa toxicidade, boas

caractersticas para formar filmes e habilidade de aderir inmeros substratos

(Barabas, 1989).

FIGURA 7. Poli(N-vinil-2-pirrolidona)

31

Devido sua propriedade adesiva e formadora de filmes utilizado em

sprays de cabelo e adesivos. J na indstria farmacutica utilizado em sistema

de liberao de frmacos e na indstria de alimentos para clarificao da cerveja

e do vinho. Na Segunda Guerra Mundial o PVP foi usado como espessante de

plasma sanguneo (Barabas, 1989).

O PVP um p higroscpico branco ou levemente amarelado. Este

polmero consiste de um grupo metileno hidrofbico e um grupo amina hidroflico.

Como conseqncia deste balano hidrofbico-hidroflico, ele solvel em

diversos solventes orgnicos e tambm em gua (Barabas, 1989).

Devido s caractersticas do vinilpirrolidona, o PVP quimicamente

inerte. O polmero seco pode ser estocado em condies normais sem ocorrer

sua decomposio, degradao, ou mudanas estruturais. Em solues aquosas

tambm podem ser estocadas por um longo perodo se estocadas

adequadamente (Barabas, 1989).

A irradiao da soluo aquosa de PVP resulta na formao de

macroradicais (na cadeia polimrica) e radicais Hidroxilas (OH) formados durante

a radilise do solvente. A reticulao resultante da recombinao mtua de

macroradicais formados, e como resultado deste processo h formao de

ligaes covalentes entre estas molculas. Se a quantidade destas novas

ligaes for suficientemente grande, aparece no sistema uma frao de gel

insolvel (FIG. 8) (Rosiak &Ulanski, 1999).

Direto

(formao do radical)

(reticulao)

32

Indireto

(formao do radical)

(abstrao do H do polmero)

(reticulao)

FIGURA 8. Formao do radical polimrico.

3.3.7 gar

O gar uma mistura complexa de polissacardeos extrados de

espcies de algas vermelhas, conhecidas como agarofitas (espcies de Gelidium,

Gracilaria, Pterocladia, Acanthopeltis e Ahnfeltia) (Bridson, 2006). insolvel em

gua e solvel em gua fervente. Quando fervido (no funde abaixo de 85C)

torna-se um lquido lmpido e na temperatura entre 32C e 38C ele torna-se

slido para resultar em um gel firme (Farmacopia Brasileira, 1977).

Agarose o componente responsvel pelas propriedades de

geleificao forte do gar, enquanto a agaropectina responsvel pelas

propriedades de viscosidade. A proporo entre agarose e agaropectina em gar

varia de acordo com a alga de origem (Bridson, 2006).

3.3.8 Poli(etilenoglicol)

O poli(etilenoglicol) (PEG) (FIG. 9) um homopolmero

termoplstico, obtido pela polimerizao cataltica do xido de etileno (Carey &

Sundberg, 1983).

33

FIGURA 9. Poli(etilenoglicol)

O PEG miscvel em gua, possui baixa toxicidade e consegue ser

compatvel com uma grande variedade de formulaes. Possui uma boa

estabilidade e pode ser misturado com gua (ou outros solventes) para obter uma

ampla faixa de viscosidade (Clinton & Matlock, 1990).

Este polmero utilizado como surfactante, lubrificante, plastificante

(Ulrich, 1982), em formulaes cosmticas, solues de lentes de contato, etc.

(Clinton & Matlock, 1990).

3.4 Arctalg

Observando a vida selvagem na regio subrtica do Atlntico,

pesquisadores verificaram que as algas vermelhas resistiam s baixas

temperaturas do inverno extremo, assim como a pouca luminosidade devido os

dias serem mais curtos. Estas algas, como a Chondrus crispus, quando

submetidas em situao de stress, como no inverno intenso, sintetizam em

grande quantidade o dipeptdeo citrulil-arginina, que utilizado como uma reserva

energtica (fonte de nitrognio) para este perodo do ano (Christophe, 2006).

