Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

MARGOT ERIKA CARIS

ENVOLVIMENTO DA APRESENTAÇÃO CRUZADA NA DIFERENCIAÇÃO DE

LINFÓCITOS T CD4+ PARA O FENÓTIPO Th1

Rio de Janeiro 2007

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MARGOT ERIKA CARIS

ENVOLVIMENTO DA APRESENTAÇÃO CRUZADA NA DIFERENCIAÇÃO DE

LINFÓCITOS T CD4+ PARA O FENÓTIPO Th1

Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós-graduação do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica)

Orientador: Dr. João Paulo de Biaso Viola

Rio de Janeiro 2007

Caris, Margot Erika,

Envolvimento da Apresentação Cruzada na Diferenciação de Linfócitos T CD4+ para o fenótipo Th1. Margot Erika Caris. Rio de Janeiro, 2007.

Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas - Biofísica), Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2007.

Orientador: D. João Paulo de Biaso Viola

1. Apresentação Cruzada. 2. IFN-γ. 3. Diferenciação de linfócitos T CD4+ – Teses. I.Viola, João Paulo de Biaso. (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. III. Envolvimento da Apresentação Cruzada na Diferenciação de Linfócitos T CD4+ para o fenótipo Th1.

Este trabalho foi desenvolvido na Divisão de Biologia Celular da Coordenação de Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer (INCA) sob a orientação do Dr. João Paulo de Biaso Viola e com o auxílio financeiro da Fundação Ary Frauzino (FAF/INCA), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

AGRADECIMENTOS Ao meu orientador Dr. João Viola, por ter acreditado em mim e pela oportunidade de trabalhar em seu grupo. Nesses anos que tive uma amostra do que é a Ciência! Obrigada pelo exemplo de liderança, dedicação, paciência e ética. Aos meus pais, Marlen e Godfried, pelo amor, educação e dedicação. Obrigada mãe pelo exemplo de determinação e coragem e pai, por ter me ensinado que independente de quão dura a vida possa parecer, temos que aproveitá-la nos pequenos detalhes, vivê-la de forma plena e feliz!! Aos meus irmãos, Ricardo e Marieanne, pelo amor, carinho e brigas de sempre. À minha querida avó Elisabeth, seu apoio, carinho, confiança, amizade e incentivo foram essenciais!!!! Obrigada pelos conselhos, pelas longas conversas e por me conhecer verdadeiramente. Aos meus avós, Luis e Marion, pelo carinho e pela infância maravilhosa que vocês proporcionaram. Aos meus tios, pelo amor, pelo incentivo e pelos momentos inesquecíveis. Aos meus primos pela amizade, cumplicidade e pelas bagunças. Á Elisa, pelas longas conversas em momentos difíceis e à Marcelle, que além das conversas, trouxe mais alegria aos meus finais de semana. Á minha querida tia Tereza, pelas palavras de apoio, pelo carinho e por me mostrar que os sonhos só permanecem sonhos, se não tivermos determinação e garra para transformá-los em realidade. Aos meus amigos de bancada que além da ajuda no dia-a-dia, fazem a vida ser mais divertida. Bianca, pela paciência e ajuda nas longas etapas de purificação. À Giu, pela sua determinação, pela cumplicidade e pela amizade, obrigada por me ouvir. Bruno Robbs, por ter trazido seu bom-humor e por ter enriquecido as discussões científicas. À Lílian e Anita, pela cumplicidade e pela amizade. À Maria Theresa e Cristiane, pela amizade e incentivo. Ao Leo, por acreditar em mim, pela amizade e pelas longas discussões sobre Ciência. À todo o pessoal do laboratório: Nina, André, Bruno, Patrícia e Flávia. Obrigada pelo carinho, pelas discussões científicas e pela convivência.

À minha amiga Bruna, por sua ajuda na bancada, pela cumplicidade no dia-a-dia e principalmente pela amizade!!! Obrigada pelas horas de risos, de choros e pelos momentos divertidos e inesquecíveis!!! Aos amigos da Divisão de Medicina Experimental, especialmente Sheila, Aline, Ana Paula, Luciana, Luiz Gustavo, João Luis e João Paulo, pelo apoio, incentivo e amizade. Aos meus grandes amigos “do outro lado da ponte”. Na realidade, a palavra amigo é pouco para representar o que vocês significam para mim. Apesar dos momentos difíceis, os bons momentos prevalecem e a distância jamais vai mudar o que sinto por vocês. Às amigas do sul, Tânia, Michelle e Graziela. Apesar da distância, a amizade permanece intacta. Obrigada pelo apoio, carinho, amizade, cumplicidade e pela saudade de sempre. Aos meus grandes amigos Roberto, Isabella, Paulinha, Verinha e Elza. Aprendo com vocês a cada dia. Obrigada pelos momentos especiais, pelas experiências trocadas, pelo apoio e pelo carinho. Ao Chris, pelo carinho, respeito, amizade e por me ajudar a encarar a vida de uma forma tranqüila. À todos que me ajudaram a crescer, a construir e a trilhar os caminhos da minha vida.

RESUMO Caris, Margot Erika. Envolvimento da Apresentação Cruzada na Diferenciação de Linfócitos T CD4+ para o Fenótipo Th1. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas – Biofísica)- Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.

Apresentação cruzada é um mecanismo onde as células dendríticas (DCs) podem adquirir, processar e apresentar antígenos exógenos à células T CD8+ através do complexo de histocompatibilidade (MHC) de classe I. A diferenciação de células T CD4+ naives para o fenótipo Th1 é influenciado por citocinas presentes no microambiente onde estas células reconhecem o antígeno, principalmente IL-12 e IFN-γ. As células T CD8+ são excelentes produtoras de IFN-γ, podendo representar uma das fontes iniciais de IFN-γ durante a diferenciação das células T CD4+. No entanto, o papel do IFN-γ produzido pelas células T CD8+ na diferenciação das células T CD4+ não está completamente demonstrado e a participação do mecanismo de apresentação cruzada em modular esta diferenciação também não está estabelecido. Neste estudo, avaliamos a função do IFN-γ produzido por células T CD8+, estimuladas por apresentação cruzada, na diferenciação de células T CD4+ para o fenótipo Th1. Usando um modelo in vitro de co-cultura com DCs e células T CD8+, demonstramos que as células T CD8+, e não as DCs, produzem IFN-γ quando cultivadas com OVA. As células T CD8+ não produziram IFN-γ quando ativadas com DCs de camundongos β2m-/-. A adição do bloqueador de proteossomo MG132, que bloqueia o mecanismo de apresentação cruzada na DC, inibiu a produção de IFN-γ pela célula T CD8+. Juntos, estes resultados sugerem que as células T CD8+ estão sendo ativadas pelo mecanismo de apresentação cruzada neste modelo. Posteriormente, avaliamos a influência das células T CD8+ ativadas pelo mecanismo de apresentação cruzada no processo de diferenciação das células T CD4+. Quando as células T CD4+ foram estimuladas in vitro na presença de células T CD8+ ativadas por apresentação cruzada, e re-estimuladas com anti-CD3, elas produziram altos níveis de IFN-γ e baixos níveis de IL-4. Contudo, quando as células T CD4+ foram estimuladas com células T CD8+ ativadas por DCs de camundongos β2m-/-, ao serem re-estimuladas com anti-CD3, produziram baixos níveis de IFN-γ e altos níveis de IL-4. Nossos resultados sugerem que a apresentação cruzada é capaz de induzir as células T CD8+ a produzir IFN-γ, que pode modular a diferenciação da célula T CD4+ para um fenótipo Th1, e/ou ajudar na consolidação da resposta Th1.

ABSTRACT Caris, Margot Erika. INVOLVEMENT OF CROSS-PRESENTATION IN CD4+ Th1 DIFFERENTIATION. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas – Biofísica)- Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.

Cross-presentation is a process whereby dendritic cells (DCs) can acquire, process and present exogenous antigens to CD8+ T cells through the major histocompatibility complex (MHC) class I. The differentiation of naive CD4+ T cells into the Th1 phenotype is influenced by the cytokines present in the microenvironment where these cells recognize the antigen, mainly influenced by IL-12 and IFN-γ. CD8+ T cells are excellent sources of IFN-γ, and therefore may represent one of the initial sources of IFN-γ during CD4+ Th1 differentiation. However, the real function of the IFN-γ produced by CD8+ T cells in the differentiation of CD4+ T cells is not completely elucidated and the role of the croos-presentation in modulating the differentiation of CD4+ T cells is not completely established. In this study, we evaluated the role of the IFN-γ produced by CD8+ T cells, stimulated by cross-presentation, in the differentiation of CD4+ T cells to the Th1 phenotype. Using an in vitro co-culture system with DCs and CD8+ T cells, we showed that CD8+ T cells, but not DCs, produce IFN-γ when stimulated with OVA. CD8+ T cells were not able to produce IFN-γ when activated in the presence of DCs from β2m-/- mice. Also, MG132 (a proteasome inhibitor), which blocks DC cross-presentation, inhibited IFN-γ production by CD8+ T cells. Together, these results suggested that CD8+ T cells were being activated by a cross-presentation mechanism in this model. We then evaluated the influence of CD8+ T cells activated by cross-presentation on the process of CD4+ T cell differentiation. When naive CD4+ T cells were stimulated in vitro in the presence of CD8+ T cells activated by cross-presentation, and re-stimulated with anti-CD3, they produced high levels of IFN-γ, and low levels of IL-4. However, when naive CD4+ T cells were stimulated with CD8+ T cells activated by DCs from β2m-/- mice, they produced low levels of IFN-γ, and high levels of IL-4. Our results suggest that cross-presentation is able to induce CD8+ T cells to produce IFN-γ, which can modulate the CD4+ Th1 differentiation and/or the consolidate the Th1 response.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Ag Antígeno APC Célula Apresentadora de Antígenos ATPases Enzimas de degradação da adenosina trifosfato β2m Beta 2 microglobulina CCR Receptor de quimiocina do tipo CC CD Complexo de diferenciação CD40L Ligante de CD40 CsA Ciclosporina A CTLA-4 Antígeno 4 de linfócito T citotóxico CXCR Receptor de quimiocina do tipo CXC DC Célula Dendrítica DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco EDTA Ácido etileno diamino tetracético ELISA Ensaio de imunoadsorção enzimática ER Retículo Endoplasmático FACS Separação celular ativada por fluorescência FasL Ligante de Fas FcR Receptor de Fc FITC Isotricianato de fluoresceína HBSS Solução salina balanceada de HANK’s HEPES Ácido hidroxietil piperazina etanosulfônico HSP Proteína de choque térmico IFN Interferon Ii Cadeia invariante IL Interleucina LC Célula de langerhans LPS Lipopolissacarídeo MHC Complexo principal de histocompatibilidade NK Células Natural Killer OT Camundongo com TCR transgênico responsível a OVA OVA Ovalbumina PAMPs Padrões moleculares associados ao patógeno PBS Salina tamponada por fosfato PGE Prostaglandina E PRRs Receptores que reconhece padrões de patógenos RAG Gene ativador de recombinação Sec-61 Canal de translocação proteica SFB Soro fetal bovino STAT Ativador de transcrição e transdutor de sinal TAP Proteína transportadora associada com processamento de antígenos T-bet T-box expresso em células T TCR Receptor de células T TGF Fator de crescimento tumoral Th Célula T auxiliar ou “T helper” TLR Receptor do tipo Toll TNF Fator de necrose tumoral Ub Ubiquitina

UBCs Ubiquitina conjugada a enzimas UPS Sistema de proteossomo e ubiquitina

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Mecanismos de reconhecimento da imunidade inata que podem influenciar a

resposta do sistema imune adaptativo.

4

Figura 2: Vias de apresentação cruzada. 15

Figura 3: Vias envolvidas na diferenciação de linfócitos T CD4+ para o fenótipo Th1 e Th2 20

Figura 4: Vias envolvidas na diferenciação de linfócitos T CD4+ para o fenótipo Th1 e Th2 33

Figura 5: Caracterização da população celular CD11c+ purificada dos baços de

camundongos C57BL/6 através de coluna magnética por seleção positiva.

35

Figura 6: Perfil de ativação das células CD11c+ purificadas de baços de camundongos

C57BL/6.

37

Figura 7: Ensaio de curva da dose de antígeno (OVA) e do tempo de cultura. 39

Figura 8: Análise da população celular produtora de IFN-γ no modelo de apresentação

cruzada in vitro.

41

Figura 9: Estabelecimento de um modelo de apresentação cruzada in vitro. 43

Figura 10: Análise da influência do IFN-γ na diferenciação de linfócitos T CD4+. 45

Figura 11: Influência da apresentação cruzada na diferenciação de linfócitos T CD4+. 47

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 1

1.1 O sistema imune 1

1.1.1 Imunidade inata 1

1.1.2 Imunidade adaptativa 3

1.2 Apresentação de antígenos 5

1.2.1 Células apresentadoras de antígenos 5

1.2.2 Células dendríticas 6

1.2.2.1 Subtipos de células dendríticas de camundongos 7

1.2.2.2 Subtipos de células dendríticas humanas 8

1.2.2.3 Processo de maturação 8

1.2.3 Mecanismo de captura de antígenos 10

1.2.4 Mecanismos de processamento de antígenos 11

1.2.4.1 Processamento e apresentação por MHC de classe II para células T CD4+ 11

1.2.4.2 Processamento e apresentação por MHC de classe I para células T CD8+ 12

1.2.4.2.1 Apresentação cruzada 13

1.2.4.2.1.1 Via Fagossomo-citosol e fusão do ER ao fagossomo 14

1.2.4.2.1.2 Via Vacuolar 16

1.3 Ativação de células T 16

1.3.1 Diferenciação Th1/Th2 17

1.3.2 Importância do microambiente na diferenciação de células T CD4+ 21

1.3.2.1 IFN-γ na diferenciação de células Th1 23

2. OBJETIVOS 25

2.1 Geral 25

2.2 Específicos 25

3. MATERIAIS E MÉTODOS 26

3.1 Animais utilizados 26

3.2 Cultura de células 26

3.3 Purificação de células T CD4 26

3.4 Purificação de células T CD8 27

3.5 Purificação de células dendríticas do baço de camundongos 28

3.6 Co-cultura de DC + células T CD8+ 29

3.7 Diferenciação in vitro de células T CD4+ 29

3.8 Marcação de células para análise por citometria de fluxo (FACs) 30

3.9 Marcação intracelular de citocinas 30

3.10 ELISA 31

3.11 Anticorpos utilizados 31

4. RESULTADOS 32

4.1 Purificação de células dendríticas do baço de camundongos C57Bl/6 32

4.2 Caracterização das células CD11c+ purificadas do baço de camundongos C57Bl/6 34

4.3 Caracterização do perfil de ativação de DCs purificadas do baço de camundongos

C57Bl/6

36

4.4 Ensaio de curva da dose de antígeno (OVA) e do tempo para o estabelecimento de um

modelo de apresentação cruzada in vitro

38

4.5 Análise da população celular produtora de IFN-γ no modelo de apresentação cruzada

in vitro

40

4.6 Estabelecimento de um modelo de apresentação cruzada in vitro 42

4.7 Análise do papel do IFN-γ na diferenciação de células T CD4+ 44

4.8 Influência da apresentação cruzada na diferenciação de células T CD4+ 46

5. DISCUSSÃO 48

6. CONCLUSÕES 58

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 59

1

1. INTRODUÇÃO

1.1- O Sistema Imune

O sistema imunológico é composto por um conjunto de células e moléculas

responsáveis pela defesa do organismo e pela manutenção do próprio. A resposta

imunológica geralmente ocorre para proteger o indivíduo de infecções e eliminar

antígenos estranhos ao organismo. Além disso, o sistema imunológico é responsável

pela retirada de células mortas, renovação de determinadas estruturas, rejeição de

enxertos e memória imunológica (revisto por Abbas & Janeway, 2000; Beutler,

2004).

Classicamente, a resposta imune tem sido subdividida em resposta imune

inata e adaptativa (Janeway, 1989). O sistema imune inato funciona como uma

primeira linha de defesa do organismo, formado por células e moléculas que

conferem uma proteção imediata e sem desencadear memória imunológica. A

resposta imune adaptativa é mais tardia e capaz de gerar memória imunológica

(revisto por Fearon & Locksley, 1996). A ativação destas respostas envolve a

participação de diferentes tipos celulares e mecanismos efetores (revisto por Akira et al., 2006).

