Rev. Inst. Med. trop. São Paulo23(5) :194-203, setembro-outubro, 7987

LESÕES ULTRA.ESTRUTURAIS DO CÉREBROINOGUTADOS EXPERIMENTATMENTE GOM

RE SUMO

A inoculação experimental do vírus Piry (Be An 24232) em camundongo.s al-binos recém-nascidos induz à formação de uma encefalite com lesões graves, decélulas isoladas ou focais, que evoluem para necrose e na qual a reação inflama-tória é discreta e só aparece na fase final da evolução. A modificaçáo mais precoceé a diminuição da eletrondensidade e a marginaçáo da cromatina nuclear. Se-guem.se modificações de organelas, mais intensas nas mitocôndrias e no Golgi,com reagrupamento delas. Os citolisosomas surgem no citoplasma celular e, emmaior quantidade nas células produtoras de vÍrions. Os GERL sáo muito proe-minentes e guardam relação direta com a presença de maior número de partícu-Ias. O vírion é montado na membrana citoplasmática de neurônios e acumula-do no interstício, com raras vesículas vírus-símiles no citoplasma, vizinhas àsáreas de sÍntese virótica.

Ermelinda R. M. da CRUZ (1)

DE CAMUNDONGOS ALBINOSO V¡RUS PIRY (BeAn 24232)

O vírus Piry foi isolado pela primeira vezem 1960, de amostras de fígado e baço de ummarsupial (Philander opossum) capturado pelogrupo do Instituto Evandro Chagas na Florestado Utinga em Belém, Pará, Brasil (\4/OO-DALL27). Faz parte do grupo antigênico da Es.tomatite Vesicular dos ArbovÍrus. Sobre este ví-rus já foram feitos estudos sorológicos (pI-NHEIRO & col.2s) para observar a taxa d.e

imunidade nos habitantes de várias áreas daregião Amazônica, e ocorrência de casos huma-nos (PINHEIR@6) e estudos da patologia expe-rÍmental a nível de microscopia óptica (DIASe).Estudos de microscopia eletrônica porém, fo-ram feitos, no sistema nervoso central, porBERGOLD & MUNZ 6, apenas para identifica-ção da partÍcula virótica. Também nas fibras do

cDU 616.988

I N TRODUÇÃO

Trâbalho executado na Secção de patologia Virótica (prof. Dr. Ronaldo de Araujo) do Núcleo d.e patologiâ Regional e Higiene da universidade Federal do Pará e no Departamento de Anatomia pâtológica e Medicina Legal (prof. Dr. LuigiBogliolo) da Universidade Federât de Minas Gerais. Projeto SIP/02-006 do progrâma do Tïópico úmido do cNpq e pro-jero B/39/79/093/00/00 da FINEP. Integrante de pesquisa conjunta com û Instituto Evandro châgas, Betém e o rnsti.tuto de Medicina Tropicat de Hamburgo, Alemanha, segund.o convênio cNpq-KFA. Trabalho elaborado com base na Tesede Doutorado em Patologia. Humana apresentada ao DAPÀ4L da UFMG(1) P¡of. Ass. Dt., pesquisadora do NPRH da UFpâ

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miocárdio ARAUJO & col.2, demonstraram pe-Ia primeira vez o aparecimento e a reduplica-ção do vírus, assim como as alteraeões ultra-estruturais precoces.

O estudo do vírus Piry é de grande interessenão só por ser um arbovírus da região Amazõ-nica, mas também por ser patógeno para a es-pécie humana. Experimentalmente o quadromais grave observado até agora é o da ence-falite, que no entanto ainda náo foi estudadacompletamente. Este trabalho procura preen-cher essa lacuna, analisando as lesões ultr.a-es-truturais do cérebro produzidas pelo vírus piryno modelo mais clássico: em camundongos al-binos recém-nascidos infectados ex'oerimental-mente.

CR'UZ, E. R,. M. da - Lesões ultra,-estruturais do cérebro de camundongos albinos inoculados experimentalmente como vÍrus Piry (BeAn 24232). Rev. Inst. Med, troB, São P¿uto 23:194-203, 198L

MATERIAL E MÉTODOS

Foi usada'a amostra B,eAn 24232 do virusPiry, fornecida pelo Instituto Evandro Chagaspâra duâs séries de inoculações.

Foram inoculados por via intra-cerebral 3

lotes com 6 animais em cada, de camundongosalbinos suiços recém-nascidos com 2 dias deidade. O inoculum para cada animal foi 0,02 mlde uma suspensão em soluçáo de albumina bo-vina, de tecido cerebral de camundongos recém-nascidos infectados previamente com o vírus Pi-ry. Idêntico número de animais usou.se paracontrôle, tendo recebido cada um, também porvia intra-cerebral, 0,02 ml apenas da solução dealbumina bovina. Tanto os animais contrôlecomo os inoculados com suspensáo do vírusPiry foram sacrificados L2,24 e 36 horas apósa inoculação sendo utilizados em cada etapadois animais para exame em microscopia ele-trônica, um para microscopia óptica e um paracontrôle. Posteriormente, foi feita outra sériede inoculação, idêntica à acima referida.