Baseado nesses fatos foi estudado e desenvolvido um extrato natural

padronizado desta alga vermelha do mar rtico, o qual foi registrado como

ArctAlg. Este extrato derivado da biomassa da Chondrus crispus que

selecionada sob condies controladas de frio intenso, pouca luminosidade e

processo de extrao especfico que permite a padronizao dos principais

constituintes (dipeptdeo citrulil-arginina, aminocido taurina e agentes

osmoreguladores) (Exsymol, 2005).

34

FIGURA 10. Frmula estrutural do dipeptdeo citrulil-arginina

ArctAlg um extrato aquoso com cerca de 7,5% de resduo seco. Um

de seus principais componentes o dipeptdeo citrulil-arginina (FIG. 10), rico em

nitrognio, representando cerca de 7% do extrato seco. Outros componentes

importantes so: o aminocido taurina (importante fonte de energia celular), o

agente osmoregulador floridosdeo e seus ismeros representando cerca de 13%

do resduo seco, alm de sais minerais como Ca, Mg, K, Cl. Este extrato possui

uma excelente ao antioxidante, lipoltica, antiinflamatria e citoestimulante.

Devido essas propriedades, o ArctAlg pode ser utilizado em produtos

cosmticos com ao anti-envelhecimento, anti-celulite e tambm na no auxlio da

cicatrizao (Exsymol, 2005).

3.5 Sistema de liberao de frmacos

O maior avano no desenvolvimento de sistemas de liberao de

frmacos est na possibilidade de manter a concentrao do princpio ativo em

um nvel teraputico plasmtico por um longo perodo de tempo, abaixo do nvel

txico e acima do nvel mnimo efetivo, como ilustrado na FIG.11 (Heller, 1996).

35

FIGURA 11. Concentrao de frmaco absorvido em funo do tempo.

(____) dose segura (- - -) dose no segura (__ . __ .__) liberao controlada

Um dos materiais mais utilizados como matriz para compor um

dispositivo de liberao controlada de medicamentos so os polmeros,

principalmente devido biocompatibilidade, biodegradabilidade, e a possibilidade

de se projetar mecanismos ou sistemas diferentes de liberao de drogas (Uhrick

et.al., 1999).

Os sistemas polimricos para a liberao controlada podem ser

classificados de acordo com o mecanismo que controla a liberao do agente

teraputico: por difuso, pela penetrao de gua e quimicamente, como pode ser

visto na TAB. 2 (Heller, 1996).

Nos sistemas controlados por difuso existem dois tipos de

dispositivos, os monolticos e os controlados por membrana (dispositivos

reservatrios). Em um dispositivo monoltico o frmaco disperso uniformemente

na matriz polimrica e a liberao controlada por difuso atravs da matriz. A

difuso vai depender da solubilidade do frmaco no polmero, em que ou o

princpio ativo vai estar abaixo do limite de solubilidade e dissolvido no polmero

ou ele vai estar bem acima do seu limite de solubilidade disperso na matriz

(Heller, 1996). Outro fator que interfere na difuso em dispositivos monolticos o

tamanho do poro. Em hidrogis, a difuso ocorre atravs dos poros, em que o

frmaco se move por meio das regies que esto preenchidas com gua (Gehrke

& Leee, 1990).

36

Nos dispositivos reservatrios o frmaco est contido em um

compartimento envolto por uma membrana polimrica que pode ou no ser

porosa e que controla a difuso da droga para o meio externo. Um exemplo deste

tipo de dispositivo so os contraceptivos transdrmicos (Heller, 1996).

No mecanismo controlado pela penetrao de gua, a taxa de

liberao do frmaco controlada pela taxa de penetrao de gua no

dispositivo, sendo dois tipos de sistema: o osmtico e o por intumescimento. Nos

dispositivos do tipo bomba osmtica o agente osmtico est contido dentro de

uma cmara rgida e separado do frmaco por uma partio mvel, sendo que um

dos lados do compartimento rgido uma membrana semipermevel. Quando o

dispositivo imerso em meio aquoso, a gua penetra no dispositivo atravs da

membrana aumentando o volume do compartimento osmtico que por

conseqncia exerce uma presso sobre a parte mvel fazendo com que o

frmaco saia por meio de um orifcio. Nos dispositivos controlados por

intumescimento o princpio ativo disperso uniformemente em uma matriz

hidroflica reticulada, no estado slido seco. Esta matriz, quando em contato com

um meio aquoso, se expande e o frmaco se difunde para fora do polmero

(Heller, 1996).

