27/05/2015

1

ANÁLISE DE IMAGENS EM

TECNOLOGIA DE SEMENTES

Produção de Sementes (LPV-5705)

Pós-graduação - Fitotecnia

Primeiro Semestre de 2015

C.C.

Francisco Guilhien Gomes Junior

Tecnologia de Sementes

Depto de Produção Vegetal

USP/ESALQ

Permitida a cópia desde que citada a fonte. A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação de direitos

autorais, sob pena da Lei nº 9.610, de 19 de fevereiro de 1998

11/05/2012 13h10 - Atualizado em 11/05/2012 14h14

Satélite russo registra maior foto já feita da Terra, com 121 megapixelsCada pixel da imagem corresponde a 1 km de distância

PIXEL, RESOLUÇÃO E TAMANHO DA IMAGEM

TamanhoO tamanho de uma imagem digital está definido no número de linhas e colunas que a forma

ResoluçãoCapacidade que um sistema de captura/reprodução de imagens tem para reproduzir detalhes

A resolução de uma imagem é o número de pixels impressos ou exibidos por unidade de medida

Pixel: (“Pictures Elements”)É o menor ponto que forma uma imagem

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2

Imagem digital

Representação de uma imagem bidimensional usando números

binários codificados de modo a

permitir seu armazenamento,

transferência, impressão ou

reprodução, e seu processamento

por meios eletrônicos

x

y

Pixel = f(x,y)

Imagem digital

Imagem bitmapImagem vetorialCDR, AI e EPS TIFF, JPEG, PNG, GIF, BMP e PSD

Tipos de imagens digitais

Cada pixel

tem um valor

independente

de cor

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Esquerda: semente

de milho captada

em imagem de

100dpi, 256 tons de

cinza e 8bits.

Direita: ampliada 7x

em tela (700%)

Resolução de imagem digital

Teixeira (2004)

Propriedades das cores

RGB - Modelo aditivo CMYK - Modelo subtrativo

Escala de cinzas

Fonte: Google

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4

28 x 28 x 28

16,7 milhões de

cores

Modelo

RGB

8 bits

Escala de

cinzas

8 bits

Pixel = f(x,y)

Pixel = f(x,y)28

256 níveis

x

y

x

y

Bits nos modelos RGB e escala de cinzas

Imagem digital

Níveis de cinza

2568 bits

1287 bits

646 bits

325 bits

164 bits

83 bits

42 bits

21 bit

Marques Filho e Vieira Neto (1999)

IMAGEM BINÁRIA

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Procedimentos não destrutivos para avaliação da

qualidade de sementesRaios X

Microtomografia computadorizada de raios X

Tomografia por ressonância magnética

Câmera multiespectral

Fluorescência de clorofila

Avaliação de características físicas e morfológicas

de sementes e de plântulasDescritores de cor, forma e tamanho das sementes

Avaliação do vigor de sementes com base em imagens

digitais de plântulas

Análise de imagens de sementes e de

plântulas

Procedimentos não destrutivos para avaliação da qualidade de sementes

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RAIOS X

Procedimentos não destrutivos para avaliação da qualidade de sementes

Raios X

Descoberta dos raios X

Físico alemão Wilhelm Conrad Röntgen (1845-1923)

8 de novembro de 1895: primeira chapa de raios X

Fonte: google

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7

Raios X

Características dos raios X

Fonte: google

Como os raios X são gerados?

filme

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Fatores que afetam o nível de absorção

dos raios X pela semente

Espessura e densidade dos tecidos

Fonte: google

Composição química da semente

Espécie Proteínas (%) Carboidratos (%) Lipídios (%) Estrutura

Algodão 39 15 33 Embrião

Amendoim 31 12 48 Embrião

Arroz 8 65 2 Endosperma

Ervilha 25 52 6 Embrião

Feijão 23 56 1 Embrião

Girassol 17 19 46 Embrião

Mamona 18 0 64 Endosperma

Milho 10 80 5 Endosperma

Soja 37 26 17 Embrião

Trigo 12 75 2 Endosperma

Adaptado de Bewley e Black (1985)

