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Determinação de Ácido Perfluorooctanossulfónico (PFOS)
na matriz água e biota por UPLC-MS/MS
Joana Filipa Moreira da Silva
Dissertação para a obtenção do Grau de Mestre em
Engenharia Química
Orientadores: Profª. Dra. Margarida Maria Portela Correia dos Santos Romão
Engª. Georgina Maria Sarmento Felisberto
Júri
Presidente: Profª. Dra. Maria Matilde Soares Duarte Marques
Orientador: Profª. Dra. Margarida Maria Portela Correia dos Santos Romão
Vogais: Engª. Maria Paula Machado de Barros Viana
Novembro 2017
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“Sê todo em cada coisa. Põe quanto és
No mínimo que fazes.”
Ricardo Reis, “Odes”
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Agradecimentos
Em primeiro lugar gostaria de agradecer às minhas orientadoras por toda a confiança que
depositaram em mim para a realização deste trabalho. À Professora Margarida Romão pela
oportunidade, por toda a orientação, apoio e disponibilidade. À Engª. Georgina Sarmento por me ter
recebido no LAIST (Laboratório de Análises do Instituto Superior Técnico), por toda a aprendizagem
que me possibilitou e por se ter mostrado sempre disponível e pronta a esclarecer as minhas dúvidas.
Às minhas colegas de Laboratório, Ana e Marta por todo o apoio, ajuda e inesgotável
paciência, mas principalmente pela amizade e carinho com que sempre me trataram.
Aos restantes colegas do LAIST, um obrigada por me terem recebido tão bem, fazendo-me
sentir parte da “família”.
Um agradecimento especial à minha mãe por todos os valores que sempre me transmitiu e por
ser um exemplo de persistência, resiliência, determinação e sucesso.
Um obrigada sentido à minha avó por toda a dedicação, preocupação e pela sua fé que em
muito me ajudou ao longo da minha vida académica.
Agradeço, também, à minha grande amiga Sofia, que viveu todos os meus sucessos e
infortúnios como se fossem seus, que aguentou todas as minhas lamurias e que nunca deixou de
acreditar em mim.
Ao meu namorado, Rafael, pelo seu apoio incondicional, paciência e acima de tudo por sempre
me incentivar a ultrapassar-me.
Às minhas colegas de curso e amigas, Catarina, Joana, Mafalda, Maria Ana, Maria, Marta,
Susana e Teresa por toda a amizade e por terem tornado estes cinco anos no técnico bem mais fáceis.
Por último, mas não menos importante, gostava de agradecer à minha irmã, ao meu pai e aos
restantes familiares e amigos.
iv
v
Resumo
O presente trabalho experimental consistiu na implementação e validação de um método
analítico para a determinação de ácido perfluorooctanossulfónico (PFOS) na matriz água e biota.
O PFOS trata-se de uma substância persistente, bioacumulável e tóxica que pertence à família
dos compostos perfluorados (PFC). A necessidade da sua deteção advém destas características que
contribuíram para a sua inserção na lista de substâncias de ação prioritária, para as quais foram
definidas as respetivas normas de qualidade ambiental (NQA), no âmbito do Decreto-Lei nº218/2015.
Assim, para a determinação deste composto alvo a metodologia analítica utilizada foi a
cromatografia líquida de ultra eficiência com deteção por espectrometria de massa em tandem – UPLC-
MS/MS. Quanto ao método de extração, este variou consoante a matriz da amostra. Tem-se, então,
para as águas a extração em fase sólida (SPE) recorrendo a discos de extração SDB-XC e, para o
biota, a extração com recurso ao banho de ultrassons.
Em relação à matriz água, o Laboratório já determinava a concentração de PFOS em amostras
de águas superficiais e subterrâneas, pelo que, este trabalho focou-se em alargar esta determinação a
águas para consumo.
Para o biota, depois de otimizada a metodologia de extração, foram analisadas amostras
provenientes de diversas zonas do país, tendo os resultados obtidos (valores entre 0,26 e 3,78 µg/kg
de massa húmida) sido comparados com os valores determinados para as amostras de água dos locais
de colheita.
Por fim, recorrendo a este procedimento analítico, foi possível verificar que as NQA estipuladas
estavam a ser respeitadas.
Palavras-chave: PFOS, Água, Biota, UPLC-MS/MS, SPE, Ultrassons
vi
vii
Abstract
The aim of this master’s thesis was to implement and validate an analytical method for the
determination of perfluorooctanesulfonic acid (PFOS) in water and biota matrixes.
PFOS’s are persistent, bioaccumulative and toxic substances that belong to the family of
perfluorinated compounds (PFC). The need to detect PFOS’s comes from these characteristics that led
to them being identified as priority action substances', for which it was defined the environmental quality
standards (EQS), under the Portuguese law.
In order to achieve this determination, the analytical equipment used was an ultra-performance
liquid chromatographer coupled with tandem mass spectromety (UPLC-MS/MS). As for the extraction
method, it differs according to the matrixes. Thus, for water matrixes the appropriate method was the
solid phase extraction (SPE) with SDB-XC disks and for the biota it was extraction using the ultrasonic
bath.
Regarding the water matrixes, the laboratory already had determined PFOS concentrations in
superficial and underground water samples, so in this dissertation the focus was to extend these
analyses to drinking water samples.
For biota samples, after optimizing the extraction methodology, some samples from different
locations in Portugal were analysed and the results (that ranged from 0,26 to 3,78 µg/kg wet-weight)
were then compared to the values determined for the concentrations of PFOS in the waters of those
particular places.
At the end, with the usage of this analytical procedure, it was possible to establish if the EQS
were being respected.
Key words: PFOS, Water, Biota, UPLC-MS/MS, SPE, Ultrasound
viii
ix
Índice
Agradecimentos ....................................................................................................................................... iii
Resumo ....................................................................................................................................................v
Abstract................................................................................................................................................... vii
Índice ....................................................................................................................................................... ix
Índice de Figuras ................................................................................................................................... xiii
Índice de Tabelas ................................................................................................................................... xv
Lista de Símbolos e Abreviaturas ......................................................................................................... xvii
1. Âmbito do trabalho .......................................................................................................................... 1
1.1. Enquadramento ....................................................................................................................... 1
1.2. Objetivo .................................................................................................................................... 1
2. Laboratório de Análises do Instituto Superior Técnico (LAIST) ...................................................... 3
3. Compostos Perfluorados (PFC) ...................................................................................................... 5
3.1. Ácido Perfluorooctanossulfónico (PFOS) ................................................................................ 5
3.1.1. Propriedades Físico-Químicas ........................................................................................ 5
3.1.2. Síntese ............................................................................................................................. 6
3.1.3. Aplicações ....................................................................................................................... 7
3.1.4. Regulações Ambientais / Legislação............................................................................... 7
3.1.5. Ocorrências/Histórico ...................................................................................................... 9
3.1.6. Toxicologia ..................................................................................................................... 10
4. Metodologia Analítica .................................................................................................................... 13
4.1. Estado de Arte ....................................................................................................................... 13
4.1.1. Preparação de Amostras Aquosas ................................................................................ 13
4.1.2. Preparação de Amostras de Biota ................................................................................. 13
4.1.3. Técnicas Analíticas ........................................................................................................ 14
4.2. Métodos de Preparação de Amostras no LAIST ................................................................... 15
4.2.1. Extração em fase sólida (SPE) ...................................................................................... 15
4.2.2. Extração por Ultrassons ................................................................................................ 17
4.3. Cromatografia ........................................................................................................................ 19
4.3.1. Cromatografia Líquida ................................................................................................... 20
4.3.2. Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência ..................................................................... 21
4.4. Espetrometria de Massa ........................................................................................................ 22
4.4.1. Fonte de ionização - Electrospray ................................................................................. 23
4.4.2. Analisadores de massas - Quadrupolo ......................................................................... 24
4.4.3. Detetores ....................................................................................................................... 25
4.4.4. Acoplamento UPLC-MS/MS .......................................................................................... 25
4.4.5. Supressão e Enriquecimento Iónico .............................................................................. 25
5. Validação ....................................................................................................................................... 27
6. Parte Experimental ........................................................................................................................ 29
6.1. Equipamento.......................................................................................................................... 29
x
6.2. Material .................................................................................................................................. 29
6.3. Reagentes e Padrões ............................................................................................................ 29
6.4. Colheita e Preservação de Amostras .................................................................................... 30
6.5. Interferências e Contaminações ............................................................................................ 31
6.6. Descontaminação de Material ............................................................................................... 31
6.7. Segurança ............................................................................................................................. 31
6.8. Condições Operatórias .......................................................................................................... 31
6.9. Fase Móvel ............................................................................................................................ 32
6.10. Preparação de Soluções Padrão ....................................................................................... 32
6.11. Metodologia ....................................................................................................................... 33
6.12. NMR ................................................................................................................................... 35
7. Apresentação e Discussão de Resultados .................................................................................... 37
7.1. Metodologias Testadas ......................................................................................................... 37
7.1.1. Águas ............................................................................................................................. 37
7.1.2. Biota ............................................................................................................................... 38
7.2. Validação do Método ............................................................................................................. 49
7.2.1. Gama de Trabalho ......................................................................................................... 49
7.2.2. Calibração Analítica ....................................................................................................... 49
7.2.3. Limiares Analíticos......................................................................................................... 51
7.2.4. Precisão ......................................................................................................................... 52
7.2.5. Exatidão ......................................................................................................................... 53
7.2.6. Incertezas ...................................................................................................................... 53
7.3. Interligação Biota-Águas ....................................................................................................... 55
7.4. Testes recorrendo ao NMR ................................................................................................... 57
8. Conclusões e Perspetivas Futuras ................................................................................................ 59
9. Referências Bibliográficas ............................................................................................................. 63
Anexo A – Ocorrência de PFOS ........................................................................................................... 67
Anexo B – Validação ............................................................................................................................. 71
Critérios de Validação ....................................................................................................................... 71
- Âmbito do Método ....................................................................................................................... 71
- Gama de Trabalho ...................................................................................................................... 71
- Calibração Analítica .................................................................................................................... 71
- Limiares Analíticos ...................................................................................................................... 73
Precisão ............................................................................................................................................. 74
- Repetibilidade .............................................................................................................................. 74
- Reprodutibilidade ........................................................................................................................ 74
- Precisão intermédia ..................................................................................................................... 75
Exatidão ............................................................................................................................................. 75
- Ensaios de Recuperação ............................................................................................................ 75
- Materiais de Referência Certificados (MRC) ............................................................................... 76
xi
- Ensaios Interlaboratoriais ............................................................................................................ 76
Robustez............................................................................................................................................ 77
Sensibilidade ..................................................................................................................................... 77
Seletividade e Especificidade ............................................................................................................ 77
Incertezas .......................................................................................................................................... 77
Anexo C – Amostras de Biota ............................................................................................................... 79
Anexo D – Metodologias Testadas ....................................................................................................... 81
Anexo E – Razões MRM ....................................................................................................................... 83
Anexo F – Espectro de Massa .............................................................................................................. 85
Anexo G - Tratamento de Resultados (Área/Altura) ............................................................................. 87
xii
xiii
Índice de Figuras
Figura 1 – Representação esquemática da estrutura química do PFOS. .............................................. 6
Figura 2 - Representação de um cartucho e de um disco de extração. Nota: As imagens não se
encontram representadas à escala real. ............................................................................................... 15
Figura 3 – Esquema que resume as principais etapas da extração em fase sólida. Adaptado de [25].