No mecanismo de liberao controlado quimicamente o frmaco

liberado devido degradao do polmero. Essa degradao pode ocorrer por

enzimas, por reaes qumicas ou pela gua. Neste mecanismo existem dois

tipos de sistema: monolticos e de cadeias pendentes. No sistema monoltico o

frmaco disperso uniformemente em um polmero biodegradvel, em que sua

liberao pode ser controlada pela difuso ou pela degradao ou ainda pela

combinao dos dois (Heller, 1996). Nos sistemas de cadeias pendentes o

princpio ativo ligado covalentemente cadeia de um polmero biodegradvel,

sendo que sua liberao ocorre com o rompimento das ligaes entre o polmero

e o frmaco (Heller, 1996).

37

TABELA 2. Classificao dos Sistemas de Liberao Controlada.

TIPOS DE SISTEMA

MECANISMO DE LIBERAO

Controlado pela Difuso

Dispositivos reservatrios

Dispositivos monolticos

Difuso atravs da membrana.

Difuso atravs do corpo do polmero.

Controlado pela Penetrao de gua

Sistema osmtico

Sistema por intumescimento

Transporte osmtico da gua por meio de

uma membrana semipermevel.

Penetrao de gua em um polmero

seco.

Controlado Quimicamente

Sistemas monolticos

Sistemas de cadeias laterais (enxertos)

Por eroso ou pela combinao de

eroso com difuso.

Combinao entre a hidrlise do grupo

pendente e a difuso do corpo do

polmero.

Em sistemas de liberao de frmacos, o termo hidrogel reservado

para materiais polimricos que conseguem absorver quantidades significantes de

gua (mais que 20% do seu peso seco) enquanto mantm sua estrutura

tridimensional (Gehrke &Lee, 1990).

Os dispositivos de hidrogel possuem uma relevante importncia em

sistemas de liberao, pois alm de possibilitar o controle da liberao do

frmaco, eles aumentam a estabilidade de princpios ativos instveis por proteg-

los do meio externo (Gehrke &Lee, 1990).

Em relao incorporao de princpios ativos em hidrogis,

destacam-se dois mtodos gerais. O primeiro mtodo consiste na mistura do

38

frmaco com o hidrogel e sua posterior reticulao, fazendo com que o princpio

ativo fique preso dentro da matriz. No segundo mtodo, primeiramente, o hidrogel

seco e assim obtido o dispositivo. Este mergulhado em uma soluo

contendo o princpio ativo que incorporado atravs da capacidade de

intumescimento do hidrogel. Este ltimo mtodo possui algumas vantagens em

relao ao primeiro, pois durante o processo de reticulao pode haver uma

alterao nas propriedades teraputicas do princpio ativo (Kim et.al., 1992).

Os hidrogis devem possuir propriedades fundamentais para que

possam ser utilizados como matrizes para compor dispositivos de liberao

controlada, sendo elas a biocompatibilidade, permeabilidade e capacidade de

intumescimento. Embora esta ltima propriedade seja a mais importante, a

permeabilidade que faz com que ele possa ser utilizado como um sistema de

liberao de frmacos (Gehrke &Lee, 1990).

Os hidrogis podem ser impermeveis, semipermeveis e totalmente

permeveis em relao a um soluto. Sua permeabilidade pode ser alterada em

relao ao tempo ou devido resposta a um estmulo externo (Gehrke & Lee,

1990).

