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Biofar, Rev. Biol. Farm. Campina Grande/PB, v. 9, n. 1, p. 13-17, maro/maio, 2013

Revista de Biologia e Farmcia. Universidade Estadual da Paraba. Centro de Cincias Biolgicas e da Sade.

Departamento de Biologia. Av. Juvncio Arruda, s/n, Bodocong, Campina Grande, PB, BRASIL. Cep: 58.109-753. E-mail: biofar@uepb.edu.br ou biofar.uepb@gmail.com

ESTUDO COMPARATIVO DE DOIS MTODOS DE EXTRAO DE DNA GENMICO

DO PEQUI (Caryocar coriaceum Wittm.)

Isaac Farias Cansano1, Henrique Douglas Melo Coutinho

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RESUMO - Caryocar coriaceum Wittm. (pequi) uma espcie abundante Floresta Nacional do

Araripe (FLONA). O fruto apresenta altas concentraes de vitaminas A, B1, B2, C e E, leo e

protenas, alm de propriedades amplamente utilizadas na medicina popular. Este trabalho visou

comparar dois protocolos de extrao de DNA. No primeiro procedimento, o isolamento do DNA

foi realizado com a macerao de folhas jovens utilizando o N2 lquido por meio do CTAB 2%.

Para o segundo protocolo, folhas jovens foram submetidas a uma macerao em liquidificador

domstico utilizando tampo de extrao com propores especficas para sua homogeneizao.

Estas amostras foram quantificadas e analisadas quanto quantidade do DNA obtido. Uma maior

concentrao de DNA foi observada nas amostras extradas por macerao mecnica. A partir

destes dados obtidos, o procedimento dois demonstrou ser mais simples e de menor custo,

favorecendo assim seu uso laboratorial.

Unitermos: genmico, espectrofotometria, lise mecnica, CTAB.

COMPARISON BETWEEN TWO METHODS OF GENOMIC DNA EXTRACTION FROM

PEQUI (Caryocar coriaceum Wittm.)

ABSTRACT - Caryocar coriaceum Wittm. (pequi) is a common plant found on the National Forest

of Araripe (FLONA). The fruit presents a high content of vitamins A, B1, B2, C and E; fixed oil

and proteins, being also used on the folk medicine due its biological activities. The aim of this work

was compare two different protocols of DNA extraction. On the protocol 1, the DNA was isolated

from young leaves macerated using liquid nitrogen and CTAB 2%. On the protocol 2, the same

kinds of leaves were disrupted using a domestic blender for a mechanical lysis and homogenized

with extraction buffer. The two samples were quantified and analyzed to verify the DNA quality.

Best quality and higher concentrations of DNA were observed from the protocol 2. Due this results,

the protocol 2 shows to combine low costs and simplicity, being a possible method to be used on

laboratories and as didactic resource on the schools.

Uniterms: genomic, spectrophotometry, mechanical lysis, CTAB.

INTRODUO

O gnero Caryocar autctone e ocorrente em diversas regies do Brasil (Macedo, 2005).

Algumas espcies so encontradas em savanas, vegetao semelhante ao cerrado Brasileiro, estando

presente desde a Costa Rica at o Paraguai (Franco et al., 2004). Caryocar coriaceum Wittm.

1 Bilogo, Mestre em Gentica, Universidade Federal do Vale do So Francisco - UNIVASF, Departamento de Cincias da Natureza, So Raimundo Nonato PI, Brasil (isaac.farias@gmail.com); 2 Bilogo, Doutor em Farmacologia, Universidade Regional do Cariri - URCA, Departamento de Qumica Biolgica, Crato CE, Brasil (hdmcoutinho@gmail.com ). * Endereo para correspondncia: Henrique D.M. Coutinho: Universidade Regional do Cariri - URCA; Centro de

Cincias Biolgicas e da Sade - CCBS; Departamento de Qumica Biolgica; Laboratrio de Microbiologia e Biologia

Molecular LMBM. 63105-000. Crato, CE Brasil. Fone: +55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E Mail: hdmcoutinho@gmail.com

Recebido em 20/01/2013 - Aceite para publicao em 27/02/2013

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(Pequi), uma espcie bem representada do nordeste Brasileiro. Madeira, casca, polpa, folhas e

amndoas so empregados para as mais diversas finalidades pelas comunidades tradicionais

(Oliveira, 1988; 2009).