............................................................................................................................................................... 16
Figura 4 - Esquema de uma montagem de SPE utilizando discos de extração. Adaptado de [26]. .... 17
Figura 5 - Representação esquemática de um banho de ultrassons. Adaptado de [28]. ..................... 18
Figura 6 - Representação esquemática de uma extração recorrendo a uma sonda ultrassónica.
Adaptado de [22]. .................................................................................................................................. 18
Figura 7 – Classificação dos processos cromatográficos de acordo com a sua configuração. ........... 19
Figura 8 - Esquema simplificado dos constituintes de um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC).
Adaptado de [32]. .................................................................................................................................. 20
Figura 9 - Representação do cromatógrafo de ultra eficiência (UPLC) acoplado a um espetrómetro de
massa (idêntico ao instalado no LAIST). ............................................................................................... 22
Figura 10 - Componentes básicos de um espectrómetro do tipo ESI – fonte de ionização à pressão
atmosférica. Adaptado de [36]. ............................................................................................................. 23
Figura 11 - Desenho simplificado de uma sonda para Electrospray. Adaptado de [39]. ...................... 24
Figura 12 - Representação esquemática de um quadrupolo [24]. ........................................................ 24
Figura 13 - Esquema de um equipamento do tipo triplo quadrupolo. Adaptado de [35]. ..................... 25
Figura 14 – Montagem da extração em fase sólida (SPE). .................................................................. 33
Figura 15 – Esquema que resume a metodologia analítica para a deteção de PFOS na matriz biota. 34
Figura 16 – Exemplo de testes realizados recorrendo a amostras de matriz biota (5 primeiros vials à
esquerda) e ao MRC de sedimento (1º vial à direita). .......................................................................... 40
Figura 17 – Exemplo de duas amostras de biota após estas sofrerem o passo de concentração. ..... 41
Figura 18 - Exemplo da heterogeneidade de uma amostra de biota. ................................................... 43
Figura 19 – Cromatograma obtido para a amostra 18403 (matriz biota) recorrendo à metodologia A. 48
Figura 20 - Cromatograma obtido para a amostra 18403 (matriz biota) recorrendo à metodologia B. 48
Figura 21 - CC obtida na sessão de trabalho de dia 22 de Agosto de 2017, para um intervalo de
concentrações de 0,05 a 2 µg/L. ........................................................................................................... 50
Figura 22 - Representação gráfica da análise de resíduos efetuada para a mesma sessão de trabalho
de dia 22 de Agosto de 2017. ............................................................................................................... 50
Figura 23 – Representação gráfica da função obtida por ajuste linear para a sessão de trabalho de 20
de Julho de 2017. .................................................................................................................................. 50
Figura 24 - Representação gráfica da função obtida por ajuste polinomial para a sessão de trabalho de
20 de Julho de 2017. ............................................................................................................................. 50
Figura 25- Representação gráfica do teste de Rikilt realizado para a sessão de trabalho de dia 4 de
Agosto de 2017, para um intervalo de concentrações de 0,05 a 2 µg/L............................................... 51
Figura 26 – Mapa que relaciona as concentrações de PFOS obtidas para as amostras de biota (µg/kg)
e água (µg/L) de acordo com o local de colheita. ................................................................................. 56
xiv
Figura 27 – Representação gráfica que relaciona a concentração de PFOS no biota (µg/kg) e nas águas
dos rios (µg/L). ....................................................................................................................................... 57
Figura 28 - Exemplo de um espectro de massa obtido para uma determinada amostra de biota. ...... 85
xv
Índice de Tabelas
Tabela 1 - Propriedades fisico-químicas do PFOS na forma de sal de potássio. Adaptado de [8]. ....... 6
Tabela 2 – NQA para as diversas matrizes. Adaptado de [3]. ................................................................ 8
Tabela 3 - Locais de recolha de peixes. ................................................................................................ 30
Tabela 4 - Condições operatórias do UPLC para a análise do PFOS. ................................................. 31
Tabela 5 – Parâmetros e condições operatórias do espectrómetro de massa. .................................... 32
Tabela 6 - Condições de otimização do MS. ......................................................................................... 32
Tabela 7 – Detalhes para a preparação das soluções padrão para a calibração................................. 33
Tabela 8 – Resultados obtidos para os ensaios realizados a águas para consumo. ........................... 37
Tabela 9 - Resultados obtidos para os testes iniciais (A0.1 e A0.2), nos quais se recorreu ao MRC de
sedimento e se variou apenas o solvente de extração utilizado. .......................................................... 38
Tabela 10 - Testes realizados com o objetivo de determinar as condições de extração. Os testes
seguiram a metodologia A, sendo que nas observações se encontram descritas algumas
particularidades dos mesmos. Todos foram concentrados a 1,2 mL. .................................................. 39
Tabela 11 – Condições de extração (nomeadamente, o solvente escolhido, o volume utilizado e as
condições banho de ultrassons) definidas para a Metodologia A. ........................................................ 39
Tabela 12 – Resultados obtidos para os primeiros testes realizados a amostras de biota, de acordo com
a metodologia A. .................................................................................................................................... 40
Tabela 13 – Resultados obtidos para os testes referentes ao estudo de diferentes passos de limpeza
no âmbito da metodologia A. ................................................................................................................. 41
Tabela 14 – Resultados obtidos para os ensaios replicados, de acordo com a metodologia A. .......... 42
Tabela 15 - Resultados obtidos para os ensaios de recuperação realizados em amostras de biota
segundo a metodologia A. ..................................................................................................................... 43
Tabela 16 - Estudos de re-extração realizados para amostras de biota de acordo com a metodologia A.
............................................................................................................................................................... 44
Tabela 17 - Estudo da influência do fator tempo na concentração de PFOS nas amostras de biota, no
âmbito da metodologia A. ...................................................................................................................... 44
Tabela 18 – Ensaios realizados para diferentes proporções da solução água/acetonitrilo no âmbito da
metodologia B. ....................................................................................................................................... 45
Tabela 19 – Resultados obtidos para ensaios de recuperação realizados para amostras de biota de
acordo com a metodologia B. ................................................................................................................ 45
Tabela 20 – Resultados obtidos para o estudo do passo de re-extração na metodologia B. .............. 46
Tabela 21 – Comparação de resultados obtidos pelas duas metodologias para uma mesma amostra.
Dif = diferença percentual dos resultados obtidos calculada com base na metodologia B. ................. 46
Tabela 22 – Comparação entre metodologias recorrendo a amostras de MRC de sedimento e biota.47
Tabela 23 - Coeficiente de correlação (r2), declive (a) e ordenada na origem (b) obtida para cada curva
de calibração tendo em conta a gama de trabalho adotada. ............................................................... 49
Tabela 24 - Resumo dos resultados obtidos para os testes de linearidade para todas as sessões de
trabalho. ................................................................................................................................................. 51
Tabela 25 - Valores obtidos para o LQ e LD com base nas CC, PCs e ensaios repetidos. ................. 52
xvi
Tabela 26 – Valores determinados para o estudo da repetibilidade. .................................................... 52
Tabela 27 – Tabela resumo do estudo da reprodutibilidade. ............................................................... 52
Tabela 28 - Resultados obtidos para o estudo de exatidão nas matrizes água de consumo e biota... 53
Tabela 29 - Incertezas estimadas para a determinação de PFOS na matriz água de consumo e biota.
............................................................................................................................................................... 54
Tabela 30 - Resumo dos resultados obtidos para a validação do método. .......................................... 54
Tabela 31 – Concentrações obtidas para as amostras de biota analisadas expressas em µg/kg de
massa seca e em µg/kg de húmida. ...................................................................................................... 55
Tabela 32 – Concentrações de PFOS obtidas para as amostras de biota e água consoante o local de
colheita e respetivo fator de bioconcentração (BCF). ........................................................................... 56
Tabela 33 - Concentrações de PFOS para diferentes espécies de peixes no âmbito de diversos estudos.
[15] ......................................................................................................................................................... 67
Tabela 34 – (Continuação) Concentrações de PFOS para diferentes espécies de peixes no âmbito de
diversos estudos. [15] ............................................................................................................................ 68
Tabela 35 - Ocorrência de PFOS nos diversos grupos de alimentos com base num estudo realizado
pela EFSA [16]. ..................................................................................................................................... 69
Tabela 36 – (Continuação) Ocorrência de PFOS nos diversos grupos de alimentos com base num
estudo realizado pela EFSA [16]. .......................................................................................................... 70
Tabela 37 - Correspondência entre o número da amostra, o local de colheita, a sua massa seca e %H2O
(humidade). ........................................................................................................................................... 79
Tabela 38 – Resultados obtidos durante o desenvolvimento da metodologia de extração para a matriz
biota que envolveram o estudo do solvente de extração, do solvente de injeção no UPLC e testes
complementares (que passaram pelo uso do vórtex e sonda). Legenda: NA = Não Aplicável. ........... 81
Tabela 39 - Razões MRM1/MRM2 obtidas para os diversos pontos das curvas de calibração por sessão
de trabalho. ............................................................................................................................................ 83
Tabela 40 - Exemplo de uma sessão de trabalho em que se tratou os resultados com base na altura e
na área do pico. ..................................................................................................................................... 87
xvii
Lista de Símbolos e Abreviaturas
ACN: Acetonitrilo;
APA: Agência Portuguesa do Ambiente;
API: Ionização à pressão atmosférica;
BCF: Fator de Bioconcentração;
CC: Curva de Calibração;
Conc.: Concentração;
CV: Coeficiente de Variância;
DS2: Diferença de Variâncias;
ECF: Electro-Chemical Fluorination;
EFSA: European Food Safety Authority;
EIL: Ensaio Interlaboratorial;
ESI: Electrospray;
F: Fluor;
FSANZ: Food Standards Australia New
Zealand;
GC-MS: Cromatografia Gasosa acoplada à
Espetrometria de Massa;
HPLC: Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência;
HPLC-MS/MS: Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência com deteção por Espetrometria de
Massa em Tandem;
H2O: Água;
Int: Intermédia;
IPAC: Instituto Português de Acreditação;
IPE: Ion-Pair Extraction;
ISO: Internacional Standard Organization;
IST: Instituto Superior Técnico;
IUPAC: International Union of Pure and Applied
Chemistry;
LAIST: Laboratório de Análises do Instituto
Superior Técnico;
LC-MS: Cromatografia Líquida acoplada à
Espetrometria de Massa;
LD: Limite de Deteção;
LQ: Limite de Quantificação;
m/z: Razão massa sobre carga;
MeOH: Metanol;
Micro: Microprovetas de 2 mL;
MRC: Material de Referencia Certificado;
MS: Espetrómetros de Massa;
MTBE: Tert-butyl Ether;
NMR: Ressonância Magnética Nuclear;
NQA: Normas de Qualidade Ambiental;
NQA-CMA: NQA referente à concentração
máxima admissível;
NQA-MA: NQA expressa em valor médio anual;
OCDE: Organização para a Cooperação e
Desenvolvimento Económico;
PC: Padrão de Controlo;
PFBS: Ácido Perfluorobutanossulfónico;
PFC: Compostos Perfluorados;
PFOA: Ácido Perfluorooctanóico;
PFOS: Ácido Perfluorooctanossulfónico;
POP: Persistent Organic Pollutant;
POSF: Fluoreto de Perfluorooctanossulfonila;
PTFE: Politetrafluoroetileno;
r2: Coeficiente de Correlação;
r: Repetibilidade;
R: Reprodutibilidade;
Rec.: Recuperação;
S: Desvio Padrão;
SPE: Extração em fase sólida;
TBA: Tetrabutylammonium;
TDI: Tolerable daily intake;
TFE: Tetrafluoroetileno;
TM: Telomerization;
TSCA: Toxic Substances Control Act;
UPLC: Cromatografia Líquida de Ultra
Eficiência;
UPLC-MS/MS: Cromatografia Líquida de Ultra
Eficiência com deteção por Espectrometria de
Massa em Tandem;
US EPA: United States Environmental
Protection Agency;
US: Extração por Ultrassons;
Vol.: Volume;
VT: Valor Teste;
%RSD: Desvio Padrão Relativo.