A capacidade de intumescimento de um hidrogel tambm pode ser

interferida por um estmulo externo. Assim, nos ltimos 30 anos houve um grande

interesse no desenvolvimento dos hidrogis que respondem a estmulos do

ambiente. O uso de hidrogis inteligentes tem sido proposto, principalmente pelo

fato desses gis absorverem uma grande quantidade de gua, de possurem uma

natureza elstica similar a de tecidos naturais, por apresentarem

biocompatibilidade e, principalmente, por terem a capacidade de controlar a taxa

de liberao do frmaco em funo de estmulos externos e das condies do

meio em que se encontra. Como algumas manifestaes de doenas alteram

parmetros do organismo tais como pH, temperatura, concentrao de

substncias e etc., esses hidrogis tm a capacidade de alterar a cintica de

liberao do frmaco de acordo com essas mudanas (Langer & Peppas, 2003).

39

3.6 Citotoxicidade

A biocompatibilidade pode ser definida como a capacidade de um

material funcionar com uma resposta apropriada do hospedeiro em uma aplicao

especfica (Williams, 1986). Esta resposta apropriada, na maioria dos casos,

significa que um sistema vivo na presena de tal material no apresenta resposta

adversa. O material no pode ser afetado pelo meio fisiolgico, e os tecidos locais

e remotos no podem sofrer danos pela presena deste material (Ratner, 1996).

A seleo e avaliao de qualquer material ou dispositivo com inteno

de uso em humanos requer um programa estruturado de avaliao. Num

processo descrito, deve ser feita uma descrio informada que pesa as vantagens

e desvantagens dos vrios materiais e escolhas de procedimentos de testes. Para

se ter segurana de que o produto final ir realizar/efetuar como desejado e ser

seguro para uso humano, o programa dever incluir uma avaliao biolgica (ISO

10993-1, 2003).

A caracterizao de materiais biocompatveis implica na

obrigatoriedade do teste de citotoxicidade. A toxicidade de um material pode ser

avaliada por testes in vitro, em animais de experimentao, incluindo testes de

uso, e por estudos clnicos em seres humanos (ISO 10993-5, 1992).

Os testes in vitro minimizam o uso de animais em pesquisa. Eles so

normalmente efetuados como um teste de triagem inicial na primeira fase de

avaliao da biocompatibilidade. Eles avaliam os danos causados pelo material

s clulas, fornecendo dados rpidos e de baixo custo. Dentre os vrios testes de

toxicidade para biomateriais, o teste de citotoxicidade o mais sensvel e sua

sensibilidade depende da linhagem celular, do tipo de aplicao dos materiais no

teste e da interpretao da resposta celular (ISO 10993-5, 1992).

O teste de citotoxicidade uma tcnica que utiliza cultura celular e

determina a lise das clulas (morte celular), inibio do crescimento celular e

outros efeitos, causados pelos dispositivos, materiais e/ou seus extratos (ISO,

1992). Este teste consiste em colocar o material direta ou indiretamente em

contato com uma cultura de clulas de mamferos, verificando-se as alteraes

celulares por diferentes mecanismos, entre os quais a incorporao de corantes

vitais ou a inibio da formao de colnias celulares (ISO 10993-5, 1992).

Uma das tcnicas mais utilizadas para verificar a toxicidade de um

material a de Incorporao do Vermelho Neutro (Ciapetti et. al., 1996). Esta

40

tcnica foi descrita inicialmente por Finter (1969) e consiste em avaliar a

toxicidade por meio da viabilidade celular pela medida da quantidade do corante

vermelho neutro incorporado nas clulas vivas.

3.7 Citoestimulao de fibroblastos e produo de colgeno

A principal clula envolvida no processo de regenerao cutnea o

fibroblasto. Com estmulos adequados, durante a reparao tecidual, os fibrcitos

(forma inativa da clula) revertem para o estado de fibroblastos (forma ativa da

clula) reativando a capacidade de sntese de colgeno e elastina (Junqueira &

Carneiro, 2008).

A sntese de colgeno um processo bioqumico complexo que ainda

no totalmente conhecido. Os fibroblastos que se encontram no tecido

lesionado, durante o processo de regenerao tecidual, so caracterizados por

possurem uma alta produo de colgeno e sintetizar espontaneamente xido

ntrico (NO), o que no ocorre com os fibroblastos que no esto em locais com

leso (Witte et al., 2002).

