CARACTERIZAÇÃO DOS PADRÕES PROTÉICOS DOENDOSPERMA DO MILHO E SUA RELAÇÃO COM A

ESTRUTURA FÍSICA DO GRÃO!

RESUMO - As propriedades fisicas do grão de milhosão de grande importância no processamento desse ce-real, embora pouco se conheça sobre os fatores bioquí-micos, moleculares e estruturais que afetam essas ca-racterísticas. A conversão do endosperma opaco em ví-treo envolve uma relação intrínseca entre proteínas ecorpos protéicos, numa distribuição espacial e temporalespecífica durante todo o período de formação do en-dosperma. Desse modo, o acompanhamento das altera-ções quantitativas das frações protéicas do endospermapoderia contribuir para o conhecimento dos mecanis-mos genéticos e bioquimicos envolvidos no processo.Utilizando-se de um genótipo indígena 'BOL lI' (mu-tante), com característica fenotípica de endospermaopaco e mole, e uma linhagem Híbrido Simples (pater-

RAIMUNDO PEREIRA DA SILVA2

LEANDRO LOPES LOGUERCIO 3

EDILSON PAIVA3

no) do 'BR201', de endosperma duro e vítreo, foramfeitas avaliações de densidade (método da proveta) edos padrões protéicos desses genótipos individualizadose dos cruzamentos recíprocos entre eles, mediante o usode eletroforese de poliacrilamida e densitometria a la-ser. Os padrões protéicos referentes às gerações FI>F2 eF3 desses cruzamentos e de outros genótipos indígenasreferenciais foram estudados. Os resultados indicaramque a herança de densidade do endosperma é do tipomonogênica. Além disso, as análises da geração F2:3 re-velaram que existe, para a fração protéica das 'não-zeinas', um padrão de polipeptídeos que pode estar as-sociado à característica fisica de opacidade/vítreosidadedo endosperma, podendo, assim, servir como um indi-cador molecular para essa característica.

TERMOS PARA INDEXAÇÃO: Milho, endosperma, proteína, estrutura física, dureza.

CHARACTERIZATION OF THE PROTEIN PATTERNS FROM MAIZEENDOSPERM AND THEIR RELATIONSIDP WITH THE PHYSICAL

STRUCTURE OF THE GRAIN

ABSTRACT - The physical properties of com grainsare very important for its processing, although little isknown about the biochemical, molecular and structuralfactors affecting this trait. The conversion of an opaqueinto a vítreous endosperm involves an intrinsicrelationship between proteins and protein bodies, in aspecific spatial and temporal distribution throughoutthe whole period of endosperm formation. Thus, acontribution to the knowledge about the genetic andbiochemical mechanisms involved in this process couldbe achieved by following quantitative changes in the

protein fractions of the endosperm. By using both anexotic mutant genotype ('BOL lI'), with opaque andsoft endosperm, and a Single Hybrid (paternal) line ofthe 'BR201' cultivar, with hard and vitreousendosperm, the protein patterns for these indivídualgenotypes, as.well as for their reciprocal crosses, wereevaluated through polyacrylamide gel electrophoresisand laser densitometry. The protein pattems referringto the Fb F2 and F2:3 generations from those crosses,and to the other exotic genotypes (used as a reference),were studied. The results indicated that endosperm

1. Parte da dissertação apresentada pelo primeiro autor à UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS - UFLA, para aobtenção do grau de Mestre em Agronomia - Área: Genética e Melhoramento de Plantas.

2. Engenheiro Agrônomo, Mestrando em Agronomia - Genética e Melhoramento de Plantas na UFLA, Caixa Postal37 - 37.200-000 - Lavras - MG.