A partir das 24 horas de inoculados com asuspensão de vírus, os animais começaram ater morte espontânea e não sobreviveram às Bg

horas. Os animais controle restantes sobrevive-ram a este período e foram desprezados.

Apenas os animais sacrificados foram utili-zados para coleta de material para estudo. Osanimais eram .sacrificados por decapitação sendoretirados fragmentos de I mm3 da porção cen-tral e posterior do cérebro, que foram fixadospor imersão em solução de aldeído glutárico a250/o ern tampão fosfato 0,1, pH ?,2 (GLAU-ERT 12) os da primeira inoculação e em para-formaldeído a 40/o em tampão fosfato (K,{R-NOVSKYTc) com pH 7,2 os da segunda inocu-lação.

Após lavagem em tampão fosfato os frag-mentos foram processados pela técnica de roti-na; com pós-fixação em ácido ósmico a Lo/o edesidratados em alcoois de concentraçáo cres-cente e incluídos em Epon Bl2, fórmula deLUFT 17, com pequenas modificações (ARAUJO& col3).

Os cortes ultrafinos foram contrastadoscom acêtato de uranila e citrato de chumbo(KARNOVSKYI6) e examinados em microsco-pios Zeiss Em - 952 e Siemens Elmiskop 101.

RESULTADO

Microscopia óptica

12 horas após a inoculação as lesões são dis-cretas e consistem em alterações d.egenerativasde neurônios isolados, distribuÍdos irregular-mente. Os neurônios assim comprometidos mcs-tram núcleos retraídos, com marginaçáo cro-mafínica, citoplasma levemente eosinófilo (Fig.1A e 18) e aparente reduçáo do volume celular;alguns deles, pela maior retraçáo citoplasmáti-ca, configuram corpúsculos eosinofílicos comnúcleos picnóticos na periferia. Mais numerosassão as células de citoplasma e núcleo de aspectovesiculoso e lobulado, de cromatina rarefeita. Ointerstício é alargado e esponjoso (Fig. 1A). Pe-quenos focos com grumos de cromatina são en-contrados, ainda, em várias áreas (Fig. 18, se-tas).

24 horas após a inoculagão estão presentesas lesões descritas acima porém com distribui-ção focal e em maior,,intênsidade. Estabelecem-se nesta fase lesões vasculares, constantes de tu-mefação endotelial com diminuição do lume, ex-sudação celular incipiente e edema perivascular(Fis. lC).

36 horas após a inoculação a necrose focalé mais evidente; fragmentos e grânulos de cro-matina são bem identificáveis dentro de espa-

ços claros. A disposição linear destes focos su-gere que os mesmos formam ao longo do tra-jeto de capilares.

A tumefaçáo celular, citoplasmática e nu-clear, é intensa, assim como o edema. Coexis-tem focos hemorrágicos perivasculares (Fig.lD).

Vasos com hiperemia e intensa exsudaçãoneutrofílica são ainda encontrados. São rarosos leucócitos no interstício, mesmo nos focosde necrose. O edema perivascular persiste e, emalgumas áreas, é mais intenso (Fig. lD).

RESULTADOS

Microscopia eletrônica

Com 12 horas após a inoculação a distribui-ção das lesões é irregular, sem predileção poráreas ou células. São atingidas tanto as céIula,sgliais como as neuronais e seus prolongamentos,

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CRUZ, E. R. M. da - Lesões ultra-estruturais do cérebro de camundongos albinos inoculados experimentalmente com

o vírus Piry (Bean 2423Ð. Rev. Inst. Med. trop. São Paulo 23:194-203, 1981.

cialmente freqüentes nas fotografias que docu-mentam acúmulo virótico no interstício. Talvezindiquem céIulâs que sintetizam mais proteínasviróticas, ou seja, aquelas que sáo mais agredi-das pelo vírus e, portanto, mais necessitadas de"turnover" mais rápido. Provavelmente a presen-

ça precoce dos citolisosomâs representa a ex-pressão morfológica dessa condiçáo, uma vezque em animais jovens a quantidade desse liso-somas é constante (PETERS & col. zc).

Um achado muito freqüente foi a presençados chamados GERL (associação entre Golgi,Retículo Endoplasmático e Lisosomas) (NOVI-KOFF22), particularmente nos animais sacrifi-cados 36 horas após a inoculação. Entre as in-fecções por arbovÍrus amazônicos analisadascom a microscopia eletrônica, é esta a primei-ra em que os GERL aparecem tão frequente-mente. Como a infecção com o vírus Piry é aque produz maior abundância de partículas vi-róticas há portanto, aparentemente, relaçáo di-reta entre o número dessas partículas e a abun-dância de GERL. Um achado que reforça essa

interpretação é o de que, na lesáo miocárdicapelo mesmo vírus, onde o número de partículasé muito menor, a ocorrência do GERL não foidocumentada (ARAUJO & col.z).

