entendendo o metabolismo de amino ácidos em cereais · mutantes de endosperma de milho opaco...

EntendendoEntendendo o o MetabolismoMetabolismo

de de AminoAminoáácidoscidos emem CereaisCereais

Salete A Salete A GaziolaGaziola

BiBióólogaloga

Laboratório de Genética Bioquímica

de Plantas, Esalq/USPFoto: Prof. Dr. Ricardo A Azevedo

Departamento de Genética

Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - BrasilTelefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

Por que estudar o metabolismo de Por que estudar o metabolismo de

aminoaminoáácidos em cereais??cidos em cereais??

1. Os aminoácidos essenciais (9), incluindo

lisina são sintetizados pela maioria das

plantas e bactérias apenas.

2. Devem ser providos pela dieta

3. Os cereais são deficientes em pelo menos

um dos aminoácidos essenciais

4. Baixa qualidade nutricional dos grãos

AminoAminoáácidos Essenciaiscidos Essenciais

Histidina

Isoleucina

Leucina

Lisina

Metionina

Fenilalanina

Treonina

Triptofano

Valina

Glutamate

Glutamine

ASPARTATEASPARTATE ASPARAGINE

THREONINETHREONINE

METHIONINEMETHIONINE

LYSINELYSINE

ß -Aspartyl phosphate

Aspartate semialdehyde

HSDH

Dihydrodipicolinate Homoserine

O-Phosphohomoserine

Cystathionine

S-adenosylmethionine

ISOLEUCINEISOLEUCINE

ASN

AS

AK

ASADH

DHDPS

HK

TS

TD

CGS

Homocysteine

CBL

MS

SAM-S

Cysteine

AHR1

BCAT

DHAD

DHDPR

THPA*

ADAPAT*

ADPD*

DAPE

DAPDSulphate

Ammonium

-

+

-

-

-

-

Pyruvate

Valine

Leucine

-

AHAS

----------------------------------------------------------------------------------

Tecido % de Lisina solúvel total

----------------------------------------------

WT Homozigoto

Calos 0.5 4.0

Folhas jovens 0.9 1.0

Folhas 1.9 29.0

Sementes imaturas 1.1 1.4

Sementes maturas 0.9 0.8

----------------------------------------------------------------------------------

Ghislain et al. (1995)

MutanteMutante dada enzimaenzima DHDPS DHDPS

emem N. N. sylvestrissylvestris

Catabolismo de lisina

•Cevada, milho e trigo – 14C-lisina

Glutamato

+

Semialdeido

aminoadipatoBrandt, 1975; Sodek e Wilson, 1970

•Caracterização em mamíferos

Hutzler e Dancis, 1968;1970; Fjellstedt e Robinson, 1975

•Milho – sugerem que o catabolismo de lisina é

um dos mecanismos controlando a concentração

de lisina solúvel no endosperma.Arruda et al., 1982

LORLOR

SDHSDH

----------

Via da sacaropina para o

catabolismo de lisina

Recomendado: 5,5% na composição

de lisina (LYS) em arroz (WHO,

1973)

Arroz: 8% de proteína

4% na composição de lisina

Por que arroz???

Objetivos Objetivos

�Purificar parcialmente e caracterizar as

enzimas LOR e SDH envolvidas no

catabolismo de lisina em sementes em

desenvolvimento de arroz.

Material: Cultivar IAC-165 de arroz de

sequeiro

� Sementes de arroz + tampão fosfato (1g:2 mL)

+ inibidores de protease e compostos fenólicos

homogeinização

Centrifugação

Precipitação com Sulfato de amônio

Métodos: 1º. Passo de purificação

“pellet” proteína

centrifugação

Dessalinização coluna sephadex

G-25

Reação enzimática

NADPH +

NADP+

NAD +

NADP

+ NADH

NADPH NADP+ = absorbância

NAD NADH = absorbância

1 nmol NADPH/NAD = 0,00622

Atividade de LORAtividade de LOR--SDH de tecidos SDH de tecidos

de arrozde arroz

Gaziola et al. (1995)

CROMATOGRAFIA

Perfil de Perfil de eluieluiççãoão das enzimas LORdas enzimas LOR--SDH de SDH de

arroz em cromatografia de troca iônica e arroz em cromatografia de troca iônica e

filtrafiltraçção em gel São em gel S--200200


○ LOR □ SDH

Atividade de LORAtividade de LOR--SDH de arroz SDH de arroz

em PAGEem PAGE

1 2 3 4

LOR SDHLOR SDH

Gaziola et al. (1997) Lugli et al. (2002)

Milho arroz Coix

Passos Passos sequenciaissequenciais de purificade purificaçção das ão das

enzimas LOR e SDHenzimas LOR e SDH


Regulação da LOR e SDH por Cálcio

LORSDH


A. 1-Controle

2- +EGTA

3- EGTA + CaCl2

B. Controle +

EGTA

+ crescentes

[CaCl2]

Regulação da LOR e SDH por força

iônica (tris e KCl)

SDHLOR


A. Aumento [Tris]

B. 10 mM Tris +

aumento [KCl]

C. 100 mM Tris +

aumento [KCl]