3. Engenheiro Agrônomo, PhD, EMBRAPAlCNPMS, Caixa Postal 151, Sete Lagoas - MG

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between the polypeptide pattem obtained for theendosperm and its opaque/vitreous phenotype, whichmight serve as a molecular tracer for this trait.

density is a monogenic trait. Furthermore, the analysesfor the F3 generation revealed, at least for the 'non-zein' fraction, that there is a possible association

INDEX TERMS: Maize, endosperm, protein, physical estructure, hardness

INTRODUÇÃOApesar do potencial que o milho apresenta

como fonte protéica, contendo cerca de 10% de pro-teína na matéria seca do grão, ele é considerado umalimento energético para seres humanos e animaismonogástricos, graças a sua deficiência em aminoá-cidos essenciais, como a lisina e o triptofano (Lopes,1993). O endosperma do milho é um tecido de ar-mazenamento que corresponde a aproximadamente85% do peso seco do grão. Por constituírem a maiorparte do grão, os componentes do endosperma sãoessenciais na definição das propriedades químicas efisicas (Wolf et al., 1952). Dentre as proteinas totaisdo endosperma, a fração denominada 'não-zeína' écomposta por proteínas estruturais, inibi dores deproteases, enzimas, etc., com funções distintas dasproteínas de reserva, ou 'zeínas'. Entretanto, as não-zeínas também podem atuar secundariamente como re-serva, possuindo, inclusive, um valor nutricional maiore mais balanceado (Wallace et aI., 1990).

Um frouxo empacotamento dos componentes doendosperma leva à formação de espaços preenchidoscom ar, que bloqueiam a passagem da luz através dasemente madura; por essa razão, mutantes desse tiposão geralmente conhecidos como opacos (Lopes, 1993;Robutti et aI, 1974). Desde o surgimento do mutanteopaco-2 (02), caracterizado pelo elevado teor de lisinae triptofano, e apresentando fenótipo opaco, vários ou-tros mutantes têm sido caracterizados (Soave e Sala-mini, 1984; Lopes, 1993). Por causa da presença de ca-racterísticas desejáveis, muitos desses mutantes vêmsendo incorporados em programas de melhoramento.Contudo, em virtude de outros efeitos pleiotrópicos edeletérios associados a esse fenótipo, o seu aproveita-mento só é possível por meio do uso de modificadoresgenéticos capazes de restaurar as características agro-nômicas desejáveis. Um desses efeitos indesejáveis se-ria, por exemplo, o fato de sua semente possuir um en-dosperma com pouca densidade, o que a toma bastantesuscetível ao ataque de insetos; além disso, quebra fa-cilmente durante o manuseio. Portanto, o estudo e acompreensão dos mecanismos envolvidos na ação des-ses genes são de fundamental importância para o seuaproveitamento no desenvolvimento de variedades com

grãos melhorados no que se refere à qualidade protéicae às características fisicas.

O aperfeiçoamento de técnicas biotecnológicaspermitiram o avanço no conhecimento das bases gené-ticas e dos mecanismos envolvidos na expressão das vá-rias características de interesse agronômico, tais como:dureza do grão, teor de aminoácidos essenciais, entreoutros. Essas ferramentas constituem um importanteapoio aos programas de melhoramento voltados paraobtenção de milhos QPM, ou "Quality Erotein Maize".Esses são genótipos do tipo 'opaco-modificados', se-melhantes aos mutantes opacos-2 em termos de quali-dade nutricional, diferindo, porém, no aspecto fisico doendosperma. Há também fenótipos de milhos indígenasque apresentam grãos opacos de baixa densidade, se-melhantes aos mutantes opaco-2; porém, apresentambaixa qualidade protéica, como os fenótipos comerciais(vitreos). Observou-se que essas populações indígenasnão estavam incluídas em nenhuma classe conhecida demutantes para a densidade do endosperma, apresentan-do, portanto, um grande potencial para futuros estudosacerca dos mecanismos que afetam a estrutura e quali-dade protéica do endosperma em milho.

A densidade é característica que está relacionadacom a dureza: o grão mais denso é conseqüente-mente mais duro, possui um maior peso e é menossuscetível à quebra durante os processos de secagem,armazenamento e classificação. Apesar de a vitreo-sidade e a dureza serem comumente utilizadas parase referir à textura do grão, tais termos não se refe-rem à mesma propriedade. A vitreosidade está maisrelacionada com a "aparência" do endosperma, en-quanto que a dureza se refere nitidamente a umapropriedade fisica (Shull, 1988). Apesar de a durezaser de fundamental importância para o processoprodutivo do milho, há pouco conhecimento sobre osfatores bioquímicos e estruturais que governam essa ca-racterística (Lopes, 1993). Cavanaugh et alo (1995), pelouso da seleção recorrente,mostraram que há pouca corre-lação entre a produtividade,a qualidadeprotéica e a durezado endosperma, sugerindocom isso que, no curso da sele-ção, faz-se necessário a utilização de avaliações específi-cas para essas características.

