“Desarrollo y evaluación de sensores

potenciométricos miniaturizados para biomarcadores

de cáncer de próstata basados en polímeros de

impresión molecular”

Tesis presentada por:

M.C Soane Fernández Puig

Para obtener el grado de

Doctor en Electroquímica

DICIEMBRE, 2019

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO TECNOLÓGICO

EN ELECTROQUÍMICA

EN ELECTROQUIMICA.

Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico en Electroquímica

REALIZADO POR:

MC. Soane Fernández Puig

DIRIGIDA POR:

Dr Abraham Ulises Chávez Ramírez

SINODALES

Bibiana Cercado Quezada

Presidente Firma

Jannú Ricardo Casanova Moreno

Secretario Firma

Irma Robles Gutiérrez

Vocal Firma

Arístides Camilo Valdés González

Vocal Firma

Adriana Jheny Rodríguez Méndez

Vocal Firma

Goldie Harikrishna Oza

Suplente Firma

R E S U M E N

Desde hace unos años el cáncer de próstata (CaP), se ha convertido en una preocupación para la

medicina debido a que es la segunda causa de muerte en hombres. Actualmente el antígeno prostático

específico PSA (4-10 ng/mL) en sangre es el más empleado para la predicción de esta enfermedad.

En la búsqueda de biomarcadores que puedan ayudar en el diagnóstico, la sarcosina ha sido

ampliamente estudiada como biomarcador potencial para predecir la progresión del CaP, debido a que

se ha investigado que existe una relación entre la progresión de CaP y este analito en orina (80.1–

1975.8 ng/mL), por tanto, es vital la detección temprana para el tratamiento exitoso de la enfermedad.

Desarrollar un método rápido, sensible y específico para la detección de sarcosina es primordial. En

nuestro trabajo se diseñaron sensores potenciométricos para sarcosina utilizando electrodos de estado

sólido base epoxi grafito empleando polímeros de impresión molecular como elementos de

reconocimiento.

Los sensores se diseñaron empleando como elemento de reconocimiento polímeros de impresión

molecular con diferentes monómeros y se empleó un programa de modelado computacional para

determinar el monómero de mejor energía de enlace (ácido metacrílico). Los polímeros se probaron

en sistemas de extracción en fase sólida (EFS) siendo el polímero IIA, VIIA y PIM –SC I los de mejor

capacidad de adsorción: 9.03·10-5; 8.0·10-5 y 6.44·10-4 de sarcosina/g de PIM respectivamente, el

mejor tiempo de adsorción fue de 90 min y el pH de trabajo fue 7. El mejor disolvente para la elución

de sarcosina fue una mezcla ácido acético-metanol 9/1.

Los sensores potenciométricos miniaturizados diseñados se emplearon en la detección de sarcosina.

Los resultados de la calibración mediante el método de las adiciones arrojaron que presenta una

respuesta Nerstiana en el intervalo de 8.0·10-8 – 5.9·10-5 mol/L para el sensor IIA (6 % polímero de 15

m). La pendiente obtenida es de -23.7 mv/Dec y los límites de detección del sensor se encuentran

en 2.0·10-8 mol/L con un coeficiente de correlación de 0.985. La detección es dependiente del pH

siendo el pH 7 el empleado para las determinaciones, el tiempo de respuesta del sensor es de 30 s y

su tiempo de vida de 6 meses. Los sensores son selectivos a sarcosina en presencia de otros

compuestos (biotina, histidina, ácido úrico y glicina) a excepción de la creatinina con un KA,B Pot (0.2).

Por los resultados obtenidos podemos decir que los sensores obtenidos son selectivos a sarcosina y

se podrían emplear en la detección de este biomarcador en muestras de orina de pacientes con CaP.

A B S T R A C T

For a few years, prostate cancer (PCa) has become a concern for medicine, because it is the second

leading cause of death in men. Currently the antigen prostatic specific PSA (4-10 ng / mL) in blood is

the most used for the prediction of this disease. In the search for biomarkers that can help in the

diagnosis, sarcosine has been widely studied as a potential biomarker to predict the progression of

PCa, because it has been investigated that there is a relationship between the progression of PCa and

this analyte in urine (80.1–1975.8 ng/mL), by therefore, early detection is vital for the successful

treatment of the disease. Developing a fast, sensitive and specific method for the detection of PCa is

paramount. In our work, potentiometric sensors for sarcosine were designed using graphite epoxy

based solid state electrodes using molecular imprinted polymers as recognition elements.

The sensors were designed using molecular printing polymers with different monomers and a

computational modelling program was used to determine the best binding energy monomer

(methacrylic acid). The polymers were tested in solid phase extraction systems (SPE) with polymer IIA,

VIIA and PIM -SC I with the best adsorption capacity 9.03·10-5, 8.08·10-5 and 6.44·10-4 mg / g

respectively, the best adsorption times was 90 min and the working pH was 7. The best solvent for the

elution of sarcosine was an acetic acid-methanol mixture 9/1.

The miniaturized potentiometric sensors designed were used in the detection of sarcosine. The results

of the calibration by the addition method showed that it has a Nerstian response in the range of 8·10-8

- 5.9·10-5 mol / L for the IIA sensor (6 % polymer of 15 m). The slope obtained was -23.7 mv / Dec

and the detection limits of the sensor are at 2.0·10-8 mol / L with a correlation coefficient of 0.985. The

detection is dependent on the pH, 7 was the pH used for the determination and the response time of

the sensor is 30 s and its life time of 6 months. The sensors are selective to sarcosine in the presence

of other compounds (biotin, histidine, uric acid and glycine) with the exception of creatinine with a KA,

B Pot (0.2). From the results obtained we can say that the sensors obtained are selective to sarcosine

and could be used in the detection of this biomarker in urine samples from patients with PCa.

Este trabajo fue realizado en el Centro de Investigación

y Desarrollo Tecnológico en Electroquímica (CIDETEQ),

bajo la dirección

Dr. Abraham Ulises Chávez Ramirez

co-dirección

Dr Arístides Camilo Valdés González

El presente trabajo se realizó en el Centro de Investigación y Desarrollo

Tecnológico en Electroquímica, Bajo la dirección del Dr Abraham Ulises

Chávez Ramírez y la co-dirección del Dr Arístides Camilo Valdez González.

Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, al Centro

de Investigación y Desarrollo Tecnológico en

Electroquímica por el apoyo económico brindado y las facilidades materiales brindadas

para la realización del presente proyecto.

No debemos tener miedo a equivocarnos,

hasta los planetas chocan y del caos

nacen las estrellas

¨Charles Chaplin¨

Hay una fuerza motriz más poderosa

que el vapor, la electricidad y la

energía atómica: la voluntad.

El crecimiento intelectual debe

comenzar solo en el nacimiento y

solo cesar con la muerte.

¨Albert Einstein¨

AGRADECIMIENTOS

Es maravilloso soñar algo y lograrlo, es lindo levantarse cada día y agradecer a la vida por todo lo que

te da. Este examen de grado es más que un mero ejercicio, muchos no conocen el enorme sacrificio

que conlleva un acto como el que se está desarrollando hoy, noches en vela, estrés, experimentos

fallidos, dudar sobre ti mismo, en fin. Puedo sentirme afortunada por todos los amigos que tengo,

pocos pero los mejores. Es por eso que este día quiero agradecer a todas las personas que confiaron

en mí desde el inicio de este viaje.

A mi familia:

En primer lugar a mi madre Sonia: has sido mi guía, mi ejemplo, no te cambiaría por otra, aunque mi

estrés diga lo contrario.

A mi familia toda en especial a mis tías Mayra, Elizabeth son especiales me tocaron las mejores.

A mis hermanos Yanais y Roger que siempre están pendientes de mí y ayudando en lo que pueden,

molestando también, pero así los quiero.

A mis sobrinos no puedo querer más que esos niños maravillosos.

A mi esposo

A mi esposo Ariel por su grandísimo apoyo y por estar a mi lado en todo momento, gracias por

acompañarme por aguantar mis malos humores, mis ganas de dejarlo todo y ser mi apoyo. Gracias

por quererme tanto.

A mis tutores y profesores:

Abraham y Camilo que más que llevarme de la mano y enseñarme que la Investigación es bella,

levantaron mi autoestima cuando creí que no iba a tener fuerzas para terminar.

A Toki como cariñosamente le decimos por sus acertados consejos y la ayuda prestada.

A la profe Pilar persona maravillosa, más que su estudiante me trató como su familia.

A mis sinodales:

Irma, Bibiana, Jannú, Jheny, gracias por acompañarme en cada uno de mis pasos, mis seminarios

académicos. Por darme una sugerencia acertada en cada momento.

A mis amigos:

A mis amigos incondicionales Lisbet, Yaremis, Yanio, por siempre darme aliento, escucharme

regañarme cuando hace falta y saber que tengo un hombro para llorar o reír.

A los que me acompañaron en este viaje amigos nuevos que esté país maravilloso me dejo conocer

Pine, Alonso, Juan de Dios, Geyla, Chuy, Ingrid, Lalo, Marta, Jannú, Euth, Polett, Martín ese

SEQE maravilloso que me hizo sobrellevar mi estancia.