xviii
1
1. Âmbito do trabalho
1.1. Enquadramento
O crescimento populacional aliado à necessidade de dar resposta às exigências da sociedade,
levou à descoberta e utilização de diversos compostos orgânicos cujas consequências para o planeta
e seres vivos ainda não são completamente conhecidas. Um exemplo são os compostos perfluorados
(PFC), onde se incluem o PFOS (ácido perfluorooctanossulfónico) e o PFOA (ácido perfluorooctanóico),
entre muitos outros.
Assim, pelo motivo acima descrito, nos últimos anos tem surgido uma crescente preocupação,
na comunidade científica, relacionada com a presença destes compostos no meio ambiente. Os PFC,
face às suas fortes e estáveis ligações carbono-flúor, são praticamente inertes e, como tal,
extremamente persistentes no meio ambiente. A sua produção em grandes quantidades remonta a
1950 e deve-se às suas propriedades hidrofóbicas e lipofóbicas que tornam estes compostos ideais
para serem utilizados, tanto no tratamento de têxteis, como na indústria de papel e produtos de cuidado
pessoal. [1] [2]
Atualmente, o PFC com maior distribuição ambiental e sobre o qual incidiu um maior número
de estudos é o ácido perfluorooctanossulfónico (PFOS). Este composto pode ter efeitos nocivos na
vida humana e animal, tendo sido classificado como persistente, bioacumulável e tóxico. O PFOS
encontra-se, assim, na lista de substâncias prioritárias para as quais se estabeleceu as
correspondentes normas de qualidade ambiental (NQA). Estas normas, definidas no âmbito da política
da água, têm como objetivo o controlo da poluição estabelecendo níveis máximos de concentração
para estas substâncias na água e biota. [1]
É no âmbito desta problemática que surgiu o presente trabalho, no qual foram realizados
ensaios nas matrizes água e biota, de forma a garantir que estão a ser respeitados os limites
estipulados para o PFOS, de acordo com o Decreto-Lei nº218/2015. [3]
1.2. Objetivo
O objetivo desta dissertação consistiu em desenvolver um método analítico para a
determinação de ácido perfluorooctanossulfónico na matriz água e biota.
Para tal, otimizou-se um método de extração adequado e recorreu-se a uma metodologia
analítica suficientemente sensível (a cromatografia liquida de ultra eficiência com deteção por
espectrometria de massa em tandem - UPLC-MS/MS), de forma a garantir a deteção e medição fiáveis
dos valores de concentração de PFOS e avaliar o cumprimento das NQA.
Procedeu-se, assim, à implementação e validação deste método no Laboratório de Análises do
Instituto Superior Técnico (LAIST).
2
3
2. Laboratório de Análises do Instituto Superior Técnico (LAIST)
O Laboratório de Análises foi criado no final do século XIX, pelos Professores Charles LePierre
e Herculano de Carvalho, no Instituto Industrial e Comercial de Lisboa, que mais tarde veio dar origem
ao Instituto Superior Técnico (IST). Atualmente, o LAIST depende diretamente do Presidente e Vice-
Presidente para a Gestão Administrativa e Financeira do IST, sendo dirigido por um Diretor Adjunto
coadjuvado pelo coordenador técnico do laboratório. [4]
O Laboratório é então constituído por uma área administrativa e cinco núcleos analíticos
definidos de acordo com a sua atividade em Análises Gerais aplicadas em Águas; Análises de
Compostos Orgânicos; Metais e Preparação de Amostras; Microbiologia (Clássica e Novas
Tecnologias) e Gestão de Colheitas, Ambiente, Saúde e Segurança. [4] Com base nesta organização,
o LAIST consegue dar resposta às diversas necessidades dos seus clientes, não só no que respeita a
análises realizadas a águas, mas também a outro tipo de matrizes, entre elas, alimentos, ar ambiente,
efluentes líquidos, produtos químicos, resíduos sólidos, solos e sedimentos.
Trata-se, assim, de um laboratório de referência a nível nacional que possuí acreditação desde
1994, estando atualmente acreditado segundo a Norma NP EN ISO/IEC 17025 pelo Instituto Português
de Acreditação (IPAC). [4]
O presente trabalho foi desenvolvido com base num estágio realizado no núcleo de Análises
de Compostos Orgânicos.
4
5
3. Compostos Perfluorados (PFC)
Os compostos perfluorados (PFC) são uma classe de compostos orgânicos particular. Estes
compostos consistem numa estrutura de carbono na qual todos os átomos de hidrogénio foram
substituídos por átomos de flúor, existindo pelo menos uma ligação a um átomo ou grupo funcional
diferente. [5] [6]
A grande maioria dos PFC não se formam espontaneamente na natureza, sendo que a sua
produção em larga escala data ao ano de 1950 e deve-se às suas caraterísticas únicas que os tornam
perfeitos para serem utilizados em inúmeras aplicações. Assim, é possível encontrá-los não só em
aplicações industriais, mas também em produtos do quotidiano, como por exemplo em têxteis, tintas,
óleos ou até mesmo no revestimento de certos utensílios de cozinha. [6] [7]
A família dos PFC inclui diversas substâncias, entre elas o fluoreto de perfluorooctanossulfonila
(POSF), o ácido perfluorooctanossulfónico (PFOS), o ácido perfluorooctanóico (PFOA) e o ácido
perfluorobutanossulfónico (PFBS).
Tal como referido anteriormente, o presente trabalho incide na metodologia de análise do
composto PFOS, pelo que este será abordado com especial detalhe nos próximos pontos.
3.1. Ácido Perfluorooctanossulfónico (PFOS)
O ácido perfluorooctanossulfónico (PFOS) é um composto sintetizado pelo homem que
pertence à família dos compostos perfluorados (PFC).
Desde 2000 que os PFC e, em particular o PFOS, têm sido tema de diversos estudos que
vieram a revelar os seus efeitos tóxicos na vida selvagem e nos humanos, tendo sido detetados em
diversos organismos e nas mais variadas zonas do mundo. [8]
Face às suas propriedades aditivas e surfactantes, pode ser utilizado nas mais diversas
aplicações, tanto a nível comercial, como industrial. Algumas das aplicações típicas do PFOS estão
relacionadas com revestimentos de superfícies, como têxteis, madeiras, metais e papel. De destacar a
sua presença em tecidos respiráveis e à prova de água, espumas de combate a incêndios e isoladores
de fios elétricos. [1] [2]
Tendo em conta a sua vasta aplicabilidade, estes compostos podem ser libertados para o meio
ambiente não só aquando da sua produção, mas também durante o seu uso e eliminação.
3.1.1. Propriedades Físico-Químicas
O PFOS, de fórmula molecular 𝐶8𝐹17𝑆𝑂3𝐻 é um composto orgânico perfluorado constituído por
uma estrutura de 8 carbonos e um grupo funcional -𝑆𝑂3𝐻. Normalmente, é utilizado na forma de sal (de
potássio, sódio, amónia ou lítio) ou incorporado na estrutura de polímeros. Devido às suas fortes
ligações carbono-flúor, o PFOS é resistente a degradações metabólicas, ambientais e igualmente a
biotransformações. Apresenta ainda propriedades químicas hidrofóbicas e lipofóbicas que, justificam a
sua ampla utilização nas mais diversas aplicações. [8]
6
Na figura 1 é possível observar uma representação esquemática do composto.
Figura 1 – Representação esquemática da estrutura química do PFOS.
Por sua vez, na tabela 1 apresentam-se compiladas as principais propriedades químicas e
físicas do PFOS, na sua forma de sal de potássio (salvo quando indicado o contrário).
Tabela 1 - Propriedades fisico-químicas do PFOS na forma de sal de potássio. Adaptado de [8].
Propriedades Valor
Nº CAS 1763-23-1 (*)
1763-23-3
Fórmula Química 𝐶8𝐹17𝑆𝑂3𝐻 (*)
𝐶8𝐹17𝑆𝑂3−
Peso Molecular (g/mol) 500,13 (*)
538
Cor e estado físico Pó Branco
Ponto de Ebulição Não mensurável
Ponto de Fusão ≥ 400℃
Pressão de Vapor 3,31 × 10−4 𝑃𝑎 (20 ℃)
Solubilidade em Água 570 mg/L (Água pura)
12,4 mg/L (Água salgada)
(*) – referente ao PFOS na forma ácida.
De salientar que, atualmente, existe na literatura um maior número de propriedades referentes
ao PFOS na forma de sal de potássio devido a este anião ter sido utilizado em diversos estudos em
animais.
3.1.2. Síntese
Os compostos perfluorados, regra geral, não ocorrem espontaneamente na natureza. Assim
sendo, a maioria destes compostos podem ser produzidos essencialmente através de dois processos
diferentes: Electro-Chemical Fluorination (ECF) e Telomerization (TM).