Principais reservas armazenadas em sementes

de algumas espécies de interesse econômico

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Composição porcentual de reservasarmazenamdas em diferentes partes da semente de milho, cv. Iowa 939

Reserva Semente Endosperma Embrião

Proteínas 8 7 19

Amido 74 88 9

Lipídios 4 <1 31

Bewley e Black (1985)

Endosperma

Embrião

A composição química da semente define seu grau de avidez

por água

O teor de água da semente influencia a densidade óptica

35% de água 15% de água

Imagens radiográficas de sementes de Tucumã

(Astrocaryum aculeatum) apresentando

diferentes graus de umidade

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Comprimento de onda () da radiaçãoionizante

Raios X de menor comprimento de onda possuem maior poderde penetração

objetos menos densos objetos mais densos

O TESTE DE RAIOS X

interpretação

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O TESTE DE RAIOS X

interpretação

Trinca 3Trinca 1

Trinca 2

Radícula

Plúmula

Raízes seminais

ISTA (2003) e RAS (2009)

Recomendado com a

finalidade básica de

detectar sementes cheias,

vazias, com injúrias

mecânicas ou atacadas

por insetos

1 mm

Crotalaria juncea L.

radícula

hipocótilo

plúmula

cotilédones

tegumento

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Viabilidade da utilização de raios X emsementes

CAUSA EFEITO

Radiografia de semente

de milho doce

A pequena dose de radiação usada durante o teste não exerceinfluência negativa sobre a germinação (não provocamutação)

Não inviabiliza a

semente (método não

destrutivo): relações

de causas e efeitos

Gomes-Junior e Cicero (2012)

ISTA - desde a década de 1980 (detecção de sementes

vazias, danificadas mecanicamente ou por insetos).

RAS 2009 – capítulo específico (16) sobre o teste de

Raios X para análise de sementes

Histórico

Início da década de 1950 na Suécia: avaliação da

qualidade de sementes de Pinus sylvestris L.

(Simak e Gustafsson,1953)

Pinus sylvestris L.

Primeiro trabalho foi realizado por Lundström em

1903: sementes de coníferas

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Raios X

Aplicações em Tecnologia de Sementes

Detecção de anormalidades em embriões

Determinação do estádio de desenvolvimento das

sementes

Estudos de alterações fisiológicas durante os

processos de maturação, secagem, germinação ou

condicionamento fisiológico

Identificação de injúrias mecânicas, injúrias causadas

por insetos ou injúrias decorrentes de outros fatores

adversos em pré e pós-colheita

Seleção de sementes cheias

Base para utilização de programas computadorizados

na avaliação de alterações da morfologia interna

Embrião

deformadoPA

Embrião com

pequeno defeito PA

PNEmbrião sem

defeito

Socolowski e Cicero (2008)

Tecoma stans

Raios X

Detecção de anormalidades em embriões

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Raios X

Identificação de injúrias mecânicas

Gomes-Junior e Cicero (2012)

Flor et al. (2004)

milho doce

soja

Plântula anormal

Plântula anormal

Raios X

Identificação de injúrias por “umidade”

Injúrias severas no eixo

embrionário

Injúrias severas na

região dos cotilédones

Plântula anormal

soja

Forti et al. (2010)

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Menezes et al. (2012)

Semente de

arroz: secagem

a 50o C

Raios X

Identificação de injúrias causadas por secagem

Caruncho em

feijão-caupi

Melo et al. (2010)

Raios X

Identificação de injúrias causadas por insetos

Forti et al. (2008)

Percevejo em

feijão

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Raios X

Seleção de sementes cheias

Totalmente formada Parcialmente formada Não formada

(Carvalho et al., 2010)

Sementes

de mamona

Área do embrião = 57%

Raios X

Base para utilização de programas computadorizados na

avaliação de alterações da morfologia interna

Espaço livre interno total = 1,28 mm2

Semente

de algodão

Semente de

Xylopia aromatica

Sokolowski et al. (2011)Marcos-Filho et al. (2010)

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1 Moega de entrada de sementes