A Rosy, Azucena, Rubí, Armando, Lety, Diana, Victor, Miguel, Jan, Isaac, Isaías, Arturo, Fabiola,

Aby, Lalo, Trini, gracias por invitarme a sus convivios y hacerme sentir uno más de ustedes.

A Alberto, Dennys, Leydis, Erick, Ruslán, Montse, Olivia, Lissy, Rulo, Ramón, Juanita, Raúl

gracias por estar ahí y formar parte de mi vida.

Al grupo de la UNESP Araraquara Douglas, Gerson, Lucas, Caio, Mariana, Sabir, Shakeel, Rajabo,

Andresa, Carolina y mis amigos cubanos Daylin, Alexander que bien lo pasé con ustedes, sino no

hubiera podido tener una estancia tan grata gracias a todos.

A México:

A este maravilloso país que me abrió las puertas incondicionalmente para que me pudiera superar y

lograr parte mis sueños. A Cideteq por el acceso a sus instalaciones para poder desarrollar mis

experimentos.

Y por último, a cada una de las personitas que de una forma u otra estuvieron allí cuando lo necesité

y me tendieron su mano amiga. Sé que quedaron algunos pero sepan que están en mi corazón.

A todos muchas gracias.

ABREVIATURAS Y SIGLAS

CaP Cáncer de Próstata

PSA Antígeno Prostático Específico (Prostatic Specific Antigen, por

sus siglas en inglés)

DRE Análisis digital del recto (Digital Rectal Analysis, por sus siglas

en inglés)

HBP Hiperplasia Benigna de Próstata

hk2 Calicreína 2

PTEN Homólogo de la fosfatasa y tensina

EPCA Antígeno Temprano de Cáncer de Próstata (Early Prostatic

Cancer Antigen, por sus siglas en inglés)

PSMA Antígeno Específico de Membrana (Prostatic Specific

Membrane Antigen, por sus siglas en inglés)

PCA3 Antígeno prostático del cáncer ( Prostatic Cancer Antigen, por

sus siglas en inglés)

ELISA Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (Enzyme-

Linked Immunosorbent Assay, por sus siglas en inglés)

ESI Electrodo selectivo a iones

AMACR α metilacil CoA racemasa (α metilacil CoA racemace, por sus

siglas en inglés)

SPINK1 Serina proteasa inhibidor Kazal-tipo 1( Serine protease inhibitor

Kazal- type 1, por sus siglas en inglés)

GOLPH2 Golgi phosphoprotein 2 (Fosfoproteina Golgi 2,por sus siglas en

inglés)

TFF3 Factor de crecimiento derivado del epitelio de Leris (Leris

epiteliumm-derivated growth factor, por sus siglas en inglés)

XAGE1b Antígeno de la familia G, miembro 2 (G antigen family D,

member 2)

SSX-2,4 Gen tipo 2 y tipo 4

NY-ESO1 Antígeno de cáncer testicular

CEA Antígeno carcinoembrionario (Carcinoembryonic antigen

Antigen, por su siglas en inglés)

PIM Polímero de impresión molecular

PIN Polímero no impreso

ADN Ácido desoxirribonucleico

mARN Ácido ribonucleico mensajero

DFT Teoría del funcional de la densidad (DFT por sus siglas en

inglés)

LD Límite de detección

LOC Lab on a chip (por sus siglas en inglés)

UPLC-MS Ultra Performance Liquid Chromatography - Mass

(Cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a masas, por

sus siglas en inglés)

ÍNDICE

1 Introducción 1

2 Objetivos 4

2.1 Objetivo general 4

2.2 Objetivos específicos 4

3 Antecedentes 5

3.1 Biomarcadores para el CaP 5

3.2 Sarcosina 8

3.3 Sensores 9

3.3.1 Sensores electroquímicos potenciométricos 12

3.3.2 Mecanismo de trabajo de los ESI 15

3.4 Polímeros de impresión molecular 19

3.5 Estudio de la interacción monómero plantilla 21

3.6 Tecnología Lab on a chip 23

3.7 Justificación 25

4 Materiales y métodos 26

4.1 Reactivos, disoluciones y equipos 26

4.1.1 Reactivos 26

4.1.2 Disoluciones 27

4.1.3 Equipos 27

4.2 Parte experimental 28

4.2.1 Selección de la molécula plantilla 29

4.2.2 Estudio de la interacción monómero plantilla 29

4.2.3 Síntesis de los polímeros de impresión molecular 30

4.2.3.1 Caracterización morfológica de los PIM 33

4.2.3.2 Evaluación de las propiedades de reconocimiento 34

4.2.3.3 Metodología de determinación de sarcosina por UPLC-MS 35

4.3 Construcción de los cuerpos de los electrodos 37

4.3.1 Activación de las membranas y calibración de los electrodos 37

4.4 Caracterización analítica 37

4.4.1 Influencia del pH 37

4.4.2 Tiempo de respuesta 38

4.4.3 Tiempo de vida 39

4.4.4 Estudio de posibles interferentes 39

5 Resultados y discusión 40

5.1 Selección de la molécula plantilla 40

5.2 Estudio de la interacción monómero plantilla 41

5.3 Síntesis de los polímeros de impresión molecular PIM 41

5.3.1 Caracterización morfológica 41

5.3.2 Evaluación de las propiedades de reconocimiento de los PIM 47

5.4 Caracterización analítica de los PIM 50

5.4.1 Efecto del tiempo de contacto 50

5.4.2 Efecto del pH 50

5.4.3 Capacidad de sorción 51

5.4.3.1 Polímeros empleados para Extracción en Fase Sólida (EFS) 52

5.4.3.1.1 Eficiencia del disolvente 52

5.4.3.2 Selectividad del PIM 53

6 Construcción y evaluación de los sensores potenciométricos 56

6.1 Construcción del cuerpo de los electrodos 56

6.1.1 Evaluación del funcionamiento del transductor 56

6.2 Caracterización morfológica de la membrana 57

6.3 Calibración de los sensores 59

6.3.1 Caracterización analítica del sensor 61

6.3.2 Influencia del pH del medio 61

6.3.3 Tiempo de respuesta 63

6.3.4 Tiempo de vida 63

6.3.5 Selectividad del sensor 64

6.3.6 Aplicación analítica 65

7 Conclusiones 67

Perspectivas 68

Anexo 1 69

Anexo 2 71

8 Referencias bibliográficas 74

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Partes fundamentales de un sensor 10

Figura 2 Componentes de las lenguas electrónicas 11

Figura 3 Típica distribución de componentes en una membrana

polimérica

15

Figura 4 Montaje experimental para realizar las medidas

potenciométricas

16

Figura 5 Mecanismo de detección de límite de fase 18

Figura 6 Representación esquemática del proceso de impronta

molecular

20

Figura 7 Sistema microfluídico con tecnología Lab on Chip 24

Figura 8. Estructura y nube electrónica de a) ácido metacrilíco b)

sarcosina c) 4 vinilpiridina

30

Figura 9 Representación del proceso de impronta molecular en

bloque convencional

30

Figura 10 Representación del proceso de impronta molecular

core@shell

32

Figura 11 Esquema de los electrodos confeccionados 36

Figura 12 Propiedades ácido base de la sarcosina 38

Figura 13 Estudio de la influencia del pH empleando una celda de

flujo

38

Figura 14 Micrografías de los polímeros obtenidos 44

Figura 15 Isotermas de sorción de N2 de los PIM convencionales 46

Figura 16 Isotermas de sorción de N2 de los PIM core @shell 47

Figura 17 Porcentaje de sarcosina en solución de lavado de los

polímeros

48

Figura 18 Influencia del tiempo en la sorción de sarcosina 50

Figura 19 Efecto del pH en la respuesta del sensor 51

Figura 20 Efecto de la concentración de sarcosina en la sorción de

los polímeros

52

Figura 21 Estructura de los compuestos interferentes 54

Figura 22 Miniaturización de electrodos 56

Figura 23 Micrografías de las membranas 58

Figura 24 Calibración de los sensores a distintos tiempos de

activación

59

Figura 25 Calibración de los sensores con distintos porcentajes de

elemento de reconocimiento

60

Figura 26 Efecto del pH 62

Figura 27 Tiempo de respuesta del sensor 63

Figura 28 Calibración de los sensores durante 6 meses 64

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Clasificación IUPAC de los ESI según el tipo de membrana

que utilizan

12

Tabla 2 Composición de los diferentes polímeros sintetizados 31

Tabla 3 Composición de los polímeros en formato core@shell 33

Tabla 4 Composición de la membrana sensora 36

Tabla 5 Resumen de biomarcadores de CaP 41

Tabla 6 Energía de interacción del monómero- sarcosina 42

Tabla 7 Análisis superficial de los polímeros en bloque 45

Tabla 8 Análisis superficial de los polímeros core@shell 47

Tabla 9 Resultado reenlace PIM 49

Tabla 10 Resultados reenlace de los PIM core@shell 49

Tabla 11 Efecto del eluente en la sorción de sarcosina 53

Tabla 12 Efecto del eluente en la extracción de sarcosina 53

Tabla 13 Porcentajes de recobrado en la elución de compuestos

interferentes

54

Tabla 14 Valores promedio de la resistencia eléctrica de los electrodos 57

Tabla 15 Caracterización de los sensores con distintos tamaños de

partícula

61

Tabla 16 Coeficiente de selectividad del sensor 65

Tabla 17 Medición de muestras con los sensores 65

1

1. INTRODUCCIÓN

Hace algunas décadas las enfermedades cancerígenas, han estado afectando la calidad de vida del

hombre, siendo consideradas una de las principales causas de mortalidad y morbilidad 1. Entre los

tipos de tumores malignos causantes de cáncer, el de próstata (CaP) es el más común encontrado en

hombres, por lo que se estima que 1 de cada 7 será diagnosticado con este tipo cáncer en el transcurso

de su vida 2.

