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Universidade AgrícolaUppsala - Suécia

Julho - 2003

ENZIMAS

W.J.Melo

W.J.Melo

Cinética Enzimática

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

!Como avaliar?

!Realiza-se experimento com as seguintes características:#A varios tubos de ensaio, colocam-se a mesma concen-

tração da enzima em estudo.#Adiciona-se, a cada tubo, uma concentração diferente

do substrato, partindo-se de um tubo em que não se co-loca subs trato (testemunha ou branco).

#Incuba-se por um certo tempo em um pH e uma tempe-ratura ideal.

#Mede-se a quantidade de produto formado ou a de subs-trato que sobrou.

#Com os resultados obtidos, elabora-se um gráfico emsistema cartesiano.

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CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

T1 T2 T3 T4 T5

EnzimaTampão

adicionar substrato

H2O S1 S2 S3 S4

Substrato

incubarTemperaturaTempo t

Medir Substratoou

ProdutoGRÁFICO

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Vmax

Vmax2

KM

W.J.Melo

II I I

-

-

-

concentração do substrato

20

0

40

60

0 32 64 12896

ATIVIDADE DA UREASE NO SOLOEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

Longo & Melo (2005)

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CINÉTICA ENZIMÁTICA - CONCEITOS

!Equação de Michaelis-Mentem#Equação que descreve a velocidade de uma reação en-

zimatica em função da concentraçao do substrato.

!Velocidade máxima#Qantidade máxima de produto formado por unidade

de tempo e por unidade de enzima nas mesmas con-dições experimentais.

!Constante de Michaelis (KM)#Concentração de substrato que determina que a veloci-

dade de uma ração enzimática ocorra com a metade davelocidade máxima.

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#Equação de Michaelis-Menten

� A velocidade de reação das enzimas não alos-téricas segue a equação de Michaelis-Menten

� A velocidade da reação em um ponto qualqueré dada pela equação

V=Vmax S

KM + S

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A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN

!V= velocidade da reação

!Vmax= velocidade máxima da reação

!S= concentração do substrato

!KM= constante de Michael#Indica a concentração do substrato que deter-mina que

a velocidade da reção seja a metade da velocidade máxima.#Reflete a afinidade entre a enzima e o substrato

� Quanto menor KM, maior afinidade.

V=Vmax*[S]

KM + [S]

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A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTENINTERPRETAÇÃO

!Para baixas concentrações de substrato, a velocidade da reação aumenta linearmente com o aumento da concentra-ção do substrato.#Esta é uma reação de primeira ordem.

!Para concentrações intermediárias do substrato o aumento da velocidade não é linear com o aumento da concentra-ção do substrato.#Esta é uma reação de segunda ordem.

!Para altas concentrações do substrato, a velocidade da reação não se altera com o aumento da concentração dosubstrato.

� Esta é uma reação de ordem zero

� O sítio ativo está saturado pelo substrato

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A EQUAÇÃO DE LINEWEAVER-BURKE

!Lineweaver e Burke trabalharam com os inversos davelocidade e da concentração do substrato.

!Verificaram que, ao plotarem o inverso da concentra-ção do substrato (eixo x) com o inverso da velocida-de (eixo y), obtinha-se uma equação de reta.

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A EQUAÇÃO DE LINEWEAVER-BURKE

1

Vmax

-

Y=aX + bb= 1/VmaxSe Y=0, X=-1/KM

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EFEITO DA TEMPERATURA

!Efeitos da temperatura#Aumenta a velocidade da reação.#Causa desnaturação da proteína enzimática.#A conjugação dos dois efeitos determina o comporta-

mento da velocidade em função da temperatura.#No caso de enzimas do solo, o efeito é m pouco dife-

rente, devido à proteção dos colóides do solo.

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Temperatura

-

-

-

II I I I I

CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA TEMPERATURA

Vmax

W.J.Melo

--

------

0

10

20

30

40

II I I II I I

10 20 30 40 50 60 70 800

Temperatura (oC)

ATIVIDADE DA UREASE NO SOLOEFEITO DA TEMPERATURA

LVd

LVef

Longo & Melo (2005)W.J.Melo


CINÉTICA ENZIMÁTICA EFEITO DO pH

!Desnaturação da proteína enzimática#Em pH muito baixo ou muito alto, tende a ocorrer a des-

naturação da proteína enzimática, resultando em uma diminuição na atividade catalítica.

!A curva de resposta da velocidade da reação enzimáti-ca tende a assumir a forma de um sino, mas é variável emfunção do tipo de enzima.

!As enzimas do solo apresentam um comportamento dife-rente, em função da interação com os colóides do solo.

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CINÉTICA ENZIMÁTICA EFEITO DO pH

pH

Vmax

W.J.Melo

--

-

-

--

-

II I I II

pH

0

2 -

4

6

8

10

12

14

2,2 3,2 4,2 5,2 6,2 7,2 8,2

LVd

LVef

Longo & Melo (2005) W.J.Melo

ATIVIDADE DA UREASE NO SOLOEFEITO DO pH


CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA

!A velocidade de uma reação enzimática aumenta com oaumento da concentração da enzima.