A geração da resposta imunológica ocorre através da diferenciação e

proliferação de compartimentos celulares específicos e da regulação estreita de

cada um dos efeitos gerados por esses componentes. A desregulação destes

mecanismos pode levar ao aparecimento de alergias, inflamações, doenças auto-

imunes e câncer (revisto por Medzhitov & Janeway, 2000).

1.1.1- Imunidade Inata

A imunidade inata pode usar uma variedade de mecanismos efetores para

eliminar uma infecção, ou na falha deste, conter a infecção até que o patógeno

possa ser reconhecido pelo sistema imune adaptativo. Os mecanismos da

imunidade inata incluem as barreiras funcionais da superfície do corpo como a pele,

epitélio mucoso do trato respiratório, gastrointestinal e reprodutivo (revisto por

Medzhitov & Janeway, 2000).

Quando o patógeno atravessa esta barreira inicial, mecanismos de defesa

são induzidos e sua ativação requer o reconhecimento específico do microorganismo

invasor. A estratégia de reconhecimento do sistema imune inato é baseado na

detecção de produtos constitutivos e conservados do metabolismo microbiano

2

(revisto por Medzhitov, 2001), como através do reconhecimento de padrões

moleculares associados ao patógeno (PAMPs, “Pathogen-Associated Mollecular

Patterns”) (Janeway, 1989). Este reconhecimento permite ao sistema imune inato

distinguir antígenos próprios e não próprios (Medzhitov & Janeway 2002).

PAMPs representam estruturas moleculares que estão presentes ou são

produzidas por microorganismos patogênicos, como peptídeoglicanos e

lipopolissacarídeos (LPS, “Lypopolysaccharide”) (Medzhitov & Janeway, 1997). O

reconhecimento dos PAMPs não indica apenas a presença de uma infecção, como

também providencia informações sobre o tipo de patógeno invasor. Esta propriedade

ajuda o sistema imune a responder com o mecanismo efetor mais eficiente contra a

classe do patógeno (revisto por Medzhitov & Janeway, 2000).

Os receptores do sistema imune inato que reconhecem estruturas

encontradas em patógenos são chamados de receptores de reconhecimento de

padrões (PRRs, “Pattern Recognition Receptors”) (Janeway, 1989). O sistema imune

inato utiliza vários PRRs que são expressos na superfície celular, em

compartimentos intracelulares ou secretados em certos fluídos do corpo (revisto por

Medzhitov & Janeway, 2000). Funcionalmente, estes receptores podem estar

envolvidos na opsonização, na fagocitose, na indução da apoptose e na ativação do

complemento e de vias de sinalização pró-inflamatórias (Fraser et al., 1998). A

indução da via de sinalização resulta na transcrição de vários genes da resposta

imune, como peptídeos antimicrobianos e citocinas inflamatórias (revisto por

Medzhitov & Janeway, 2000). As citocinas são mediadores solúveis, e podem atuar

como mensageiros do sistema imune ajudando a regulação da resposta imune

(revisto por Delves & Roitt, 2000).

Um bom exemplo destes receptores foi a identificação e caracterização da

família de receptores do tipo Toll em mamíferos (TLR, “Toll-like Receptors”)

(Medzhitov et al., 1997; Rock et al., 1998). Os receptores TLR são expressos em

devirsas células, como por exemplo, nos macrófagos, neutrófilos, mastócitos, células

NK (“Natural Killer”), células dendríticas (DCs, “Dendritic Cells”). São considerados

os principais receptores que reconhecem os PAMPs (revisto por Pulendran &

Ahmed, 2006).

A ativação das vias de transdução por TLRs leva a indução de vários genes

que funcionam na defesa do organismo, incluindo citocinas inflamatórias,

quimiocinas, aumento da expressão do complexo principal de histocompatibilidade

(MHC, “Major Histocompatibility Complex”) e moléculas co-estimulatórias (Thoma-

3

Usynski et al., 2001). Além disso, a sinalização via TLR induz a expressão de

selectinas e quimiocinas, que regulam a migração celular aos sítios de inflamação

(Huang et al., 2001) ou estimula a maturação das DCs (revisto por Takeda et al., 2003).

O reconhecimento por TLRs não é o único mecanismo de reconhecimento do

sistema imune inato, pois existe também mecanismos de reconhecimento de células

infectadas por vírus, células com moléculas do próprio alterados ou ausentes. O

reconhecimento do próprio pode ser percebido, por exemplo, na detecção de

mudanças em regiões de glicosilação de glicoproteínas de membrana ou na

composição de fosfolipídeos de membrana (revisto por Medzhitov & Janeway, 2000;

Hoffmann et al., 1999).

1.1.2- Imunidade Adaptativa

A influência do sistema imune inato na resposta da imunidade adaptativa foi

sugerida a partir de 1960, quando foi demonstrado que células fagocíticas

mononucleares eram necessárias para induzir uma resposta linfóide efetiva ao

antígeno (Dutton, 1967; Unane & Askonas, 1968). O sistema imune adaptativo

geralmente responde ao antígeno após ele ter sido reconhecido, processado e

apresentado pelo sistema imune inato (revisto por Beutler, 2004).

A resposta adaptativa é iniciada em áreas ricas em células T nos órgãos

linfóides secundários, onde as células apresentadoras de antígenos (APCs, “Antigen

Presenting Cells”) encontram células naives que reconhecem o antígeno que está

sendo apresentando (revisto por Kaech et al., 2002). Recentes trabalhos sugerem

que as células dendríticas (DCs, “Dendritic Cells), um dos tipos de APCs, exercem

funções críticas na detecção dos patógenos de forma direta ou indireta, e integram

as informações para regular a quantidade, qualidade e duração da resposta imune

adaptativa (Figura 1) (revisto por Janeway & Medzhitov, 2002; Banchereau et al., 2000; Shortman & Liu, 2002).

4

Figura 1- Mecanismos de reconhecimento da imunidade inata que podem influenciar a resposta do sistema imune adaptativo. O reconhecimento de PAMPs por seus receptores, como os TLRs, geram sinais que ativam o sistema imune adaptativo. Os receptores endocíticos PRRs auxiliam a fagocitose pelas APCs. Estes antígenos são internalizados, degradados e acoplados às moléculas de MHC de classe II, que são reconhecidas pelo TCR da célula T, ocasionando a ativação da célula T. Adaptado de Medzhitov & Janeway, 2000.

Os linfócitos T e B são as células fundamentais do sistema imune adaptativo.

Existem dois tipos de resposta imune adaptativa: a imunidade celular e humoral.

Estas respostas são mediadas por diferentes componentes do sistema imune e

funcionam para eliminar diferentes tipos de patógenos (revisto por Kaech et al., 2002). A imunidade humoral é mediada por anticorpos, que são produzidos por

plasmócitos derivados dos linfócitos B (revisto por Clark & Kupper, 2005). A

imunidade celular é mediada por linfócitos T que lisam a célula infectada por

patógenos intracelulares, vírus ou algumas bactérias (revisto por Clark & Kupper,

2005).

O reconhecimento do antígeno pela célula T ocorre através da ligação do

receptor de célula T (TCR, “T Cell Receptor”) ao MHC da APC. O TCR é encontrado

apenas na superfície da célula T e reconhece a estrutura primária do peptídeo

antigênico apenas quando estiver presente no complexo de histocompatibilidade

(MHC) na superfície da APC (revisto por Garcia & Adams, 2005). Os mecanismos

utilizados na captura, processamento e apresentação de antígenos pelas APCs

serão discutidos mais adiante, assim como os mecanismos de estabelecimento do

contato e a regulação entre a imunidade inata e a adaptativa. O reconhecimento do

5

antígeno pela célula T na superfície da APC, não é suficiente para ativar a célula T,

ela necessita de um segundo sinal vindo da APC para ser ativada, como o sinal co-

estimulatório das moléculas CD80 e CD86 (revisto por Kapsenberg, 2003).

Após o processo de ativação, os linfócitos T iniciam a proliferação e

diferenciação. Os linfócitos T CD8+ são, juntamente com as células NK,

responsáveis pela resposta citotóxica do organismo (revisto por Harty et al., 2000).

Já os linfócitos T CD4+ têm a capacidade de se diferenciar em populações celulares

com habilidades funcionais distintas (revisto por Mosmann et al., 1989). Os linfócitos

T CD4+ diferenciados produzem citocinas específicas e mutuamente exclusivas,

influenciando a ativação e diferenciação de outros tipos celulares (revisto por

Mosmann et al., 1996; Abbas et al. 1996). Os mecanismos desta diferenciação e sua

influência na resposta imune serão abordados posteriormente.

1.2- Apresentação de Antígenos

1.2.1- Células Apresentadoras de Antígenos

As APCs são uma população celular altamente especializada em capturar

antígenos, processar e apresentar os fragmentos peptídicos na superfície celular no

contexto de MHC, juntamente com outras moléculas necessárias à ativação de

linfócitos. Devido a estas características, as células dendríticas, macrófagos e

células B, são chamadas de APCs (revisto por Kondo et al, 2003).

As DCs são consideradas as mais potentes e versáteis APCs do sistema

imunológico, pois além de se localizarem nas portas de entrada dos antígenos e

serem eficientes na aquisição e processamento de antígenos, apresentam a

expressão de altos níveis de moléculas co-estimulatórias e de MHC de classe II

(revisto por Banchereau & Steinman, 1998; Trombetta & Mellman, 2005). As DCs

possuem a habilidade de transportar antígenos dos sítios de infecção aos órgão

linfóides, o que aumentanda a possibilidade de induzir a resposta imune adaptativa.

Além disso, as DCs podem produzir diferentes tipos de citocinas pode ser importante

na modulação da resposta efetora pelas células T (revisto por Banchereau &

Steinman, 1998).

6

1.2.2- Células Dendríticas

As DCs se desenvolvem na medula óssea e migram aos tecidos na forma

imatura (revisto por Clark & Kupper, 2005). Estão distribuídas na maioria dos tecidos

e órgãos, com exceção do cérebro e epitélio córneo central. São encontradas

principalmente em tecidos que fazem interface com o ambiente externo (revisto por

Rescigno et al., 1999; Banchereau et al., 2003).

A DC imatura encontrada no tecido periférico é caracterizada pela grande

capacidade em capturar antígenos através de vias endocíticas e da fagocitose

(revisto por Cella et al., 1997). O mecanismo de endocitose é possível pois a DC

imatura expressa receptores endocíticos, como os receptores de manose DEC-205

e DC-SIGN. Além disso, a DC imatura pode ser capaz de processar antígenos, mas

apresenta baixa capacidade em estimular os linfócitos, visto que não expressam as

moléculas co-estimulatórias (revisto por Clark & Kupper, 2005; Cella et al., 1997).

Após o reconhecimento e endocitose do patógeno, a DC entra em processo

de maturação e reprograma suas funções (revisto por Pulendran et al. 2001;

Steinman, 2003). Primeiramente, recruta os leucócitos ao sítio de infecção através

da produção de quimiocinas, citocinas inflamatórias e interferons. Devido as

mudanças na expressão de receptores de quimiocinas na superfície celular, as DCs

adquirem propriedades migratórias, saindo do sítio de infecção para os órgãos

linfóides secundários. Durante esta migração, completam o processo de maturação

e adquirem a habilidade de ativar os linfócitos (revisto por Banchereau & Steinman,

1998; Rescigno et al., 1999; Banchereau et al., 2000; Münz et al., 2005). Durante a

maturação, as DCs aumentam a expressão de moléculas co-estimulatórias CD80 e

CD86, que são transportadas junto com moléculas de MHC de classe II à superfície

onde permanecem associadas com microdomínios de membrana (Turley et al., 2000).

Após o processo de maturação, as DCs são capazes de ativar as células T

naives, apresentando peptídeos associados tanto em moléculas de MHC de classe I

quanto de classe II, podendo ativar células T CD8+ e CD4+, respectivamente

(Rescigno et al., 1998). Além de iniciar a imunidade inata e regular a resposta imune

adaptativa, as DCs in vivo também podem capturar antígenos normalmente

encontrados no organismo (Vermaelen et al., 2001; Huang et al., 2000). Esta

captação de proteínas no estado basal (“Steady State”), permite às DCs controlar a

tolerância ao próprio e aos constituintes ambientais normais (Hawiger et al., 2001).

7

Existe uma diversidade de classificações para as DCs baseadas, por

exemplo, na sua origem, na existência de diferentes sub-populações, nas

características imunofenotípicas e funcionais e nos diferentes estágios de maturação

(revisto por Caux et al., 1995). A questão chave é se esta heterogenidade reflete a

diferença na linhagem ou no estágio de maturação, ou ambos.

As DCs foram descritas pela primeira vez em 1973, por Ralph Steinman e

Cohn, onde foi proposto inicialmente que as DCs eram de origem mielóide

(Steinman & Cohn, 1973). Posteriormente, foi confirmado que as DCs de fato são de

origem mielóide (Inaba et al., 1993) e são produzidas continuamente por células

tronco hematopoiéticas na medula óssea (revisto por Banchereau et al., 2000).

Sugere-se que a linhagem mielóide dê origem a dois tipos de DCs, as células

de Langerhans (LC) e as DCs intersticiais. Ambos os tipos de DCs podem diferir

quanto o estágio de maturação, função e localização (revisto por Pulendran et al., 2001). No entanto, dados posteriores indicam que as DCs também podem ser

obtidas a partir de precursores comprometidos com a linhagem linfóide (Manz et al., 2001).

1.2.2.1- Subtipos de Células Dendríticas de Camundongos

Nos órgãos linfóides secundários de camundongos, ao menos três

subpopulações principais de DCs foram descritas: DCs CD8α+ de origem linfóide,

CD8α- de origem mielóide e as células de Langerhans. Elas podem difereir quanto

aos fenótipos, a localização e a função (Tabela 1) (revisto por Pulendran et al.,

2001). Em 1996, foi proposto pela primeira vez, que as DCs CD8α+ e CD8α- se

originam de progenitores linfóides e mielóides, respectivamente (Wu et al., 1996).

Em 2000, o grupo do pesquisador Weissman demonstrou que tantos os progenitores

linfóides quanto os progenitores mielóides eram capazes de gerar tanto DCs CD8α+

quanto CD8α- (Traver et al., 2000). Desta forma, o termo célula dendrítica mielóide

ou linfóide, usado para diferenciar as DCs, não tem sido mais tão aceito, e sim a

diferenciação pelo marcador CD8α (Traver et al., 2000; Brasel et al., 2000).

8

Tabela 1- Subtipos de DCs nos órgãos linfóides de camundongos

Linfóide Mielóide Linhagem CD8α+ DC CD8α- DC Cel. Langerhans

(LC) Fenótipo CD11c+

MHC de classe II+

CD8α+ DEC205+ CD11bdull/- 33D1- CD4- CD86+ CD40+

CD11c+

MHC de classe II+

CD8α- DEC205- CD11b+ 33D1+ CD4+ CD86+ CD40+

CD11c+

MHC de classe II+

CD8α+/-(?) DEC205+ CD11b+ 33D1- CD4+ CD86+ CD40+

Localização Zonas de células T de órgãos linfóides; córtex tímico

Zona marginal do baço (move para a zona de células T quando ativados com LPS ou toxoplasma); sub-epitelial de placas de Peyer’s

LC imatura no epitélio; DCs derivadas de LCs em zonas de células T no linfonodo.

Função Captura de Ag Processamento de Ag Secreção de IL-12 Secreção de IFN-γ Priming célula T CD4+

Priming célula T CD8+

+ ++ ++++ ++++ ++++ (Th1) +++

++ ++ +/- - ++++ (Th2) ++++

++ ++ ++++ ? ? ++++

*Diferenças entre os subtipos de DCs de camundongos de acordo com marcadores de superfície, localização e função (adaptado de Pulendran et al., 2001).

1.2.2.2- Subtipos de Células Dendríticas Humanas

Em seres humanos, embora o conhecimento esteja sendo gerado em estudos

in vitro, a biologia, a distribuição no tecido e a função de subtipos de DCs in vivo

estão apenas começando a ser explorados. Ao menos três subtipos de DCs

humanas são conhecidas: (1) DCs mielóides, conhecidas também como DCs

intersticiais ou da pele; (2) DCs derivadas das LCs e as (3) DCs plasmocitóides

(revisto por Pulendran et al., 2001).