O primeiro utiliza como percursor o POSF e consiste em substituir todas as ligações
carbono-hidrogénio por carbono-flúor mantendo, no entanto, alguns grupos funcionais de interesse.
O resultado final é uma mistura complexa com compostos que variam em peso molecular e
comprimento da cadeia (compostos lineares e ramificados) tratando-se, assim de um processo que não
é eficiente nem seletivo, apresentando um rendimento de aproximadamente 40% (em relação ao
7
PFOS). Contudo, não obstante estas limitações, era através de ECF que a 3M Company, o maior
fabricante de PFOS, os produzia. [5]
O segundo processo é a telomerization. De uma forma simplista, trata-se de um conjunto de
reações em cadeia que se iniciam com a reação do tetrafluoretileno (TFE) com pentafluoreto de iodo,
levando à formação de uma mistura de perfluoroalquilo iodetos. Estes últimos são intermediários
importantes no fabrico de compostos perfluorados. Por este processo, já é possível obter apenas
compostos com cadeias lineares e com elevado grau de pureza. [9]
O PFOS pode ainda formar-se a partir de reações de degradação que envolvem os subprodutos
destes dois processos. [8]
3.1.3. Aplicações
Como já foi anteriormente referido, desde a sua descoberta, o PFOS tem sido utilizado nas
mais diversas aplicações devido, essencialmente, às suas fortes ligações carbono-flúor, às suas
propriedades hidrofóbicas e lipofóbicas (subunidade C8F17) e à sua polaridade (grupo SO3-). Tendo tudo
isto em consideração, é correto afirmar que o PFOS é um composto extremamente estável, com
caraterísticas importantes para aplicações industriais e comerciais, podendo as suas utilizações serem
agrupadas em 3 categorias: tratamento de superfícies, proteção de papel e performance chemicals.
O PFOS era, assim, o ingrediente chave na produção de Scotchgard, um repelente utilizado
não só em têxteis, mas também noutras superfícies, ideal para impermeabilizá-las. Este era produzido
pela 3M Company. No entanto, quando em 2000 se vieram a realizar estudos que detetaram a presença
de PFOS em amostras de sangue de diversos indivíduos, bem como, no biota e em amostras de
centrais de tratamento de águas, a 3M Company, voluntariamente, cessou a produção de PFOS (em
2002), substituindo a sua presença na Scotchgard por ácido perfluorobutanossulfónico (PFBS).
Atendendo às propriedades repelentes de gordura, óleos e água do PFOS, este também foi
utilizado para fabricar embalagens de produtos alimentares. Esta aplicação levava à contaminação dos
alimentos com PFOS, tendo sido uma importante fonte de exposição para o homem.
É ainda de salientar a utilização de PFOS como aditivo para espumas de combate a incêndio,
na medida em que estas, nos últimos anos, estiveram envolvidas nalguns incidentes que levaram à
contaminação de rios próximos dos locais onde foram utilizadas. Por este motivo, o fabrico deste tipo
de espumas foi descontinuado, tendo sido proibido o seu uso em 2011. [10]
Atualmente, dada toda a problemática envolvendo o PFOS, este já não é utilizado em larga
escala, existindo mesmo regulações ambientais e legislação que restringem o seu uso. Entre as marcas
conhecidas, que comercializaram produtos que tinham na sua constituição PFOS, destaca-se a já
mencionada Scotchgard, a Tefal e o Post-it. [11]
3.1.4. Regulações Ambientais / Legislação
No final dos anos 90, começaram a surgir questões relacionadas com os efeitos dos compostos
perfluorados, em particular do PFOS e PFOA, no ambiente e na saúde dos seres vivos, o que
8
eventualmente levou a que, no início do ano 2000, um conjunto de países membros da OCDE
(Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Económico) começasse a realizar estudos
informais a fim de apurar as consequências da sua utilização. Esta preocupação coincidiu com a
decisão voluntária por parte da 3M Company, a principal fabricante de PFOS, de diminuir a sua
produção e eventualmente cessar o seu uso. [12]
O PFOS deixou, assim, de ser produzido nos EUA e na Bélgica. Mais tarde, ainda no ano de
2002, a US EPA (United States Environmental Protection Agency) emitiu uma proposta na qual inseriu
o PFOS como substância tóxica a ter em atenção no âmbito da TSCA, Toxic Substances Control Act,
e apresentou um conjunto de regras/restrições para o uso de compostos perfluorados, no geral. [12]
Em 2006, o Canadá decidiu incluir o PFOS e os seus derivados na sua lista de substâncias
prioritárias (Priority Substances List) de acordo com o Canadian Environmental Protection Act. Também
nesse ano, a União Europeia baniu o uso de PFOS em produtos finais e semi-acabados, estipulando
uma concentração máxima de 0,005 %(w/w).
Em Maio de 2009, os ácidos perfluorooctanossulfónicos foram caracterizados como compostos
orgânicos persistentes e poluentes (Persistent Organic Pollutant – POP) pela Convenção de
Estocolmo. [12] Entretanto, países como a China, Japão, Austrália e Nova Zelândia também estão a
seguir estes exemplos, identificando o PFOS como um composto a ter em atenção e sobre o qual se
devem tomar medidas. [13]
Os PFOSs são assim compostos persistentes, bioacumuláveis e tóxicos que estão inseridos
na lista de substâncias de ação prioritária.
Quanto à legislação portuguesa, é no âmbito do Decreto-Lei nº218/2015 que estão definidas
as normas de qualidade ambiental (NQA), nas quais se estabelecem níveis máximos de concentração
de PFOS na água, sedimentos e biota, com o objetivo de proteger o ambiente e a saúde humana. Cabe
à Agência Portuguesa do Ambiente (APA) a responsabilidade pelo cumprimento do supramencionado
decreto.
Na tabela 2 encontram-se organizados os valores para as NQA, expressos em valor médio
anual (NQA-MA) e em concentração máxima admissível (NQA-CMA). De salientar que as águas de
superfície interiores compreendem os rios, lagos e as massas de água artificiais, ou fortemente
modificadas. Por sua vez, para o biota a NQA diz respeito aos peixes. [3]
Tabela 2 – NQA para as diversas matrizes. Adaptado de [3].
NQA-MA para Águas Superficiais Interiores 6,5 × 10−4 µg/L
NQA-MA para Outras Águas Superficiais 1,3 × 10−4 µg/L
NQA-CMA para Águas Superficiais Interiores 36 µg/L
NQA-CMA para Outras Águas Superficiais 7,2 µg/L
NQA Biota 9,1 µg/kg de peso húmido
9
De acordo com o decreto, o cumprimento da NQA-MA exige que, em cada ponto de
monitorização representativo, a média aritmética das concentrações medidas em momentos diferentes
do ano não exceda a norma. Por sua vez, a NQA-CMA significa que a concentração medida não pode
exceder a norma em nenhum ponto de monitorização representativo. [3]
Por último, é de referir que atualmente não existe estipulada na lei portuguesa um valor limite
para a concentração de PFOS nas águas para consumo.
3.1.5. Ocorrências/Histórico
Devido ao PFOS se tratar de um composto persistente no ambiente e bioacumulável, a sua
presença tem sido detetada no ar, em sedimentos, águas superficiais, águas subterrâneas e nos mais
diversos organismos, nas mais variadas zonas do mundo. [8] Atualmente, já foram detetados níveis
significativos de PFOS no Oceano Pacífico (a cerca de 1000 m de profundidade) e em amostras de
sangue e fígado de animais que habitam as regiões árticas, nomeadamente ursos polares, focas e
raposas. Também os peixes, aves e anfíbios têm sido afetados por este tipo de poluente. [14] [15]
Estudos realizados no inicio do século XXI a amostras de águas subterrâneas colhidas em
bases da força aérea americana, nas zonas de Michigan, Nevada e Florida, detetaram concentrações
de PFOS entre os 3 e os 120 µg/L, sendo que, a razão apontada para estes valores elevados está
relacionada com o uso de espumas de combate a incêndio que apresentavam na sua constituição
PFOS. [15] Ainda envolvendo estas espumas, uma das situações mais críticas ocorreu no ano de 2000
em Toronto, no Canadá, onde se deu um derrame acidental de cerca de 22000 L deste tipo de espuma
que continha aproximadamente 300 kg de PFOS, os quais vieram a contaminar o rio Etobicoke
Creek. [10]
Hansen e os seus colaboradores, em meados de 2002, analisaram amostras de água do rio
Tennessee, no Alabama, o qual recebia descargas de efluentes de unidades fabris, incluindo de uma
fábrica que produzia compostos perfluorados. As concentrações de PFOS obtidas para estas amostras
variaram entre os 17 e 54 ng/L. [15]
Em 2003, estudos realizados por Harada a amostras de água da torneira provenientes de nove
diferentes estações de tratamento de águas situadas no Japão, concluíram que oito destas amostras
apresentavam níveis de PFOS compreendidos entre 0,1 e 4 ng/L e, uma chegou mesmo a atingir uma
concentração de 50 ng/L (possivelmente devido a tratar-se de uma estação que se abastecia de água
de um rio poluído). [15]
Ainda numa fase inicial desta problemática, Giesy e Kannan identificaram a presença de PFOS
em várias espécies de animais aquáticos, aves, peixes e anfíbios em concentrações superiores a
1 ng/g. Seguiram-se estudos na Europa, em que se verificaram níveis elevados de PFOS no biota numa
zona poluída da Bélgica (36 a 1700 ng/g). [15] Nas tabelas 33 e 34 do Anexo A apresentam-se as
concentrações de PFOS obtidas em diversas espécies no âmbito de diferentes estudos.
Em 2012, a EFSA (European Food Safety Authority) focou-se em determinar a concentração
de PFOS, entre outras substâncias, nos diferentes grupos de alimentos. Nas tabelas 35 e 36 do
10
Anexo A é possível observar em detalhe os valores obtidos para a ocorrência do PFOS nos alimentos.
De referir que, os níveis mais elevados deste foram detetados nos grupos em que o peixe e a carne
estão inseridos (Fish and other seafood e Meat and meat products). Por sua vez, cerca de 11% de um
total de aproximadamente 400 amostras de água para consumo analisadas, apresentaram
concentrações que variaram entre 0,001 e 0,016 µg/kg. No final a EFSA refere a possibilidade de
existirem outras fontes de exposição de PFOS aos seres humanos com maior importância que o regime
alimentar. [16] [5]
De um modo geral, estas ocorrências devem-se às emissões de PFOS para o ambiente, as
quais podem ter acontecido aquando da sua produção, uso ou após a sua eliminação.