A literatura disponvel existente retrata que C. coriaceum foi objetivo de trabalhos de anlise

morfolgica, fsica e qumica dos seus frutos bem como suas propriedades medicinais, inexistindo

pesquisas genticas at o momento (Saraiva et al., 2008; Oliveira, 2009). O estudo molecular frente

a espcies nativas de grande importncia, principalmente em estudos visando o auxlio em

programas de melhoramento gentico, uma vez que este tipo de planta naturalmente propaga-se por

sementes, apresentando grande heterogeneidade em suas caractersticas (Silva; Medeiros Filho,

2006; Vera et al., 2007).

Entretanto, dependendo da espcie em questo e das condies laboratoriais, so necessrias

algumas modificaes e adaptaes nos protocolos para a obteno de padres qualitativos e

quantitativos de DNA. Estas adequaes acontecem porque algumas plantas apresentam altos nveis

de polifenis e presena de mucilagens foliares que dificultam a extrao e amplificao de cidos

nuclicos, necessitando assim de uma otimizao que facilite a operacionalizao da tcnica de

extrao (Ferreira; Grattapaglia, 1995). Diante deste fato, pretende-se conhecer o nvel de

Diversidade Gentica do pequizeiro (Caryocar coriaceum Wittm.) na Biorregio do Araripe, onde

um dos objetivos especficos foi testar e analisar dois protocolos de extrao de DNA [mtodo

CTAB e SDS via liquidificador] para uma melhor padronizao e otimizao do DNA dessa espcie

na regio em destaque.

MATERIAIS E MTODOS

Material vegetal

Folhas jovens foram colhidas em reas preservadas da Reserva Florestal do Araripe. Estas

foram estocadas em sacos plsticos, etiquetados e armazenados em recipientes isolantes a 0C e

posteriormente foram armazenadas em freezer a -20o C at a extrao do DNA. Os protocolos

adotados so bastante utilizados e consistentes em estudos genticos direcionado a plantas, bem

como acompanhados com as devidas adaptaes necessrias de padronizao.

Extrao de DNA usando o protocolo CTAB

O isolamento do DNA genmico foi feito usando 0,5g de folhas jovens para cada amostra de

pequi seguindo protocolo descrito por Doyle e Doyle (1990), com modificaes. As amostras foram

maceradas na presena de N2 lquido, sendo ento transferidas para tubos contendo 6 mL de CATB

2% (brometo de Cetil-Trimetilamnio; Tris-HCl; EDTA) previamente incubados a 65 C durante

1h. Em seguida, foi feita uma lavagem com clorofrmio/lcool isoamlico (1 mL) com proporo de

24:1 e centrifugada a 2500 rpm por 15 minutos temperatura ambiente. Recuperada a fase superior

de cada tubo, estes foram conduzidos para tubos autoclavados, adicionando-se dois teros de

volume de isopropanol e deixados em temperatura ambiente por 12h. Na sequncia, foram

centrifugados a 1500 rpm por 3 minutos. Posteriormente, foram adicionados dois volumes de NaCl

(1M), mantendo os tubos em soluo por 10 minutos e 2,5 volumes de Etanol 100%, seguido de

centrifugao a 1500 rpm por 3 minutos para a precipitao do DNA. Aps a retirada do

sobrenadante, o DNA foi seco e adicionado ao pellet dois volumes de T.E. para ressuspender o

DNA. As amostras foram armazenadas a 4C, preservando o material at a quantificao.