1.2.2.3- Processo de Maturação

As DCs imaturas funcionam como sentinelas do sistema imune inato, pois

elas patrulham o organismo através do sangue, dos tecidos periféricos, da linfa e

dos órgãos linfóides secundários (Steinman et al., 2000). Nos tecidos periféricos, as

DCs examinam (“scanning”) antígenos próprios e não-próprios (Hawiger et al., 2001). Os antígenos internalizados são degradados e acoplados ao complexo MHC

de classe II (revisto por Kapsenberg, 2003). Os mecanismos de captura,

9

processamento e carreamento do antígeno à superfície é chamado de apresentação

de antígeno e será detalhado mais adiante.

As DCs imaturas podem ser atraídas aos sítios de infecção ou inflamação por

diferentes quimiocinas que são reconhecidas por receptores de quimiocinas, como

CCR1, CCR2, CCR5, CCR6 e CXCR1. Estes receptores geralmente são expressos

na superfície das DCs imaturas (revisto por Sallusto & Lanzavecchia, 2000). Após a

endocitose do antígeno, a DC começa a liberar quimiocinas, citocinas e IFN-α/β, que

são importantes para o recrutamento e amplificação da resposta imune inata.

Quando as DCs imaturas internalizam um antígeno na ausência de estímulos

inflamatórios ou de maturação, são ineficientes na apresentação do antígeno (revisto

por Matzinger, 1998).

Durante o reconhecmineto do antígeno, alguns fatores podem contribuir para

o processo de maturação, como citocinas, proteínas de choque térmico (HSP, “Heat

Shock Proteins”), eicosanóides, componentes da matriz extracelular de bactérias,

produtos virais, assim como outras moléculas próprias. Estes fatores são

reconhecidos através de interações com receptores específicos na superfície das

DCs, como os receptores TLRs, de citocinas, da família das moléculas TNF, FcR e

de morte celular (revisto por Guermonprez et al., 2002). Os linfócitos T, através de

vias dependentes ou independentes de CD40, e as células endoteliais, podem

contribuir para o estágio final da maturação das DCs através de um contato direto

célula-célula ou através da secreção de citocinas (revisto por Bell et al., 1999).

Após a DC iniciar o processo de maturação, sua capacidade endocítica

diminui, mas ocorre o aumento da expressão e estabilidade dos complexos de MHC

de classe I e II na superfície (revisto por Thery & Amigorena, 2001), o aumento da

expressão de moléculas co-estimulatórias, como CD40, CD54, CD80 e CD86, e a

secreção de citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6, IL-12, IL-18 e IL-23 (revisto

por Liu, 2001). Além disso, ocorrem mudanças na expressão dos receptores de

quimiocinas, como CCR6 e CCR7, de moléculas de adesão, assim como profundas

mudanças na morfologia da DC. Todas essas mudanças contribuem para a

migração das DCs através da linfa para os órgãos linfóides (revisto por Banchereau

et al., 2000).

10

1.2.3- Mecanismos de Captura de Antígenos

As DCs imaturas são eficientes em capturar antígenos e podem usar diversas

vias endocíticas, como a macropinocitose, a pinocitose e a fagocitose. O processo

de endocitose pode ser mediado por receptores via receptores de lectina tipo C,

como os receptores de manose e DEC-205 (Jiang et al., 1995; Sallusto et al., 1995)

ou os receptores Fcγ tipo I e II (Fanger et al., 1996).

Antígenos solúveis são eficientemente internalizados pelo processo de

macropinocitose (revisto por Banchereau & Steinman, 1998). O impacto da

macropinocitose in vivo ainda não está claro, mas pode certamente aplicar-se em

condições onde os antígenos estão disponíveis na forma solúvel, como após

injeções de antígeno. De fato, as DCs são o principal tipo de célula capaz de

reconhecer e carregar antígenos solúveis aos linfonodos após injeções intravenosas,

intraperitoniais ou intradérmicas (revisto por Trombetta & Mellman, 2005).

O processo de endocitose mediada por receptores pode ser vantajoso para o

sistema imune de duas formas. Primeiramente, de forma quantitativa, pois a

captação do antígeno se torna mais rápida e eficiente, sem contar que o antígeno

mesmo estando em concentrações muito mais baixas ainda pode ser apresentado

pelas APCs (revisto por Lanzavecchia, 1990). Em segundo, quanto aos aspectos

qualitativos da endocitose mediada por receptores, visto que este mecanismo pode

contribuir para uma diversidade funcional entre diferentes APCs pela expressão

seletiva dos receptores ou por conseqüências funcionais diferentes em torno do

acoplamento do ligante (revisto por Trombetta & Mellman, 2005).

A fagocitose é o processo de endocitose in vivo mais comum. Receptores

endocíticos reconhecem os ligantes na superfície dos patógenos. A ligação das

partículas ao receptor é o primeiro passo para a fagocitose (revisto por Trombetta &

Mellman, 2005). Após o reconhecimento do patógeno, ocorre um prolongamento da

membrana plasmática em torno das partículas, a formação do pseudópodo, que se

estende até que se ligue ao outro pseudópodo e ocorra a fusão, formando o

fagossomo (revisto por Desjardins, 2003). Algumas organelas, incluindo

endossomos tardios, endossomos recirculantes e lisossomos podem se fusionar

com a membrana plasmática durante a fagocitose, auxiliando na formação do

fagolisossomo (revisto por Desjardins, 2003).

Várias proteínas identificadas nos fagossomos podem estar envolvidas na

morte e degradação dos patógenos, dentre elas, hidrolases, proteínas da maquinaria

de fusão da membrana, subunidades de ATPases e muitas outras (revisto por

11

Desjardins, 2003; Garin et al., 2001). A degradação do patógeno em fagolisossomos

fornece um sistema ideal de processamento de antígeno exógeno e geração de

peptídeos para a apresentação em moléculas de MHC (revisto por Watts, 1997).

1.2.4- Mecanismos de Processamento e Apresentação de Antígenos

Atualmente, existem três tipos conhecidos de moléculas apresentadoras de

antígenos que controlam o reconhecimento antigênico pelas células T: MHC de

classe I, MHC de classe II e a família de CD1 (revisto por Germain & Jenkins, 2004).

Cada uma destas famílias está envolvida na ativação de populações distintas de

linfócitos T, as quais apresentam propriedades fenotípicas e funcionais diferentes

(Porcelli & Hämmerling, 2006). As duas moléculas de MHC, classe I e II, apresentam

diferenças quanto a sua distribuição e função. Enquanto as moléculas de MHC de

classe I são expressas na maioria das células nucleadas, a expressão do MHC de

classe II é restrito às APCs, incluindo macrófagos, DCs e linfócitos B. A degradação

do antígeno é essencial para a apresentação tanto no MHC de classe I quanto no

MHC de classe II (revisto por Rock et al., 2002). Contudo, o processo e os

mecanismos envolvidos nessas duas vias são fundamentalmente diferentes, e o

resultado da apresentação do MHC de classe I e classe II diferem, resultando na

ativação de linfócitos T CD8+ e CD4+, respectivamente (revisto por Rock et al., 2002).

1.2.4.1- Processamento e apresentação por MHC de classe II para células T CD4+

Peptídeos exógenos, como proteínas, microorganismos e material apoptótico,

podem ser capturados e processados por proteases no compartimento endocítico

das APCs para serem acoplados ao complexo MHC de classe II e ativar células T

CD4+ (Endres & Grey, 1980; Chapman, 1998). DCs imaturas são eficientes em

capturar antígenos solúveis e particulados e acoplar ao complexo MHC de classe II

(Inaba et al, 1998).

Inicialmente, após a síntese no ER, três dímeros do MHC de classe IIαβ são

associados ao trímero da cadeia invariante (Ii) (revisto por Watts, 2004). Este

nonâmero sai do ER e passa através do complexo de Golgi antes de ser

transportado para a via endocítica, sob a influência de sinais transportadores

presentes na região citoplasmática da cadeia Ii (Lotteau et al., 1990). Ii atua como

uma chaperona para MHC de classe II, ocupando o sítio de ligação do peptídeo

(revisto por Honey & Rudensky, 2003). Uma vez na via endocítica, a exposição a

12

proteases lisossomais, combinado com a diminuição do pH, resulta na clivagem do

canal invariante (revisto por Cresswell, 2005). Quando o sítio de ligação do peptídeo

no MHC de classe II está aberto, peptídeos exógenos derivados de material

endocitado se ligam, e passam a ser protegidos de uma degradação subseqüente

(revisto por Guermonprez et al., 2002). Posteriormente, são transportados à

membrana plasmática para apresentação do antígeno à células T CD4+ (revisto por

Pieters, 1997).

Uma vez na superfície, MHC de classe II pode ser rapidamente internalizado,

podendo se associar a novos peptídeos nos endossomos recirculantes antes de

retornar a superfície, ou pode ser direcionado aos lisossomos onde pode ser

degradado. Esta via resulta numa apresentação curta MHC/peptídeo na superfície

de células dendríticas imaturas. Sinais de maturação induzem uma modificação

coordenada na formação do complexo MHC/peptídeo e no transporte (revisto por

Rescigno et al., 1999). A atividade endocítica diminui e o transporte de moléculas de

MHC de classe II internalizado para degradação no lisossomo reduz muito,

resultando na estabilização do complexo MHC de classe II/peptídeo na superfície.

Mais tarde, a síntese de MHC de classe II é diminuída e a associação de peptídeos

em moléculas MHC recém sintetizadas se torna pouco eficiente. Contudo, DCs

maduras podem formar novos complexos MHC/peptídeo, usando moléculas MHC

recirculantes da superfície celular (Askew et al., 2000).

1.2.4.2- Processamento e apresentação por MHC de classe I para células T CD8+

Os receptores de células T CD8+ reconhecem peptídeos endógenos que são

expostos através de moléculas de MHC de classe I na superfície das células (revisto

por Stager & Kaye, 2004). Os peptídeos endógenos que são acoplados ao MHC de

classe I podem representar a composição proteica intracelular, o que permite o

monitoramento do estado da célula por células T citotóxicas, ou apresentar

peptídeos de parasitas intracelulares, vírus e tumores (revisto por Guermonprez et al., 2002).

As moléculas de MHC de classe I recém formadas no ER, estão ligadas a β2

microglobulina e podem se associar a três proteínas, a calnexina, calreticulina ou a

ERp57, o que confere estabilidade ao complexo em ausência de peptídeo de alta

afinidade. Este complexo estável se liga à outra proteína, a tapsina, com o objetivo

de se associar a transportadores peptídicos especializados (TAP) (Yang & Braciale,

1995). A proteína TAP é responsável pelo transporte, e provavelmente pela

13

colocação de peptídeos citosólicos gerados pela atividade dos proteossomos nas

moléculas MHC de classe I recém formadas (Reits et al., 2003). O sistema de

proteossomo e ubiquitina (UPS) é uma peça chave na cascata de eventos

proteolíticos, pois supre o sistema imune celular com peptídeos na quantidade e

qualidade apropriada (revisto por Strehl et al., 2005). O complexo proteossomo 26S

é responsável pela degradação seletiva de substratos protéicos poliubiquitinados

(revisto por Voges et al., 1999). Apenas os peptídeos que chegam ao ER podem ser

associados à molécula MHC de classe I.

Uma vez associado ao peptídeo, as moléculas de MHC de classe I são

rapidamente transferidas através do Complexo de Golgi para a membrana

plasmática. Foi demonstrado que a síntese e a duração de moléculas de MHC de

classe I aumenta após a indução da maturação da DC, porém, não tão intenso

quanto o MHC de classe II (revisto por Guermonprez et al., 2002). Ao contrário do

MHC de classe II, o MHC de classe I é eficientemente sintetizado e transportado à

superfície celular em DCs imaturas (Cella et al., 1999).

1.2.4.2.1- Apresentação cruzada

A apresentação cruzada foi descrita em 1976 por Bevan (Bevan, 1976). É um

processo onde antígenos exógenos, que são classicamente apresentados em

associação à molécula de MHC de classe II, passam a ser apresentados por

moléculas de MHC de classe I, ativando as células T CD8+. A apresentação cruzada

pode ocorrer em algumas circunstâncias, como em transplantes, infecções virais,

doenças autoimunes e câncer (revisto por Heath & Carbone, 2001).

As proteínas solúveis internalizadas através de todos os métodos de

endocitose, incluindo a macropinocitose, endocitose mediada por receptores e

fagocitose, podem ser apresentados via MHC de classe I pela apresentação cruzada

(Fonteneau et al., 2003; revisto por Steinman et al., 1999). Os mecanismos pelo qual

os antígenos exógenos são processados e apresentados ainda permanece

controverso, mas algumas hipóteses tem sido propostas.

1.2.4.2.1.1- Via Fagossomo-citosol e fusão do Retículo Endoplasmático ao

fagossomo

Uma das principais vias de apresentação cruzada foi demonstrada quando

proteínas exógenas escapavam dos fagossomos para o citoplasma, o que permitiu

sugerir que os antígenos exógenos poderiam entrar na via utilizada para processar

14

antígenos endógenos (Kovacsovics-Bankowski & Rock, 1995; Rodriguez et al., 1999). Ao chegar no citoplasma, o antígeno é degradado por proteossomos e resulta

em peptídeos que serão transportados por TAP para as moléculas recém

sintetizadas do complexo MHC de classe I. Portanto, esta via é dependente de TAP

e proteossomos (Kovacsovics-Bankowski & Rock, 1995). O mecanismo pelo qual os

antígenos são transportados do fagossomo para o citoplasma ainda não está claro.

Com a identificação das proteínas ER contidas nos fagossomos, como MHC

de classe I, TAP, tapsinas, chaperonas e Sec-61, foi observado a presença de

proteínas características de ER, sugerindo-se então a participação do ER no

processo de endocitose (Gagnon et al., 2002). Análises posteriores revelaram que

os fagossomos podem se fusionar ao ER durante ou logo após o englobamento do

patógeno na superfície celular. Esta foi uma importante descoberta, visto que canais

de translocação proteica (Sec61) são encontrados na membrana do ER. Sec61 tanto

pode importar proteínas recém sintetizadas para o ER quanto pode exportar

proteínas, possibilitando a degradação proteica pelo proteossomo (Roy, 2003). Isto

sugere que o complexo Sec61 pode estar presente nos fagossomos após a fusão

com o ER. Se verdadeiro, este complexo pode ser o elo de ligação na via de

apresentação cruzada, o transportador responsável por exportar proteínas exógenas

do fagossomo para o citoplasma (Figura 2) (Roy, 2003; revisto por Shen & Rock,

2005).

No citoplasma, estes peptídeos podem ser degradados por proteossomos em

peptídeos antigênicos que retornam ao fagossomo transportados por TAP e se ligam

ao MHC de classe I. Corroborando com esta hipótese, foi demonstrado que tanto

TAP quanto o MHC de classe I permanecem ativos na membrana celular do

fagossomo (Roy, 2003). Contudo, este mecanismo ainda não foi demonstrado in vivo (Guermonprez et al., 2003). Além disso, a importância de TAP no mecanismo

de apresentação cruzada é observada quando DCs incubadas com um

recombinante solúvel, US6, um inibidor de TAP, não são capazes de realizar a

apresentação cruzada (Ackerman et al., 2003). Antígenos protéicos solúveis, quando

injetados, geralmente não são apresentados às células T CD8+ por apresentação

cruzada e in vitro somente ocorre a apresentação cruzada quando os antígenos

solúveis estão presentes em altas concentrações. Portanto, a participação de TAP

no mecanismo de apresentação cruzada in vivo precisa ser melhor elucidada.

15

Figura 2- Vias de apresentação cruzada. I) Via fagossomo-citosol. Antígenos exógenos são endocitados, o fagossomo se fusiona com o ER adquirindo a maquinaria de apresentação de antígeno presente no ER (TAP, tapsina e moléculas de MHC de classe I) e Sec61. Alguns antígenos vão para o citoplasma, onde sofrem retro-translocação através do Sec61 e ubiquitinação (Ub). Posteriormente, são clivados por proteossomos que se associam com a membrana do fagossomo e são transferidos de volta ao fagossomo por TAP. II) Via Vacuolar. Os antígenos internalizados podem ser clivados em peptídeos por proteases no fagossomo, onde a Tapsina pode ajudar na colocação dos peptídeos nas moléculas MHC de classe I, que posteriormente são levados à superfície da célula. Adaptado de Rock, 2003.

16

Novos estudos suportam fortemente um modelo de apresentação cruzada

onde a união entre o fagossomo e o ER ocorre (Gagnon et al., 2002; revisto por

Zinkernagel, 2002;). Contudo, eles não demonstram se a fusão é necessária (Touret

et al., 2005). Portanto, não é possível afirmar se a união de componentes do ER no

retículo é um artefato ou se os fagossomos adquirem moléculas do ER por outro

mecanismo.