Não existem dados suficientes que permitam determinar a quantidade total de PFOS produzida
mundialmente durante os seus anos de produção. Apenas existem dados referentes ao ano de 2000,
no qual só a 3M Company foi responsável por produzir cerca de 300 000 ton. Embora, atualmente, haja
uma forte regulamentação/legislação envolvendo estes compostos, a sua libertação para o ambiente
pode ainda estar a ocorrer devido ao legado de produtos que apresentam PFOS na sua
constituição. [15]
3.1.6. Toxicologia
Como já foi referenciado no ponto 3.1.4, o PFOS é um composto extremamente persistente e
tóxico, quer para o ambiente, como para os seres vivos. Este composto e os seus derivados são, na
sua grande maioria, detetados no soro, rins e fígado dos seres vivos. Ao contrário do que é habitual,
não se acumulam na massa gorda, mas estabelecem ligações com a matéria proteica. [8]
Testes realizados em animais, nomeadamente ratos e macacos, permitiram concluir que o
PFOS não é eliminado através de reações metabólicas ou de excreção, sendo que o seu tempo de
meia vida varia consoante a espécie, tendo para os ratos um valor de 100 dias e para os macacos
200 dias. De notar que, no caso dos seres humanos, este tempo de meia vida pode chegar aos
5,4 anos. Foi também demonstrado que o PFOS pode atravessar a barreira sangue-placenta chegando
até ao feto. [5]
Outros estudos permitiram observar que o PFOS é rapidamente absorvido após ingestão (oral
exposure), sendo que, numa primeira fase afeta o fígado, podendo ser responsável pela formação de
tumores nestes órgãos. Existe ainda a possibilidade de se acumular no sangue, intestinos e
cérebro. [15]
Ensaios mais recentes, realizados pelo U.S. Department of Health and Human Services,
permitiram concluir que o PFOS altera o sistema imunitário dos seres humanos, tornando-se
responsável por mecanismos que levam à diminuição da resistência a doenças. [1]
Por sua vez, testes epidemiológicos permitiram identificar uma associação entre a exposição
ao PFOS e a incidência de cancro na bexiga, embora esta relação ainda não seja compreendida em
toda a sua extensão. [5]
11
Em 2016, a Food Standards Australia New Zealand (FSANZ) determinou que a dose diária
tolerável (tolerable daily intake, TDI) para o PFOS é cerca de 0,020 µg/kg massa corporal/dia. [13] [17]
É de suma importância ter em consideração que, ainda não foram realizados estudos
suficientes capazes de prever, com um determinado grau de confiança, os riscos associados à
exposição dos seres humanos ao PFOS.
12
13
4. Metodologia Analítica
Numa primeira parte deste capítulo realizou-se um resumo dos principais métodos utilizados
para a determinação do composto alvo em estudo (ponto 4.1), sendo que numa fase posterior (pontos
4.2, 4.3 e 4.4) se explicou em detalhe apenas as metodologias a que se recorreu para a realização
deste trabalho, nomeadamente a extração em fase sólida, a extração recorrendo ao ultrassons, a
cromatografia líquida e a espetrometria de massa.
4.1. Estado de Arte
Da literatura consultada verificou-se que os efeitos de matriz são recorrentes, como tal, o passo
de limpeza é de extrema importância, quer no caso das amostras de água, como de biota (em particular
para este último, dada a complexidade desta matriz).
Os métodos de preparação de amostras podem ter como objetivo isolar uma ou mais
substâncias presentes numa mistura complexa e/ou concentrar as amostras para que o analito em
estudo consiga ser detetado, mesmo estando presente em concentrações vestigiais.
Face ao exposto, antes das amostras serem analisadas, através de uma técnica analítica
adequada, é necessário que estas sofram um passo de preparação.
4.1.1. Preparação de Amostras Aquosas
Para o caso de amostras de água, estas normalmente sofrem um processo de extração em
fase sólida (SPE), que também funciona como passo de limpeza, utilizando para tal cartuchos ou discos
de extração. A norma ISO 25101 (criada pela Internacional Standard Organization) recomenda o uso
de cartuchos Oasis WAX (Waters Corporation, Milford, MA, 150 mg, 6ml, 30 µm). A principal
desvantagem desta norma está relacionada com os limites de deteção muito altos (cerca de 2 ng/L). [2]
Outro método de extração foi descrito por Powley et al. [18] e recorre a adsorventes de grafite
(graphitized carbon adsorbent). [2]
4.1.2. Preparação de Amostras de Biota
Dada a complexidade das amostras de matriz biota, o passo de extração adquire ainda uma
maior relevância, sendo que, atualmente, existem três métodos de extração vulgarmente aplicados a
este tipo de amostras: [19]
1) Extração por par iónico (Ion-Pair Extraction, IPE) com TBA (tetrabutylammonium) e
extração com o solvente MTBE (methyl tert-butyl ether) – descrito por Hansen et al. (2001).
Este método é utilizado desde o inicio dos anos 2000, altura em que se começou a estudar a
incidência do PFOS no biota. Apresenta como principal desvantagem o facto de também se dar
a extração de outros constituintes, como os lípidos, que podem vir a ser uma fonte de
interferências. Uma forma de melhorar a eficiência deste método consiste em realizar uma
digestão da amostra, com uma solução alcalina, antes desta ser extraída;
14
2) Extração por Ultrassons (US) com um consequente passo de limpeza – de acordo
com Powley et al. (2005). A extração por ultrassons é um método de fácil aplicação e que
apresenta boas recuperações, contudo, devido aos possíveis efeitos de matriz esta deve
seguir-se de um outro passo de limpeza. Podem ser utilizados como solvente de extração o
metanol ou o acetonitrilo, sendo possível realizar uma ou mais extrações repetidas. No caso
de se efetuarem re-extrações, o extrato é combinado e segue, então, para um passo de
limpeza;
3) Digestão alcalina seguida de SPE – explanado por So et al. (2006). Esta última
metodologia tenta alcançar uma maior sensibilidade analítica através da digestão alcalina de
lípidos e proteínas, antes da extração em fase sólida. No entanto, trata-se de um processo
bastante moroso.
De uma forma geral, estas três metodologias apresentam boas recuperações e são de fácil
aplicação, pelo que a sua escolha poderá passar pelo material, equipamento e reagentes presentes no
laboratório, sem nunca esquecer o compromisso tempo despendido e custo associado a cada método.
É, ainda possível combinar as metodologias numa só.
Normalmente, numa fase posterior à extração, pode ser necessário um outro passo de limpeza
de modo a prevenir efeitos de matriz, entre as opções mais utilizadas está a precipitação a - 20 °C, a
centrifugação, o uso do vórtex e/ou a adição de carvão ativado.
Por fim, é de referir que atualmente não existe nenhuma norma para a extração de PFOS no
biota.
4.1.3. Técnicas Analíticas
Numa fase inicial, os compostos perfluorados, no qual o PFOS se insere, eram detetados
através de métodos não específicos que não permitiam a sua identificação e quantificação individual.
A sua deteção específica só foi permitida quando se começou a aplicar técnicas de cromatografia
líquida acoplada à espetrometria de massa (LC-MS). [10]
Uma das técnicas vulgarmente utilizada, envolve a cromatografia líquida de alta eficiência com
deteção por espetrometria de massa em tandem (HPLC-MS/MS) e, foi descrita pela primeira vez por
Hansen et al., em 2001. O principal problema relacionado com o uso de HPLC-MS/MS deve-se aos
limites de deteção deste serem um pouco elevados. Como tal, nos últimos anos, tem-se vindo a recorrer
a equipamentos de cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) que apresentam inúmeras
vantagens, entre elas um limite de deteção mais baixo. No entanto, estas técnicas de cromatografia
líquida apresentam como inconvenientes a existência de interferências de matrizes que, se revelam
através de supressão ou enriquecimento iónico. [9]
Recentemente, também se apostou na técnica de ressonância magnética nuclear (NMR) para
a determinação e quantificação destes compostos perfluorados. Tal deve-se essencialmente à sua
exatidão, boa resolução e especificidade para o flúor. Outro importante fator está relacionado com a
fraca influência de efeitos de matriz neste tipo de técnica. Esta ausência de interferências justifica-se,
15
em parte, devido à formação de compostos com múltiplas ligações a átomos de flúor não ocorrerem
espontaneamente na natureza. Por outro lado, como principal desvantagem desta técnica tem-se os
altos limites de deteção que levam a extensos e morosos procedimentos de pré-concentração das
amostras. [20] [9]
De referir que, o uso da técnica de cromatografia gasosa acoplada à espetrometria de massa
(GC-MS) não é indicada para a determinação de PFOS, uma vez que este composto é de difícil
derivatização. [21] [19]
4.2. Métodos de Preparação de Amostras no LAIST
Como já foi referido, os métodos de preparação de amostras têm como propósito isolar um ou
mais analitos presentes numa mistura complexa, eliminando as possíveis substâncias interferentes.
Pode também ter como objetivo a concentração de amostras de forma a que o analito em estudo
consiga ser detetado através do método de análise que irá ser aplicado. Trata-se, assim, de uma etapa
de extrema importância de modo a obter resultados fiáveis e robustos, contribuindo para a precisão e
exatidão do método. [22]
Neste trabalho, utilizou-se o método de extração em fase sólida (SPE), para o caso particular
da matriz água, por sua vez para o biota recorreu-se à extração por ultrassons (US).
4.2.1. Extração em fase sólida (SPE)
Como já foi referido, as amostras de água foram extraídas recorrendo ao método de extração
em fase sólida (SPE). Atualmente, este método de preparação de amostras é uma das técnicas mais
utilizadas para extrair, concentrar e/ou purificar o(s) analito(s) de interesse em amostras complexas,
antes destas seguirem para uma análise cromatográfica, garantindo, deste modo, a qualidade dos
resultados obtidos. Neste tipo de preparação, os compostos que estão dissolvidos ou em suspensão
numa amostra líquida são separados dos restantes constituintes de acordo com as suas propriedades
físico-químicas. Trata-se assim de um processo de adsorção seletivo, no qual o analito fica retido no
adsorvente, que se pode tratar de um cartucho ou disco, como se observa na figura 2.
Figura 2 - Representação de um cartucho e de um disco de extração. Nota: As imagens não se encontram representadas à escala real.
Não existe um adsorvente universal capaz de reter todos os tipos de compostos, sendo que
estes materiais sólidos têm de ser selecionados de acordo com o objetivo em estudo e com os
16
mecanismos de retenção pretendidos. Tem-se, assim, adsorventes apolares ou de fase reversa, nos
quais a retenção do analito se deve a interações de van der Waals de tipo hidrofóbico; adsorventes
polares ou de fase normal, onde as interações são do tipo hidrofílico e devem-se a pontes de hidrogénio
e/ou forças dipolo-dipolo. Por sua vez, na troca iónica tem-se atrações electroestáticas entre o(s)
analito(s) e a fase sólida, sendo que nos de adsorção a retenção deve-se aos centros ativos superficiais
dos materiais constituintes do enchimento. [23]
Regra geral, esta técnica apresenta 4 etapas: [24]
1) condicionamento dos cartuchos ou discos com volumes de solvente adequados, com
o objetivo de ativá-los (tendo atenção para não os deixar secar);
2) adição da amostra, sendo que, quando são adicionadas grandes quantidades da
mesma, pode haver necessidade de aplicar vácuo, tendo de existir um controlo da velocidade
do fluxo, pois esta pode influenciar a retenção;
3) lavagem do cartucho ou disco com um determinado volume de solvente de forma a
arrastar consigo os compostos que apresentam pouca (ou nenhuma) afinidade com o
adsorvente, deixando-se o adsorvente secar antes de seguir para o próximo passo;
4) eluição do analito utilizando volumes definidos de solvente.