En México, el CaP es el segundo más común encontrado en hombres. Las cifras oficiales (2019)

indican que casi 7 mil mexicanos mueren anualmente por ese padecimiento, siendo reportados entre

21 y 25 mil nuevos casos al año, lo que posiciona a este padecimiento como un grave problema de

salud pública.

El CaP es un padecimiento que se origina como consecuencia del desarrollo de células cancerosas

en la glándula prostática, este desarrollo de células tumorales generalmente ocurre después de los

cincuenta años de edad. La detección de CaP podría y debería ser oportuna, lo que incrementaría

sustancialmente la tasa de supervivencia a la enfermedad, la falta de una cultura en medicina

preventiva, los mitos y prejuicios “machistas” asociados al procedimiento de diagnóstico más

empleado, el análisis digital del recto, le permiten desarrollarse hasta alcanzar altas cotas de

mortalidad. Debido a esto, los investigadores han ido desarrollando estrategias terapéuticas, en

función de mejorar la calidad de vida de los pacientes después de su diagnóstico y tratamiento. A

pesar de estos esfuerzos, hoy día, la sobrevivencia sigue siendo muy baja 3.

El CaP, según los estudios realizados, es una enfermedad heterogénea. Se trata de tumores que

progresan de manera asintomática, en la mayoría de los casos, por lo que pueden ser imperceptibles

o muy agresivos y como consecuencia de esto, las manifestaciones clínicas sólo aparecen cuando la

enfermedad es sistémica 4. Por esta razón, alrededor del 92 % de la diagnosis es realizada cuando la

enfermedad se encuentra en la próstata y en los órganos adyacentes, en el denominado estadio local

o regional, según el Instituto Mexicano de Seguridad Social (IMSS)5. De acuerdo al IMSS, sólo en el

2014 se diagnosticaron alrededor de 233,000 nuevos casos, el 60 % de los cuales se detectó ya en

etapas avanzadas, provocando la mortalidad de alrededor de 80 mil mexicanos, muchos de los cuales

habrían podido sobrevivir si se contara con un sistema de detección temprana. Anualmente 6 de cada

10 casos se diagnostican en hombres de 65 años o más y en pocas ocasiones se presenta antes de

los 40 años 6. Uno de los principales retos en este tipo de enfermedad es desarrollar pruebas de

diagnóstico eficientes en etapas tempranas.

2

Los métodos de diagnóstico más comunes empleados para la detección del CaP son: el examen digital

del recto (DRE) y la prueba del antígeno específico de la próstata (PSA) 7 las cuales presentan una

sensibilidad y especificidad limitada 8. En el caso del DRE, la eficacia del diagnóstico dependerá de la

experiencia y habilidad del especialista que lo realiza, para discriminar si el aumento de la próstata es

producido por alguna de las diferentes patologías que puede presentar la próstata: hiperplasia,

inflamación o infección prostática, entre otras afecciones y la prueba del PSA, pese a que se considera

un marcador tumoral efectivo, su aumento no siempre asegura que exista CaP, lo cual hace que su

especificidad no sea muy elevada. Se ha demostrado que debido a la inespecificidad de estas pruebas

aproximadamente el 75 % de las biopsias transrectales realizadas dan resultados negativos 9-10. Esto

representa una consecuencia negativa para el paciente debido a que pueden existir complicaciones

en la toma de muestra, como alto riesgo de infección, malestar e incomodidad y la angustia de saber

que puedes estar padeciendo de esta enfermedad 11-12.

La alta prevalencia de CaP, su heterogeneidad y las distintas vías moleculares potencialmente

implicadas en su patogénesis, hacen improbable que un único marcador molecular tenga una

sensibilidad y específicidad suficientemente alta para considerarlo idóneo. Por lo tanto, resulta de

particular interés mejorar la capacidad para pronosticar y predecir esta mortal enfermedad. Esto

conlleva a la investigación de nuevos biomarcadores y el desarrollo de herramientas tecnológicas para

su detección. En los últimos años han comenzado a publicarse trabajos donde se realiza la detección

de combinaciones de varios marcadores en sangre y/o en el orina que sumados, aumenten la

sensibilidad y especificidad en el diagnóstico del CaP 13-14.

En el presente trabajo se propone obtener electrodos potenciométricos miniaturizados que puedan

determinar biomarcadores potenciales de CaP basados en polímeros de impresión molecular (PIM).

Estos últimos actuarán como elemento de reconocimiento del analito seleccionados presente en

fluidos biológicos (suero u orina).

Tomando en consideración la importancia y actualidad que tiene el desarrollo de nuevos y mejores

materiales (PIM) para la detección de biomarcadores que identifiquen el CaP, la importancia de

incorporarlos a la detección, las facilidades de los sistemas para la miniaturización y el haber

encontrado muy poca literatura sobre la detección de selectiva de biomarcadores empleando PIM se

puede reconocer el siguiente problema científico:

3

Problema científico:

Los sistemas de detección actuales resultan poco eficientes para el diagnóstico de CaP de forma

específica y en etapa temprana.

Hipótesis

El desarrollo de PIMs y su empleo como portador móvil en la construcción de sensores

potenciométricos miniaturizados brindarán una solución tecnológica de alta sensibilidad, especificidad

y rápida respuesta para la detección de biomarcadores relacionados con el CaP.

4

2. Objetivos

2.1 Objetivo general

Desarrollar electrodos miniaturizados potenciométricos empleando PIM como elemento de

reconocimiento de biomarcadores de CaP.

2.2 Objetivos específicos

1. Seleccionar la molécula plantilla (biomarcador) más adecuada con base en la revisión

bibliográfica

2. Sintetizar los polímeros de impresión molecular de tipo acrílico para los biomarcadores

seleccionados

3. Caracterización físico química de los materiales obtenidos por diferentes técnicas

4. Desarrollar sensores potenciométricos de membrana líquida empleando los PIMs sintetizados

5. Caracterizar analíticamente los sensores

6. Evaluación operacional del sensor

5

3. ANTECEDENTES

3.1 Biomarcadores para la detección de CaP

A pesar de las limitaciones del PSA, actualmente se sigue empleando para la detección del CaP. Este

biomarcador es una serina proteasa producida por el epitelio de la próstata que se utiliza en oncología

como un biomarcador no específico para el premonitoreo del CaP cuando sus valores se encuentran

en concentraciones de 4 a 10 ng/mL 15. Aunque la concentración del PSA se eleva en pacientes con

CaP también puede elevarse en pacientes con tumores benignos, con hiperplasia benigna de próstata

(HBP), prostatitis y asociado a factores como la edad e infecciones etc, de ahí la baja específicidad.

Es por ello que se están considerando una serie de biomarcadores, más efectivos para emplearlos

como herramientas de apoyo para la detección del CaP. En este sentido, hay un grupo de

biomarcadores del tipo proteómico, metabolómico y genómico que han sido objeto de estudio. De los

más de mil metabolitos estudiados 16 hay un pequeño grupo que se destaca debido a que se

incrementan significativamente cuando hay presencia de CaP: la prolina, kiurenina, glicerol 3 fosfato,

leucina, creatinina, uracil, glicina y el metabolito secundario sarcosina; otros biomarcadores como la

calicreína 2 (hk2), el antígeno temprano de cáncer de próstata (EPCA), el antígeno específico de

membrana (PSMA), el antígeno prostático del cáncer (PCA3), el homólogo de la fosfatasa y tensina

PTEN y la fusión del gen TMPRSS2-ERG incrementan su concentración cuando hay tumores

presentes en la próstata.

El EPCA es una proteína que se eleva cuando hay presencia de CaP 17-18 su detección en muestras

de suero permite diferenciar entre la enfermedad local y extra prostática, además, establecer si el

paciente se encuentra sano o tiene CaP. Aunque se han hecho pruebas y se ha determinado que es

un marcador más específico que el PSA, aún no es lo suficientemente confiable para reemplazar al

PSA en el diagnóstico de tumores prostáticos. El PSMA es una glicoproteína que se encuentra en el

tejido prostático sano y con tumoración 17-18. Este anticuerpo se ha empleado con un anticuerpo

monoclonal marcado con In111 para detección in vivo de CaP en tejido y en suero; adicionalmente

permite diferenciar grado de tumor y estadio de la enfermedad. Su limitación radica en que aún no se

ha establecido si es mejor predictor de la enfermedad que el PSA, por lo que se encuentra en estudio.