2 Tubo de raios X

3 Ampliação da imagem

4 Interface de usuário

5 Unidade de classificação

Posicionamento

da semente

Obtenção da

imagem radiográficaAnálise e processamento

dos dadosClassificação

Raios X no controle de qualidade de

sementes

Fonte: google (adaptado)

Tomografia computadorizada de

raios X (TC)

É uma técnica que permite a visualização de

seções transversais (cortes internos) de um

objeto de forma não destrutiva

A captura é feita através de uma série de

pequenas rotações

As informações de atenuação da radiação que

atravessa o objeto são gravadas para um plano

de interesse

Um algoritmo processa os dados para formar

uma imagem 2D

A combinação dessas imagens pode gerar a

visualização em 3D

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Microtomografia de raios X

Tubo de

raios X

Intensificador

de imagem

Câmera

CCD

Projeções

Imagem 3D

Algoritmo de reconstrução

Seções

Análise das imagens

Determinação de

parâmetros físicos

Modelo 3D

Sistema de

circulação

Amostra

Tomografia e microtomografia de raios X

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A tomografia por ressonância magnética

utiliza fortíssimos campos magnéticos e

ondas de rádio para formar imagens de

uma amostra

São utilizados os pulsos de

radiofrequência direcionados somente ao

hidrogênio contido na amostra

O excesso de energia liberado pelos

prótons de hidrogênio quando o pulso de

radiofrequência é desligado emite um

sinal de uma bobina para o computador

Por meio de cálculos matemáticos os

sinais são transformados em uma

imagem

Tomografia por ressonância magnéticaTomografia

Prótons de hidrogênio sob ação do

campo magnético externo

Campo magnético

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Tomografia por ressonância magnética

Método não invasivo

Informações sobre o estado químico e físico dos

materiais

Informações sobre o estado fisiológico e as

condições de metabolismo em sistemas biológicos

Não emprega radiação ionizante e não exige o uso

de meios de contraste

Diferencia claramente cada tipo de tecido mole,

mesmo que estes tecidos tenham a mesma

densidade, quando seus estados fisiológicos

diferem entre si

Raios X RM

Soja

Imagens: Francisco G Gomes Junior

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21

Imagem: Francisco G Gomes Junior

Imagem: Francisco G Gomes Junior

Milho: RM

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Monitoramento da secagem de sementes de cevada

Seefeldt et al. (2007)

Imagem por ressonância magnética

5 min 2 h 5 min 5 h 5 min 6 h 5 min

8 h 5 min 11 h 5 min 12 h 5 min 17 h 5 minKoizumi et al. (2008)

Monitoramento da hidratação de sementes de soja

Imagem por ressonância magnética

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Câmera multiespectral

Imagem multiespectral: imagens de um mesmo objeto, tomadas com diferentes comprimentos de ondas eletromagnéticas (luz visível, infravermelha, ultravioleta, raios X ou qualquer outra faixa do espectro)

Imagem colorida tradicional

Utiliza três filtros

para as bandas

Red, Green e

Blue

Imagem RGB

Limite do

Infravermelho

Comprimento de onda (nm)

Resposta

rela

tiva

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Imagem multiespectral

ultravioleta infravermelho

Clorofila b

Clorofila a

Comprimento de onda (nm)

Absorb

ância

Imagem colorida tradicional

Clorofilas a e b

apresentam

quase o mesmo

sinal RGB

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Clorofila b

Clorofila a

Comprimento de onda (nm)

Absorb

ância

Imagem multiespectral

Em comprimentos

de onda específicos

as clorofilas a e b

apresentam

diferentes sinais e

podem sem

identificadas

Identificação de fungos em sementes de

espinafre

Olesen et al. (2011)

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Identificação de fungos em sementes de

espinafreN

úm

ero

de p

ixe

lsN

úm

ero

de p

ixe

ls

Intensidade do pixel

Alternaria spp.

Cladosporium spp.

Fusarium spp.

Verticillium spp.

Stemphylium spp.