Na figura 3, tem-se um esquema que resume estes passos principais.
Figura 3 – Esquema que resume as principais etapas da extração em fase sólida. Adaptado de [25].
Para o presente trabalho utilizou-se discos de extração, recorrendo a uma montagem como a
observada na figura 4. Os discos apresentam enchimentos com tamanho inferior aos das colunas,
tendo partículas de dimensões compreendidas entre 8 e 40 µm. Apresenta, assim, como vantagens o
17
facto de possuir uma maior capacidade de retenção dos analitos em estudo, permitindo uma maior
reprodutibilidade e uma redução do tempo de análise, quando utilizados grandes volumes de
amostra. [23]
Figura 4 - Esquema de uma montagem de SPE utilizando discos de extração. Adaptado de [26].
4.2.2. Extração por Ultrassons
No caso particular do biota, recorreu-se aos ultrassons como técnica de extração de PFOS.
Este tipo de equipamentos têm vindo a ser utilizados pelos químicos analíticos, quando existe a
necessidade de agitar a amostra e com o objetivo de auxiliar em processos de extração e/ou
lixiviação. [27]
Esta técnica recorre, assim, aos ultrassons que são ondas mecânicas de frequência superior a
20 kHz que se propagam através de qualquer meio material. Os ultrassons podem ser divididos em
duas categorias: ultrassons de baixa frequência (de 20 kHz a 1 MHz) e de alta frequência (superior a
1 MHz). As ondas ultrassónicas de baixa frequência apresentam alta potência, verificando-se o
contrário nas ondas de alta frequência (baixa potência). [27]
De uma forma simplista, o uso desta técnica promove o contato entre a amostra e o solvente
devido à propagação das ondas ultrassónicas, o que leva à formação nos líquidos de intensas e
sucessivas ondas de compressão e rarefação, podendo também ocorrer a formação de cavitações
Estas cavitações não são mais do que cavidades no interior do líquido para as quais os gases
dissolvidos no sistema migram, formando bolhas que, podem aumentar e diminuir de tamanho ao longo
dos ciclos de compressão e rarefação até que se dê o colapso das mesmas favorecendo, deste modo,
a interação amostra-solvente. Como parâmetros a controlar neste tipo de técnica destacam-se a
escolha do tipo de solvente e do volume a utilizar, a temperatura e as condições operatórias,
nomeadamente o tempo e potência do equipamento. [22]
Os aparelhos, usualmente utilizados em laboratórios de análise, são o banho de ultrassons e a
sonda ultrassónica, que funcionam na gama de ultrassons de baixa frequência. É possível afirmar que
nestes equipamentos o constituinte de maior importância é o transdutor, um dispositivo que transforma
uma forma de energia noutra, neste caso converte a energia mecânica ou elétrica em som de alta
frequência (> 20 kHz).
18
Quanto ao banho de ultrassons, os mais comuns consistem num vaso metálico (geralmente de
aço inox) que tem um ou mais transdutores na parte inferior, como se observa na representação da
figura 5. No caso de transdutores piezoelétricos, ao ser aplicada uma determinada diferença de
potencial nestes, serão provocadas vibrações nas faces perpendiculares do dispositivo, sendo que,
este irá vibrar a uma frequência pré-determinada. Estas ondas propagam-se pelo banho até atingirem
a amostra.
Figura 5 - Representação esquemática de um banho de ultrassons. Adaptado de [28].
Por sua vez, a sonda ultrassónica atinge potências mais elevadas que o banho ultrassónico,
sendo que, a energia ultrassónica não é transferida através de um meio líquido, mas introduzida
diretamente na amostra, podendo funcionar em modo continuo ou por impulsos. Na figura 6, é possível
observar uma representação esquemática deste tipo de equipamento.
Figura 6 - Representação esquemática de uma extração recorrendo a uma sonda ultrassónica. Adaptado de [22].
No geral, a extração com recurso aos ultrassons é, usualmente, recomendada para a
preparação de amostras sólidas de modo a extrair compostos orgânicos não voláteis ou semi-voláteis.
Trata-se de uma técnica de simples utilização, que envolve pouco tempo de preparação e tem baixos
custos associados.
19
4.3. Cromatografia
A primeira técnica de cromatografia ganhou importância no início do século XX devido aos
trabalhos do botânico Mickhail Tswett sobre a pigmentação das plantas.
Segundo a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), a cromatografia define-
se como sendo um método físico de separação no qual os componentes de uma amostra são
distribuídos entre duas fases, uma fase estacionária e outra móvel. A fase estacionária pode ser sólida,
líquida ou gel e encontra-se, como o nome indica, imobilizada dentro de uma coluna ou fixa num suporte
apropriado. Por sua vez, a fase móvel pode tratar-se de um líquido, gás ou fluído supercrítico e move-
se através da fase estacionária numa determinada direção. [24]
Atualmente, existem diferentes técnicas cromatográficas. No esquema da figura 7, encontra-se
sistematizada uma classificação simples dos processos cromatográficos, de acordo com a sua
configuração.
Figura 7 – Classificação dos processos cromatográficos de acordo com a sua configuração.
A cromatografia de camada fina e em papel são práticas mais simplistas quando comparadas
com as técnicas cromatográficas em coluna.
A escolha do método cromatográfico apropriado para um determinado analito baseia-se no
conhecimento que se tem sobre este e as suas propriedades físico-químicas.
Regra geral, a cromatografia gasosa é aplicável a compostos termicamente estáveis e voláteis,
e, em contrapartida, a cromatografia líquida a compostos termicamente instáveis e/ou com pontos de
ebulição elevados.
Para o presente trabalho, recorreu-se à cromatografia líquida, mais especificamente à
cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC), sendo sobre esta técnica que, no ponto 4.3.2, irá incidir
uma explicação mais pormenorizada.
Cromatografia
Leito Aberto
Papel
Camada Fina
Coluna
Líquida
Fluído Supercritico
Gasosa
20
Em suma, há que ter em consideração que no geral a cromatografia permite, separar, identificar
e/ou quantificar compostos químicos, estando muitas vezes associada a outras metodologias analíticas
justificando, assim, a sua ampla utilização nos mais diversos contextos.
4.3.1. Cromatografia Líquida
A cromatografia líquida surge, em 1940, no seguimento dos trabalhos de Martin e Synge [29]
e, desde então, tem vindo a ganhar importância devido às suas inúmeras aplicações. Trata-se de uma
técnica adequada para fins analíticos, comerciais, de controlo de qualidade, de rotina ou para
investigação. Neste tipo de cromatografia, a fase estacionária está contida numa coluna
cromatográfica, a qual é feita de um material inerte que tem no seu interior um determinado enchimento
formado por partículas de pequenas dimensões. Por sua vez, a fase móvel é um líquido que flui de
forma contínua através do sistema, arrastando consigo a amostra a analisar. Tal pode acontecer devido
à força da gravidade (cromatografia de baixa pressão) ou em consequência de vácuo criado por uma
bomba de vácuo (cromatografia líquida de alta pressão). [30]
As substâncias presentes na amostra possuem estruturas moleculares e grupos funcionais
diferentes e, como tal, apresentam afinidades distintas com a fase móvel e estacionária. Estas ao serem
deslocadas ao longo da fase estacionária pelo caudal da fase móvel separam-se como resultado das
diferentes velocidades de migração (migração diferencial) dos diversos componentes da mistura. [31]
[29] À saída da coluna encontra-se um detetor que regista a composição da amostra, podendo esta ser
transcrita, com recurso a um software apropriado, na forma de um cromatograma. [30] Na figura 8,
encontra-se um esquema simplificado dos constituintes de um cromatógrafo líquido de alta eficiência
(HPLC). De salientar que, neste tipo de cromatografia líquida tem-se uma coluna com diâmetro interno
entre 2 e 5 mm, empacotadas com partículas de pequenas dimensões (entre 3 e 10 µm). Tal leva a um
aumento da capilaridade da fase estacionária e, assim sendo, é necessário recorrer a uma bomba de
vácuo (aplicando pressões não superiores a 6000 PSI). [32] [30]
Figura 8 - Esquema simplificado dos constituintes de um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC).
Adaptado de [32].
21
É possível afirmar que um dos constituintes com maior importância na cromatografia líquida é
a coluna, uma vez que, é nesta que se dá o processo de separação. A escolha do tipo de coluna é
crucial para a obtenção de bons resultados e baseia-se, não só nas características da amostra
(polaridade, carga iónica e estrutura química), nos mecanismos de separação que melhor se adaptam
a esta (partição, adsorção, permuta iónica, exclusão de tamanhos e afinidade), mas também nos fatores
químicos e mecânicos da coluna (propriedades e detalhes do seu enchimento e configuração da sua
estrutura – diâmetro, material, comprimento, etc.). [31] Quanto à polaridade da coluna, é possível
distinguir a cromatografia líquida de fase reversa da de fase normal. Na primeira, a fase estacionária é
menos polar que a fase móvel e, na segunda verifica-se o contrario. Assim, no caso da cromatografia
de fase reversa os compostos não polares ou pouco polares, vão ter maior afinidade pela fase
estacionária ficando retidos na coluna por mais tempo que os compostos polares. Os grupos funcionais
mais comuns em cromatografia de fase normal são a sílica e alumina. Enquanto que na cromatografia
de fase reversa tem-se muitas vezes substâncias quimicamente modificadas com ligações a grupos
funcionais, por exemplo, sílica com ligações a cadeias de C18 ou a grupos amina.
Outro parâmetro importante a ter em consideração é a fase móvel, nomeadamente algumas
das suas caraterísticas, tais como viscosidade, miscibilidade e polaridade. É também essencial definir
a proporção da fase móvel que atravessa a coluna, ou seja, se o método é isocrático ou se funciona
em gradiente. Num método isocrático tem-se as mesmas percentagens de fase móvel ao longo de todo
o processo de separação cromatográfica. Pelo contrário, se o método funciona em gradiente tem-se
uma percentagem para a fase móvel que varia ao longo de todo o processo de separação
cromatográfica.