O NO produzido em condies inflamatrias e constitui um

importante mediador em diversos processos biolgicos. Ele produzido a partir

da L-arginina por uma reao mediada pela enzima NO-sintetase (Dusse, et. al.,

2003). Esta enzima possui trs isoformas, sendo uma delas a NO-sintetase

induzvel (iNOS) em que sua expresso est diretamente relacionada a processos

inflamatrios na pele. A expresso da iNOS no est restrita somente em clulas

do sistema imune como os macrfagos, ela tambm expressa em fibroblastos.

(Frank et. al., 2002).

A L-arginina produzida em situaes de stress como traumas,

ferimento, queimadura, etc. Este aminocido pode ser metabolizado via NO-

sintetase produzindo NO ou via arginase produzindo ornitina e uria (Witte et al.,

2002).

A ornitina precursora das poliaminas e prolinas (Lehninger, 1995). As

poliaminas so bases orgnicas alifticas, pertencentes ao grupo das aminas

bioativas, so encontradas em quase todas as clulas e desempenham diversas

atividades biolgicas (Lima & Glria, 1999). J a prolina essencial para a

formao da fibra colgena devido ser a precursora do colgeno tipo III (Gimnez

et. al., 2005).

41

As poliaminas so essenciais para a citoestimulao celular, ou seja, a

proliferao das clulas fibroblsticas (Witte et al., 2002), devido estarem

envolvidas em quase todas as etapas de sntese do DNA, RNA e protenas.

Sendo assim, as poliaminas so indispensveis as clulas vivas por estarem

diretamente envolvidas com o crescimento e renovao celular (Bardcz, 1995) e

principalmente em tecidos com alta demanda celular como na cicatrizao de

feridas (Kalac & Krausov, 2005), para que haja um maior nmero de clulas

fibroblsticas e uma maior produo de colgeno.

42

4 MATERIAIS E MTODOS

4.1 MATERIAIS

4.1.1 Matria prima utilizada para sntese das matrizes polimricas

Poli(N-vinil-pirrolidona) (PVP) K 90, Kollidon 90F, massa molar mdia

1000000 1500000 proveniente da BASF, poli(etileno glicol) (PEG 300) da

Oxiteno, gar tipo tcnico n 3 da Oxoid e poli(vinil lcool) (PVA), Celvol E47/88,

grau de hidrlise 87-89%, ponto de fuso de 180oC, temperatura de transio

vtrea de 58C, proveniente da Dermet Agekem.

4.1.2 Princpio ativo

ArctAlg um extrato de algas de colorao amarela fornecido pela

Exymol. Possui cerca de 7,5% de resduo seco, sendo cerca de 7% de dipeptdeo

citrulil-arginina, 0,15% de aminocido taurina, 0,9% de floridosdeo, 0,14% de

metil parabeno sdico e sais minerais.

4.2 MTODOS

4.2.1 Obteno das matrizes de hidrogel

Foram utilizadas duas formulaes para a obteno das matrizes de

hidrogel. Os componentes e suas concentraes esto descritos na TAB. 3.

43

TABELA 3. Descrio da formulao das membranas de PVP e PVA.

Para sntese do hidrogel de PVP foram misturados primeiramente o

PVP K90, o PEG 300 e a gua destilada, deixando durante 24h em temperatura

ambiente. Aps este perodo a mistura foi aquecida e adicionou-se o gar,

mantendo-se em aquecimento at a completa dissoluo dos componentes. O

hidrogel de PVA foi sintetizado a partir da mistura de PVA e gua destilada com

aquecimento at a dissoluo do PVA. Posteriormente foi adicionado o gar e

manteve-se o aquecimento at dissoluo total dos componentes.

As membranas de hidrogel foram preparadas vertendo-se 5 mL da

soluo resfriada a aproximadamente 40C em moldes circulares de 5 cm de

dimetro e 0,2 cm de espessura, as quais, aps resfriamento, foram seladas,

embaladas adequadamente e enviadas para irradiao em uma fonte de raios

gama de Co-60. As membranas de PVP foram irradiadas na dose de 25 kGy e as

membranas de PVA na dose de 20 kGy.