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Dentro desse contexto, o objetivo principal dopresente trabalho foi a caracterização dos padrões ele-troforéticos de polipeptídeos e sua possível associaçãocom as características fisicas do endosperma. Tambémfoi realizado o estudo do efeito da dosagem de alelosnessas características, como forma de contribuir para oconhecimento sobre mecanismos genéticos e bioquimi-cos envolvidos na formação do endosperma do milho.

MATERIAL E METODOS

Os trabalhos foram conduzidos nos campos ex-perimentais do CNPMSIEMBRAPA e nos Laboratóriosdo Núcleo de Biologia Aplicada (NBA-CNPMSIEMBRAPA). A estratégia básica utilizadaconsistiu em se cruzar um híbrido simples de endos-perma vítreo ('BR201') com um milho indígena de en-dosperma farináceo (opaco - 'BOL lI'), obtendo-se po-pulações FI. Estas foram, posteriormeÍlte, autofecunda-das para a obtenção de populações segregantes F2 e F2:3

quanto aos fenótipos opacos, semi-opacos e vítreos.Para a determinação da associação entre dosa-

gem de alelos e densidade dos grãos, utilizaram-se se-mentes do cruzamento entre o 'BOL lI' X 'BR20 1',bem como do seu recíproco. As sementes obedeceram auma ordem gradual de dosagem de alelos - 'BOL lI'(aaa), 'BOL lI' x 'BR201' (aaA), 'BR201' x 'BOL lI'(AAa), e 'BR201' (AAA). Na geração F2:3, os indivídu-os foram escolhidos com o auxílio de um translumina-dor, formando-se dois grupos de amostras para essa ge-ração, isto é, fenótipos opaco e vítreo. Para se determi-nar a densidade, padronizou-se a umidade das semen-tes, colocando-as em estufa a 37>C por três dias, se-guindo-se, então, os procedimentos descritos por Kinepe Mason (1989). Foram pesados 50 grãos em uma pro-veta de 50 ml (m I) e o volume foi completado até 30mlcom etanol absoluto (densidade = 0,78612g1ml), regis-trando-se o peso total correspondente (m-). A densidade'd' (glml) foi calculada segundo a equação: d = m, /{30 - [(m2 - m.) / 0.78612]}.

A extração de proteínas total foi feita em mi-crotubos de 1,5 ml, adicionando-se lOOmg de endos-perma pulverizado a 1,0 ml de tampão de extração - bo-rato de sódio 12,5 mM (PH 10,0); SDS 1,0 %; 2-f3-mercaptoetanol 2,0 % (v/v). Centrifugaram-se asamostras a -11.000 x g por 10 mín. A extração dasnão-zeínas foi feita baseando-se na fração anterior, emque o sobrenadante de cada amostra foi transferido paraoutro microtubo, adicionando-se etanol absoluto, demodo a obter uma concentração final de 70% (v/v).

Centrifugou-se o material a -11.000 x g durante 15 mi-nutos, separando-se, assim, as frações solúveis (sobre-nadante) contendo as zeínas, do pellet precipitado cor-respondendo à fração não-zeína. Para a precipitaçãodas zeínas a partir do sobrenadante anterior, coletaram-se alíquotas de 200111,adicionaram-se 1200111de aceto-na na proporção 1:6, incubou-se o material a 4°C porum período mínimo de 4 horas, e repetiu-se o procedi-mento de centrifugação anterior. O pélete obtido nessaetapa representou a fração zeína.