Por fim, o detetor deve possuir algumas caraterísticas de modo a conseguir identificar e
quantificar corretamente os analitos. Em particular deve apresentar alta sensibilidade e rápida resposta
para todos os solutos, um limite de deteção baixo, boa estabilidade e reprodutibilidade do sinal e ser
pouco influenciado por mudanças na temperatura, velocidade do fluxo e composição da fase móvel.
[30] [33] Atualmente, existem diversos tipos de detetores, sendo utilizado neste trabalho um detetor de
espectrometria de massa (MS) que irá ser explicado, mais pormenorizadamente, no ponto 4.4.
4.3.2. Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência
A cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) surge em 2004 como resultado dos avanços
no desenvolvimento de tecnologias de fabrico de materiais de pequenas dimensões resistentes a altas
pressões. Trata-se de uma tecnologia que veio revolucionar as ciências de separação, apresentando
uma melhor resolução, um menor tempo de retenção, uma maior sensibilidade e um menor consumo
de solventes do que a convencional cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), anteriormente
abordada. Este equipamento apresenta colunas com diâmetro interno na ordem dos 2 mm,
empacotadas com partículas de dimensões inferiores a 2 µm, e suporta pressões até 15000 PSI. [34]
22
Figura 9 - Representação do cromatógrafo de ultra eficiência (UPLC) acoplado a um espetrómetro de massa (idêntico ao instalado no LAIST).
Numa visão geral, este equipamento segue a configuração de um HPLC (figura 8). É possível
observar na figura 9 uma representação do equipamento utilizado, um cromatógrafo de ultra eficiência
acoplado a um espetrómetro de massa. À esquerda observam-se os 3 módulos que constituem o
UPLC: um onde se encontra o sistema de bombagem dos eluentes, outro com o sistema de injeção
(neste caso automático) e, por fim, um no qual se encontram as colunas cromatográficas. Por sua vez,
à direita localiza-se o espetrómetro de massa, sobre o qual o próximo subcapítulo irá incidir.
4.4. Espetrometria de Massa
Como já foi referido, neste trabalho recorreu-se à cromatografia líquida de ultra eficiência
acoplada a um detetor de espetrometria de massa. Esta combinação tem como objetivo conseguir
identificar, da forma mais inequívoca possível, o composto em estudo e proceder à sua quantificação.
A espetrometria de massa fornece ainda informações úteis sobre a estrutura do composto e a sua
massa molecular. Trata-se de uma técnica bastante sensível, que consegue identificar quantidades
diminutas de analito com elevada exatidão e precisão. [24]
É possível afirmar que, um espetrómetro de massa é constituído essencialmente por quatro
partes: um sistema de introdução de amostra, fonte de ionização, analisador de massas e detetor. De
notar que, embora os analisadores e detetores estejam sempre sob vácuo (10-3 a 10-10 mbar), algumas
fontes de ionização trabalham à pressão atmosférica, como a que se observa na figura 10. [35]
23
Figura 10 - Componentes básicos de um espectrómetro do tipo ESI – fonte de ionização à pressão atmosférica. Adaptado de [36].
De forma simplificada, os componentes de uma amostra, previamente convertidos numa
mistura gasosa de iões, são obrigados a moverem-se rapidamente sob a ação de um campo
eletromagnético, sendo separados de acordo com as suas razões massa/carga (m/z). Obtém-se,
assim, um espetro de massa com abcissa igual à razão massa sobre o número de cargas do ião (m/z)
e ordenada abundância relativa. [37]
Na análise de compostos moleculares, os espetros dependem dos grupos funcionais, do
método de ionização e do tipo de analisador. No caso do presente trabalho, utilizou-se como fonte de
iões o mecanismo de ionização por electrospray (ESI) e um analisador do tipo triplo quadrupolo.
4.4.1. Fonte de ionização - Electrospray
A fonte de ionização é o constituinte do equipamento responsável por converter os analitos de
interesse em iões na fase gasosa.
Existem diversas fontes de ionização, sendo que neste trabalho, como já foi referido, recorre-
se à ionização à pressão atmosférica (API), em particular ao electrospray. Este consiste na formação
de pequenas gotas de solvente, que contém o analito em estudo, devido à passagem do eluente por
um capilar muito fino, o qual apresenta uma superfície metálica afetada de um potencial positivo (no
caso de se tratar de ionização positiva). O líquido emerge do capilar à pressão atmosférica e na forma
de um aerossol, sendo que, o campo elétrico aplicado ao capilar confere às gotas uma determinada
densidade de carga (m/z). O solvente é, então, removido com base em mecanismos complexos: por
aquecimento ou através da energia de colisão com um gás inerte (vulgarmente azoto). Ao evaporarem,
as gotas aumentam a sua densidade de carga na sua superfície o que desencadeia uma serie de
explosões (coulombic explosions) que levam à libertação de iões não fragmentados, protonados ou
catiónicos, multiplamente carregados. Trata-se de um método de ionização suave, na medida em que
ocorre muito pouca fragmentação, permitindo que as interações não covalentes entre moléculas, que
existiam em solução, prevaleçam na fase gasosa. [38]
Na figura 11 tem-se uma representação da sonda, do capilar e do cone.
24
Figura 11 - Desenho simplificado de uma sonda para Electrospray. Adaptado de [39].
4.4.2. Analisadores de massas - Quadrupolo
Este constituinte é responsável por separar os iões de acordo com a sua razão m/z. Existem
diversos tipos de analisadores, sendo que, a sua escolha depende da resolução, gama de massas e
limites de deteção que se pretenda. Atualmente, o mais utilizado é o quadrupolo, representado na figura
12, devido essencialmente à sua simplicidade, facilidade de utilização, bom rigor nos valores de massa
medidos e preço relativamente baixo. [39] Este analisador consiste em quatro barras paralelas às quais
são aplicadas dois tipos diferentes de voltagens, de modo a ser possível efetuar uma transmissão
seletiva de iões de acordo com a razão massa/carga. [24]
Figura 12 - Representação esquemática de um quadrupolo [24].
Para o presente trabalho, recorreu-se à espetrometria de massa em tandem, o qual apresenta
mais de uma etapa de espetrometria de massa e faz uso de um analisador de massas que, embora
seja designado por triplo quadrupolo, consiste em apenas dois quadrupolos separados por uma câmara
de colisão (hexapolo). No primeiro quadrupolo dá-se a seleção do iao percursor, de acordo com a razão
m/z, sendo que, estes iões seguem para a célula de colisão, na qual se dá a fragmentação dos mesmos
25
dando origem a iões produto. Por fim, estes iões passam para o segundo quadrupolo, no qual ocorre
novamente uma separação com base na razão m/z, realizando-se ainda um varrimento de massas que
permite construir um espectro de massas. Na figura 13, é possível observar um esquema desta
técnica. [33] [35]
Figura 13 - Esquema de um equipamento do tipo triplo quadrupolo. Adaptado de [35].
Com base nas transições dos iões percursor e produto (MRM1 e MRM2) é possível,
respetivamente, quantificar e confirmar a presença do composto em estudo. Assim, a razão
MRM1/MRM2 trata-se de uma importante ferramenta, na medida em que permite confirmar a
identificação do composto. Esta pode ser calculada com base na área ou na altura do pico resultante
de cada uma das transições.
4.4.3. Detetores
O detetor é responsável por detetar e amplificar o sinal elétrico do feixe de eletrões proveniente
do analisador de massas e transferir este sinal para o sistema de dados, de modo a este ser
posteriormente processado. O sistema de deteção mais utilizado consiste na conversão dos iões em
eletrões através de um dínodo de conversão. Estes eletrões são depois direcionados para o
multiplicador de eletrões, onde se geram muitos outros eletrões, aumentando o sinal
exponencialmente. [35] [40]
4.4.4. Acoplamento UPLC-MS/MS
Com este acoplamento é possível tirar partido dos benefícios da cromatografia líquida de ultra
eficiência e da espectrometria de massa em tandem, sendo a primeira utilizada essencialmente como
técnica de separação e a segunda de identificação. O UPLC-MS/MS permite, assim, detetar e
caracterizar os mais diversos compostos presentes nas mais variadas e complexas amostras, fazendo-
o num curto período de tempo e com elevada seletividade e sensibilidade. [40] [41]
4.4.5. Supressão e Enriquecimento Iónico
Uma das grandes limitações das análises realizadas recorrendo à combinação da
cromatografia líquida e espectrometria de massa, está relacionada com os efeitos de matriz. Diversos
autores descreveram que a presença de compostos, que foram extraídos em simultâneo com o analito
26
em estudo, pode afetar a quantificação destes últimos especialmente quando a amostra é submetida a
técnicas de cromatografia líquida acoplada à espetrometria de massa (LC-MS) com fonte de ionização
ESI. [41]
Este efeito pode afetar significativamente a ionização do analito em estudo podendo conduzir
a valores por excesso (enriquecimento iónico) ou defeito (supressão iónica) da concentração do
mesmo. Trata-se, assim, de um problema que altera de forma severa a reprodutibilidade, linearidade e
exatidão do método.
Atualmente, ainda não existe uma completa compreensão do mecanismo responsável pelos
efeitos de matriz. Atendendo a este facto, considera-se que uma explicação plausível para a supressão
iónica está relacionada com a competitividade do processo de ionização, isto é, os compostos co-
extraídos com o analito em estudo influenciam a intensidade do sinal, dado competirem com este pelas
cargas disponíveis e pelo acesso à superfície das gotículas de aerossol. Por sua vez, é possível
justificar o enriquecimento iónico com base na existência de interferentes que, formam iões
fragmentados com uma razão m/z muito semelhante às do analito em estudo, o que leva a um aumento
do sinal devido à sobreposição dos picos (do analito e dos interferentes).
Estes efeitos são difíceis de lidar, na medida em que podem advir de diversas fontes,
nomeadamente, da própria amostra, da sua preparação, da fase móvel ou até mesmo das condições
cromatográficas e dos parâmetros do espectrómetro. [35]
Face ao exposto, é de salientar que não existe uma solução universal para este tipo de
problema, podendo, no entanto, serem adotadas diversas estratégias com o intuito de minimizar a
influência destes interferentes nos resultados finais.
Assim sendo, pode recorrer-se a um passo de limpeza exaustivo que anteceda a análise no
equipamento ou, ainda, usar como padrão interno isótopos do composto em estudo. A primeira
alternativa permite reduzir a introdução destes interferentes no sistema de análise, mas trata-se de uma
opção morosa e que pode levar a perdas de analito. Por outro lado, o uso de isótopos do composto
como padrão interno possibilita a existência de um termo de comparação, uma vez que, caso se
verifique efeitos de matriz, estes irão sofrer supressão ou enriquecimento iónico na mesma extensão
que o analito em estudo. Contudo estes tipos de padrões são caros e nem sempre existem no mercado.
27
5. Validação
Atualmente existe a necessidade por parte dos laboratórios de análises químicas de assegurar
a qualidade dos resultados obtidos.