4.2.2 Caracterizao da matriz de hidrogel

As matrizes de hidrogel de PVP e PVA foram submetidas aos

seguintes ensaios:

4.2.2.1 Frao Gel

As amostras de membranas de hidrogel foram secas em estufa na

temperatura de 60C at peso constante. Aps a secagem, cada amostra com

cerca de 0,15 g cada, em triplicata, foi acondicionada em saquinho de tecido non

MATRIZ COMPOSIO CONCENTRAO (%)

PVP K90 6,0

PVP PEG 300 1,5

GAR 0,5

GUA DESTILADA 92,0

PVA PVA 8

GAR 1

GUA DESTILADA 91

44

woven e colocadas para remoo da frao solvel, por 36h, no extrator Soxhlet

(FIG. 12), utilizando como solvente a gua. Decorrido este tempo as amostras

foram novamente secas em estufa na temperatura de 60 C at atingirem peso

constante.

FIGURA 12. Extrator Soxhlet

O clculo da frao gel foi realizado pelas Equaes 1 e 2 de acordo

com a norma ASTM D 2765 (ASTM, 2001).

Fs = ( mi mf) / mi x 100 (1)

FG = 100% - Fs (2)

Onde: mi = massa inicial da amostra

mf = massa de gel seco

Fs = frao solvel

FG = frao gel

4.2.2.2 Intumescimento

As amostras de membranas de hidrogel foram secas em estufa na

temperatura de 60C at peso constante. Cada amostra seca, em triplicata, com

45

cerca de 0,15g foi colocada em frasco contendo 20mL de tampo fosfato salina

(PBS) 0,1M pH = 5,0 e durante um perodo de 24 horas, foi verificada a massa a

cada hora durante as primeiras 6 horas do ensaio e aps 24 horas.

O grau de intumescimento foi calculado utilizando a Equao 3 de

acordo com a norma ASTM D 570 (ASTM, 1998).

I% = (mf mi) / mi x 100 (3)

Onde: I% = grau de intumescimento em porcentagem

mf = massa final em gramas

mi = massa inicial em gramas

4.2.2.3 Propriedades Mecnicas

As propriedades mecnicas das matrizes de hidrogel foram avaliadas

pelo ensaio de trao utilizando-se o texturmetro, modelo TA-TX2i com clula de

carga 25 Kg, da marca Stable Micro System (FIG 13).

FIGURA 13. Texturmetro, modelo TA-TX2i da Stable Micro System

Foram utilizados corpos de prova retangulares (2,4 x 10 cm) fixados em

probes roller grips (modelo A/TGT). No ensaio as amostras foram tracionadas a

uma velocidade de 0,8 mm/s, partindo-se de uma distncia inicial (lo) de 60mm,

at a ruptura. Este ensaio seguiu a norma ASTM D882-95 (ASTM,1995) e

46

metodologia encontrada na literatura (Carvalho e Grosso, 2006) com algumas

alteraes.

4.2.2.4 Citotoxicidade

O ensaio in vitro de citotoxicidade das matrizes de hidrogel foi realizado

utilizando-se a tcnica de Incorporao do Vermelho Neutro seguindo normas

internacionais (ISO 10993-1, 10993-5 1992) e metodologia publicada

anteriormente (Rogero, et. al., 2003). Os extratos das amostras das membranas

de hidrogel e do controle negativo foram preparados pela imerso dos mesmos

em meio mnimo de Eagle (MEM) e incubados em estufa durante 24h a 37C. Foi

utilizado 1/8 de cada membrana de hidrogel, equivalente a 4,5cm2 em 9mL de

MEM, ou seja, 0,5cm2/mL. Como controle negativo foi utilizado pellets de PVC

(policloreto de vinila) atxico (1cm2/mL) e como controle positivo soluo de fenol

0,02%. Aps este perodo, foram feitas diluies seriadas (100, 50, 25, 12,5 e

6,25%) dos extratos obtidos das amostras e do controle negativo assim como da

soluo de fenol. Em seguida, 200 L de cada diluio dos extratos e dos

controles, em triplicata, foram colocados em contato com uma cultura de clulas

de tecido conectivo de camundongo, a linhagem NCTC clone 929 do ATCC

(American Type Culture Collection), cultivadas em microplaca de 96 poos (FIG.