1.2.4.2.1.2- Via vacuolar

Foi demonstrado que alguns antígenos podem ser apresentados através da

apresentação cruzada por um mecanismo distinto (revisto por Rock & Shen, 2005).

Esta via não requer TAP, é insensível a inibidores de proteossomo e difere

claramente da via do fagossomo para o citosol. Rock e colaboradores demonstraram

em 2004 que nesta via de apresentação cruzada, os peptídeos foram gerados pela

cisteina protease catepsina S. A catepsina S foi necessária in vivo para a

apresentação cruzada independente de TAP, tanto para apresentar OVA por células

transfectadas quanto para apresentar dois antígenos diferentes do vírus influenza

(Shen et al., 2004). Ainda não está claro se outras proteases presentes no vacúolo

podem contribuir para esta via de apresentação.

Ainda é necessário determinar se as moléculas de MHC de classe I são

formadas no fagossomo. MHC de classe I pode ser selecionada para os

compartimentos vacuolares através de um sinal base de tirosina no seu domínio

citoplasmático (revisto por Shen & Rock, 2006). Alternativamente, MHC de classe I e

os complexos para ligar o peptídeo, como a tapsina, podem chegar ao fagossomo

através da fusão do ER (Guermonprez et al., 2003; Houde et al., 2003).

1.3.- Ativação de Células T

Um dos processos centrais que induzem e regulam a ativação e resposta da

imunidade adaptativa envolve o estabelecimento de contato célula-célula das células

T e B com as APCs (revisto por Dustin & Cooper 2000). A interação APC-linfócito

leva a sinais de transdução e a respostas de ativação que determinam a expressão

de moléculas co-estimulatórias, expansão clonal, diferenciação e aquisição da

função efetora das células T (revisto por Lanzavecchia & Sallusto, 2001). A região

onde a membrana de ambas as células interagem é conhecida como sinapse

imunológica. As interações celulares na sinapse imunológica são curtas, o tipo e a

17

quantidade de informação trocada entre a APC e o linfócito é determinado pela

duração da interação, o tipo de receptores e moléculas de sinalização envolvidas e

recrutadas, e os sinais que são transmitidos (revisto por Friedl et al., 2005).

Uma vez ativadas, as células T naives expressam uma variedade de

proteínas que contribuem para a sustentação ou modificação dos sinais co-

estimulatórios que dirigem a expansão clonal e a diferenciação das células, como o

ligante CD40, assim chamado por se ligar à molécula CD40 nas APCs. A ligação de

CD40 ao seu receptor ativa as células T e também as APCs que passam a

expressar as moléculas B7, estimulando a proliferação de células T (revisto por

Pulendran & Ahmed, 2006).

A expansão clonal antígeno-específica de células T naives requer além do

sinal do TCR e dos co-receptores CD4 e CD8, que se unem aos complexos MHC-

peptídeo, um segundo sinal co-estimulatório que é emitido pela mesma APC sobre a

célula T. As moléculas co-estimulatórias mais bem caracterizadas nas APCs são as

glicoproteínas B7.1 (CD80) e B7.2 (CD86) ou LICOS, que se ligam aos receptores, o

CD28 ou ICOS, das células T, respectivamente. A diferenciação dos linfócitos T

depende de IL-2, que induz a proliferação e a expansão clonal. Os linfócitos T CD8+

são então capazes de induzir a lise de células infectadas através de dois

mecanismos distintos: exocitose de grânulos dependente de uma molécula

formadora de poros em membranas, a perforina; e expressão de FasL (CD95L) que

pode iniciar a morte celular programada por agregação ao receptor Fas (CD95)

expresso na superfície das células alvo (revisto por Harty et al., 2000). Além disso,

estas células são excelente produtoras de IFN-γ, um inibidor da replicação viral e

importante indutor da expressão de MHC de classe I e da ativação de macrófagos.

As células T CD8+ são importantes na indução da morte de células infectadas por

vírus, na produção de citocinas que ajudam a manutenção da resposta de células T

CD4+, na citotoxidade e memória (revisto por Stager & Kaye, 2004).

1.3.1- Diferenciação Th1/Th2

Os linfócitos T CD4+ têm como principal função a produção e secreção de

citocinas. Originalmente foram descritos dois tipos de células T CD4+ murinas (Th)

ativadas após infecção por Leishmania major, capazes de secretar padrões distintos

de citocinas, que foram chamados de Th1 e Th2 (revisto por Mosman & Coffman,

1989). A diferença funcional destes subtipos é caracterizada pela diferença na

atividade das citocinas que eles secretam. Células do tipo Th1 caracterizam-se pela

18

secreção de IFN-γ, IL-2, e TNF-β, auxiliando na resposta imune celular contra

patógenos intracelulares, enquanto células do tipo Th2 produzem IL-4, IL-5 e IL-13,

participando na resposta imune contra patógenos extracelulares e auxiliando na

diferenciação e produção de anticorpos por células B (revisto por Seder & Paul,

1994; O’Garra, 1998).

Alguns marcadores de superfície têm sido descritos para diferenciar essas

duas subpopulações, incluindo receptores de quimiocinas como CCR3, CCR4 e

CCR8 presentes em células Th2 e CCR5 e CXCR3 e receptor de IL-12, IL-12Rβ2,

expressos em células Th1 (revisto por Sallusto et al. 1998). Recentemente, alguns

marcadores de superfície como CD94/NKG2 e Tim-3 expressos em células Th1; e

T1/ST2 expresso em células Th2, também foram identificados como possíveis

marcadores da diferenciação de células T CD4+ (Meyers et al., 2002; Monney et al., 2002; Lohning et al., 1998). Porém, a produção de citocinas ainda é o principal fator

que diferencia e caracteriza essas duas subpopulações.

Após encontrarem o antígeno, as células T CD4+ são ativadas através da

sinalização via TCR, e as citocinas presentes no microambiente ativam fatores de

transcrição específicos para Th1 ou Th2, remodelando a cromatina e permitindo a

abertura dos loci de citocinas específicas Th1 ou Th2 (Agarwal et al., 1999). Porém,

este programa de diferenciação é regulado e influenciado por vários fatores, como o

tipo de APC, a concentração de antígeno, de moléculas co-estimulatórias e

principalmente pelas citocinas presentes no microambiente (revisto por Abbas et al., 1996; O’Garra, 1998).

Inicialmente, as células CD4+ naive, ao serem estimuladas, diferenciam-se

para um fenótipo Th0, produzindo tanto IL-4 quanto IFN-γ. Nesse estágio, as células

CD4+ Th0 podem ser influenciadas pela presença de determinadas citocinas a se

tornarem células comprometidas com um fenótipo Th1 ou Th2. As citocinas IL-12 e

IL-4 foram inicialmente caracterizadas como as citocinas dominantes que

influenciavam a diferenciação Th1 e Th2, respectivamente. A IL-4 permanece a

citocina dominante na diferenciação para Th2, mas as citocinas envolvidas na

indução e regulação da resposta Th1, incluem IFN-γ, IL-12 e IL-18 (revisto por Szabo

et al., 2003).

As células CD4+ diferenciadas para Th1 e Th2 exibem fatores de transcrição

específicos e mutuamente exclusivos de seu fenótipo. Os fatores de transcrição

STAT4 e STAT1 estão envolvidos na diferenciação Th1 e na regulação IFN-γ (Figura

19

3). As proteínas STAT são expressas tanto nos subtipos Th1 quanto Th2 e podem

não ter uma função única em direcionar a regulação da transcrição do gene de IFN-γ

(Neurath et al., 2002). Certamente, a produção de IFN-γ é diminuída em células T

deficientes para STAT-4 e STAT-1 (Carter & Murphy, 1999; Durbin et al., 1996). Isto

sugere a existência de uma via regulatória alternativa no controle da expressão do

gene de IFN-γ.

Explicações adicionais para elucidar o comprometimento da linhagem Th1 e

expressão do IFN-γ têm sido fornecidas recentemente pela clonagem de um fator de

transcrição da família T-box, chamado T-bet (Szabo et al., 2000). T-bet é expresso

em células Th1, produtoras de IFN-γ, mas não nas células Th2 e a transcrição de T-

bet é aumentada 72 horas após estimulação das células T CD4 em condições Th1

(Szabo et al., 2000). O papel funcional de T-bet na regulação da produção de IFN-γ

é sustentado por estudos recentes que mostram uma profunda supressão da

produção de IFN-γ em células T CD4+ e não em células T CD8+ de camundongos

deficientes para T-bet (Szabo et al., 2002). As citocinas presentes no microambiente

também podem influenciar a diferenciação, a IL-12 promove a ativação de STAT4

que leva a produção de IFN-γ e polariza a diferenciação para um fenótipo Th1.

Em contrapartida, GATA-3 promove a expressão de várias citocinas Th2,

incluindo IL-4, IL-5 e IL-13 (Neurath et al., 2002), e é capaz de transativar o promotor

de IL-4 em células T (Lee et al., 2001). GATA-3 pode exercer uma auto-ativação

independente de STAT-6, criando uma alça regulatória e estabelecendo o

comprometimento Th2 (Ouyang et al., 2000). Contudo, os mecanismos moleculares

de regulação da diferenciação Th1/Th2 por fatores de transcrição ainda não estão

completamente elucidados.

20

Figura 3- Vias envolvidas na diferenciação de linfócitos T CD4+ para o fenótipo Th1 e Th2. A diferenciação tem início com a estimulação via TCR e moléculas co-estimulatórias que resulta na ativação de fatores de transcrição, como o NFAT, induzindo a transcrição e produção de citocinas, como IFN-γ ou IL-4. As citocinas presentes no microambiente influenciam a aquisição e comprometimento da diferenciação. IFN-γ produzido por células do sistema imune inato ou células T CD4, induz a ativação de STAT1 e consequentemente T-bet. T-bet induz o remodelamento de cromatina do locus de IFN-γ e a transativação do gene de IFN-γ, assim como a expressão do receptor IL-12R e inibição da produção de citocinas Th2. IL-12 induz a diferenciação Th1 ativando STAT4 e consequentemente a indução da produção de IFN-γ e estabilização do comprometimento Th1. A IL-4 induz a produção de citocinas Th2 através da ativação de STAT6 seguida pela ativação do fator de transcrição GATA3, que regula a produção de IL-4 e inibe a produção de IFN-γ e IL-12R.

21

1.3.2- Importância do Microambiente na Diferenciação de Células T CD4+

Alguns pontos afetam a polarização da célula T, dentre eles, o patógeno, os

receptores que reconhecem o patógeno na DC, subtipos de DCs e o microambiente

da sinalização (revisto por Shortman & Liu, 2002; Pulendran, 2005).

A ligação TCR-MHC entre as células T e DCs, e as moléculas co-

estimulatórias como CD80 e CD86 na DC com seu receptor CD28 na célula T,

induzem a célula T a expressar CD40L. Este, se liga ao receptor CD40 na DC

estimulando-a produzir citocinas, como IL-12 e IL-18 que influenciam a diferenciação

da célula T (revisto por Pulendran & Ahmed, 2006). A produção de IL-12 pode ser

modulada por citocinas e mediadores presentes durante a maturação da DC

(Kalinski et al., 1999).

Células Th1 e Th2 se desenvolvem em resposta a sinais vindos do sistema

imune inato (revisto por Romanagni, 1992). A IL-12 induz a diferenciação de células

T CD4+ para o fenótipo Th1, caracterizado pelo aumento da produção de IFN-γ e

redução da produção de IL-4 (revisto por Trinchieri, 1995). IFN-γ e IL-12 fazem uma

alça reguladora positiva que amplifica os níveis de IFN-γ e IL-12, aumentam a

proliferação e ativação de células Th1 (revisto por Pulendran & Ahmed, 2006). As

citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α ou IL-6, também podem atuar aumentando

a expressão de moléculas co-estimulatórias na DC (Le Bon & Tough, 2002).

Além das citocinas, vários estudos sugerem que diferenças nas DCs

modulam a resposta da célula T CD4+ (Maldonado-Lopez, 1999; Rissoan et al.,

1999). No baço, DCs CD8α- são encontradas na zona marginal, ao passo que DCs

CD8α+ são encontradas em maior número nas áreas de células T (Leenen et al.,

1998). Ambos os subtipos contém DCs maduras e imaturas que podem ser

induzidas a entrar no processo de maturação após ativação (Pullendran et al., 2001).

Ainda, DCs CD8α- demonstram ter maior capacidade endocítica e fagocítica que

DCs CD8α+ (Leenen et al., 1998).

Durante a resposta de células T in vivo, DCs CD8α- parecem induzir a

diferenciação para a expressão do fenótipo Th2, enquanto DCs CD8α+, parecem

induzir Th1 através de sua capacidade de produzir altos níveis de IL-12 (Maldonado-

Lopez et al., 2001). Contudo, estudos in vitro indicam que esta divisão funcional

pode ser alterada por fatores que modulam a função das DCs, em particular a

habilidade de produzir IL-12. Estes fatores incluem o estado de ativação da DC, a

natureza do antígeno, a concentração do antígeno, o tipo de receptor responsável

22

pela identificação do antígeno e as citocinas (Boonstra et al., 2003; Manickasingham

et al., 2003).

As DCs CD8α+ têm funções especializadas que justificam seu alto potencial

em estimular células T, que são ausentes nas DC CD8α-. Dentre eles, a capacidade

de produzir IFN-γ e IL-12 (Ohteki et al., 1999) e a capacidade de realizar

apresentação cruzada (den Haan et al., 2000). No entanto, as diferenças entre estas

duas populações ainda precisa ser melhor elucidada.

As DCs maduras não só têm a capacidade de estimular as células T naives,

como induzir diferentes tipos de respostas da célula T, dependendo do tipo de sinal

de maturação (revisto por Liu, 2001). Existem dois grupos de sinais que estimulam a

DC imatura a induzir a diferenciação Th1 versus Th2 (Kalinski et al., 1999).

Moléculas vindas de patógenos, como LPS, CpG DNA e RNA viral de dupla fita,

assim como sinais da célula T como CD40L e IFN-γ, todos estimulam a DC imatura a

produzir IL-12 e induzem a diferenciação para Th1. Em contraste, moléculas anti-

inflamatórias como IL-10, TGF-β, PGE-2 e corticosteróides, inibem a maturação da

DC e produção de IL-12, induzindo a diferenciação Th2 ou a resposta T regulatória

(revisto por Liu, 2001).

Existem evidências que sugerem que a duração do estímulo pelo TCR junto

com a polarização de citocinas pode determinar a progressiva diferenciação das

células T CD4+, levando a geração de células efetoras (revisto por Lanzavecchia &

Sallusto, 2000). Células que recebem um curto estímulo do TCR em ausência de IL-

12 proliferam, mas não se diferenciam em células efetoras (revisto por Lanzavecchia

& Sallusto, 2001). Em contraste, células T que recebem um estímulo prolongado do

TCR em presença de IL-12 ou IL-4 se diferenciam em células Th1 ou células Th2,

respectivamente (revisto por Lanzavecchia & Sallusto, 2001). As citocinas que

participam da diferenciação são conhecidas (revisto por Mosmann & Coffman,

1989), mas as células responsáveis pela sua produção in vivo ainda não estão bem

estabelecidos.

1.3.2.1- IFN-γ na Diferenciação de Células Th1

O IFN-γ é um importante ativador das funções antimicrobianas dos fagócitos e

exerce papel essencial na resistência a infecções bacterianas, fungos e parasitas

intracelulares. Além disso, o IFN-γ é uma citocina fundamental na regulação

funcional de células do sistema imune inato e adaptativo. O IFN-γ pode aumentar o

23

processamento de antígenos, vias de apresentação, a atividade de células NK e

induzir a maturação e diferenciação de muitos tipos celulares (revisto por Schroder

et al., 2004). É produzido majoritariamente por células NK e após ativação, por

células T CD8+ e NKT (Lertmemongkolchai et al., 2001). Macrófagos, DCs e células

B também podem produzir IFN-γ, contudo a real contribuição desta produção ainda

não foi determinada (Ohteki et al., 1999).

O IFN-γ aumenta a capacidade de apresentação de antígenos, pois aumenta

a expressão de moléculas de MHC de classe I e II e várias enzimas intracelulares

importantes para o processamento de antígenos (revisto por Farrar & Schreiber,

1993). Nas DCs, o IFN-γ estimula uma rápida regulação positiva de

imunoproteossomos durante a fase inicial da infecção, aumentando o

processamento de antígenos (revisto por Strehl et al., 2005). Além disso, o IFN-γ

induz a APC a produzir IL-12, que também é importante no comprometimento Th1

(Seder et al., 1993).