El PTEN es un gen supresor del tumor localizado en el cromosoma 10, que normalmente esta presente

en el tejido prostático 13-14, 19. Su detección en sangre es asociada con cáncer positivo y recurrencia,

siendo empleado, junto con TMPRSS2 para la predicción de la enfermedad. Por otra parte, el PCA3

6

es un gen que resulta elevado en más del 90% de los casos de CaP, mientras que resulta normal en

otras patologías no malignas 13-14, 19-20. La Food and Drugs Administration (FDA) ha probado el uso del

PCA3 con un punto de corte de 25 como indicador de necesidad de biopsia en pacientes con niveles

de PSA entre 2.5-10 ng/mL y pacientes con biopsias previas negativas y cifras de PSA

persistentemente elevadas, lo que indica su valor predictivo negativo (90 %), sensibilidad de 77.5 %,

especificidad de 51.7 % y el valor predictivo positivo de 33.6 %. El TMPRSS-2 suele combinarse con

el PCA3, un producto derivado de la fusión del gen TMPRSS-2 con el factor de trascripción ERG. Dicho

producto corresponde a una serino proteasa transmembrana tipo II que se expresa de forma normal

en el epitelio prostático y ha sido involucrada en procesos patológicos como el CaP. Sin embargo, su

función biológica es aún desconocida. Estos nuevos compuestos tienen múltiples ventajas sobre el

PSA ya que predicen el riesgo de enfermedad y su detección evita biopsias innecesarias. En el caso

del PCA3, aunque su concentración es independiente del tamaño de la próstata, para la determinación

del punto de corte aún depende de la determinación del mARN (ácido ribonucleico mensajero) del PSA

para establecer el valor que se correlaciona con la necesidad o no de biopsia en pacientes con CaP.

Otros biomarcadores como la sarcosina (N-metilglicina), se ha comprobado que la concentración de

este biomarcador se incrementa significativamente en los pacientes durante la progresión del CaP 13,

21-22. La relación entre los cambios en los niveles de concentración de sarcosina en la orina humana

en el desarrollo de CaP fue publicado por primera vez en 2009 por Sreekumar et. al. 16. Por su parte,

el grupo de Struys et. al. 23, realizó un estudio preliminar donde determinó que la detección de este

biomarcador en sangre tiene más potencialidades para ser empleado para el diagnóstico, debido a

que aumenta su concentración cuando hay tumores prostáticos presentes. Además, otro estudio

realizado por Isaaq et. al. 24, corrobora que en sangre hay más posibilidades de detectarla y a diferencia

de los otros metabolitos es el más estudiado, debido a que tiene más potencialidades para ser

empleado como predictor de la enfermedad. Otro marcador que promete ser un buen candidato para

su estudio es la hk2 13, 17-18, 25, la cual es una glicoproteína del grupo de las calicreínas humanas y está

localizada en la próstata. La hk2 es más específica del tumor que el PSA y se expresa a niveles más

altos en el tejido prostático canceroso. También se ha comprobado que la concentración del precursor

(pro hK2) se encuentra elevado en suero de pacientes con CaP y en el tejido prostático canceroso

comparado con el tejido de la HBP o el tejido prostático normal 26. Adicionalmente, estos marcadores

resultan ser más específicos de los tumores prostáticos, con muy pocas probabilidades de ser

encontrados en otros tipos de células cancerígenas.

7

En años recientes se han realizado varios intentos de detectar múltiples biomarcadores de CaP con el

objetivo de desarrollar dispositivos automáticos para su detección en suero, orina o tejido. Este es el

caso de grupos como el de S. Simpa Salami et. al. 27 que desarrollaron un algoritmo clínico que

combina la detección urinaria de TMPRSS2: ERG y PCA3 con la de PSA en suero para predecir el

CaP. Bharathi Laxman et. al. 28 crean la primera generación de análisis multiplexados qPCR de

biomarcadores que se expresan en etapa temprana (AMACR, ERG, GOLPH2, PCA3, SPINK1, TFF3,

y TMPRSS2: ERG). La sensibilidad y especificidad para el modelo multiplexado fue de 65,9 % y 76 %

respectivamente y los valores predictivos positivos y negativos fueron 79,8 % y 60,8 %,

respectivamente. Por otra parte, Xie Chong et. al. 29 identificaron epítopes de células de 6 antígenos

previamente asociados a CaP: el NY-ESO-1, XAGE-1b, SSX-2,4, α- metilacil-CoA racemasa

(AMACR), p90 y LEDGF estos se conjugaron con microesferas seroMAP para permitir la medición

multiplexada en muestras de suero. Zheng et. al. 30 describen la detección eléctrica multiplexada de

marcadores de cáncer (PSA, PSA-α1-antiquimotripsina, antígeno carcinoembrionario (CEA) y mucina-

1, utilizando dispositivos de efecto de campo (nanocables de silicio) en los que se incorporan nanohilos

como receptores. Los marcadores se detectaron en concentraciones 0,9 pg/ mL con elevada

sensibilidad y especificidad en muestras de suero. Estos métodos proporcionan una mejora

significativa sobre las técnicas de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas

en inglés) estándar, pueden predecir proliferación de los tumores después de un tratamiento de

quimioterapia o quirúrgico, ayudar a los especialistas en el diagnóstico clínico y además evita biopsias

innecesarias. Sus desventajas radican, en la mayoría de los casos, en el uso de los antígenos,

anticuerpos o enzimas para hacer la medición lo cual hace que la técnica sea de un solo uso y con

tiempos limitados debido a caducidad de los biomarcadores como de los reactivos para su

determinación, lo que limita su empleo, así como los biomarcadores que determinan por estas técnicas

son inespecíficos del CaP. Adicionalmente, hay que procesar las muestras en el laboratorio para la

determinación de los analitos y por tanto dependen de personal calificado.

Por otra parte, el análisis de la mayoría de los biomarcadores implica complejas etapas de tratamiento

y procesamiento de la muestra, ensayos ELISA, qPCR (reacción en cadena de la polimerasa o

transcripción en tiempo real) etc. o con técnicas instrumentales de alto costo, como la cromatografía

líquida de alta eficiencia acoplada a diferentes sistemas de detección, como fluorescencia, ultravioleta

con arreglo de diodos (UV-DAD), o diferentes sistemas de masas y masas en tándem (HPLC/MS,

HPLC/MS/MS), electroforesis capilar o cromatografía gaseosa (GC). El empleo de sensores

8

potenciométricos que emplean PIM como fase sensora, con elevada selectividad, sensibilidad y bajo

costo sería una alternativa viable.

3.2 Sarcosina

La sarcosina (N- metilglicina), es un metabolito derivado de la glicina, el cual es un aminoácido natural

encontrado en músculos y otros tejidos. Según estudios realizados, este analito podría ser empleado

para predecir la presencia del CaP y se ha determinado que se encuentra en suero 5.34–240 ng/mL

(0.06 – 2.67 M ) y en la orina en un intervalo de concentración desde 80.1–1975.8 ng/mL ( 0.9 – 22.2

M) 31-32. En investigaciones recientes, se encontró un nivel alto de sarcosina en la orina de pacientes

con CaP, lo que llevó a realizar diversos estudios en los cuales, se ha demostrado que la sarcosina

incrementa su concentración durante la progresión y metástasis de esta enfermedad. Por otro lado, se

determinó niveles de concentración de sarcosina en pacientes con biopsia negativa y estos fueron más

bajos que en pacientes con CaP; así como, los niveles de sarcosina en orina tuvieron mejores

resultados que los niveles séricos de PSA para predecir el riesgo de CaP, cuando los niveles de PSA

se encuentran en valores entre 2-10 ng / mL 16, 33.

Actualmente los métodos empleados para determinar la sarcosina son métodos colorimétricos,

cromatográficos, métodos cromatográficos acoplados a masas y electroquímicos (menos empleados).

Entre los métodos colorimétricos se encuentran los enzimáticos como los empleados por Yamkamon

et. al. 34 en el cual se emplea la sarcosina oxidasa para la determinación del analito, este método

requiere utilizar enzimas con los problemas que conlleva como: trabajar a un pH, temperatura

específicas para evitar la desnaturalización de la misma lo que hace el trabajo engorroso y caro 35. En

el caso de la cromatografía usualmente se requiere la derivatización de la molécula. La derivatización

es la modificación del analito mediante una reacción química, esto consiste en hacer reaccionar al

analito con una molécula derivatizante que le confiere una propiedad ya sea color, fluorescencia o

fosforescencia con lo que se facilita su determinación y depende de la estabilidad del reactivo

derivatizante, la reacción y que compuestos con una estructura similar no tengan la misma propiedad

que el analito principal, lo que la hace ineficiente 36. En el caso de los métodos cromatográficos

acoplados a masa son métodos altamente sensibles, su desventaja radica en el hecho que son equipos

complejos que dependen de personal altamente calificado para su puesta en marcha, la preparación

de la muestra es complicada y en ocasiones también se necesita derivatizar la molécula a analizar,

9

la mayoría de los mismos no están al alcance de análisis rutinarios 37-38.