Sem infecção

Olesen et al. (2011)

Câmera multiespectral no controle de

qualidade de sementes

Entrada das sementes

Esteira móvel

Espectômetro e unidade de iluminação

Classificação:Sementes maduras e sadiasSementes imaturasSementes infectadas por fungos

Fonte: google (adaptado)

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Fluorescência de clorofila

Jalink et al. (1998)

A clorofila fluoresce quando

excitada em um determinado

comprimento de onda

1. Um laser ou uma luz de LED

excita a clorofila

2. Um filtro de largura de banda

estreita filtra a fluorescência

3. A clorofila da semente é

determinada

Fluorescência de clorofila em semente de

pimenta durante a germinação

Mé

dia

de

FC

/pix

el x1

00

0 (

va

lor

esca

la d

e c

inza

)

0 10 20 30 40 50 60 70 80

40

30

20

10

0

Tempo (h)

68h 20min

50

http://www.phenovation.com

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Lote de baixo vigor

Ocorrência de sementes esverdeadas

Lote de alto vigor

Sinal de fluorescência, baixo para alto: pretovermelholaranjaamareloverde

Fluorescência de clorofila em sementes

de soja

http://www.phenovation.com

Avaliação de características físicas e morfológicas de sementes e de plântulas

Sementes

Plântulas

Câmera CCD

Escâner de mesa

Computador e programa

para análise de imagens

Imagens em Time-lapse

Descritores de cor, forma e

tamanho das sementes

Classificação do vigor

de lotes de sementes

Construção da imagem da semente

Curva de embebição (monitoramento)

Taxa de crescimento da raiz

Índices médios RGB

Descritores biomorfológicos Adaptado de Dell´Aquila (2006)

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Dell’Aquila (2009)

Índices RGB como indicadores da viabilidade

de sementes

Inicial Após envelhecimento

Escurecimento do tegumento de

sementes de lentilha após o

envelhecimento (51 dias a 40 °C

e teor de água de 14,4%)

Onobrychis viciifolia

Behtari et al. (2014)

Índices médios RGB como indicadores da

viabilidade de sementes

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Método direto para a

identificação de sementes

com alto potencial de

desempenho

Armazenamento das imagens

de plântulas

Resultados rápidos, objetivos

e precisos

Biossíntese incompleta

Membranas incompletas

MATURIDADE FISIOLÓGICA

Degeneração das membranas

Redução das atividades respiratórias e biossintéticas

Germinação lenta

Redução do potencial de conservação

Menor taxa de crescimento e de desenvolvimento

Menor uniformidade de desempenho

Maior sensibilidade a adversidades

Redução da emergência de plântulas em campo

Aberrações morfológicas (plântulas anormais)

Perda do poder germinativo

MORTE Adaptado de Delouche e Baskin (1973)

Avaliação automatizada do vigor de sementes baseada em imagens digitais de plântulas

Hipocótilo

Marcos-Filho et al. (2009)

Programas

Seed Vigor Imaging System (SVIS)

Análise Automatizada do Vigor de Sementes (Vigor-S)

Sistema de Análise de Plântulas (SAP)

Avaliação automatizada do vigor de sementes

alface soja

Foto: Miller B. McDonald

(Características morfológicas de plântulas)

Raiz

primária

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Finalidade da avaliação automatizada do

vigor de sementes

determinar o potencial de desempenho das plântulas em

campo e o estabelecimento do estande

Auxiliar os melhoristas na seleção de genótipos com

rápida emergência de plântulas ou com tolerância à seca

ou temperaturas altas

Monitoramento do desempenho de lotes de sementes ao

longo do armazenamento

Avaliar a eficiência do tratamento fungicida, da

peletização e do condicionamento fisiológico de sementes

75 a 80 °

Semeadura e posicionamento do substrato

Germinação:20 a 25 sementes por repetição

Temperatura constante

Substrato posicionado com angulação próxima da

vertical (75 a 80 ° em relação à horizontal)

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Seed Vigor Imaging System (SVIS)

Imagens de plântulas digitalizadas por meio de escâner:

as partes são identificadas e marcadas por software

específico

Imagem: Francisco G Gomes-Junior

escâner instalado na

posição invertida no interior

de uma caixa metálica

plântulas são transferidas

para a base da caixa

metálica

Obtenção de dados de comprimento da raiz

primária, do hipocótilo, das plântulas e da

relação raiz/hipocótilo

Hipocótilo

Raiz primária

Normalmente, são avaliadas plântulas com 3 e 4

dias de idade

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Processamento de uma imagem digital de

plântula de milho

256 tons de cinza

(8 bits)

300 dpi

Imagem binária Esqueleto em

imagem binária

Algoritmocontador de

pixels

Teixeira et al. (2006)

Cn = média aritmética

do comprimento (cm)

n = número de

plântulas medidas em

"pixels" sob resolução

(r) dada em dpi.