Estudos mostram que o IFN-γ influencia o desenvolvimento de células

efetoras do tipo Th1, aumentando a responsividade de células T CD4+ naives à IL-12

(Wenner et al., 1996). Além disso, o IFN-γ é responsável pela indução e manutenção

da expressão da cadeia β do receptor IL-12R (IL-12Rβ2) nas células T CD4+,

indicando um importante papel do IFN-γ nos efeitos da diferenciação Th1 mediada

por IL-12 (Afkarian et al., 2002). Outros estudos sugerem que o IFN-γ pode atuar na

própria célula T CD4+ que o produz, estimulando a diferenciação Th1 ou sendo

parciamente responsável pelo efeitos da IL-12 nessas células (Bradley et al., 1996).

IL-12 e IL-18 induzem a produção de IFN-γ por macrófagos e DCs, porém, na

DC apenas a IL-12 já é capaz de estimular a produção de IFN-γ (Munder et al., 1998;

Fukao et al., 2000). Foi proposto também que o IFN-γ estimula a produção de IL-12

em macrófagos, atuando em uma regulação positiva entre essas células e as células

efetoras Th1 (Bradley et al., 1996).

O IFN-γ é a citocina característica do fenótipo Th1, e além disso, é importante

para o estabelecimento do fenótipo Th1 (Wenner et al., 1996). No entanto, alguns

trabalhos sugerem que a ausência de IL-4 é suficiente para o desenvolvimento de

um fenótipo Th1 (Tanaka et al., 1993). Portanto, a precisa contribuição do IFN-γ no

desenvolvimento do fenótipo Th1 ainda requer estudos mais detalhados.

24

A identificação biológica dos efeitos biológicos do IFN-γ in vivo se torna

complexa, uma vez que esta citocina influencia diferentes tipos celulares. A

determinação dos tipos celulares envolvidos e os efeitos biológicos induzidos pelo

IFN-γ precisam ser melhor estabelecidos. Alguns trabalhos caracterizam as células

NK e células T CD8+ como boas produtoras de IFN-γ in vivo (Das et al., 2001).

Trabalhos mais recentes sugerem que células T CD8+ e não CD4+, após estímulo via

TCR nas células primárias, são excelentes produtoras de IFN-γ, podendo

representar uma fonte inicial de IFN-γ que atue diretamente na diferenciação da

célula T CD4+ para o fenótipo Th1 (Teixeira et al., 2005).

25

2- OBJETIVOS 2.1- Geral

Após estimulação, as células T CD4+ podem se diferenciar e se comprometer

para um fenótipo Th1 ou Th2. Células Th1 produzem IFN-γ enquanto células Th2

produzem IL-4, IL-5 e IL-13. Vários fatores influenciam a diferenciação,

principalmente as citocinas presentes no microambiente onde as células T CD4+

encontram o antígeno (Seder & Paul, 1994). IL-12 e IFN-γ são conhecidas como as

principais citocinas que induzem a diferenciação para a aquisição do fenótipo Th1

(Szabo et al., 2003). As células T CD8+ são boas produtoras de IFN-γ (Stager &

Kaye, 2004), e por isso tem sido sugerido que estas células podem representar uma

fonte inicial de IFN-γ, influenciando a diferenciação Th1 das células T CD4+ (Das et

al., 2001; Teixeira et al., 2005). Contudo, os mecanismos pelo qual as células T

CD8+ modulam a diferenciação de células T CD4+ para o fenótipo Th1 ainda não

estão completamente estabelecidos. As células T CD8+ podem ser ativadas por

antígenos exógenos por DCs através do complexo de MHC de classe I pelo

mecanismo de apresentação cruzada. O objetivo central deste trabalho é avaliar se

as células T CD8+ são capazes de produzir IFN-γ em resposta ao estímulo por

apresentação cruzada, e se esta citocina é capaz de influenciar a diferenciação de

células T CD4+.

Portanto, temos como objetivo principal neste trabalho estudar o efeito da

apresentação cruzada por DCs às células T CD8+ na diferenciação de células T

CD4+ para o fenótipo Th1.

2.2- Específicos

• Estabelecer um protocolo de purificação de células dendríticas do baço de

camundongos C57Bl/6;

• Caracterizar o estágio de maturação e os subtipos das DCs purificadas;

• Padronizar um modelo de apresentação cruzada in vitro;

• Avaliar o papel do IFN-γ produzido por células T CD8+ através de

apresentação cruzada na diferenciação de células T CD4+ para o fenótipo

Th1.

26

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1- Animais Utilizados

Em todos os experimentos, foram utilizados camundongos entre 8 e 12

semanas de idade, mantidos e criados no biotério do Instituto Nacional de Câncer

(INCA) do Rio de Janeiro. Utilizamos a linhagem de camundongos geneticamente

deficientes para IFN-γ (IFN-γ -/-) (Dalton et al., 1993) e para β2m (β2m -/-) (Zijlstra et

al., 1990). Camundongos com TCR transgênico responsivo a ovalbumina (OVA)

restrito ao MHC de Classe I (OT-I) e RAG -/- (Hogquist et al., 1994) ou restrito ao

MHC de Classe II (OT-II) (Barnden et al., 1998). Utilizamos também a respectiva

linhagem selvagem, camundongos C57Bl/6, visto que todos os camundongos

transgênicos apresentam background C57Bl/6.

3.2- Cultura de Células

As culturas de células foram mantidas em meio DMEM (“Dulbecco’s Modified

Eagle’s Medium” – alta glicose 4.5 g/l - A13233) (Gibco) suplementado com 10%

SFB (Gibco), 40 mM de Bicarbonato de Sódio (Sigma), 1 mM de Fosfato de Sódio

Monobásico (Reagen; Rio de Janeiro, RJ), 1 mM de Piruvato de Sódio, solução de

aminoácidos essenciais e não-essenciais 1x, solução de vitaminas MEM 1x, 10 mM

de HEPES, 100.000U/L de penicilina e 100 mg/L de estreptomicina, 2 mM de L-

glutamina e 55 µM de β-mercaptoetanol (todos da Invitrogen). As culturas foram

mantidas em estufas úmidas a 37ºC, com 5% de CO2.

3.3- Purificação de linfócitos T CD4

Animais naives foram eutaniziados e os linfonodos inguinais, axilares,

braquiais, e cervicais superficiais dos camundongos C57Bl/6 e OT-II foram isolados

e macerados para dissociação das células. As células de cada animal foram

contadas e o número de células por animal normalizado. Foi utilizada uma coluna

magnética de purificação por seleção negativa (MACS separation columns; Miltenyi

Biotec; Auburn, CA, EUA). A coluna foi equilibrada com 15 ml de solução tampão

MACS (SFB a 0,5%; 2 mM de EDTA em q.s.p. 300 ml de H2O). A suspensão celular

de linfonodo total foi centrifugada, o sobrenadante foi descartado e as células (108)

foram ressuspendidas em 150 µl de solução tampão por 15 minutos, no escuro,

27

contendo os anticorpos anti-CD8 (0,06 mg/ml), anti-MHC de classe II (0,03 mg/ml),

anti-CD11c (0,03 mg/ml), e anti-B220 (0,06 mg/ml).

Em seguida, as células foram diluídas em 1 ml de solução tampão e

centrifugadas por 5 minutos a 1500rpm. O sobrenadante foi descartado e as células

foram ressuspendidas em 200 µl de solução tampão contendo esferas magnéticas

marcadas com estrepto-avidinas ou anti-FITC, como descrito pelo fabricante

(Miltenyi Biotec). Após 15 minutos de incubação no escuro, as células foram diluídas

em 3 ml de solução tampão e colocadas na coluna magnética. A coluna foi eluída

com 25 ml de solução tampão e a fração purificada foi recolhida durante o processo

de eluição. As células purificadas foram centrifugadas e ressuspendidas em 1 ml de

meio de cultura para posterior contagem e plaqueamento. Para avaliar o grau de

pureza das células purificadas, utilizamos marcações por citometria de fluxo com os

anticorpos específicos para cada população linfocítária. Utilizamos o citômetro de

fluxo FACScan (Becton Dickinson) e o Cell Quest (Becton Dickinson) como

programa de aquisição e análise dos dados. As purificações variam em torno de

85% a 95% de pureza.

3.4- Purificação de linfócitos T CD8

Animais naives foram eutanaziados e os linfonodos inguinais, axilares,

braquiais e cervicais superficiais dos camundongos C57Bl/6 e OT-I foram isolados e

macerados para dissociação das células. As células de cada animal foram contadas

e o número normalizado. As células dos camundongos OT-I foram cultivadas sem

passar pela coluna magnética, pois apresentam grau de pureza em torno de 95% a

99% de linfócitos T CD8+.

Para purificar os linfócitos T CD8+ dos camundongos C57BL/6, foi utilizada

uma coluna magnética de purificação por seleção negativa (MACS separation

columns; Miltenyi Biotec; Auburn, CA, EUA). A coluna foi equilibrada e as células

marcadas e purificadas como descrito no no item 3.3. No entanto, utilizamos 150 µl

de solução tampão contendo os anticorpos anti-CD4 (0,06 mg/ml), anti-MHC de

classe II (0,03 mg/ml), anti-CD11c (0,03 mg/ml), e anti-B220 (0,06 mg/ml).

Para determinar o percentual de células purificadas, utilizamos marcações de

citometria de fluxo com os anticorpos específicos para cada população linfocítária e

então as amostras foram lidas no FACScan (Becton Dickinson), utilizando o Cell

28

Quest (Becton Dickinson) como programa de aquisição e análise dos dados. As

purificações variam em torno de 85% a 95% de pureza.

3.5- Purificação de células dendríticas do baço de camundongos

Animais naives foram eutanaziados (3-5 camundongos) e o baço isolado. Foi

injetado 1 ml de DMEM 10% SFB com colagenase tipo I (1 mg/ml - Gibco) por baço.

Posteriormente, os baços foram cortados em pequenos fragmentos e mantidos a

37ºC por 20 minutos. A colagenase dissocia o tecido, facilitando a liberação das

células emaranhadas no tecido porém, ela não atua nas interações entre as células

T e DC. As células foram centrifugadas a 1500rpm por 5 minutos, ressuspendidas

em 3 ml de ACK (135 mM de NH4Cl; 10 mM de Na2HPO4; 1 mM de EDTA; 20 mM

de NaHCO3 em q.s.p. 100 ml de H2O) por 3 minutos, para lise das hemácias. Foram

novamente centrifugadas e ressuspendidas em 5 ml de HBSS. Para dissociar o

complexo célula T-DC, foi adicionado EDTA (1 ml de 0,1M EDTA, pH 7,2) ao HBSS--

por 5 minutos. Para dificultar o estabelecimento de interações entre essas células,

em todos os passos seguintes foi utilizado um tampão livre de Cálcio e Magnésio

(HBSS --) com temperatura entre 0-4ºC (Henri et al., 2001).

Posteriormente, as suspensão de células em 5 ml de HBSS-- foram

submetidas a um gradiente de Percoll (Amersham) 54% com HBSS (Sallusto et al., 1995) e centrifugadas a uma rotação de 2000g por 10 minutos. A interface foi

recolhida e adicionado 10 mL de HBSS--. As células foram centrifugadas e

ressuspendidas em 200 µl de HBSS-- com anti-CD16/32 (bloqueador de Fc) na

proporção de 1 µl para 1x106 células por 15 minutos. As células foram novamente

centrifugadas e ressuspendidas em 150 µl de Tampão MACS com o anticorpo anti-

CD11c FITC (0,1 mg/ml),. As células permaneceram marcando por 30 minutos no

escuro, no gelo e sob agitação. As células foram diluídas em 1 ml de tampão MACS,

centrifugadas e ressuspendidas em 150 µl de Tampão MACS contendo as esferas

magnéticas contra FITC, como descrito pelo fabricante (Miltenyi Biotec). Após 30

minutos de incubação no escuro, no gelo e sob agitação, as células foram diluídas

em 3ml de solução tampão e colocadas na coluna magnética.

Foi utilizada uma coluna magnética de purificação por seleção positiva (MACS

separation columns; Miltenyi Biotec; Auburn, CA, EUA). A coluna foi equilibrada com

15 ml de solução tampão. Depois de adicionar as células, a coluna foi eluída com 25

ml de tampão MACS e a fração negativa com as células não marcadas foi

29

descartada. Para lavar as células que ficaram presas, a coluna foi retirada do

suporte e realizado um fluxo reverso com a seringa. A coluna foi re-colocada no

suporte e eluída com 10ml da solução tampão. Este procedimento foi repetido mais

uma vez, e a porção intermediária foi descartada. Para retirar as células da porção

positiva, a coluna foi retirada definitivamente do suporte. Foi feito outro fluxo reverso

e a coluna foi eluída com 10ml de tampão e a fração purificada foi recolhida durante

o processo de eluição. Este procedimento foi realizado mais duas vezes. As células

purificadas foram centrifugadas e ressuspendidas em 1ml de meio de cultura para

posterior contagem e plaqueamento.

Para determinar o percentual de células purificadas, utilizamos marcações de

citometria de fluxo com os anticorpos específicos e então as amostras foram lidas no

FACScan (Becton Dickinson), utilizando o Cell Quest (Becton Dickinson) como

programa de aquisição e análise dos dados. As purificações variam em torno de

80% a 95% de pureza.

3.6- Co-cultura de DC + células T CD8+

DCs foram purificadas como descrito no item 2.5 e os linfócitos T CD8+ foram

isoladas conforme descrito no item 2.4. As DC (8x104 células) foram cultivadas em

placas de 24 poços (TPP; Suíça, Europa) na presença de diferentes concentrações

de Ovalbumina (OVA) e DMEM com 10% de SFB, e mantidas em estufa úmida por 3

horas. As células foram recolhidas, centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm. O

sobrenadante foi descartado, e as DCs foram cultivadas em placas de 24 poços, em

presença de células T CD8+ (8x105 células). As culturas foram mantidas por até 72

horas em estufa úmida a 37°C, com 5% de CO2. Posteriormente, o sobrenadante foi

recolhido e analisada a produção de citocinas por ELISA.

3.7- Diferenciação in vitro de linfócitos T CD4+

A diferenciação de linfócitos T CD4+ foi feita como descrito por Kiani et al. (1997), porém o pulso de OVA foi feito através da DC. Inicialmente, as células

dendríticas purificadas (5x105) foram estimuladas com 0,5 mg/ml de OVA em placas

de 12 poços (TPP; Suíça, Europa) e mantidas na estufa úmida a 37°C, com 5% de

CO2 por 3 horas. As células foram recolhidas, ressuspendidas em 5 ml com DMEM

10% SFB e centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm. O sobrenadante foi

descartado e as células dendríticas foram cultivadas em placas de 12 poços, com as

30

células T CD8+ (2x106) e células T CD4+ (4x106). Vinte e quatro horas após a

estimulação, rIL-2 (20 U/ml, PeproTech) foi adicionada à cultura.

Após três dias de estímulo, as células foram recolhidas, lavadas três vezes

em meio de cultura e cultivadas na ausência de estímulo e na presença de rIL-2 (20

U/ml) por 24 horas. Em seguida, as células T CD4+ forma novamente purificados. As

células foram marcadas com anti-CD8 (1 mg/ml) e anti-CD11c (1 mg/ml) e

submetidas a uma coluna magnética de seleção negativa. As células T CD4+ foram

re-cultivadas (106 células) sem estímulo (PBS) ou re-estimuladas com anti-CD3 (1

µg/ml) por 48 horas. Os sobrenadantes livres de células das culturas foram

recolhidos e analisados para a presença de IFN-γ e IL-4 por ELISA.

3.8- Marcação de células para análise por citometria de fluxo (FACs)

Células (106) foram plaqueadas em placas de 96 poços com fundo em “U”

(marca TPP). A placa foi centrifugada por 5 minutos a 1500rpm, e o sobrenadante foi

descartado. As células foram então ressuspendidas em PBS 1x contendo os

anticorpos de interesse diluídos. As amostras foram então incubadas por 15 minutos

no escuro. Em seguida, as amostras foram diluídas em 300 µl de PBS 1x e

analisadas no FACScan (Becton Dickinson).