En las últimas decadas se ha tratado de determinar la sarcosina con métodos más simples como los

sensores electroquímicos, este campo aún esta en sus primeras etapas ya sea intentando la

inmovilización de enzimas sobre electrodos 35, 39 lo cual trae sus desventajas asociada

(desnaturalización) y tener una metodología de inmovilización que evite emplear los sitios activos de

la misma en el proceso. También se han desarrollado sensores impedimétricos en los cuales se

inmoviliza una monocapa de polimero impreso por electropolimerización sobre un sensor de

nanopartículas de oro (Au) modificado selectivos a sarcosina. Aunque efectivos con bajos límites de

detección (LD) tienen varios pasos de inmovilización y emplean Au por lo que resultan poco

económicos 40. Un campo que ha ganado la atención de la comunidad científica es el de los sensores

potenciométricos 41 por la fácil preparación de sus componentes, posibilidad de miniaturización y bajo

costo.

3.3 Sensores

En la última década, en el área de investigación, así como en la médica, se ha incrementado el interés

por realizar análisis de forma sencilla, rápida y económica. Un sensor es un dispositivo de análisis

conformado por un elemento de reconocimiento (anticuerpo, aptámero, PIM etc), asociado a un

mecanismo de transducción que convierte la interacción del dispositivo con el analito en una señal

medible 42.

Cabe destacar que las características fisicoquímicas del analito de interés son las determinantes para

la elección del material biológico/biomimético de reconocimiento. Los sensores están constituidos por

3 componentes fundamentales: un elemento de reconocimiento generalmente inmovilizado en un

soporte sólido constituyendo ambos la fase sensora, el transductor, que convierte la interacción entre

el elemento de reconocimiento y el analito en una señal medible y la electrónica asociada (Figura 1).

10

Figura 1. Partes fundamentales de un sensor

Un nuevo concepto en el campo de los sensores ha aparecido para facilitar diferentes necesidades de

monitoreo. Estos novedosos sistemas conocidos como lenguas electrónicas (e-Ts), emplean un

arreglo de sensores no específicos (sensores diferenciales) con selectividad cruzada e incluyen

métodos de procesamiento de datos, con el fin de interpretar las respuestas complejas de los sensores

y relacionarlas con su significado analítico (Figura 2) 43-44. En general podemos decir que las e-Ts son

un conjunto de sensores donde cada uno de los cuales mide una propiedad determinada de la muestra.

La respuesta del conjunto de sensores ofrece una huella característica para cada especie. Para

evaluar la capacidad de las e-Ts como método para cuantificar las concentraciones de distintos

componentes a determinar en una muestra, se llevan a cabo varios análisis multivariantes mediante

un programa. En primer lugar, se realizan análisis de los componentes principales (CAP) para poder

visualizar los datos de forma sencilla y detectar posibles datos anómalos (outliers) cuyo

comportamiento difiere del resto. En segundo lugar, se hacen análisis de mínimos cuadrados parciales

(PLS) que maximizan la correlación entre variables independientes y dependientes. El objetivo es

generar un modelo referencia que permita cuantificar dichas respuestas a partir de los valores de las

medidas obtenidas. La suma de todas las huellas permite establecer un patrón de reconocimiento para

cada sabor.

El funcionamiento de las e-Ts es muy semejante al de las papilas gustativas humanas, donde el

cerebro es el encargado procesar los datos enviados por los receptores y de interpretar la respuesta

que los relaciona con un sabor determinado. Estos sistemas de análisis a igual que las lenguas

Analito

Elemento de

reconocimiento Transductor Electrónica

11

biológicas se someten a un sistema de aprendizaje para que inequívocamente puedan distinguir un

sabor determinado o discriminar CaP de HBP u otras afecciones de la próstata.

Figura 2. Componentes de las lenguas electrónicas

La investigación y desarrollo de las e-Ts es actualmente muy extensa. Debido a las ventajas que

proporcionan estos sistemas, en la actualidad algunos grupos de investigación las han empleado para

distintos fines como la determinación de contaminantes ambientales, fármacos 45 y biomarcadores del

CaP, entre otros 43, 46. También han sido empleadas narices electrónicas (similar a las e-Ts, pero para

el análisis de muestras gaseosas), para la detección de CaP. Como un primer intento, Antti Roine et.

al. 47 emplearon una nariz electrónica comercial (ChemPro 100-eNose), utilizada usualmente para el

análisis de agua, para discriminar CaP de HBP en orina. El dispositivo empleado utiliza como elemento

de reconocimiento sensores de óxidos metálicos semiconductores y detectores de movilidad iónica.

Las limitaciones de este dispositivo radican, en que los sensores empleados en el sistema responden

a cualquier analito por lo que hay que emplear una herramienta quimiométrica (como el análisis de

discriminación lineal), para la interpretación de los resultados, volatilizar la muestra por espacio cabeza

(headspace) y además calentar el sistema (200-350 °C) para su funcionamiento. Las e-Ts también se

han comenzado a emplear en el sensado de algunos biomarcadores de CaP 48-49.

Entre los tipos de sensores más utilizados para las e-Ts son los asociados con transducción

electroquímica, entre ellos los potenciométricos, voltamperométricos. Por otra parte se encuentran los

ópticos 50. Entre los primeros se encuentran los potenciométricos basados en electrodos selectivos a

Lengua

electrónica

Reconocimiento de patrones

Arreglo de sensores

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9

Análisis

multivariado

Patrón de respuestas

12

iones (ESI), transistores de efecto de campo sensibles a iones (ion selective field effect transistor,

ISFET, por sus siglas en inglés) que son un híbrido entre los electrodos selectivos a iones y los

transistores de efecto de campo metal-óxido (MOSFET metal – oxide field effect transistor, por sus

siglas en inglés), los conductimétricos y los amperométricos.

3.3.1 Sensores electroquímicos potenciométricos

Los sensores electroquímicos potenciométricos son aquellos en los cuales la señal obtenida de la

interacción entre el analito y el elemento de reconocimiento, es un potencial eléctrico. Esta medidas

se basan en la determinación de la diferencia de un potencial eléctrico en condiciones de circuito

abierto (corriente nula) entre un electrodo indicador y uno de referencia 51. La medición realizada con

los sensores potenciométricos se relaciona directamente con la actividad de las especies en disolución

y en el caso de disoluciones diluidas y especies neutras se aproxima la actividad a la concentración

52.

Los ESI, son un tipo de sensor electroquímico que permite la determinación potenciométrica de las

actividades de iones o especies neutras. Están formados básicamente por una fase sensora asociada

a un transductor (Figura 2). Estas fases son películas delgadas o membranas permeoselectivas.

Tabla 1. Clasificación IUPAC de los ESI según el tipo de membrana que utilizan

Electrodos selectivos de iones

Primarios Compuestos

Cristalinos No cristalinos

Membrana

homogénea

Membrana

Heterogénea

Matriz rígida Portador móvil

-carga +

-carga –

-neutro

-Par iónico

hidrofóbico

Sensibles a

gases

De sustrato

enzimático

El funcionamiento de un ESI se basa en la variación del potencial entre la superficie de la membrana

y la disolución, generando una señal debida a la interacción del ion o especie a determinar con el

elemento de reconocimiento, que se encuentra confinado en el seno de la membrana. La variación de

13

la señal depende de la concentración de analito presente 53. La ecuación fundamental de trabajo de

un sensor potenciométrico que relaciona la medida con la especie química medida es la ecuación de

Nernst (Ecuación 1), que relaciona cuantitativamente el potencial del electrodo con la actividad de la

especie e indirectamente permite calcular el cambio de potencial. Cuando un sensor presenta una

respuesta que se ajusta a dicho modelo se dice que tiene un comportamiento nerstiano.

Ecuación 1:

𝐸=𝐸𝑜+S log𝑎𝑖

Donde:

E: potencial de la celda (mV)

Eº: potencial estándar (mV)

ai: actividad del ión que se analiza

𝜶𝒊 = 𝜸𝒊[𝒊]

Donde:

i: concentración

𝞬i: coeficiente de actividad

𝒍𝒐𝒈𝜸𝒊 = −𝟎. 𝟓𝟏𝒁𝒊𝟐√𝑰

I: fuerza iónica

S: pendiente de la curva nernstiana

𝑆=2,303 𝑅𝑇/𝑍𝑖𝐹

R: constante de los gases (8.314 J/K·mol)

T: temperatura (298 K)

F: constante de Faraday (9,65·104 C/mol)

Zi: carga del ión

Los ESI han sido ampliamente utilizados en los últimos años y por lo que se ha desarrollado una gran

variedad de los mismos, de los cuales los del tipo “all-solid-state” han venido desarrollándose cada vez

más por su versatilidad 54-55. Estos electrodos están constituidos, generalmente, por membranas

líquidas que están formadas por una matriz polimérica, un disolvente mediador y el elemento de

reconocimiento, siendo directamente depositadas sobre un material composite conductor. En este tipo

14

de electrodo se usa un contacto preparado básicamente con grafito o una mezcla de éste con resina

epoxídica, en proporciones adecuadas.