Para as análises do perfil protéico das fraçõesacima isoladas, optou-se por géis de poliacrilamidadesnaturantes de 1,5mm de espessura, contendo gelconcentrador a 6% (pH 6,8) e gel separador de gradi-ente (pH 8,8), numa faixa de 7,5% a 17,5% (Laemmli,1970). Para a avaliação da geração F2:3, escolheram-seduas famílias com características fenotípicas contras-tantes para o grão - opaco e vítreo - dispondo-se cadauma em uma metade do gel. Foram realizadas três re-petições para cada experimento. Para a análise de pro-teína total, utilizaram-se 60111do primeiro sobrenadante(vide acima), adicionando-se 40111 de corante-tampãode amostra (0,2% de azul bromofenol (P/v), tris-HCI25mM, glicerol 50%); para a análise dos péletes denão-zeínas e zeínas, esses foram ressuspensos em 60111do tampão original de extração, adicionando-se entãoos mesmos 40 III do corante-tampão de amostra. Essesmateriais foram fervidos por 5 minutos antes de seremaplicados ao gel (15J.1l de amostra por canaleta paraproteína total, e 12111para não-zeínas e zeínas). Proce-deu-se às eletroforeses a uma amperagem constante de50 mA, durante um período médio de 12 horas. Os géisforam corados em solução de Coomassie Blue R-250,por um período de 8 horas, e descorados em ácido acé-tico 10% (v/v) por -6 horas.

Para as análises de densitometria no equipa-mento "Densitometer Sl" (Molecular Dynamics), foramescolhidos os polipeptídeos dentro de uma mesma faixade peso molecular e que mostraram diferenças visíveisentre os genótipos. Escolheram-se bandas de maior ta-manho e delimitou-se sua área, a qual foi utilizada paraindividualizar as demais bandas de interesse. Os resul-tados corresponderam a valores adimensionais de ab-sorbância, na unidade "Relative Pixel Density", ouRPD, os quais foram tabulados para proceder-se àsanálises estatísticas. Os valores densitométricos foramanalisados estatisticamente usando o programa MSTAT.Diferenças entre médias foram avaliadas pelo teste deTukey, a 5% de significância.

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RESULTADOS E DISCUSSÃO

Considerando o caráter triplóide do endosperma,procurou-se acompanhar o efeito da dosagem de alelosusando cruzamentos recíprocos entre o híbrido simples'BR20 1" de endosperma duro e fenótipo vítreo, e omilho indígena 'BOL lI', de endosperma farináceo efenótipo opaco. Como foi observado, as sementes origi-nadas do cruzamento entre esses materiais apresenta-ram somente endosperma com característica vítrea.Além disso, os resultados do teste de "qui-quadrado"para as populações segregantes da geração FZ:3(p<0.05) sugerem a hipótese de herança monogênicapara essa característica (Tabela 1).

Nesse sentido, todavia, seria recomendadacautela nas conclusões, visto que: (i) uma maioramostragem experimental poderia gerar resultadosdistintos, (ii) a expressividade do caráter pode terinfluenciado na avaliação da segregação fenotípicadas sementes (ação de possíveis genes modificado-res), e (iii) sementes com características fenotípicasopacas podem ter sido confundidas com semi-opacase vice-versa, efeito este decorrente das limitaçõesnaturais da técnica dísponível (caixa de luz) para ava-liação dessa característica.

No estudo da determinação das características fi-sicas das sementes, foram realizadas análises de densi-dade em duas gerações (FI e FZ3), em função da carac-terística fenotípica de opacidade/vítreosidade do endos-perma. Dessa forma, procurou-se verificar se o tipo deherança proposto para essa característica (monogênicadominante) estaria associado ou não com o tipo de he-rança para densidade do grão. Como parâmetros decomparação e controle, utilizaram-se outros genótiposcontrastantes quanto à opacidadelvítreosidade (Figura1). No geral, os valores de densidade obtidos revelaram,estatisticamente, haver um efeito da dosagem de alelos