3.9- Marcação intracelular de citocinas

Para a detecção da população celular responsável pela produção de IFN-γ,

co-cultura de células dendríticas e linfócitos, purificados e estimulados como descrito

previamente, foram mantidos por 72 horas em estufa úmida a 370C, com 5% de

CO2. Foram cultivadas na proporção de 1:10 (8x104 DC para 8x105 linfócitos) em

placa de 24 poços. Brefeldina A (10 µg/ml) foi adicionada à cultura 5 horas antes do

início da marcação intracelular, como indicado pelo fabricante (BD PharMingen).

Para cada estímulo foram utilizadas células de dois poços, que foram recolhidas,

centrifugadas e ressuspendidas em 50 µl de tampão de marcação contendo o

anticorpo anti-CD3 (1/20). As células foram incubadas por 15 minutos no escuro,

posteriormente centrifugadas e ressuspendidas em 200 µl de PBS 1x. As células

foram novamente centrifugadas, e a marcação foi fixada com 200 µl de

paraformaldeído 2% por 20 minutos. Posteriormente, as células foram centrifugadas

e ressuspendidas em 200 µl de tampão de marcação. As células foram

permeabilizadas com 150 µl de tampão de permeabilização por 10 minutos. As

31

células foram novamente centrifugadas e ressuspendidas em 20 µl de tampão de

permeabilização e marcadas intracelularmente com anticorpo anti-IFN-γ (1/50) por

30 minutos no escuro. As amostras foram então analisadas no FACScan (Becton

Dickinson), utilizando o Cell Quest (Becton Dickinson) como programa de aquisição

e análise dos dados.

3.10- ELISA

Os sobrenadantes livre de células foram coletados de culturas em diferentes

intervalos de tempos, estimuladas ou não, como descrito. Os níveis das proteínas

IFN-γ e IL-4 foram então acessados utilizando kits de ELISA comerciais (BD-

Pharmingen) de acordo com as instruções do fabricante.

3.11- Anticorpos Utilizados

anti-CD8 (clone Ly-2 53-6.7; BD Pharmingen; San Diego, CA, EUA)

anti-CD45R/B220 (clone RA3-6B2; BD Pharmingen; San Diego, CA, EUA)

anti-MHC de classe II (clone 2G9; BD Pharmingen; San Diego, CA, EUA)

anti-CD4 (clone GK1.5; BD Pharmingen; San Diego, CA, EUA)

anti-CD11c (clone HL3; BD Pharmingen; San Diego, CA, EUA)

anti-IFN-γ (clone XMG1.2; BD Pharmingen; San Diego, CA, EUA)

anti-CD80 (clone 16-10A1; BD Pharmingen; San Diego, CA, EUA)

anti-CD86 (clone GL1; BD Pharmingen; San Diego, CA, EUA)

anti-IgG (clone G94-56; BD Pharmingen; San Diego, CA, EUA)

anti-CD16/CD32 (clone 2.4G2; BD Pharmingen; San Diego, CA, EUA)

anti-CD3 (clone 14522C11; BD Pharmingen; San Diego, CA, EUA)

32

4. RESULTADOS

4.1- Purificação de células dendríticas do baço de camundongos C57BL/6

A fim de obtermos DCs purificadas do baço de camundongos C57Bl/6, foram

adaptados alguns protocolos descritos na literatura (Crowley et al., 1989; Kamath et al., 2000; Vremec & Shortman, 1997; Vremec et al., 2000; Wakkach et al., 2003),

como descrito no item 2.5 dos Materiais e Métodos. Para analisar o perfil de

purificação, foi retirada uma alíquota antes do gradiente de separação com Percoll,

depois do Percoll e depois da Coluna e marcadas com o anticorpo anti-CD11c, que é

considerado o principal marcador de DCs.

Os valores representados nos histogramas demonstram a freqüência de

células CD11c+ após cada etapa de purificação (Figura 4). Antes do Percoll, a

população de células CD11c+ representa 3% da população total. Após o Percoll,

pode ser observado um enriquecimento da população de células CD11c+ para 30%.

Depois do procedimento de purificação das células CD11c+ através de coluna

magnética por seleção positiva, as células CD11c+ representam 90% da população

celular total. Portanto, a freqüência de células CD11c+ após os procedimentos de

purificação foi sempre em torno de 90%. Todos os experimentos foram realizados

com animais não sensibilizados e as análises são representativas de todos os

experimentos realizados.

33

Figura 4- Porcentagem de células CD11c+ durante as etapas de purificação. Baços de camundongos C57BL/6 foram dissociados, tratados com colagenase e ACK (Pré Percoll). Posteriormente, as células mononucleares foram separadas por um gradiente de Percoll 54% (Pós Percoll) e então, a população celular desejada foi marcada com o anticorpo monoclonal anti-CD11c e purificada através de coluna magnética por seleção positiva (Pós coluna). Após cada etapa, as células foram marcadas com o anticorpo monoclonal anti-CD11c FITC e analisadas por citometria de fluxo.

34

4.2- Caracterização das células CD11c+ purificadas do baço de camundongos

C57BL/6

As DCs se caracterizam por possuirem uma diversidade de populações com

diferentes marcadores e estágios de ativação (Mailliard et al., 2002). Com o objetivo

de verificar o perfil das DCs purificadas a partir do baço de camundongos C57Bl/6,

células CD11c+ purificadas foram marcadas e analisadas para a expressão da

molécula MHC de classe II e para a molécula CD8α, que é considerada o principal

marcador de DCs de baço de camundongos (Wu et al., 1996).

Conforme observado na Figura 5A, a maior parte das células CD11c+

apresenta altos níveis de expressão da molécula de MHC de classe II. Quanto ao

perfil das células CD11c+ para a molécula CD8α, existem duas populações, uma

minoritária CD11c+CD8α+ e outra majoritária CD11c+CD8α- (Figura 5B). Esses

dados corroboram as caracterizações das DCs purificadas de baço de camundongos

previamente descritos (Henri et al., 2001). Portanto, a partir do baço de

camundongos C57Bl/6 naives é possível isolar células CD11c+CD8α+ CD11c+CD8α-,

que expressam altos níveis da molécula de MHC de classe II.

35

CD11c

CD

8 α

37%

63%

MH

C c

lass

e II

92%

8%

CD11c

A

B

Figura 5- Caracterização da população celular CD11c+ purificada dos baços de camundongos C57BL/6 através de coluna magnética por seleção positiva. As células CD11c+ foram purificadas como descrito no Materiais e Métodos e marcadas com o anticorpo anti-CD11c+, (A) anti-MHC de Classe II PE ou (B) anti-CD8α PE. As células foram analisadas por citometria de fluxo. Os valores indicados nos quadrantes representam as freqüências de células que expressam a molécula de MHC de classe II, CD8α e CD11c+. Os resultados são representativos de 3 experimentos independentes.

36

4.3- Caracterização do perfil de ativação de células dendríticas purificadas do baço

de camundongos C57BL/6

A habilidade das DCs maduras em estimular as células T está relacionada

com a expressão das moléculas de superfície CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2)

interagindo com CD28 e/ou CTLA4 na superfície da célula T (Lenschow et al., 1996).

A molécula CD40 na superfície da DC pode providenciar um sinal de ativação para a

DC, quando este receptor se ligar à molécula CD40L nas células T (Caux et al., 1994).

Com o objetivo de avaliar o perfil de ativação e maturação das DCs, foram

utilizadas células CD11c+ purificadas como descrito no Materiais e Métodos e

marcadas com anticorpos contra as moléculas de superfície CD80, CD86 e CD40.

Como demonstra a Figura 6, as células CD11c+ apresentam altos níveis de

expressão da molécula CD80. O histograma demonstra também que a população de

células CD11c+ apresenta a expressão da molécula CD86. Para a molécula CD40, a

maioria das células CD11c+ expressa altos níveis da molécula CD40. O nível de

expressão destas moléculas está de acordo com o descrito na literatura (Vremec &

Shortman, 1997). A análise destes resultados sugere que a maioria das DCs

purificadas do baço de camundongos C57Bl/6 é madura e previamente ativada.

37

CD80

CD86

CD40

Nº d

e C

é lu l

as

Figura 6- Perfil de ativação das células CD11c+ purificadas dos baços de camundongos C57BL/6. As células CD11c+ foram purificadas como descrito nos Materiais e Métodos, marcadas com anticorpos monoclonais anti-CD80 PE, CD86 PE e CD40 PE, e analisadas por citometria de fluxo. As linhas vazadas representam as células não marcadas com os anticorpos, enquanto que as linhas cheias representam as células marcadas com os respectivos anticorpos. Os resultados são representativos de 3 experimentos independentes.

38

4.4- Ensaio de curva da dose de antígeno (OVA) e do tempo para o estabelecimento

de um modelo de apresentação cruzada in vitro

Durante o processo de maturação, as DCs têm a sua capacidade de fagocitar

material antigênico ou particulado diminuída. A maioria das DCs purificadas é

madura e ativada (Figuras 5 e 6). Com o objetivo de avaliar a funcionalidade das

DCs purificadas, verificamos se esta população celular era capaz de endocitar e

degradar um antígeno e apresentá-lo, ativando um linfócito T CD8+. Para isso, foram

feitas co-culturas de DCs estimuladas com OVA e células T CD8+ de camundongos

OT-I. A capacidade de ativação da células T CD8+ pode ser avaliada pela presença

de IFN-γ no sobrenadante da cultura. Após retirarmos os linfonodos de

camundongos OT-I x RAG-/- naives, observamos que 97% das células são linfócitos

T CD8+. Desta forma, não foi necessária a purificação por coluna magnética e estas

células foram diretamente cultivadas.

Para determinar uma concentração de OVA capaz de ativar as células T

CD8+, foi feito um ensaio com diferentes concentrações de OVA. No modelo de co-

cultura de células CD11c+ com células T CD8+, como demonstra a Figura 7A, a dose

de antígeno de 0,5 mg/ml induziu maior produção de IFN-γ em 72 horas. A Figura 7B

demonstra que quando cultivadas isoladamente, nem a DC e nem a célula T CD8+

produzem níveis detectáveis de IFN-γ. Além disso, quando a co-cultura foi

estimulada com 0,5mg/ml de OVA em diferentes tempos, em 72 horas observamos

maior produção de IFN-γ.

Portanto, as células CD11c+ purificadas do baço de camundongos são

capazes de endocitar o antígeno e, em presença de células T CD8+, induzir a

produção de IFN-γ no modelo de co-cultura in vitro. Esta metodologia foi empregada

durante todos experimentos seguintes de co-cultura.

39

0 0.1 0.2 0.50.0

0.2

0.4

0.6

0.8

OVA (mg/ml)

IFN-

γ (n

g/m

l)

24 48 720.0

0.2

0.4

0.6

0.8 DCCD8DC + CD8

Tempo (horas)

IFN-

γ (n

g/m

l)

A

B

Figura 7- Ensaio de curva da dose de antígeno (OVA) e do tempo de cultura. (A) Células CD11c+ foram purificadas como descrito nos Materiais e Métodos, cultivadas com as diferentes concentrações de OVA em presença de células T CD8+ de camundongos OT-I, na proporção de 1:10, por 72 horas. (B) Células CD11c+ foram purificadas como descrito nos Materiais e Métodos, cultivadas com 0,5mg/ml de OVA em presença de células T CD8+ de camundongos OT-I, na proporção de 1:10, por diferentes tempos. O sobrenadante livre de células foi analisado para medir os níveis de IFN-γ através de ELISA. Os resultados são representativos de 3 experimentos independentes.

40

4.5- Análise da população celular produtora de IFN-γ no modelo de apresentação

cruzada in vitro

Na Figura 7 foi observado que 0,5 mg/ml de OVA é capaz de induzir a co-

cultura a produzir IFN-γ. No entanto, não se pode afirmar qual a população celular

que está produzindo o IFN-γ. Está descrito que tanto as células T CD8+ quanto as

DCs são capazes de produzir IFN-γ (Wenner et al., 1996; Ohteki et al., 1999). Para

determinar a população celular responsável pela produção de IFN-γ, foram

purificadas DCs de camundongos IFN-γ-/- e cultivadas com células T CD8+. A Figura

8A demonstra que independente da DC ser capaz de produzir IFN-γ, os níveis de

IFN-γ foram similares, sugerindo que as células T CD8+ seriam as produtoras desta

citocina.

Para avaliar se as células T CD8+ de camundongos transgênicos OT-I,

caracterizado por apresentar TCR transgênico responsível a OVA e restrito ao MHC

de classe I, são capazes de responder ao estímulo com maior produção de IFN-γ do

que as células T CD8+ purificadas dos linfonodos de camundongos C57Bl/6, foram

feitas co-culturas destas células com DCs. Como observado na Figura 8B, as células

T CD8+ de camundongos C57Bl/6 não produzem IFN-γ em níveis detectáveis,

enquanto que as células T CD8+ dos camundongos OT-I produzem níveis

detectáveis de IFN-γ. Novamente, este resultado demonstra que neste modelo de

co-cultura, as DCs são capazes de estimular células T CD8+, que quando ativadas

produzem IFN-γ.

Para caracterizar a população celular responsável pela produção de IFN-γ, foi

feita uma marcação intracelular para a produção de IFN-γ na co-cultura de DC e

células T CD8+ de camundongos OT-I. Como demonstra a Figura 8C, a freqüência

de células CD3+ com marcação intracelular de IFN-γ é de 98%. Como a co-cultura é

constituída apenas de DC e células T CD8+, podemos afirmar que as células CD3+

são as células T CD8+.

Este conjunto de resultados demonstram que as DCs são capazes de

estimular os linfócitos T CD8+ de camundongos OT-I a produzirem IFN-γ.

41

PBS OVA0.0

0.2

0.4

0.6 DC (IFNγ+/+) + CD8DC (IFNγ-/-) + CD8

IFN-

γ (n

g/m

l)A

PBS OVA0

5

10

15 DC + CD8 (C57BL/6)DC + CD8 (OT-I)

IFN-

γ (n

g/m

l)

B

CD3

IFN

-γ

98%2%C

Figura 8- Análise da população celular produtora de IFN-γ no modelo de apresentação cruzada in vitro. (A) Co-culturas de células CD11c+ IFN-γ +/+ ou IFN-γ -/-, purificadas e estimuladas como descrito nos Materiais e Métodos com linfócitos T CD8+ de camundongos OT-I foram mantidas em cultura por 72 horas, na proporção de 1:10. (B) Co-culturas de células CD11c+ de camundongos C57BL/6, foram purificadas e estimuladas como descrito na Figura 4, com linfócitos T CD8+ de camundongos OT-I ou com linfócitos T CD8+ purificados de camundongos C57Bl/6, como descrito nos Materiais e Métodos. O sobrenadante livre de células foi então coletado e analisado para medir os níveis de IFN-γ através de ELISA. (C) Co-cultura de células CD11c+ e linfócitos T CD8 de camundongos OT-I, foram purificadas e estimuladas como descrito na Figura 4. As células foram recolhidas e marcadas na superfície com anticorpo monoclonal anti-CD3 PE, fixadas e permeabilizadas para a marcação intracelular com o anticorpo monoclonal anti-IFN-γ FITC. A análise foi realizada por citometria de fluxo. Os resultados são representativos de 3 experimentos independentes.

42

4.6- Estabelecimento de um modelo de apresentação cruzada in vitro

Foi demonstrado nas Figuras 7 e 8 que DCs cultivadas in vitro com OVA em

presença de células T CD8+, são capazes de ativar as células T CD8+ a produzirem

IFN-γ. No entanto, o mecanismo desta ativação não foi determinado. Com o objetivo

de avaliar se as células T CD8+ estão sendo ativadas pelo mecanismo de

apresentação cruzada, foram utilizadas DCs purificadas de camundongos β2-

microblogulina -/-, e um bloqueador de proteossomo.

DCs são capazes de formar o complexo MHC de classe I na superfície e

ativar células T CD8+. Como demonstra a Figura 9A, DCs purificadas de

camundongos β2m+/+ e cultivadas com OVA são capazes ativar as células T CD8+.

Em compensação, DCs de camundongos β2m-/- não formam o complexo MHC de

classe I com o antígeno estável na superfície. Como esperado, quando as células T

CD8+ de camundongos OT-I foram cultivadas em presença de DCs purificadas de

camundongos β2m-/-, não foi observada a ativação das células T CD8+ pois não

foram obtidos níveis detectáveis de IFN-γ.

O bloqueador de proteossomo impede que a DC degrade o antígeno, não

ocorrendo a apresentação cruzada. Quando a DC foi cultivada em presença do

bloqueador de proteossomo MG132 (Figura 9B), não foi detectada a produção de

IFN-γ pelas células T CD8+. Quando foi utilizado apenas o veículo diluente do

bloqueador de proteossomo, o DMSO, a DC continuou sendo capaz de degradar o

antígeno e ativar a célula T CD8+ a produzir IFN-γ.