Como se mencionó anteriormente, la fase sensora es la membrana líquida. En estos electrodos, la

constituye una fase orgánica que actúa como barrera permeoselectiva, en la cual hay 3 componentes:

la matriz polimérica (plastificante), el elemento de reconocimiento y el disolvente mediador. En el caso

del disolvente mediador, se han estudiado diferentes tipos para determinar su influencia: entre ellos el

3-nitro-o-xileno (NOX), tributilfosfato (TBP), bis-(2-etilhexil) sebacato (DOS), tris-2-etilhexilfosfato

(TEHP), dioctilftalato (DOP), dibutilftalato (DBP) tetradecil nitrato de amonio (TDAN) y o-nitrofeniloctil

eter (o-NPOE), siendo este último el más empleado. Entre las funciones del disolvente mediador, está

la modulación de la permeabilidad de la fase orgánica, además de ajustar la movilidad de los centros

de coordinación de la membrana. Al mismo tiempo debe tener otras características como las de ser

estable químicamente, presentar inercia química respecto a las formaciones del complejo receptor-

sustrato, viscosidad y constante dieléctrica adecuadas 56. De igual manera, la matriz (plastificante),

también ha sido ampliamente estudiada. Un ejemplo de compuestos que se han empleado para este

fin lo forman, polímeros, copolímeros (SBS) 57, policloruro de vinilo (PVC), etc. El más universalmente

empleado ha sido el PVC debido a sus características: ser estable e inerte al utilizar aditivos tales

como estabilizantes, plastificantes entre otros puede transformarse en un material rígido o flexible;

además es altamente resistente tiene elevada estabilidad mecánica y química 56. Las propiedades de

la membrana resultante dependen de la mezcla de ellos (Figura 3).

15

Figura 3. Típica distribución de componentes en una membrana polimérica de portador móvil

En el caso del elemento de reconocimiento, es al que se le atribuye la respuesta del electrodo, ya que

es capaz de reconocer a una especie selectivamente. Se han empleado para este fin una gran variedad

de receptores como: los éteres corona, las poliamidas y los PIM 56-57. Los últimos (PIM) han cobrado

relevancia debido a su versatilidad.

3.3.2 Mecanismo de trabajo de los ESI

Las mediciones potenciométricas con un sensor de estado sólido se realizan empleando una celda

electroquímica de dos electrodos, un electrodo de referencia y un ESI. En la (Figura 4) se muestra un

esquema típico para mediciones potenciométricas donde se puede considerar como dos medias

celdas galvánicas representadas por el ESI, el electrodo de referencia 58.

1%

33%

66%

Disolvente mediador

Plastificante

Elemento de reconocimiento

16

Figura 4. Montaje experimental para realizar las medidas potenciométricas empleando un ESI y un

electrodo de referencia (Tomado de: Tesis Zine, 2004)

Existen distintos modelos para explicar el potencial generado en la interfase del electrodo como: los

de equilibrio total (modelos clásicos), de equilibrio local (modelos de capa de difusión) y modelos

avanzados de no equilibrio. En nuestro caso solo tendremos en cuenta el modelo de potencial de límite

de fase (modelo clásico) 59. Una suposición que se puede hacer es inferir que la mayoría de las

contribuciones de los potenciales dependen de la muestra y por tanto la expresión de la fem (E) se

puede plantear de esta forma:

Ecuación 2:

𝐸 = 𝐸𝑚𝑒𝑚𝑏 + 𝐸𝑙𝑖𝑞 + 𝐸𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡

Donde:

Ememb: es el potencial de membrana

Eliq: es el potencial de unión líquida del electrodo de referencia

Econst: puede describirse como la suma de todas las contribuciones potenciales independientes de la

muestra

17

El Eliq del electrodo de referencia, aparece debido a la tendencia de dos soluciones diferentes

(electrodo de referencia interno | muestra) a mezclarse cuando se mantienen en contacto. Los cationes

y aniones de una solución más altamente concentrada tienden a difundirse hacia la disolución menos

concentrada para aumentar el equilibrio. Para evitar que las disoluciones se mezclen, se coloca un

diafragma entre la interfase de la disolución muestra y la disolución de llenado interno del electrodo de

referencia (pequeña pieza de cerámica o vidrio del electrodo, permeable a todas las especies, que

evita que las soluciones se mezclen). Se crea una diferencia potencial debido a la separación de carga

debido a diferentes movilidades iónicas. Los electrodos de referencia Ag+/ AgCl usan una sal altamente

concentrada (KCl 3M) que tiene una movilidad iónica similar, dominando la transferencia de carga en

la unión líquida. Esto mantiene el Eliq constante, minimizándolo de la ecuación 2 y haciendo que la fem

sea independiente de ese potencial, este efecto también se puede lograr utilizando un puente salino.

El Ememb se considera entonces como la suma de tres componentes diferentes:

Ecuación 3:

𝐸𝑚𝑒𝑚𝑏 = 𝐸𝐿𝑖𝑚 + 𝐸𝐷 + 𝐸𝐿𝑖𝑚´

Donde:

ELim: es el potencial límite entre el contacto sólido interno y la membrana

ED: es el potencial de difusión creado dentro de la membrana

ELim': es el potencial límite entre la membrana y la solución de muestra

18

Figura 5. Mecanismo de detección de límite de fase cuando la membrana se pone en contacto con

una disolución acuosa que contiene la especie. Separación de carga en la membrana | interfase entre

la membrana y la disolución que contiene la especie.

Deben considerarse diferentes supuestos en el modelo de potencial de límite de fase para simplificarlo:

I) El ED creado dentro de la membrana puede despreciarse debido al hecho de que está relacionado

con la cinética de especies cargadas en la membrana selectiva de iones

II) ELim se puede considerar como una constante porque comúnmente se considera independiente de

la muestra, por lo que la ecuación 3 se simplifica a la ecuación 4 suponiendo que el potencial de

membrana solo depende del potencial de límite de fase en la interfase de membrana | muestra.

III) Existe un equilibrio electroquímico en la interfase membrana (fase orgánica | muestra (fase acuosa)

Ecuación 4:

𝐸𝑚𝑒𝑚𝑏 = 𝐸𝑙𝑖𝑚´

Siguiendo todos estos supuestos, la posible ecuación de Nernst puede describir el potencial de la celda

en condiciones ideales:

𝐸 = ∆∅ = ∅𝑜𝑟𝑔 − ∅𝑎𝑐 =𝜇𝑖°𝑜𝑟𝑔 − 𝜇𝑖°𝑎𝑐

𝑍𝑖𝐹+

𝑅𝑇

𝑍𝑖𝐹𝑙𝑛

𝑎𝑖𝑎𝑐

𝑎𝑖𝑜𝑟𝑔

19

Donde:

∅: es el potencial eléctrico

Zi: carga de la especie i

μi: movilidad de las especies

ai: actividad de las especies

R: constante de los gases (8.314 J/K·mol)

T: temperatura (298 K)

F: constante de Faraday (9,65·104 C/mol)

Debido a que el valor de aiorg en la ecuación 5 permanece constante, lo que permite determinar el valor

de aiac y hacer que la concentración total de la especie en la membrana sea independiente de la

muestra. La ecuación Nerst se puede simplificar:

Ecuación 6:

𝐸 = 𝐸𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡 +59.1

𝑍𝑖𝑙𝑛 𝑎𝑖𝑎𝑐

3.4 Polímeros de impresión molecular

El elemento de reconocimiento, constituye el componente de mayor importancia dentro de un sensor

porque es el que tiene los grupos funcionales complementarios al analito. En los últimos años, se ha

visto un marcado auge en el desarrollo nuevos sistemas de análisis en los cuales se emplean PIM

como elemento de reconocimiento 60. Los PIM, son sistemas sintéticos que se comportan como

receptores biomiméticos, capaces de reconocer selectivamente, al analito para el cual se han

preparado. Esta característica le confiere muchas ventajas entre las que se encuentran las de poderse

sintetizar a diseño, su estabilidad, tanto química como física, ante las variaciones de las condiciones

de trabajo como temperatura, pH y muestran un buen desempeño en presencia de algunos solventes

orgánicos, adicionalmente se pueden obtener en forma de esferas, laminas y sobre centros

comúnmente llamados core@shell. Los PIMs se pueden obtener de forma sencilla a partir de

monómeros orgánicos e inorgánicos un entrecruzador, un disolvente (porógeno), el iniciador y el

analito a determinar (Figura 6).