na determinação da densidade do endosperma, sugerin-do, assim, que essa característica estaria provavelmentesujeita a efeitos genéticos distintos do mecanismo deherança proposto para opacidade/vitreosidade. Como sepercebe, a maioria das sementes vítreas (cruzamento'BR201' x 'BOL II' [AAa], genótipos 'BR201' [AA] e'BR45 1" e fenótipo vítreo segregante da FZ3) apresen-taram valores de densidade significativamente maiores.Uma importante exceção foi identificada, a qual ilustra-ria a provável díferença entre os mecanismos genéticosque governam densidade e vitreosidade: as sementes docruzamento 'BOL lI' x 'BR201' (genótipo 2, Figura 1)apresentaram baixa densidade, porém com fenótipo ví-treo. No primeiro caso, aparece um possível efeito aditivodos alelos; no segundo, a presença do único alelo derivadodo progenitorvítreo ('BR201') foi suficientepara a expres-são dessecaráter, sugerindo,portanto, herança monogênicadominante. No campo especulativo, e aliado aos dadosacima discutidos,o fato de o genótipo indígena MT II (5),de endospermafarináceoe opaco, ter sidoo de menor valorpara densidade poderia sugerir uma associação entreessas duas características. Contudo, outros experi-mentos envolvendo linhagens contrastantes para es-sas características seriam necessários para avaliarmais precisamente essa possibilidade.

Com as análises dos padrões protéicos obtidospor eletroforese (Figuras 2 e 3), procurou-se verifi-car se havia alguma alteração nesses padrões que fosseconsistente com as díferenças fenotípicas, i.e., poli-peptídeos possivelmente correlacionados com opacida-de/vitreosidade. Para isso, utilizou-se a geração segre-gante F23• Na faixa de peso molecular compreendidaentre 66 a 29kDa, o padrão eletroforético de proteínatotal para indivíduos da geração F23 do cruzamentoentre o 'BR201' x 'BOL lI' revelou algumas dife-renças entre os materiais segregantes para o

TABELA 1 - Número de plantas Fz e de plantas F23 segregantes para os fenótipos opacos e semi-opacos (s-opacos).

Material Fenótipo dos GrãosPopulação F2

opacos s-opacos Total X2

BR-201 X BOL-II F2 81 332 413 6,39""

BR-201 X BOL-II F23 16 80 96 3.56**

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1,4

* a,-.. a a a~'-' 1,2

Q.)

~tI3-e·00CQ.)

Cl 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Genótipos

FIGURA 1 - Distribuição dos valores de densidade dos genitores da geração Fie os seus cruzamentos recíprocos 1- BOL Il; 2 - BOL II X BR201 HS; 3 - BR201 HS X BOL lI; 4 - BR201. Os genótipos indígenas: 5 - MT lI; 6 - PRI; 7- P. CHILENO. Um QPM, 8 - BR451. Fenótipos opacos e vítreos da Geração F2:3 do cruzamento BR201 x BOL11(9 e 10 respectivamente). *Médias com a mesma letra não diferem significativamente pelo Teste de Tukey, aonível de 5% de probabilidade.

fenótipo opaco (Figura 2a). Apesar de as médias den-sitométricas terem sido estatisticamente semelhantesem alguns indivíduos contrastantes, observa-se umatendência de agrupamento entre a quantidade dos poli-petídeos (e.g., 61e 34 kDa) avaliada em RPD (ver mé-todos) e os indivíduos de mesmo fenótipo (Figura 2b,Tabela 2). Nesse sentido, poder-se-ia especular que, àmedida que se avança com autofecundações nas gera-ções seguintes, estar-se-ía favorecendo a fixação (porhomozigose) das características contrastantes. É plausí-vel que o acúmulo diferenciado desses polipeptídeospossa estar relacionado com o endosperma opaco e/ouvítreo, apesar de que uma possível relação de causali-dade entre eles é desconhecida até o momento. O mes-mo comportamento evidenciado para proteina total foiobtido no padrão eletroforético da fração não-zeína dageração F2:3 (Figura 3, Tabela 2). As diferenças entre osmateriais, mais uma vez, são confirmadas na mesmafaixa de peso detectada anteriormente, ou seja, entre 66a 29kDa. Isso sugere que a associação encontrada nosdois casos seria atribuída a polipetídeos pertencentes àfração não-zeína. Esse fato viria a reforçar uma idéia

ainda não levantada de que as características fisicas doendosperma do milho poderiam ser também influencia-das pelo conteúdo de não-zeínas, e não somente peloconteúdo de proteínas de reserva (Dombrink-Kurttzmane Bietz, 1993; Lopes 1993).