Aspectos moleculares

•O arroz é considerado como planta modelo

entre os cereais

•Genoma relativamente pequeno 420 Mb (trigo

15000 Mb)

•Sequenciado em Oriza sativa ssp. Japonica e

ssp. Indica

Paterson et al., 2006

Alinhamento da sequência de 2,6 kb de

arroz com o gene ZLKRSDH de milho

� O cDNA de arroz

codificando a proteína

LOR-SDH apresenta

83% e 98% de

homologia ao milho e

arroz (Oriza sativa L.

ssp. japonica),

respectivamente

Perfil de expressão do gene LORSDH e

DHDPS em sementes em

desenvolvimento de arroz (qRT-PCR)

� LOR-SDH-fw: 5'- GCCGTTGACATTCTCCCTAC

� LOR-SDH-rv: 5'- AGTTCCCCTCTTGCCTCCT

� DHDPS-fw:5'- CATCGGAGCAGCACTACAGA

� DHDPS-rv: 5'- AACAGCGGAGGCAATACAAG

� OsTUB-fw: 5'- TCTCCCCTCTCTCCCTTCTC

� OsTUB-rv: 5'- ATCACCTCCACCAACAGTCC

Perfil de expressão do gene LORSDH e

DHDPS em sementes em

desenvolvimento de arroz (qRT-PCR)

� LOR/TUB

� Est1: 5,6790912

� Est2: não obtido

� Est3: 0,1347982

� DHDPS/TUB

� EST1: 95,16249619

� EST2: 109,2272995

� EST3: 6,468562867

Mutantes de endosperma de milho Mutantes de endosperma de milho

OpacoOpaco

Mutante Natural Opaco-2 - Mertz, 1964

QPM 451 e 473 – programas de melhoramento

combinando o genótipo o2o2 (opaco 2), para

conferir alta qualidade protéica, e modificadores

genéticos, para melhorar as qualidades físicas e a

aparência do grão, foram desenvolvidos os materiais

denominados QPM (milho de qualidade protéica)

�Caracterização das enzimas envolvidas no metabolismo de lisina (AK, HSDH, LOR e SDH).

Atividade de AK e HSDH em milhoAtividade de AK e HSDH em milho


WT o2

QPM QPM

Atividade de LORAtividade de LOR--SDH em milhoSDH em milho


WT o2

QPM QPM

Mutantes de endosperma de milho Mutantes de endosperma de milho

Opaco e Opaco e FlouryFloury

Mutantes:

Opaco: o1, o2, o5, o7, o10, o11, o13.

Floury: fl1, fl2.

�Caracterização das enzimas envolvidas no catabolismo de lisina (LOR e SDH).

Atividade de LORAtividade de LOR--SDH em mutantes Opaco SDH em mutantes Opaco eFlouryeFloury------------------------------------------------------------------------Genótipo LOR SDH------------------------------------------------------------------------Oh43+ 3.5053.505 3.4903.490Oh43 o1 3.830 3.050Oh43 o2 0.5900.590 0.7050.705Oh43 fl1 2.115 1.870Oh43 fl2 0.4900.490 0.8900.890

W22+ 3.245 3.295W22o10 0.720 1.505W22o11 3.6153.615 4.6904.690W22o13 0.580 1.310

B37+ 2.926 3.237B37o7 2.610 2.500

B77x79+ 3.397 2.410B77x79o5 0.380 1.300

WT3+ 3.097 3.129WT3fl3 2.490 3.330------------------------------------------------------------------------

Atividade da enzima SDH de mutantes de Atividade da enzima SDH de mutantes de

milho opaco e milho opaco e flouryfloury em PAGEem PAGE

WT WT o2o2 o1 o5 o7 o10 o11 o13o1 o5 o7 o10 o11 o13

WT WT o2o2 fl1 fl2 fl3fl1 fl2 fl3

Atividade de SDH em endosperma Atividade de SDH em endosperma

de milhode milho

(PAGE)(PAGE)

Pompeu et al. (2005)

LOR e SDHLOR e SDH

� LOR-SDH: atividade endosperma

específica.

� LOR-SDH proteína bifuncional.

� Isoformas de LOR e SDH monofuncional.

SuperproduSuperproduçção de lisina e ão de lisina e

AcAcúúmulo em sementes de cereaismulo em sementes de cereais

�Alteração das enzimas AK e DHDPS.

�Manipulação das enzimas do catabolismo de

lisina.

Principais estratPrincipais estratéégias para o gias para o

acacúúmulo de lisina em cereaismulo de lisina em cereais

1. Programas de melhoramento: tempo longo.

2. Mutantes de ocorrência natural: opaco-2.

3. Mutantes bioquímicos: alteração da regulação das

enzimas chave.

4. Transformação de Plantas: produção de plantas

transgênicas expressando enzimas alteradas.

Azevedo and Lea (2001)

AgradecimentosAgradecimentos

Dep. de Genética, Esalq/USP

Prof. Ricardo A Azevedo

FAPESP

CNPq

entendendo o metabolismo de amino ácidos em cereais · mutantes de endosperma de milho opaco...

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