Os citolisosomas maiores, com aspecto de

fagolisomas, sáo mais raros; encontrados ape'nas 36 horas após a inoculação. Isso parece re-

lacionar-se com a maior extensão, nesta fase,dos fenômenos necróticos.

É de ressaltar que os citolisosomas náo fo'ram encontrados em células endoteliais: isto le-

va a supor que essas células náo participamativamente na disseminaçáo da partícula viróti-ca.

As vesículas do tipo 1 sáo de interpretaçãofácit, pela sua relação com outras esfruturas que

marcam os fenômenos regressivos celulares. As

vesículas tipo 2, derivadas de vacuolizaçáo de

organelas, guardam relaçáo com as estruturasdas quai.s derivam. As vesículas tipo 3 sáo seme-

lhantes às vesículas granulares de (BURNS-

TOCKT), porém delas se diferenciam por náoguardarem relaçáo direta com sinápses. Acumu-lam-se em maior número às proximidades das

zonas de formação dos vírions na membrana e

seu aspecto morfológico sugere a possibilidadede que se tratem de vesículas contendo mate-rial virótico, ou seja, de locus intra'citoplasmá'

tico de síntese virótica. A disposição destas ve-

sículas em áreas específicas; certo arranjo, em-

bora pouco visível, em fileiras irregulares; suaproximidade com a membrana celular ondeocorre a montagem do vírus e o fato de náo te-rem sido encontrados fora desta Tocalizaçã"o,

sáo argumentos a favor dessa interpretação.

Os resultados de estudos anteriores (BER-GOLD & MUNZ6; ARAUJO & co1.2) e a docu-mentaçáo do presente trabalho permitem afir-mar que a membrana citoplasmática é o locusprincipal de montagem dos vírions. A síntesevirótica foi documentada em neurônios prati-camente apenas na membrana citoplasmática.Outro ponto de formação virótica foi encontra-do em apenas uma célula, onde o vírus foi vis-to em cisterna dilatada do retículo endoplas-mático. Isto parece indicar que documentamosapenas a fase inicial da multiplicação virótica(MUSSGAY & 1¡úEIBEL2T; CHAIN E¿ co1.8;

ACHESON & TAMM 4) pois na fase tardia estamultiplicaçáo efetua-se em vesículas citoplas-máticas (MORGAN & col.20; ERLANDSON &col. 1r; HIGASHI & çq1. t+; ARTSOB & SPEN-CEs). Os vírions completos formam grandes

acúmulos entre as células.

O vírion tem a forma clássica dos FÙhabdo-

vírus, em forma de bala, com limites externosparalelos. As medidas por nós efetuadas, emrelação às de BERGOLD & MUNZ 6, mostrâmvírion discretamente menor quanto ao compri'mento, enquanto que a variaçáo do diâmetrotransversal foi bem maior. Também as medidasefetuadas por SHOPE & MURPIfY citados porKARABATSOS & col. 1s, sáo.maiores que as nos-sas. Estas diferenças podem estar relacionadascom o tipo de técnicas utilizadas pâra o examedas partículas.

O aspecto de edema intersticial observadona microscopia óptica corresponde, na micros-copia eletrônica, a uma tumefação grande de

dendritos isolados e dos pés vasculares dos as-

trócitos e não há acúmulo de líquido entre as

células.

Os vasos sangüíneos mais alterados são os

capilares. O lume de alguns deles é obstruídosem conseqüência do aumento de tamanho das

células endoteliais. Essa lesáo é importante por-que pode contribuir, pela isquemia que produz,para a necrose de neurônios. Embora estes

achados sejam referendados pelos exames dos

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cRvz' E R. M' da - Lesões ultra-estruturais do cérebro de camund.ongos albinoso vírus Piry (BeAn 24232). Rev. Inst. Med: trop. São paulo ¿g:194-208, 19g1.

animais controle, é ainda muito discutido o realsignificado dos achados morfológicos da patolo-gia vascular na gênese lesional do sistema ner-voso central.

SUMMARY

Electron microscopic findings in swiss albinomice brain following experimental inoculaúion

of Piry Virus (Type B,eÃn Z4ZBT)

The experimental inoculation of piry Virus(BeAn 24232) in newborn albino mice induce anencephalitis with severe lesions of isolated. cellsor focal distribution, progressing to necrosis;the inflammatory reaction is very meager andto be found only in the final stage of injuryevolution. A weaker nuclear electron-density withchromatin marginalisation are the earliest mo-difications. It follows organelle alterations,more intense in mitochondria and Golgi com-plex, with topographical rearrangments. Cyto-plasmic citolisomes appear and. are more proe-minent in virus-producing cells. The so calledGERL are very conspicuous and show a directrelationship to the amount of virus particlesproduced in the cells, The cytoplasmic membra-ne is the locus of virion assembly and the com-plete particles are accumulated between thecells. Rare small virus-like vesicles were alsodetected in neuron cytoplasm.

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Recebido p¿ra publicaçáo em 28/711980.

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