!Condição#Não haver falta de substrato#As demais condições são as ideais para a atividade da

enzima

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EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA

E

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CINÉTICA ENZIMÁTICAEFEITO DA LUZ

!Algumas enzimas, caso da redutase do nitrato, são sen-síveis à presença da luz.

!Quando isto ocorre, há necessdade de se traba-lhar naausência da luz.

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Enzimas

UNIDADES PARA EXPRESSAR A ATIVIDADEENZIMÁTICA

!Quantidade do substrato ou da enzima#Pode ser expressa em miligrama, micrograma, mol, milimol.#A unidade do SI é o mol.

!Quantidade da enzima#Pode ser expressa em quantidade do material que contém

a enzima (por exemplo g de solo), quantidade de proteí-na, quantidade de enzima, número de moléculas enzimáti-cas.

!Tempo de incubação#Pode ser expresso em horas, minutos ou segundos.

!Deve-se usar unidades do Sistema Internacional (SI).W.J.Melo

Enzimas

UNIDADES PARA EXPRESSAR A ATIVIDADEENZIMÁTICA

!Katal (kat)

#Unidade definida pela EC (Enzyme Comission) em 1961.#É derivada do SI para expressar a atividade catalítica das

enzimas.#Seu uso é recomendado pela Conferência Geral de Pesos

e Medidas (outubro de 1999).#1 kat equivale à transformação de 1 mol do substrato ou

a formação de 1 mol do produto em 1 segundo.

Kat mol/segundo

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Enzimas

FORMAS DE EXPRESSAR A ATIVIDADEENZIMÁTICA

!Unidade Internacional (IU ou U)

#Definida pela International Union of Biochemistry (1964)#Atividade que catalisa a transformação de 1 micromol do

substrato ou a produção de 1 micromol do produto em 1minuto sob condições padrões.

#U - micromol/minuto

1 kat= 6x107 U

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Enzimas


!Atividade específica

#Atividade que representa a massa ou o número de mo-les de substrato transformado ou do produto formado por umidade de enzima ou do material que a contém e por unidade de tempo.

#Exemplo

� Na hidrólise total do amido< Atividade= mg de glicose/g de folha * hora< Atividade= kat/mg folha< Atividade= kat/mg de proteína

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Enzimas


!Atividade molar ou molecular

#É o antigo turnover.#Expressa a quantidade de substrato transformado

ou de produto produzido por molécula de enzimaou por sítio ativo.

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Metabolismo Intermediário de X

X a b c d ... ... YE1 E2 E3 E4 En

X= substrato

Y= produto

a, b, c, d= metabólitos

E1, E2, ... En= enzimas

E1= enzima reguladoraW.J.Melo

Metabolismo

CONCEITOS

!Sistema e ambiente

#Em termodinâmica, sistema é a matéria contida dentrode uma região definida. Ambiente, por seu turno, é a matéria que resta no universo.

!Energia livre

#Símbolo: F ou G#Conceito

� Quantidade de energia existente em um siste-ma.

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Metabolismo

CONCEITOS-ENERGIA LIVRE

!Avaliação#A energia livre de um sistema pode ser avaliada em u-

ma bomba calorimétrica.

!Constância#A energia livre de um sistema é constante (1ª lei da ter-

modinâmica).

!Variação em uma reação química#É a diferença entre a energia dos produtos e dos rea-

gentes, independentemente do caminho seguido.

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Metabolismo

reagente produto

E = Ep - Ei

E = variação de energia do sistema

Ep= energia dos produtos

Ei= energia do substrato inicialW.J.Melo

A B

Metabolismo

CONCEITOS

! Entropia#Símbolo: S#Diz respeito ao grau de organização de um sistema.#Quanto mais desorganizado é um sistema, maior sua

entropia.

!Entalpia#Símbolo: H#Diz respeito ao conteúdo de energia interna de um

sistema.

� A unidade no SI é o J/mol

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Metabolismo

CONCEITOS

!Expontaneidade das reações

#Uma reação somente ocorre expontaneamen-te se a soma das entropias do sistema e do ambiente au-mentar.

#Uma reação em que a entropia do sistema dimi-nui pode ocorrer, desde que a entropia do ambien-te aumente.

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Metabolismo

CONCEITOS

!Energia de ativação

#É a quantidade de energia que se necessita fornecerao substrato para que o mesmo atinja a barreira e-nergética da transformação.

!Reação endergônica

#É a que ocorre com consumo de energia.#A energia do produto é maior que a do substrato.#A variação de energia é positiva.

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Metabolismo

CONCEITOS

!Reação exergônica

#É aquela que ocorre com liberação de energia.#A energia do produto é menor que a do substrato.#A variação de energia é negativa.#A energia liberada pode ser perdida na forma de

calor ou usada para realização de trabalho.

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TIPOS DE REAÇÕES

XEx

Y1aEy1

Ebt

E+

Y2

b

Ey2E-

a= reação endergônica b= reação exergônica W.J.Melo

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