Estes resultados demonstram que as DCs purificadas são capazes de ativar

as células T CD8+ após endocitarem um antígeno exógeno, ou seja, realizar o

mecanismo de apresentação cruzada. Portanto, foi consolidado um modelo de

apresentação cruzada in vitro.

43

PBS OVA0.0

0.2

0.4

0.6 DC (β2m+/+) + CD8DC (β2m-/-) + CD8

IFN-

γ (n

g/m

l)

PBS OVA0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 DC + CD8 + DMSODC + CD8 + MG-132

IFN-

γ (n

g/m

l)

A

B

Figura 9- Estabelecimento de um modelo de apresentação cruzada in vitro. (A) Co-culturas de células CD11c+ de camundongos β2m+/+ ou β2m-/- purificadas e estimuladas como descrito nos Materiais e Métodos, com linfócitos T CD8+ de camundongos OT-I foram mantidas em cultura por 72 horas, na proporção de 1:10. (B) Células CD11c+ de camundongos C57BL/6, foram purificadas e estimuladas como descrito nos Materiais e Métodos. Durante o período de estímulo, foi adicionado a cultura o bloqueador de proteossomo (MG132), e posteriormente os linfócitos T CD8+ de camundongos OT-I foram adicionados à co-cultura por 72 horas na proporção de 1:10. Os sobrenadantes livres de células foram coletados e analisados para medir os níveis de IFN-γ através de ELISA. Os resultados são representativos de 3 experimentos independentes.

44

4.7- Análise do papel do IFN-γ na diferenciação de células T CD4+

A apresentação cruzada é um mecanismo importante para a resposta de

células T CD8+ efetoras (revisto por Bevan, 2006). A diferenciação das células T

CD4+ é altamente sensível às condições que prevalecem no microambiente onde

estas células reconhecem o antígeno. O desenvolvimento e estabelecimento do

fenótipo Th1 em células T CD4+ é principalmente influenciado por IL-12 e IFN-γ

(Jacobson et al., 1995). Para abordar o papel do IFN-γ produzido pelas células T

CD8+ na diferenciação das células T CD4+, foi utilizado um modelo de diferenciação

das células T CD4+ em presença de DC estimuladas com OVA e células T CD8+.

Como controle, foram utilizadas células T CD8+ purificadas de camundongos

C57Bl/6, que como mostrado anteriormente na Figura 8B, não produziam IFN-γ em

níveis detectáveis em resposta à apresentação cruzada. As células T CD4+

diferenciadas em presença destes linfócitos, quando re-estimuladas com anti-CD3,

produziram baixos níveis de IFN-γ (Figura 10A) e altos níveis de IL-4 (Figura 10B).

Este perfil de produção de citocinas é característico de uma célula T CD4+

diferenciada para a resposta imune do tipo Th2. Quando as células T CD4+ foram

diferenciadas em presença de células T CD8+ de camundongos OT-I, capazes de

produzir IFN-γ em resposta à apresentação cruzada, e re-estimulados com anti-CD3,

foi observado que as células T CD4+ produziram níveis maiores de IFN-γ (Figura

10A) e menores de IL-4 (Figura 10B). Este perfil de produção de citocinas é

característico de uma célula T CD4+ diferenciada para uma resposta imune do tipo

Th1. Juntos estes resultados indicam que o IFN-γ produzido pela célula T CD8+ está

influenciando a diferenciação das células T CD4+ para um fenótipo Th1.

45

PBS anti-CD30

100

200

300

400DC + CD8 (C57BL/6) + CD4DC + CD8 (OT-I) + CD4

IFN-

γ (n

g/m

l)

PBS anti-CD30

100

200

300

400 DC + CD8 (C57BL/6) + CD4DC + CD8 (OT-I) + CD4

IL-4

(pg/

ml)

A

B

Figura 10- Análise da influência do IFN-γ na diferenciação de linfócitos T CD4+. Linfócitos T CD4+ foram purificados dos linfonodos de camundongos OT-II, diferenciados e re-estimulados in vitro como descrito nos Materiais e Métodos, na presença de DCs de camundongos C57BL/6 e linfócitos T CD8+ de camundongos C57BL/6 ou OT-I. Após o re-estímulo de 48 horas, o sobrenadante livre de células foi coletado e analisado para a produção (A) de IFN-γ ou (B) de IL-4 por ELISA. Os resultados são representativos de 3 experimentos independentes.

46

4.8- Influência da apresentação cruzada na diferenciação de células T CD4+

Apesar dos resultados até agora mostrados sugerirem que o IFN-γ produzido

pela célula T CD8+ influencia a diferenciação da célula T CD4+ para um fenótipo Th1,

ainda não foi demonstrado qual o mecanismo de ativação da célula T CD8+ neste

modelo. Os resultados anteriores sugerem que a célula T CD8+ está sendo ativada

através do mecanismo de apresentação cruzada. Para avaliar a influência da

apresentação cruzada na estimulação da célula T CD8+, e como esta ativação

influencia a diferenciação das células T CD4+, foi realizada a diferenciação da célula

T CD4+ em co-cultura com DCs purificadas do baço de camundongos β2m-/- e célula

T CD8+ de camundongos OT-I.

Como demonstra a Figura 9A, DCs de purificadas de camundongos β2m-/-

não foram capazes de realizar a apresentação cruzada para célula T CD8+ de

camundongos OT-I. As células T CD4+ que foram diferenciadas em presença de

DCs β2m-/- e células T CD8+, quando re-estimuladas com anti-CD3, produziram

baixos níveis de IFN-γ (Figura 11A) e altos níveis de IL-4 (Figura 11B). As células T

CD4+ parecem estar diferenciadas para o fenótipo Th2. Em contrapartida, as células

T CD4+ diferenciadas em presença de DC β2m+/+ e células T CD8+ quando re-

estimuladas com anti-CD3, expressaram um fenótipo Th1, pois produziram altos

níveis de IFN-γ (Figura 11A) e baixos níveis de IL-4 (Figura 11B). Estes resultados

sugerem que em presença de células T CD8+ ativadas por apresentação cruzada, as

células T CD4+ se diferenciam para o fenótipo Th1.

47

PBS anti-CD30

100

200

300

400DC (β2m+/+) + CD8 + CD4DC (β2m-/-) + CD8 + CD4

IFN-

γ (n

g/m

l)

PBS anti-CD30

100

200

300DC (β2m+/+) + CD8 + CD4DC (β2m-/-) + CD8 + CD4

IL-4

(pg/

ml)

A

B

Figura 11- Influência da apresentação cruzada na diferenciação de linfócitos T CD4+. Linfócitos T CD4+ foram purificados dos linfonodos de camundongos OT-II, diferenciados e re-estimulados in vitro como descrito nos Materiais e Métodos, na presença de DCs de camundongos β2m+/+ ou β2m/- e linfócitos T CD8+ de camundongos OT-I. Após o re-estímulo de 48 horas, o sobrenadante livre de células foi coletado e analisado para (A) INF-γ ou (B) IL-4 por ELISA. Os resultados são representativos de 3 experimentos independentes.

48

5. DISCUSSÃO

As DCs são APCs que se caracterizam por possuírem uma população celular

heterogênea, com diferentes características em seus estágios de ativação.

Normalmente elas apresentam antígenos exógenos no MHC de classe II, ativando

células T CD4+, mas também podem realizar o mecanismo de apresentação

cruzada, ativando células T CD8+ (revisto por Heath e Carbone, 2001).

A fim de avaliar a influência do IFN-γ produzido por células T CD8+, após

estímulo via apresentação cruzada, na diferenciação de células T CD4+, foram

purificadas DCs de baços de camundongos por seleção positiva através de uma

coluna magnética. As frações resultantes da purificação atingiram um grau de

pureza em torno de 90% de células CD11c+ durante todo o estudo (Figura 4).

Conseqüentemente, o grau de contaminação com outras populações celulares

constituintes de um baço, está de acordo com estudos anteriores que utilizam

métodos de purificação semelhantes (Crowley et al., 1988; Kamath et al., 2000;

Vremec & Shortman, 1997; Vremec et al., 2000; Wakkach et al., 2003). Está descrito

que apesar de muitos tipos de células endocíticas, incluindo macrófagos, células B,

neutrófilos e células endoteliais serem capazes de realizar a apresentação cruzada

in vitro, esta apresentação é de baixa eficiência e a DC é a principal célula capaz de

realizar este mecanismo (Reis e Souza & Germain, 1995).

A habilidade das DCs maduras em estimular células T está relacionada com a

expressão das moléculas co-estimulatórias CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2) (Lenschow

et al., 1996). As células T expressam CD40L, que podem providenciar um sinal de

ativação via CD40 na superfície da DC (Caux et al., 1994). Esta ativação da DC leva

a um aumento da expressão de CD80/CD86, citocinas como IL-12, IL-1, TNF-α e

quimiocinas (Sallusto e Lanzavecchia, 1994). Vremec e Shortman em 1997,

analizaram a expressão de CD40, CD80 e CD86 em subpopulações de DCs do

baço, timo e linfonodo de camundongos. As DCs de ambos os tecidos expressam

diferentes níveis das moléculas CD80 e CD86, e a expressão de CD40 foi um pouco

menor nas DCs purificadas do baço. Quando colocadas em cultura, eles observaram

aumento na expressão de CD80, mas pouca modificação na expressão de CD86

(Vremec & Shortman, 1997). A partir de DCs purificadas, analisamos a expressão

das moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86, das moléculas de MHC de classe II e

CD40. Como esperado, a maior parte das DCs é madura, pois apresentam

49

expressão de MHC de classe II (Figura 5A). Quanto as moléculas CD80, CD86 e

CD40, as DCs purificadas apresentam níveis de expressão diferentes. Estes níveis

de expressão foram similares em todos os experimentos (Figura 6) e corroboram as

caracterizações das DCs purificadas de baço de camundongos previamente

descritos (Henri et al., 2001; Vremec & Shortman, 1997). As DCs maduras tem a

capacidade de capturar e processar antígenos diminuída, mas sua capacidade de

apresentação e estimulação de linfócitos é aumentada em relação a DC imatura

(revisto por Banchereau et al., 2000). Vários trabalhos utilizam DCs maduras

purificadas a partir do baço de camundongos como modelo de estudo in vitro, e

estas células apesar de terem uma eficiência diminuída no processo de endocitose e

processamento, são capazes de capturar o antígeno e estimular as células T

(Maldonado-Lopez et al., 1999; Kamath et al., 2000; Vremec & Shortman, 1997;

Wakkach et al., 2003).

Várias subpopulações de DCs têm sido caracterizadas quanto a origem,

localização e função (revisto por Banchereau et al, 2000). Diversos estudos

anteriores sugerem que as DCs CD8α+, e não as CD8α-, são capazes de fazer

apresentação cruzada para as células T CD8+ (den Hann et al, 2000). Além disso,

em camundongos, DCs maduras CD8α+ produzem IL-12 e preferencialmente

estimulam a diferenciação de células T CD4+ para o fenótipo Th1, enquanto que as

DCs CD8α- induzem a produção de IL-4 estimulando a diferenciação para Th2

(Maldonado-Lopez & Moser, 2001). Outros trabalhos sugerem que a ligação de

moléculas co-estimulatórias podem influenciar na ativação de linfócitos (Swallow et. al., 1999; Ling et al., 200). A partir de DCs purificadas, foi avaliado o perfil da

população CD11c+ e observamos que são majoritariamente CD8α- (Figura 5B)

corroborando os dados da literatura que demonstram que as DCs purificadas do

baço de camundongos apresentam uma população minoritária CD8α+ (Vremec &

Shortman, 1997; revisto por Ardavín, 2003).

Após terem processado o antígeno, as DC maduras estão aptas a apresentar

o antígeno no complexo MHC de classe I às células T CD8+ por meio do TCR. Após

esta sinalização, as células T CD8+ se diferenciam em células citotóxicas,

desenvolvendo sua função efetora e produzindo citocinas, especialmente IFN-γ

(Wenner et al, 1996). A diferenciação de células T CD8+ não ativadas em células

efetoras requer o reconhecimento do antígeno e um estímulo secundário, seja por

50

moléculas co-estimulatórias, como as moléculas B7, ou por citocinas produzidas

pelas células T CD4+.

O modelo de maturação das DCs, onde estas células têm diminuída sua

capacidade de fagocitar material antigênico ou particulado quando migram para os

órgãos linfóides, e passam a ser capazes de estimular as células T, é bem aceito.

Contudo, Kamath e colaboradores (2000) demonstram que em torno de 10% das

DCs do baço de camundongos tiveram uma ou mais esferas fluorescentes

endocitadas. Eles demonstraram que todas as subpopulações de DCs do baço de

camundongos são capazes de realizar a endocitose de esferas tanto in vitro quanto

in vivo. Surpreendentemente, quando as DCs receberam LPS (estímulo de

maturação) permaneceram com a capacidade de endocitar as esferas (Kamath et al., 2000). Portanto, apesar das DCs dos baços expressarem os marcadores de

maturação ainda realizam o mecanismo de endocitose. Desta forma, foi testada a

capacidade das DCs purificadas em endocitar a OVA e estimular as células T CD8+

in vitro. Como é possível observar na Figura 7, a dose de antígeno mais eficiente na

estimulação da célula T CD8+ foi de 0,5 mg/ml de OVA e o tempo de cultura de 72

horas. Com este resultado, é possível concluir que a DC purificada é capaz de

endocitar, processar e apresentar o antígeno in vitro, pois está sendo capaz de

induzir a produção de IFN-γ.

Alguns trabalhos demonstram que as DCs CD8α+ são a única população de

DCs capaz de realizar a apresentação cruzada de OVA (den Haan et al., 2000;

Pooley et al., 2001). Independente da subpopulação celular que esteja realizando a

apresentação cruzada, do estágio de maturação e das moléculas co-estimulatórias,

as DCs estão sendo capazes de induzir a produção de IFN-γ neste modelo de co-

cultura. Este resultado corrobora os dados da literatura, onde DCs analisadas in vitro, tanto as imaturas quanto maduras, exibem capacidades similares para

proteólise lisossomal. Esta capacidade de proteólise pode estar relacionado com a

capacidade de apresentação cruzada. O mecanismo preciso pelo qual a proteólise é

ativada, ainda não está claro, mas certas proteases lisossomais são convertidas a

sua forma madura ou redistribuídas após a maturação da célula dendrítica (revisto

por Trombeta & Mellman, 2005).

A Figura 7 demonstra que a co-cultura DC-célula T CD8+ está sendo capaz de

produzir IFN-γ, mas não demonstra qual população celular está sendo responsável

por esta produção. Sabe-se que as células T CD8+ são boas produtoras de IFN-γ

51

(Wenner et al., 1996; revisto por Stager & Kaye, 2004), e que as DCs também são

capazes de produzir IFN-γ (Ohteki et al., 1999). Para avaliar se a DC poderia ser

responsável pela produção do IFN-γ, foram purificadas DCs do baço de

camundongos IFN-γ-/-. Independente da DC ser capaz ou não de produzir IFN-γ, a

co-cultura produziu níveis similares de IFN-γ (Figura 8A), sugerindo que as células T

CD8+ seriam as produtoras desta citocina. Quando foram utilizadas células T CD8+

de camundongos C57Bl/6 na co-cultura, não foram obtidos níveis detectáveis de

IFN-γ. O contrário foi observado quando foram utilizadas células T CD8+ de

camundongos transgênicos OT-I, cujas as células T CD8+ apresentam TCR

transgênico responsível a OVA e restrito ao MHC de classe I e produziram níveis

detectáveis de IFN-γ (Figura 8B). Através da marcação intracelular para a produção

de IFN-γ na co-cultura, pode-se observar que 98% das células T estão com

marcação intracelular de IFN-γ (Figura 8C), e como na cultura temos apenas DC e

células T CD8+, pode-se afirmar que as células T CD8+ estão produzindo IFN-γ.

As Figuras 7 e 8 demonstram que quando a DC é estimulada com OVA, ela é

capaz de ativar as células T CD8+ in vitro, e estas são capazes de produzir IFN-γ.

Sabe-se que as DCs podem apresentar antígenos por apresentação cruzada às

células T CD8+ (Pooley et al., 2001). Em co-culturas de DCs purificadas de

camundongos β2-microblogulina -/- com células T CD8+, o nível de IFN-γ produzido

não foi detectável pelo ELISA (Figura 9A), demonstrando que as células T CD8+

estão sendo ativadas pelas DCs pelo mecanismo de apresentação cruzada.