Extrao de DNA usando o protocolo SDS via liquidificador

Seguindo o protocolo de Milach (1998) com modificaes. Foi preparada uma soluo com

250 ml de Tampo de Extrao (NaCl 5M: 25 mL, Tris-HCl 1M: 25 mL, EDTA 0,25 M: 50 mL,

SDS 20%: 15,62 mL, gua destilada e estril: 134,38 mL). Com isso, 10 g de folhas jovens foram

adicionadas em um liquidificador domstico junto com o tampo de extrao, a fim de ocorra a

marcerao. Aps 10 minutos, a soluo foi depositada em um Becker de 500 ml e incubada a 65

C durante 30 minutos. A soluo foi distribuda em 10 microtubos de 2 mL, colocando-os no

banho-maria para manter o extrato ressuspendido. Em torno de 10 minutos, os tubos foram retirados

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e adicionado um volume (650 l) de clorofrmio/lcool isoamlico (24:1) em cada tubo, e

misturados cuidadosamente por inverso por 10 minutos, centrifugando-os a 5000 rpm por 15

minutos. Os sobrenadantes foram removidos e repassados para tubos estreis, repetindo-se este

procedimento por duas vezes. Na sequncia, estas amostras foram colocadas no refrigerador a 4C e

logo aps 2 horas foram centrifugadas a 10000 rpm por 15 minutos. Novamente os sobrenadantes

foram removidos, e distribudos em novos microtubos, ressuspendendo com gua ultrapura, sendo

ento armazenados e acondicionados em refrigerador a -20C at o momento da anlise de

quantificao destes materiais.

Anlise do DNA extrado por eletroforese em gel de agarose

A observao do DNA no primeiro protocolo foi realizada em gel de agarose a 1,5%,

utilizando um mix de 5 l de DNA e 5 l de corante de corrida (xileno cianol, azul de bromofenol e sacarose), a 80 V/cm durante 1h e analisado em transiluminador. O segundo protocolo foi feito por

anlise em gel de agarose a 1,5%, numa reao de 4L de DNA (amostra) e 15L de corante de

corrida (glicerol, T.E. e azul de bromofenol), a 80 v por 1h e analisado em transiluminador. O DNA

de seis amostras foi quantificado por espectrofotometria a 260nm e sua pureza analisada pela

relao 260/280nm para os dois protocolos citados.

RESULTADOS E DISCUSSO

Foram detectadas diferenas nos dois protocolos utilizados. O protocolo 1 (Doyle; Doyle,

1990 com modificaes) no foi to eficiente para a extrao de DNA de Caryocar coriaceum

Wittm. No foi encontrado material gentico nas amostras 05 e 06 utilizadas neste procedimento

(Tabela 1).

A partir do protocolo 2 (Milach, 1998 com modificaes) foi possvel extrair uma

quantidade maior de DNA. Este protocolo decorreu de modificaes nas etapas de extrao e

centrifugao, facilitando a obteno de materiais com melhor qualidade e quantidade do que foi

encontrado no protocolo anterior e com pequenas parcelas de contaminantes.

Os testes qualitativos e quantitativos de DNA foram realizados pelo espectrofotmetro

(FEMTO 800 XI) nas seis amostras. A concentrao de DNA foi tambm estimada em relao sua

pureza, de acordo com Sambrook et al. (2001).

As amostras do procedimento 1 perfizeram valores de 260 nm entre 0,033 e 0,085, e de

280 nm entre 0,037 e 0,078. Nas amostras do protocolo 2, os valores encontrados de 260 nm foram

entre 0,242 e 0,306, e de 280 nm entre 0,197 e 0,263. A relao A260/280 perfez valores entre 0,89

e 1,35 bem como entre 1,12 e 1,40, respectivamente.

Tabela 1 - Quantificao e anlise de pureza de seis amostras de DNA extrado de Caryocar

coriaceum Wittm. a partir de tecido foliar, obtidas pelo mtodo CTAB e SDS, utilizando leituras de

absorbncia de 260 nm e 280 nm.