14). A microplaca preparada foi colocada a 37C por 24h em estufa incubadora de

CO2, modelo CB150, marca Binder, com atmosfera mida e 5% de CO2. O cultivo

das clulas e a distribuio da suspenso celular na microplaca foram realizados

na Seo de Culturas Celulares do Instituto Adolfo Lutz.

Esta primeira etapa do ensaio foi realizada em capela de fluxo laminar

utilizando tcnicas asspticas e todo material estril.

Aps 24h, a microplaca foi retirada da estufa e os extratos foram

substitudos por 200 L de soluo do corante vermelho neutro e incubada

novamente a 37C por 3h para incorporao do corante nas clulas. Decorrido

este perodo o corante foi desprezado e a microplaca lavada com soluo tampo

fosfato pH 7,4 e posteriormente com soluo de lavagem (1% de CaCl2 10% em

soluo de formaldedo 0,5%). Aps a lavagem os poos da microplaca foram

preenchidos com 200 L de soluo de extrao (50% de cido actico 2% e

etanol 50%) para a lise das clulas vivas e liberao do corante.

47

FIGURA 14. Esquema da distribuio dos extratos das amostras e controle na

microplaca. Legenda:

Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4

Controle de clulas Controle negativo Controle positivo

A leitura da microplaca foi realizada em espectrofotmetro, leitora

ELISA modelo Sunrise da Tecan, em 540 nm. Com as densidades ticas (DO)

obtidas foram feitos clculos da porcentagem de viabilidade celular tomando-se

como referncia a DO do controle de clulas no ensaio.

O potencial txico foi determinado quantitativamente pelo ndice de

citotoxicidade (IC50%) encontrado no grfico obtido. O IC50% a concentrao de

extrato que provoca a morte de metade da populao celular do ensaio.

4.2.3 Preparo do dispositivo de hidrogel

Primeiramente foi feito um estudo do princpio ativo para avaliar sua

atividade citoestimulante e verificar a sua integridade frente radiao ionizante.

4.2.3.1 Citoestimulao

A atividade citoestimulante do ArctAlg foi verificada no ensaio in vitro

de citoestimulao utilizando o mtodo de incorporao do corante vermelho

neutro de acordo com a metodologia encontrada na literatura (Christophe, 2006).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

B 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50%

C 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25%

D

12,5%

12,5%

12,5%

12,5%

12,5%

12,5%

12,5%

12,5%

12,5%

12,5%

12,5%

12,5%

E 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25% 6,25%

F MEM MEM 100% 50% 25% 12,5% 6,25% 100% 50% 25% 12,5% 6,25%

G MEM MEM 100% 50% 25% 12,5% 6,25% 100% 50% 25% 12,5% 6,25%

H MEM MEM 100% 50% 25% 12,5% 6,25% 100% 50% 25% 12,5% 6,25%

48

Essa metodologia requereu como primeira etapa a verificao da faixa

de concentrao do princpio ativo ArctAlg a ser utilizada, em que foi

estabelecida no ensaio de citotoxicidade.

Posteriormente, foram realizados vrios ensaios de citoestimulao

(cerca de 18) para padronizao da quantidade ideal de clulas, tipo de meio de

cultura com a quantidade adequada de Soro Fetal Bovino (SFB), tempo de

incubao e concentrao do princpio ativo.

As concentraes de princpio ativo utilizadas nestes ensaios foram de

2, 1, 0,5 e 0,25%. Estas concentraes foram determinadas de acordo com o

ensaio de citotoxicidade do ArctAlg realizado previamente, em que o resultado

obtido mostrou que as concentraes abaixo de 2,5% do princpio ativo eram

atxicas.