Resultados: SVIS (soja)

Comprimento da plântula em destaque (mm)Índice de vigor

CrescimentoUniformidade

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SVIS: índices de vigor para soja(plântulas com três dias de idade)

Proposta da Ohio Seed Improvement Association

Alto vigor: > 500

Vigor médio: 200 - 500

Baixo vigor: < 200

Proposta da Ohio State University

Vigor excepcional: 800 - 1000

Alto vigor: 600 - 799

Bom vigor: 400 - 599

Baixo vigor: 200 - 399

Grãos: < 200

Comp. plântula em azul: 7,8 cm

Índice de Crescimento: 837

Índice de Uniformidade: 947

Índice de Vigor: 870

Comp. plântula em azul: 4,5 cm

Índice de Crescimento: 435

Índice de Uniformidade: 925

Índice de Vigor: 582

Baixo vigor Alto vigor

Gomes-Junior et al. (2014)

Avaliação automatizada do vigor de sementes de feijão (programa SVIS)

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Cultivar Nitro

Lote Germ.(%) PCG (%) EASS (%) EP (%) IV IU

6 99 a* 96 a 97 a 99 a 902 ab 922 ab

7 88 b 80 b 77 b 92 b 752 c 882 c

8 99 a 97 a 97 a 100 a 918 a 907 bc

9 99 a 96 a 98 a 100 a 883 ab 934 a

10 99 a 93 a 95 a 95 a 861 b 921 ab

C.V. (%) 5,5 5,5 6,0 5,3 3,6 2,9

Marcos Filho et al. (2006)* Comparação na coluna (teste de Tukey: p≤ 0,05)

Avaliação automatizada do vigor de sementes

de melão: comparação com métodos tradicionais

Índice de VigorÍndice de

Uniformidade

Índice de vigor: 613

Crescimento: 541

Uniformidade: 782

Índice de vigor: 973

Crescimento: 995

Uniformidade: 924

Abóbora(3 dias de idade)

SVISImagens: Francisco G. Gomes Junior

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Eficiência comprovada do SVIS®

Alface - Sako et al. (2001)

Soja - Hoffmaster et al. (2003); Marcos Filho et al. (2009)

Milho - Otoni e McDonald (2005)

Milho doce - Gomes Junior et al. (2009); Alvarenga et al. (2012)

Melão - Marcos Filho et al. (2006)

Crotalária - Silva, C.B. et al. (2012)

Pepino - Chiquito et al. (2012)

Amendoin - Marchi et al. (2011)

Trigo - Silva, V.N. et al. (2012)

Girassol - Rocha (2012)

Tomate e berinjela - Silva, V.N. (2012)

Quiabo - Kikuti e Marcos Filho (2013)

Algodão - Alvarenga (2013)

Arroz – Gomes Junior et al. (2013)

Feijão - Gomes Junior et al. (2014)

Cuidados: SVIS

Temperatura no germinador

Otoni e McDonald et al. (2005)

Parâmetros

SVIS

Temperatura °C

Milho Soja

24 25 26 24 25 26

Crescimento 531 b 459 b 734 a 612 b 573 b 731 a

Uniformidade 832 b 861 a 859 a 867 a 872 a 870 a

Vigor 621 b 579 b 765 a 739 b 722 b 800 a

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Uniformidade de umedecimento do substrato

Grau de umidade e tamanho das sementes

Horário de instalação e digitalização da imagens

Sementes dormentes

Diferenças na taxa de crescimento entre genótipos

Cuidados: SVIS