20

Figura 6. Representación esquemática del proceso de impronta molecular. (1) Formación de un

complejo entre la molécula plantilla y los monómeros funcionales, (2) polimerización, (3) extracción de

la plantilla, (4) reconocimiento selectivo. (Tomado de: Tesis Orellana, 2016)

Ha habido varios intentos de detectar el CaP, mediante la determinación simultánea de varios

biomarcadores del cáncer en suero, orina o tejido 12, 61.

Sin embargo, los principales problemas de estos dispositivos son que utilizan un elemento biológico y

un marcador (fluorescente, electrométrico, etc.) para mejorar la sensibilidad del sistema lo cual

aumenta la complejidad de la prueba, así como su costo. Estos dispositivos, no tienen un mecanismo

de ajuste que permita la adaptación del mismo para diferentes aplicaciones. En este sentido, el empleo

de sensores potenciométricos que emplean PIMs como elemento de reconocimiento, podrían ser una

alternativa para la detección de CaP, con elevada selectividad, sensibilidad y bajo costo. Este es el

caso del grupo de Rebelo et. al. 62-63 que desarrollaron un biosensor potenciométrico para la detección

de PSA empleando como portador móvil un PIMs para determinar PSA en suero humano. Para llevar

a cabo la síntesis del PIM, en primer lugar, inmovilizan el PSA sobre grafeno y posteriormente

sintetizan el polímero sobre la proteína, por último extraen la molécula plantilla para la posterior

detección selectiva del analito. Aunque se obtienen resultados similares (2-89 ng/mL) a los de los

ensayos ELISA comerciales (0.2-60 ng/mL), solo se han aplicado a la detección de PSA en diferentes

líneas celulares (muestra sintética, mezcla de antígenos con estructuras similares al PSA). Este grupo

1

3

4

2

Monómeros

Plantilla Entrecruzador

21

también desarrolló un sensor para la cuantificación de sarcosina mediante detección electroquímica

de H2O2 (a 0,6 V) generada a partir de la oxidación catalizada de sarcosina; se llevó a cabo después

de la modificación de los electrodos, mediante la inmovilización de la sarcosina oxidasa (elemento de

reconocimiento) sobre la superficie del electrodo. El grupo de Ebru Birlik et. al. 41 ha desarrollado y

evaluado un sensor potenciométrico empleando PIMs como elemento de reconocimiento selectivo a

sarcosina, mostrando una alta selectividad, un tiempo de respuesta menor a 2 min, un intervalo lineal

de (10-2 -10-6 mM), un límite de detección (1.35·10-7 mM) y una estabilidad de aproximadamente 5.5

meses.

Por otra parte, los PIM obtenidos se deben caracterizar analíticamente y para ello se evalúa la

interacción de la molécula plantilla con el polímero obtenido. Actualmente se usan diferentes técnicas

para este fin como Espectroscopia de Ultravioleta Visible (UV-VIS), Cromatografía Líquida de Alta

Resolución (CLAR con detección UV-VIS), Cromatografía Gaseosa Acoplada Espectrometría de Masa

(GC-MS) y técnicas electroquímicas entre otras. En este trabajo, para evaluar estas propiedades de

reconocimiento de PIM sintetizados hacia el biomarcadores, se realizó mediante técnicas

cromatográficas acopladas a masas. Estas técnicas análisis son ampliamente empleadas por las

ventajas que ofrecen, como la alta sensibilidad, robustez y reproducibilidad.

3.5 Estudio de la interacción monómero plantilla

Uno de los retos en la química moderna es tratar de realizar experimentos complejos sin que esto

requiera ocupar mucho tiempo. Debido a esto la comunidad científica se dio a la tarea hace algunas

décadas de emplear la tecnología en función de crear modelos que ayudaran a realizar

experimentación, pero sin estar en el laboratorio. Por lo tanto, se comenzó a diseñar moléculas en

computadoras y de ahí a predecir propiedades químicas de los compuestos. La química computacional

comenzó a rivalizar con las determinaciones experimentales 64-65.

La química computacional es una rama de la química teórica y de la química cuántica. El objetivo de

esta disciplina es producir y utilizar programas informáticos para el estudio de las propiedades (como

energía, momento dipolar, frecuencias de vibración) de las moléculas. Los químicos computacionales

usan los programas existentes y los aplican a problemas químicos específicos.

Los programas usados en química computacional se basan en diferentes métodos mecanocuánticos

que resuelven la ecuación de Schrödinger molecular. Estos métodos incluyen distintos parámetros

para desarrollar estas ecuaciones. Los métodos que no incluyen parámetros empíricos ni semi-

22

empíricos en sus ecuaciones se llaman métodos ab initio (desde el inicio). Los métodos ab initio es el

nombre que reciben los métodos computacionales que son directamente derivados de principios

teóricos, sin tener en cuenta datos experimentales. Las clases más populares de métodos ab initio

son: Hartree-Fock, semiempíricos y teoría del funcional de la densidad (DFT). En el caso de este último

(DFT) aún está en discusión si ha de considerarse ab initio o semiempírico. Cada clase contiene

diversos métodos que usan diferentes variantes de la teoría, típicamente orientados a una propiedad

molecular concreta, o a un conjunto especial de moléculas. La abundancia de estos métodos en es

una prueba de que no hay un método único que sea adecuado para todos los propósitos.64

En la actualidad existe cierta polémica sobre si los métodos empleados en la química computacional

son suficientemente precisos como para describir adecuadamente reacciones químicas complejas, sin

embargo, hay que reconocer que el empleo de estos programas contribuye a predecir con un

acercamiento a la realidad lo que se realiza en el laboratorio a nivel experimental.

Existe un gran número de paquetes informáticos disponibles autosuficientes para la simulación de

reacciones e interacciones entre compuestos. Entre los más usados se encuentran los siguientes:

GAMESS 66-67, Q-Chem 68-69, MOLCAS 70-71, ACES 72, MOLPRO 73, Spartan 74 y Gaussian. Este último

es de los más empleados para el estudio de las interacciones y el cálculo de las energías de enlace

para la toma de decisiones en reacciones complejas, sobre todo en interacciones monómero plantilla

para la obtención de PIMs 75-78.

El programa Gaussian emplea el Gaussian type orbital (GTO) para los cálculos que se realizan y DFT

para obtener energías y densidades del estado fundamental mediante una funcional de intercambio-

correlación de la cual se desconoce su valor exacto por lo que se realizan aproximaciones. Por esta

razón se formulan funcionales aproximados (híbridos) que pueden diferenciar los efectos locales y

otros que incluyen correcciones del gradiente de la densidad como el: APFD, MPW1PW91 y el B3LyP

(las iniciales de estos métodos corresponden al nombre del creador) 79.

Los métodos como el DFT emplean conjuntos de base para describir matemáticamente los orbitales

de un sistema químico. La elección de la base de cálculo es de suma importancia ya que de ello

dependen los resultados finales. Conjuntos de bases pequeñas se traduce en resultados poco precisos

y de bases grandes constituyen una aproximación más exacta de los orbitales por lo que se obtienen

cálculos más precisos de los electrones en el espacio. Los conjuntos de base estándar son

combinaciones de funciones gaussianas 64, 66. En el Gaussian además de elegir el método para la

simulación también se eligen conjuntos de base (emplea una combinación de conjuntos de base) entre

23

las que se encuentran: bases de valencia, base extendida (split valence, base polarizada y funciones

difusas). Una de las combinaciones que se emplea es utilizar el método DFT, función híbrida (B3LyP)

y conjuntos de base split valence (doble zeta) 6-31G, polarizada 6-31G (d, p) y difusas 6-31+G.

El software Gaussian utiliza una interfaz Gaussview en la cual ingresando los datos se puede construir

moléculas de manera visual, introduciendo la estructura de la molécula y demás comandos que

contienen la información para modelar. Una vez ingresados los datos Gaussian realiza los cálculos.

Por último, cabe destacar que la modelización molecular de las interacciones entre el monómero y la

molécula molde en PIMs permite evaluar un número elevado de posibles polímeros impresos, sin tener

que sintetizarlos en el laboratorio. Como fue mencionado anteriormente, mediante la simulación

computacional se puede estudiar la fuerza de los enlaces que se formarían entre el analito plantilla y

los monómeros simulando las diferentes condiciones experimentales empleadas durante la

polimerización. De esta forma, es posible predecir el comportamiento de los diferentes polímeros

propuestos, sintetizándose únicamente aquellos para los que el resultado obtenido nos refiere un

enlace lo suficientemente fuerte que garantice en algún modo la estabilidad de la impresión esto se

traduce en una energía de enlace baja. La comparación de los resultados obtenidos

experimentalmente con los predichos a partir del modelo de modelización molecular es generalmente

satisfactoria 80.

3.6 Tecnología Lab-on-a-chip

En los últimos años, los avances en las tecnologías de micromaquinado y microfabricación han

permitido la creación de dispositivos en escala micrométrica y nanométrica. Desde que Manz 81 y su

grupo de trabajo desarrollaron el concepto de sistema de análisis total miniaturizado (µTAS, por su

siglas en inglés) o Lab-on-a-Chip (LOC), la miniaturización de dispositivos biológicos, químicos y

electroquímicos ha acaparado enormemente la atención debido a que se han obtenido grandes

avances en este campo 82-83. Un dispositivo LOC integra los componentes esenciales y funcionalidades

de un laboratorio en un pequeño chip que realiza un análisis específico de naturaleza biológica o

química, incluyendo transporte, reacción o detección o una generación de señal cuantificable.