Amostras CTAB SDS

A260 A280 A260/280 [DNA]ng/

L

A260 A280 A260/280 [DNA]ng/L

01 0,085 0,063 1,35 425,00 0,295 0,262 1,12 1475,00

02 0,075 0,078 0,96 325,00 0,242 0,197 1,23 1210,00

03 0,033 0,037 0,89 95,00 0,299 0,252 1,19 1495,00

04 0,058 0,047 1,23 290,00 0,272 0,216 1,26 1360,00

05 - - - - 0,306 0,263 1,16 1530,00

06 - - - - 0,291 0,207 1,40 1455,00

Segundo Weising et al. (2004) e Kotchoni e Gachomo (2009), o mtodo CTAB tem sido

muito utilizado para extrao em tecidos frescos e diversos protocolos tm sido desenvolvidos para

este fim em todo o mundo. Entretanto, para extrao de DNA de C. coriaceum Wittm., alguns

procedimentos podem ter favorecido a presena de compostos que ajudam a degradar o DNA no

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momento da extrao, como polissacardeos e compostos fenlicos, detentores de grande presena

nos vegetais e que possuem um amplo efeito oxidativo nos constituintes celulares.

Entretanto, no outro protocolo utilizando SDS, diversos autores evidenciaram uma boa

eficincia no isolamento do DNA para estudos de variabilidade gentica, sendo tambm bastante

significativo na utilizao deste material gentico em programas de melhoramento gentico de

espcies agroindustriais (Figueira et al., 1992; Ahmed et al., 2009). Embora o mtodo utilizado com

xito tenha sido realizado de forma rudimentar, este procedimento garantiu o isolamento do DNA

em maior quantidade, com melhor pureza e com menor custo, ainda que seja preciso alguns ajustes

a fim de que resulte em um material gentico sem contaminantes.

Diferentes mtodos de extrao de DNA surgiram nas ltimas dcadas, na sua maioria

utilizando o nitrognio lquido (Kotchoni; Gachomo, 2009), ou em menores propores, fazendo

uso da liofilizao (Sperisen et al., 2000) ou at raspa de vidro (Huang et al., 2002). O intuito de

macerar o tecido foliar facilitar a separao e o isolamento do material gentico, servindo como de

ponto de partida para diversos estudos genticos, como seleo assistida por marcadores

moleculares ou mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Loci) (Ferreira; Grattapaglia, 1995).

De acordo com Faleiro et al. (1996), a integridade do DNA de fundamental importncia

para uma boa reprodutibilidade de produtos amplificadores assistidos por marcadores moleculares.

Entretanto, dependendo da quantidade presente de contaminantes no material, o uso destes cidos

nuclicos no inviabiliza a obteno de padres ntidos e reprodutveis por meio da PCR. O

procedimento utilizado via liquidificador pioneiro em tcnicas de isolamento de materiais

genticos, podendo ento ser empregado, mesmo de forma to simples, em diversas finalidades

cientficas como, por exemplo, em estudos de diversidade gentica intra e interespecfica, embora

os resultados de outros autores tenham sido relatados at o momento utilizando outros meios de

macerao mecnica (Faleiro et al., 2008).

Este mtodo pode tambm ser favorvel em centros universitrios ou instituies de

ensino de regies longnquas, onde possuem dificuldades de obter nitrognio lquido, e com isso a

tcnica de extrao de cidos nuclicos possa est mais presente em aulas prticas de biologia ou

projetos de pesquisa e extenso, auxiliando assim o entendimento da parte terica disciplinar. Entre

os protocolos testados neste trabalho, o que apresentou melhor resultado foi o de Milach (1998) via

liquidificador/SDS, modificado para se adaptar Caryocar coriaceum Wittm., obtendo uma

qualidade e quantidade superior em relao ao outro procedimento.

Este trabalho pode representar um importante passo para o estudo da espcie vegetal

nativa, uma vez que pioneiro na rea da gentica de plantas na regio, o que auxiliar na execuo

de um protocolo com menor custo, ampliando a aplicabilidade deste procedimento para outras

espcies nativas da Chapada do Araripe.

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