Alguns trabalhos demostram que a apresentação cruzada depende de dois

componentes da via de MHC de classe I – o complexo de proteossomos e moléculas

transportadoras associadas com a apresentação de antígenos (TAP) (revisto por

Cresswell, 2005). O complexo de proteossomos degrada as proteínas no citosol e o

transporte por TAP resulta em antígenos peptídicos no ER aptos a se ligarem à

moléculas de MHC de classe I (Brossart & Bevan, 1997). Outros trabalhos sugerem

uma via TAP-independente, onde o antígeno é hidrolisado em endossomos (Pfeifer

et al, 1993). Quando bloqueamos a degradação do antígeno, com um bloqueador de

proteossomo, a produção de IFN-γ não ocorreu em níveis detectáveis pelo ELISA

(Figura 9B), sugerindo que o antígeno está sendo degradado por proteossomos na

DC. Estes resultados demonstram um modelo in vitro de apresentação cruzada,

52

onde as DCs são capazes de ativar as células T CD8+ após endocitarem um

antígeno exógeno e apresentá-lo via MHC de classe I.

Como mencionado inicialmente, a diferenciação das células T CD4+ para um

fenótipo Th1 ou Th2 é influenciado pelas condições no microambiente onde estas

células encontram o antígeno. Alguns estudos demonstram que a presença de IFN-γ

é fator essencial para a produção posterior de IFN-γ pela célula T CD4+ (Bradley et

al., 1996). Outros estudos demonstram que a diferenciação da célula T CD4+ para o

fenótipo Th1 é principalmente influenciada por IL-12 e IFN-γ (Jacobson et al, 1995).

Contudo, o papel exato que o IFN-γ exerce na diferenciação de CD4 para o fenótipo

Th1 ainda não está completamente elucidado e a população celular responsável

pela produção desta citocina ainda não está demonstrada.

Alguns estudos sugerem que o IFN-γ pode ser produzido por células NK e

após ativação, por células T CD8+ e NKT (Lertmemongkolchai et al., 2001).

Macrófagos, DCs e células B também podem produzir IFN-γ (Ohteki et al., 1999).

Outros trabalhos demonstram que as células NK e as células T CD8+ são boas

produtoras de IFN-γ in vivo (Martín-Fontecha et al., 2004; Das et al., 2001).

Trabalhos mais recentes sugerem que células T CD8+ e não CD4+, após estímulo via

TCR nas células primárias, são excelentes produtoras de IFN-γ, podendo

representar uma fonte inicial de IFN-γ atuando diretamente na diferenciação da

célula T CD4+ para o fenótipo Th1 (Teixeira et al., 2005). Porém, os mecanismos de

ativação das células T CD8+ na diferenciação das células T CD4+ para o fenótipo

Th1 ainda não estão bem estabelecidos.

Para avaliar esses aspectos, foi utilizada uma co-cultura de DCs, células T

CD4+ e células T CD8+. As células T CD4+ diferenciadas em presença de células T

CD8+ capazes de produzir IFN-γ produziram níveis mais elevados de IFN-γ e

menores níveis de IL-4, características de células T CD4+ diferenciadas para um

fenótipo Th1. Já as células T CD4+ diferenciadas em presença de células T CD8+

que não produzem IFNγ produziram níveis elevados de IL-4 e baixos níveis de IFN-γ,

característicos de fenótipo Th2 (Figura 10).

Neste modelo de co-cultura, foi demonstrado que o IFN-γ produzido pela

CD8+ polariza uma resposta Th1, mas não foi avaliado se esta ativação está sendo

dependente do mecanismo de apresentação cruzada. Para abordar este aspecto, foi

utilizado um protocolo de diferenciação em co-culturas usando DCs purificadas de

53

camundongos β2m+/+ ou β2m/-. Como demonstra a Figura 11, células T CD4+

diferenciadas em presença de DCs incapazes de realizar a apresentação cruzada

(β2m-/-), demonstram um fenótipo Th2, com altos níveis de IL-4 e baixos níveis de

produção de IFN-γ. Este fenótipo foi revertido quando foi utilizada DCs capazes de

realizar o mecanismo de apresentação cruzada (β2m+/+). Portanto, o mecanismo de

apresentação cruzada é capaz de induzir a célula T CD8+ a produzir IFN-γ, que

potencializa a diferenciação das células T CD4+ para um fenótipo Th1.

Como abordado anteriormente, vários fatores influenciam o processo de

diferenciação das linhagens Th1 e Th2, incluindo o tipo de APC, a concentração do

antígeno (duração e força do sinal), a ligação de moléculas co-estimulatórias e o

envolvimento de citocinas. Alguns estudos sugerem que a escolha Th1/Th2 é feita

logo após a apresentação do antígeno pelas DCs às células T CD4. (revisto por

Abbas et al, 1996; Constant & Bottomly, 1997).

Para dar continuidade ao trabalho, pretendemos verificar se o estágio de

maturação da DC, ou se as moléculas co-estimulatórias podem influenciar a

aquisição de fenótipo Th1. Isto, baseado nos dados que demonstram que o

processo de maturação está associado com vários eventos coordenados, como a

perda de receptores endocíticos/fagocíticos, o aumento da expressão de moléculas

coestimulatórias CD40, CD58, CD80 e CD86, a mudança na morfologia, e a

diminuição da expressão de CD86 e mudanças nos compartimentos de MHCII.

Portanto, todos estes aspectos podem influenciar na resposta imune.

Outros trabalhos em camundongos demonstram que as DCs maduras CD8α+

produzem IL-12 e preferencialmente estimulam a diferenciação Th1. Um segundo

subtipo de DCs, as CD8α- induzem a produção de IL-4 estimulando a diferenciação

para Th2 (Maldonado-Lopez, et al., 2001). A produção de IL-12 pode ser modulada

por citocinas e mediadores presentes durante a maturação da DC (Kalinski et al., 1999). Contudo, a produção de IL-12 é restrita a uma janela temporal de 8-16 horas

após a indução da maturação (Langenkamp et al., 2000). Portanto, avaliar o papel

da IL-12, utilizando DCs de camundongos IL-12-/- é um ponto interessante a ser

avaliado.

Além disso, nos modelos de interação entre as células T CD4+, CD8+ e DCs

durante a resposta imune mediada por células, sugere-se que a ativação da DC por

patógenos ou por resposta tecidual induzida por patógeno (Medzhitov & Janeway,

1997) é necessária para a migração das DCs para os linfonodos e para sua

54

habilidade em ativar células T naives. O passo seguinte é mediado por interações

DC40-CD40L com as células T CD4+ específicas ao antígeno, levando a DC a

adquirir um segundo passo no nível de ativação e efetivamente interagir com as

células T CD8+ (Bennett et al., 1998).

Ainda não se sabe se a interação DC-células T CD8+ resulta em algum sinal

que pode afetar a resposta das células T CD8+ (Mailliard et al., 2002). Este seria

outro aspecto interessante a ser abordado. Kapsenber e colaboradores (1999)

demonstraram que as DCs que sofreram a maturação em presença de células T

CD8+ são diferentes das maturadas em presença de LPS ou citocinas inflamatórias,

incluindo IL-1β e TNF-α, onde estas DCs mostraram uma menor produção de IL-12

e redução na indução da resposta Th1 (Kalinski et al., 1999). DCs polarizadas com

IFN-γ produzem até 10 vezes mais IL-12p70 do que DCs maturadas por LPS ou

TNF-α/IL-1β. DCs maturadas em presença de células T CD8+ produziram níveis

similares de IL-12p70 (Mailliard et al., 2002). Esses dados sugerem que as células T

CD8+ podem ter influência durante a resposta imune primária induzindo a resposta

para o fenótipo Th1. No entanto, a própria célula T CD8+ necessita de ativação por

uma APC, que providencia certos níveis de co-estimulação. Portanto, tanto células T

CD4+ quanto células T CD8+ naives necessitam de uma ativação inicial dependente

de patógeno vindo da DC. Assim, sugere-se que as células T CD4+ e CD8+ atuem

num sistema de rede, controlando a atividade uma da outra, através de sinais

mediados pela DC.

Outro ponto interessante está baseado em trabalhos que sugerem que DCs

podem providenciar sinais as células T naives e influenciar a direção da resposta

Th1/Th2. Contudo, não está claro como as DCs distinguem entre diferentes classes

de patógenos que requerem a resposta Th1 versus Th2. Um mecanismo

previamente proposto sugere a habilidade de alguns patógenos intracelulares que

induzem a produção de IL-12 ou outros fatores que direcionem a diferenciação Th1.

Outra proposta é a habilidade seletiva de distintos tipos de patógenos interagirem

com diferentes subpopulações que possam induzir Th1 ou Th2 (revisto por Liu et al., 2001), através de diferentes receptores de PAMPs. (Mailliard et al., 2002). Portanto,

pode-se modular experimentalmente a interção entre patógenos e DCs através de

receptores, como PRRs, e avaliar se existe alteração no mecanismo de

diferenciaçõa das células T CD4+.

55

Está demonstrado que células T CD8+ específicas contra antígenos tumorais

tem um papel importante na erradicação do câncer pelo sistema imune (van de

Bruggem et al., 1991). Sabe-se que as células T CD8+ são ativadas quando

reconhecem antígenos tumorais no complexo do MHC de classe I nas APCs, pelo

mecanismo de apresentação cruzada (Larsson et al., 2001). Células tumorais podem

alterar a qualidade da apresentação cruzada nas DCs do hospedeiro (Hargadon et al., 2006). Além disso, a apresentação cruzada de antígenos tumorais é necessária

para induzir a ativação de células T CD8+ em alguns modelos (Nguyen et al., 2002;

Nowak, et al., 2003). A relação in vivo entre a apresentação cruzada e a

apresentação direta em modelos anti-tumorais ainda não está completamente

elucidada. Ainda não foi demonstrado se a eficiência da resposta anti-tumoral das

células T CD8+ depende da funcionalidade ou da natureza da APC. Além disso, o

microambiente onde ocorre esta apresentação também pode influenciar a ativação

dos linfócitos. Portanto, modular o mecanismo de apresentação cruzada in vivo pode

levar a potencialização da resposta imune na erradicação do tumor. Uma forma de

potencializar a apresentação cruzada e verificar seu efeito na diferenciação seria

aumentar a quantidade de peptídeos antigênicos ou aumentar a eficiência dos

proteassomos no processamento de antígenos. Fisiologicamente, a fagocitose é a

principal rota de captura de antígeno para a apresentação cruzada. Trabalhos

pioneiros em macrófagos, e mais recentemente nas DCs, mostram que antígenos

ligados a esferas de látex, forçam a entrada por fagocitose, aumentando fortemente

a capacidade de apresentação cruzada (Kovacsovics-Bankowski et al., 1993; Shen

et al., 1997).

O aumento da apresentação cruzada não pode ser explicado somente pelo

aumento da captura do antígeno, pois não necessariamente esta capacidade

endocítica resulta em uma boa apresentação cruzada. Além disso, a apresentação

cruzada também pode ser aumentada pela adição de partículas que possam atuar

como adjuvantes para antígenos solúveis (Reis e Souza & Germain, 1995).

Peptídeos ligados a diferentes HSPs, incluindo gp96, HSP90, HSP60 e HSP70,

induzem eficiente apresentação cruzada tanto in vivo quanto in vitro. No estado

constante, HSPs são ligadas com peptídeos endógenos. A interação de gp96 com

peptídeos, por exemplo, ocorre no ER e é dependente de TAP. HSPs estão

relacionadas com morte celular por necrose, e podem ser internalizados pelas APCs

através de receptores específicos, como CD91. De alguma forma, HSPs-associados

ao antígeno são transportados às moléculas de MHC de classe I ou II para a

56

apresentação do antígeno. Bloqueando o receptor CD91, reduz-se a apresentação

cruzada, o que sugere que a captura do antígeno mediada pelo receptor é

necessária (Guermonprez et al., 2003).

O estudo do mecanismo de apresentação cruzada é especialmente relevante

no contexto da imunidade, pois permite a ativação de células T CD8+ especificas.

Esta resposta das células T CD8+, além de ser importante na resposta anti-tumoral,

é necessária para o controle de parasitas intracelulares e infecções virais (revisto por

Heath et al., 2004). Entretanto, nas infecções virais ainda não está claro a

importância da apresentação cruzada (Heath & Carbone, 2001). Os patógenos

intracelulares podem ser internalizados pelas DCs em fagossomos. Sabe-se que

antígenos bacterianos podem entrar no mecanismo de apresentação cruzada (Lenz

et al., 2000) e a resposta de células T CD8+ pode contribuir na resposta imune

contra patógenos intracelulares (Watts & Amigorena, 2001). As células T CD8+

através da apresentação cruzada podem reconhecer células infectadas por

patógenos intracelulares ou vírus e produzir IFN-γ, que ajuda a ativar as APCs ou

matar as células infectadas para eliminar e resolver a infecção.

Uma das mais eficazes terapias para previnir muitas doenças infecciosas, tem

sido a estimulação da resposta imune através da vacinação. A maioria das vacinas

atuais consistem em componentes de patógenos mortos. Estas vacinas são

consideradas mais seguras, porém elas geralmente falham em ativar a resposta

imune mediada por células T CD8+ (revisto por Rock & Shen, 2005). Esta limitação

impossibilitaria o uso destas vacinas para proteger o organismo contra doenças

onde a imunidade é mediada pelas células T CD8+, como determinadas infecções

virais e o câncer. Sabe-se que as células T CD8+ não são estimuladas por estas

vacinas, pois as APCs não processam e não apresentam estes antígenos no MHC

de classe I. Se estes antígenos forem inoculados de forma a induzirem a

apresentação no MHC de classe I nas DCs, então seria possível a imunidade

mediada por células T CD8+. Alguns mecanismos têm sido sugeridos, dentre eles a

utilização de adjuvantes ou a utilização de preparações de antígenos particulados

(Falo et al., 1995). Sabe-se que estas preparações podem ser reconhecidas por

APCs e serem apresentadas no complexo de MHC de classe I ou II (Falo et al., 1995; Raychaudhuri & Rock, 1998). A resposta imune subseqüente é

suficientemente forte para proteger os modelos animais do encontro ao desafio com

tumores agressivos (Falo et al., 1995). Os antígenos particulados podem ser usados

com outros antígenos nas DCs in vivo de forma a ativar tanto a imunidade mediada

57

por células T CD4+ quanto as células T CD8+. Também é possível estimular a via de

apresentação cruzada de DCs in vitro e depois injetá-las in vivo, funcionando como

uma vacina celular (Celluzzi & Falo, 1998). Sabe-se também que a apresentação

cruzada pode conduzir a tolerância ou a imunidade. No entando, nestes estudos

ainda não está estabelecida a relação entre a apresentação cruzada, a estimulação

das células T CD8+ e sua influência no mecanismo de diferenciação de células T

CD4+.

O estudo destes mecanismo celulares é de grande relevância para o

desenvolvimento e aprimoramento de técnicas de terapia celular e imunoterapia.

Alguns modelos de aplicações clínicas, que utilizam como terapia injeções de

antígenos tumorais associados a DCs possuem vários aspectos em aberto, por

exemplo, quão eficiente é a DC e por quanto tempo a DC ativada in vitro com

peptídeos pode continuar apresentando estes peptídeos in vivo (Hayashi et al., 2006). Portanto, o desenvolvimento de modelos e estratégias que modulem e

polarizem a resposta imune, aumentando sua eficiência na estimulação dos linfócitos

é de grande valia, tanto em modelos anti-tumorais, quanto virais ou contra parasitas

intracelulares.

58

6. CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos, concluímos que o mecanismo de

apresentação cruzada é capaz de estimular as células T CD8+ a produzirem IFN-γ,

que pode modular a diferenciação da célula T CD4+ para o fenótipo Th1.

• DCs purificadas do baço de camundongos C57Bl/6 apresentam diferentes

níveis de expressão das moléculas de MHC de classe II, CD8α, CD40 e co-

estimulatórias (CD80 e CD86).

• DCs são capazes de realizar apresentação cruzada, estimulando as células T

CD8+ a produzirem IFN-γ in vitro.

• O IFN-γ produzido pelas células T CD8+ potencializa a diferenciação de

células T CD4+ para um fenótipo Th1 in vitro.

• A apresentação cruzada induz as células T CD8+ a produzir IFN-γ, que

potencializa a diferenciação das células T CD4+ para um fenótipo Th1 in vitro

59

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