24

Una de las aplicaciones más importantes de las plataformas microfluídicas bajo tecnología LOC es en

la biomedicina, sobre todo en el diagnóstico de enfermedades. Las principales ventajas que aportan

los dispositivos LOC 46, radican en la realización de medidas en continuo y en tiempo real de

volúmenes de muestra muy pequeños para la determinación de analitos de interés clínico como los

biomarcadores de cáncer y otros patógenos peligrosos (Figura 7).

Figura 7. Sistema microfluídico con tecnología LOC (Tomada de: Lab Chip, 2011,11, 845-850)

Debido a que las e-Ts y los sensores potenciométricos basados en PIMs, incorporados a sistemas

LOC, constituyen una opción atractiva para la detección simultánea de varios analitos se han

encontrado trabajos que incorporan estas ventajas para la detección de analitos que afectan la salud

humana y en la detección de biomarcadores de CaP. Este es el caso del grupo de Dan Xu et. al. 60

que han miniaturizado sensores y ubicado en microcanales de electrodos interdigitados una capa fina

polimérica de polianilina (cátodo) y 3,4 etilendioxitiofeno-poliestireno sulfonato, polipirrol (ánodo) para

la determinación de trazas de contaminantes tóxicos, (atrazina, bisfenol A) en aguas. La medición se

basa en el sensado diferencial de 6 analitos y se analiza la respuesta mediante análisis de

componentes principales. También se han desarrollado dispositivos LOC para la detección del CaP en

el cual combinan la detección de dos biomarcadores (PSA y SPONDIN2) mediante un sistema tipo

ELISA inmovilizados sobre electrodos de oro y detección voltamperométrica 84. El sensor resulta

adecuado para medir valores de estos marcadores tumorales entre 1-10 ng/mL, pero incluye varios

pasos de reacción empleando biomoléculas (como los anticuerpos del PSA y del SPONDIN-2) y la

unión al anticuerpo antígeno es muy fuerte, convirtiendo el método en irreversible y de un solo uso.

25

Aunque el estado del arte de estos desarrollos es muy amplio, no se encontraron reportes en la

literatura consultada de PIMs acoplados a electrodos potenciométricos en plataformas microfluídicas,

bajo tecnología LOC para la detección diferencial de más de un biomarcador de CaP.

3.7 Justificación

La detección actual del CaP basada en la determinación del PSA es insuficiente para la determinación

de la existencia o no de la enfermedad. Esta debe ser confirmada a través de otras evaluaciones a los

pacientes como del DRE y la biopsia, los cuales resultan en métodos invasivo y con diferentes

complicaciones físicas y psicológicas para el paciente.

Existe la necesidad inmediata, de tener en cuenta otros analitos complementarios capaces de

proporcionar una información de mayor sensibilidad y especificidad para la determinación de la

presencia de la enfermedad y fase de aparición. La detección selectiva de analitos como la sarcosina

mediante sensores potenciométricos; permiten vislumbrar un sistema de análisis sensible, específico,

con tiempos de respuesta rápidos y automatizados.

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Artículo 113 fracción II de la

Ley Federal de Transparencia y

Acceso a la Información Pública 2017,

y con el Artículo 116 de la Ley

General de Transparencia y Acceso a

la Información Pública 2015.

67

7 Conclusiones

1. El estudio de las características estructurarles, naturaleza, la matriz a analizar y la etapa en que

aparece el biomarcador permitieron seleccionar a la sarcosina, como el biomarcador prioritario.

2. Mediante estudios teóricos por química computacional fue posible seleccionar al MAA, en relación

4:1 respecto a sarcosina, como el monómero funcional de mejor interacción para la síntesis de los

PIM

3. Los PIM desarrollados empleando MAA como monómero funcional en las condiciones del trabajo,

permitieron la obtención de materiales de reconocimiento altamente sensibles y selectivos para la

sarcosina

4. La caracterización de los PIMs por BET, permitió corroborar que los materiales obtenidos

corresponden sólidos micro y mesoporosos, con tamaños de poro y área superficial adecuados

para su empleo en sensores potenciométricos.

5. El estudio del tamaño de partícula del PIM empleado en la membrana permitió establecer que los

sensores obtenidos con tamaños de partículas menores a 38 m presentan mejor sensibilidad e

intervalo lineal de trabajo que los obtenidos con tamaños de partículas mayores.

6. Para los estudios de reenlace de los materiales sintetizados fue necesario desarrollar y optimizar

una metodología analítica mediante UPLC-MS, en modo isocrático capaz de determinar el analítico

en concentraciones inferiores a 10-5 M.

7. El electrodo que utiliza tamaño de partícula menor de 15 μm y 6 % del PIM en membrana, exhibe

una sensibilidad -23.7 de mV/dec, con LD de 2·10 -8 mol/L, LD lo cual lo hace adecuado para la

determinación de sarcosina en muestras de orina (9·10-7 -2.22·10-5 mol/L), con un tiempo de

respuesta de 30 s.

8. El estudio de selectividad mostró que los sensores desarrollados presentan una alta selectividad a

sarcosina en presencia de las especies estudiadas (ácido úrico, biotina, histidina, glicina), a

excepción de la creatinina con un KA,B Pot (0.2).

68

Perspectivas

Desarrollar polímeros de impresión molecular no selectivos para sensado diferencial de diferentes

biomarcadores complementarios de CaP (hk2, PSA libre, prolina, ácido kinurénico)

complementarios

Llevar sensores diferenciales a plataforma microfluídica

Integrar métodos de análisis multivariado para la correcta discriminación de señales de los diversos

biomarcadores para conformar una lengua electrónica microfluídica

69

Anexo 1

Sensor: PIM 2 %, 4 %, 6 %

Electrodo de referencia: Ag /AgCl

Disolución: sarcosina

1- Hoja de trabajo empleada para calibración de los electrodos

Conc patrón

Sarcosina

Vol (µl) Conc final

sarcosina

Log C E (mV)

10-5 10 8·10-8 -7.09791

25 1.79·10-7 -6.74864

50 3.77·10-7 -6.42583

50 5.74·10-7 -6.24376

50 7.71·10-7 -6.11604

10-4 25 1.76.10-6 -5.75916

25 2.74·10-6 -5.56808

50 4.74·10-6 -5.33462

50 6.66·10-6 -5.1856

10-3 10 1.06·.10-5 -4.98613

25 2.19·10-5 -4.7062

25 3.02·10-5 -4.53923

25 3.99·10-5 -4.4211

50 5.94·10-5 -4.25308

50 7.88·10-5 -4.13436

50 9.81.10-5 -4.04104

70

10-2 25 1.95.10-4 -3.75814

25 2.92.10-4 -3.59325

50 4.86.10-4 -3.38839

50 6.78.10-4 -3.25679

50 8.68.10-4 -3.16052

50 1.06.10-3 -3.08358

2- Sensor potenciométrico empleado para la detección de sarcosina

Electrodo selectivo (ES) b) composite epoxiconductor c) membrana líquida d) electrodo de referencia

Ag/AgCl e) micrografía de la membrana líquida con 24 h de activación

71

Anexo 2

Estudios realizados en la Universidad Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho

Estancia becas mixtas

- Síntesis de PIM core Shell sobre partículas comerciales y nanopartículas de SiO2

- Estudios de reenlace con metodología ninhidrina

1- Determinación de sarcosina con ninhidrina: A 5 ml de una disolución que contiene 0.2 mg

de sarcosina se le agrega 2 mL de una disolución preparada de ninhidrina (2 % m/v) en acetona.

Para que ocurra la reacción de derivatización esta disolución debe ser calentada en un baño

por 10 min hasta aparecer el color rosa. Después de fría se mide la concentración de sarcosina

a 570 nm. Se prepara un blanco bajo las mismas condiciones de la muestra.

1.1 Curva de calibración

400 500 600 700

0.0

0.3

0.6

0.9

blanco

8.10-4

6.10-4

4.10-4

2.10-4

10-3 0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Absorb

ancia

Longitud de onda (nm)

Absorb

ancia

Longitud de onda (nm)

72

1.2 Lavados polímeros

500 600 700

0.0

0.1

0.2

0.3A

bsorb

ancia

Longitud de onda nm

ninhidrina

Lavado PIM III

Lavado PIN III

Lavado PIM I

Lavado PIM II (10)

Lavado PIM I

73

1.3 Micrografías de a) Partículas de SiO2@MPS, b) Tamaño de partículas (nanopartículas de

SiO2@MPS) c) PIN-CS III d) PIM-CS III

1.4 Comparación sensor con PIM II A y PIM-CS III

-7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.5

-200

-150

-100

-50

0

50

100

150

E (

mV

)

Log C

PIM CS-III

PIM IIA

a b

c d

74

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