Em seguida, foram realizados alguns ensaios com clulas fibroblsticas

de pele de coelho, linhagem celular FPC IAL para padronizar o nmero de

clulas/mL que iria conter na suspenso celular que seria utilizada para preparar

a microplaca. No primeiro ensaio foi utilizada uma microplaca que foi preparada

com uma suspenso de 200.000 clulas/mL, sendo que duas fileiras da

microplaca foram cultivadas com MEM e L-15 (v/v) mais 5% SFB como controle

do ensaio; outras duas fileiras com MEM e L-15 (v/v) mais 10% SFB, meio que

proporciona condio nutricional total e nas outras fileiras foi colocado as

diferentes concentraes do ArctAlg com o MEM e L-15 (v/v) mais 5% SFB.

Neste ensaio a microplaca foi incubada durante 24h e depois feito a leitura da DO.

O resultado obtido foi que a viabilidade celular deste ensaio, em todas as

condies nutricionais das clulas, foi semelhante e elevada, no havendo

diferena significativa entre as clulas que se encontravam em condio restrita

de nutrio com as que estavam com o princpio ativo ou em condio de nutrio

total (Apndice A). Portanto decidiu-se diminuir a quantidade do nmero de

clulas/mL para o prximo ensaio.

Outros 4 ensaios foram realizados, iguais ao descrito anteriormente,

onde foi alterado somente o nmero de clulas/mL. Foram testadas suspenses

de 180.000 clulas/mL, 150.000 clulas/mL e 100.000 clulas/mL, sendo este

ltimo realizado em duplicata. O melhor resultado encontrado foi com a

suspenso celular de 100.000 clulas/mL, mas mesmo assim no foi muito

49

satisfatrio devido a viabilidade celular do controle do ensaio ainda estar elevada

(Apndice B).

Aps a padronizao do nmero de clulas/mL foram realizados os

ensaios para padronizar a concentrao adequada de SFB e tambm verificar se

o L-15 interferia no crescimento celular. Para tanto, foi realizado um ensaio

utilizando uma microplaca preparada com uma suspenso de 100.000 clulas/mL

cultivadas com MEM e as concentraes de 15, 10, 5 e 2% de SFB. A microplaca

foi incubada durante 24h e aps trmino do ensaio feito a leitura da DO (Apndice

C). Neste ensaio pode-se observar que houve um aumento da viabilidade celular

nas concentraes de 10 e 15% de SFB, mas no houve uma diferena

significativa do crescimento celular entre essas concentraes. J as clulas que

estavam em contato com 5% de SFB apresentaram um pequeno crescimento e

as que estavam com 2% mantiveram-se sem crescimento. Este mesmo ensaio foi

repetido utilizando MEM e L-15 (v/v) junto com o SFB para verificar se no havia

alterao no crescimento das clulas (Apndice D). O resultado obtido neste

ensaio foi semelhante ao obtido quando se utilizou somente o soro fetal bovino.

Sendo assim, foi determinado utilizar o meio de cultura MEM e L-15 (v/v) com 2%

SFB para o controle do ensaio de citoestimulao e o MEM e L-15 (v/v) com 10%

SFB como o meio de cultura com condio total de nutrio.

Tendo a padronizao da suspenso celular de 100.000 cls/mL e das

concentraes de SFB (2 e 10%), foram realizados os ensaios com o ArctAlg.

No primeiro ensaio foi utilizada apenas uma microplaca, contendo o meio de

condio total de nutrio (MEM e L-15 (v/v) com 10% SFB), o meio com dficit

de nutrio (MEM e L-15 (v/v) com 2% SFB), ou seja, o controle do ensaio, e o

princpio ativo em diferentes concentraes (2; 1; 0,5 e 0,25%) sendo esta

diluio seriada feita em meio MEM e L-15 (v/v) mais 2% SFB. A microplaca foi

incubada durante 24h e aps finalizar o ensaio feito a leitura da DO (Apndice E).

Neste ensaio, ainda no foi possvel observar um crescimento significativo das

clulas em contato com o princpio ativo. Tentou-se, portanto aumentar a

incubao da microplaca para 48h.

No ensaio realizado com 48h de incubao o resultado mostrou que

houve aumento no nmero das clulas que estavam em contato com o ArctAlg.

Este ensaio foi repetido, mas o resultado no foi reprodutvel (Apndice F).

Portanto, decidiu-se trabalhar com micro

estudo da incorporação e liberação de um extrato de algas

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