A utilização de experimentos de focalização iso-elétrica (IEF), em todos os casos aqui avaliados, apare-ce como importante alternativa para o aprofundamentodos estudos comparativos de composição protéica doendosperma, associados ou não com a sua característicafenotípica. Tal tecnologia poderia fornecer pistas im-portantes a respeito de uma possível decomposiçãodas bandas (analisadas por densitometria) em maisde um polipeptídeo de mesmo peso molecular,aprofundando, assim, o conhecimento acerca das re-ais associações de síntese e composição protéica comestrutura fisica do endosperma. Também a adoção deoutros métodos mais eficazes na avaliação das ca-racterísticas fisicas do endosperma (por exemplo, adensidade) poderiam contribuir para uma melhoranálise associativa entre fenótipo e conteúdo pro-téico do mesmo.

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(a)

kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 17 18 kDa

(b)

450 lI:1 I

C61kDal.34kDa

300* 250c~ ~1150

10050o !

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Genótipos

FIGURA 2 - (a) Padrão eletroforético de proteina total em gel de poliacrilamida (gradiente 7,5% a 17,5%) com osgenótipos dos indivíduos segregantes da geração F2:3, 1 a 9 (grãos opacos), 10 a 18 (grãos vítreos); (b) Distribuiçãodos valores percentuais de RPD (proteina total) para os polipeptídeos de 61, e 34kDa dos progenitores da geraçãoda geração F2:3.

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(a)

kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 kDa

:,400 1

~ ::1100O+!~~~~~~~~~~~~~~~~--~~-,~~~~~~~-,

[061=[.34kDa

(b)

500 -,

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 l3 14 15 16 17 18

Genótipos

FIGURA 3 - (a) Padrão eletroforético de não-zeínas em gel de poliacrilamida (gradiente 7,5% a 17,5%) com osgenótipos dos indivíduos da geração F32, 1 a 9 (grãos opacos), 10 a 18 (grãos vítreos); (b) Distribuição dos valorespercentuais de RPD (não-zeínas) para os polipeptídeos de 61 e 34kDados progenitores da geração da geração F2:3.

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TABELA 2 - Valores médios de RPD da Geração F2;3, em RPD*, para as frações proteína total e não-zeínas-grãos opacos (1 a 9) e VÍtreos(10 a 18).

Proteína total Não-zeínasGrãos

61kDa 34kDa 61kDa 34kDa

bcd abcdef abc abc

2 def bcdef abcd abcd

3 a a ab a

4 bcde abcdef cd bcde

5 abc ab abcd bcde

6 cde abcd abcd abcde

7 bcde abcde abcd abcde

8 ab abcdefg abcd abcd

9 abc abc a ab

10 f efg bcd bcde

11 f g cd cde

12 ef defg bcd bcde

13 f fg cd de

14 cef bcdefg abcd bcde

15 f fg d cde

16 df cdefg bcd cde

17 def bcdefg abcd bcde

18 ef defg d e

*Médias com a mesma letra não diferem estatisticamente (p>O.05) pelo Teste de Tukey.

CONCLUSÕES zamentos recíprocos entre o 'BOL lI' X 'BR201'permitiu a identificação do efeito de dosagem dealelos na densidade do grão.

a) Baseado no conteúdo triplóide do endos-perma, a avaliação de famílias segregantes dos cru-

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b) Os resultados de segregação dos fenótiposopaco e vítreo na geração F2:3, bem como dados daanálise de densidade do grão em distintos genótipos,reforçam a hipótese de herança monogênica dominantepara essa característica.

c) O perfil das frações protéicas estudadas('proteína total' e 'não-zeina') e a quantificação pordensitometria dos polipeptídeos analisados para a gera-ção F2:3 permitiram uma associação entre o conteúdode proteína e a vitreosidade/opacidade do endosperma,podendo ser utilizadas como indicadores molecularespara essa característica.

d) Os resultados demonstraram haver associaçãoentre polipeptídeos da fração não-zeína com os fenóti-pos vítreos ou opacos. Além disso, observou-se o efeitoda dosagem de alelos no endosperma (triplóide) no quediz respeito aos fenótipos opaco (menos denso) e vítreo(mais denso), sugerindo que essa característica se tratade uma herança monogênica.

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