O objetivo da validação de um método analítico passa, assim, por demonstrar que este é
adequado para a determinação do analito na respetiva matriz, fazendo-o de forma exata, precisa e
garantindo um elevado grau de fiabilidade nos resultados obtidos. [42] [43]
Como referido anteriormente, o Laboratório de Análises encontra-se acreditado segundo a
norma NP EN ISO/IEC 17025:2005, de acordo com a qual se define que, para que uma dada
metodologia analítica esteja validada é preciso:
definir a sua gama de trabalho;
verificar a linearidade das curvas de calibração;
determinar os seus limiares analíticos;
avaliar a precisão e exatidão;
estudar a robustez e sensibilidade;
estimar as incertezas associadas aos seus resultados.
Todos estes critérios de validação encontram-se explicados em detalhe no Anexo B.
28
29
6. Parte Experimental
O trabalho experimental que permitiu a realização desta dissertação apresenta-se descrito
neste ponto. Tem-se, assim, em detalhe todo o material utilizado, as condições experimentais e as
metodologias testadas.
6.1. Equipamento
Cromatógrafo Líquido de Ultra Eficiência – Modelo Acquity;
o Coluna Waters ACQUITY UPLC BEH C18, 2,1×75 mm de 1,7 µm (partículas
número 186005604).
Espetrómetro de Massa – Modelo Xevo TQD, API (ESI);
o Fonte de Ionização do tipo Electrospray;
o Analisador do tipo triplo quadrupolo.
Software MassLynx V4.1;
Balança analítica, Mettler Toledo;
Sistema de obtenção de água ultra pura (Milli-Q);
Banho Ultrassónico, Elma® modelo Transsonic TI-H-5;
Sonda Ultrassónica, Branson modelo Sonifier 150;
Centrífuga, Eppendorf MiniSpin Plus;
Vortéx, Heidolph REAX Top;
Sistema de extração por SPE;
Bomba de vácuo, Buchi.
6.2. Material
Seringa de vidro de 1000, 500, 100, 50 e 25 µL;
Balões volumétricos de 5, 10, 20, 200 e 250 mL;
Vials de 2 mL de vidro com tampa pré-furada para injeção automática;
Micropipetas de 100 – 1000 µL, 10 – 100 µL e de 50 – 200 µL;
Vials de 20 e 40 mL para extração;
Funis de vidro;
Microprovetas de 2 mL, designadas por micro;
Concentrador de Azoto;
Discos de extração Empore™ Styrene Divinyl Benzene (SDB-XC) 47mm, marca 3M;
Filtros de papel Filter-Lab® (δ = 125 mm);
Filtro de seringa MS® PTFE, 0,22 µm de porosidade;
Material corrente de laboratório.
6.3. Reagentes e Padrões
Água ultra pura – Milli Q;
Acetonitrilo (para HPLC-GOLD-Ultragradient);
Metanol (para HPLC-GOLD-Ultragradient);
30
Metanol p.a.;
Tiossulfato de sódio;
Acetato de amónio;
Ampola de solução padrão certificado de PFOS em MeOH de concentração 100 mg/L
da marca Sigma Aldrich®.
6.4. Colheita e Preservação de Amostras
Técnica apta para analisar amostras de matriz água e biota.
- Água
As amostras de água (superficial, subterrânea e de consumo) foram colhidas em frascos de
alumínio. A sua conservação foi feita a 5 ± 3 °C, tendo sido extraídas num prazo máximo de 7 dias.
Quando a análise da amostra no equipamento não pôde ser imediata, o extrato foi guardado a 5 ± 3 °C
até um período máximo de 14 dias após extração.
- Biota
Por sua vez, o biota foi previamente capturado, com recurso à pesca elétrica, em diversas
zonas do país. Os peixes capturados nos rios Cávado, Douro, Mondego, Tejo e Sado pertencem à
espécie barbus bocagei, sendo que, no rio Guadiana, os exemplares são barbus microacephalus. Na
tabela 3 encontram-se especificados o número de indivíduos capturados e os respetivos locais de
recolha, de notar que estes apresentavam idades compreendidas entre os 3 e 5 anos.
Tabela 3 - Locais de recolha de peixes.
Local de Recolha Nº de Indivíduos
Rio Vez – Ponte Nova, Lima 3
Rio Cávado – Areias de Vilar 3
Rio Douro – Lever 7
Rio Mondego – Ponte de Formoselha 7
Rio Tejo – Ponte Velha, Santarém 1
Rio Sado – Ermidas do Sado 7
Rio Guadiana – Monte da Vinha 3
As amostras de peixe, antes de trituradas, foram liofilizadas por inteiro, tendo a sua humidade
sido contabilizada. Na tabela 37 do Anexo C observa-se a correspondência entre o número da amostra,
o local de recolha, os valores obtidos para o parâmetro da humidade (%H2O) e a massa da amostra
depois de seca.
Após a chegada ao LAIST, e até à sua análise, o biota foi preservado num local seco, sem
exposição solar, durante um período máximo de 6 meses sendo, depois de extraído, conservado a
5 ± 3 °C e igualmente analisado num prazo máximo de 14 dias.
31
6.5. Interferências e Contaminações
Devem ser tidas em consideração todas as preocupações relacionadas com os solventes,
reagentes e interferentes de matriz. Deve dar-se especial atenção ao uso de material de vidro devido
à possível adsorção do PFOS a este. É ainda de evitar todo o tipo de material de plástico que contenha
na sua constituição fluoropolímeros, incluindo politetrafluoroetileno (PTFE). Por último, devem realizar-
se brancos, frequentemente, de modo a testar possíveis contaminações.
6.6. Descontaminação de Material
A descontaminação do material utilizado neste trabalho experimental foi realizada de acordo
com o procedimento interno do LAIST.
6.7. Segurança
Foram respeitadas as regras de segurança pelas quais o LAIST se rege, que passou pela
proteção do técnico de laboratório (através do uso de bata, luvas e óculos) e tendo o cuidado de,
sempre que necessário, manusear os reagentes em locais ventilados apropriados (hottes).
6.8. Condições Operatórias
Para o presente trabalho utilizou-se as condições operatórias vigentes no LAIST para a
determinação de PFOS em matrizes de águas superficiais e subterrâneas. Na tabela 4 estão
discriminadas as condições operatórias do UPLC, na tabela 5 apresentam-se os parâmetros e
condições operatórias do espetrómetro de massa e, por fim, na tabela 6 encontram-se as condições de
otimização do MS.
Tabela 4 - Condições operatórias do UPLC para a análise do PFOS.
Coluna Cromatográfica Waters ACQUITY UPLC BEH C18, 2.1x75 mm de
1,7 µm (part number 186005604)
Temperatura da Coluna (℃) 50
Volume de Injeção (µL) 10
Caudal da Fase Móvel (mL/min) 0,4
Fase Móvel A - 2 mM acetato de amónio 95% água e 5%
metanol; B - 2 mM acetato de amónio em metanol
Gradiente
Tempo (min) % A % B
0 75 25
0,5 75 25
5 15 85
5,1 0 100
6,5 0 100
8,5 75 25
32
Tabela 5 – Parâmetros e condições operatórias do espectrómetro de massa.
Gás de dessolvatação Azoto
Gás de colisão Árgon
Modo de ionização ESI negativo
Voltagem Capilar (kV) 0,44
Radiofrequência (V) 2,5
Extrator (V) 3
Temperatura da fonte (℃) 150
Temperatura de dessolvatação (℃) 600
Fluxo de gás de cone (L/h) 10
Fluxo de gás de dessolvatação (L/h) 900
Tabela 6 - Condições de otimização do MS.
MRM Janela de Tempo (min)
0-10
Modo de Ionização ESI -
Ião Precursor (Da) 499
Voltagem de Cone (V) 60
Ião Produto Quantificação - MRM1 (Da)
99
Energia de Colisão (eV) 38
Ião Produto Qualificação - MRM2 (Da)
80
Energia de Colisão (eV) 39
De frisar que estas condições operatórias foram aplicadas à leitura das amostras de água e de
biota.
6.9. Fase Móvel
Para este procedimento experimental utilizou-se duas fases móveis: a fase móvel A que
consiste numa solução de 2 mM de acetato de amónio numa proporção água/metanol de 95:5 e uma
fase móvel B de uma solução, também de 2 mM de acetato de amónio, mas apenas em metanol
(MeOH). Após a sua preparação, as soluções foram colocadas durante três minutos no banho de
ultrassons de forma a sofrerem desgaseificação.
6.10. Preparação de Soluções Padrão
A partir da solução padrão certificada de PFOS, de concentração 100 mg/L, preparou-se uma
diluição em metanol de modo a obter uma solução intermédia com concentração igual a 0,25 mg/L -
intermédia 1. Tanto a solução mãe como esta intermédia foram conservadas no congelador a - 18°C.
Para cada sessão de trabalho utilizou-se a intermédia 1 para preparar uma outra em água, intermédia 2,
com uma concentração de 50 µg/L.
33
Recorrendo à intermédia 2, prepararam-se as soluções padrão a usar na calibração com
concentrações na ordem da gama de trabalho. Estas foram preparadas usando como solvente uma
mistura metanol/água na proporção 75:25. Na tabela 7 encontram-se em detalhe os volumes a retirar
da solução intermédia 2 de forma a obter as concentrações desejadas para estas soluções padrão.
Tabela 7 – Detalhes para a preparação das soluções padrão para a calibração.
Sol. Padrão de Calibração 1 2 3 4 5 6 7 8
Vol. a retirar de Int. 2 (µL) 10 15 20 45 80 100 200 400
Volume final (mL) 10 10 10 10 10 10 10 10
Concentração final (µg/L) 0,05 0,075 0,1 0,225 0,4 0,5 1 2
Os padrões assim preparados foram analisados no UPLC-MS/MS. A curva de calibração foi
então traçada, através da representação da área de cada padrão em função da concentração do padrão
injetado utilizando, para tal, o método dos mínimos quadrados.
6.11. Metodologia
- Água
No que respeita à matriz água, o LAIST já tinha implementado uma metodologia para as
amostras de águas superficiais e subterrâneas. Assim sendo, este trabalho focou-se em alargar a sua
aplicação a águas para consumo.
Para a preparação deste tipo de amostras recorreu-se à extração em fase sólida, utilizando
para tal os discos de extração e fazendo uso de uma bomba de vácuo. Esta extração consistiu nos
seguintes passos:
Condicionamento do disco, utilizando primeiro 5 mL metanol e, de seguida, 10 mL de água
Milli-Q;
Extração de um volume de 200 mL de amostra (sem necessidade de ajustar o seu pH).
Depois da passagem da amostra deixou-se o disco secar durante aproximadamente
20 minutos;
Eluição realizada em três vezes recorrendo, respetivamente, a 2, 3 e 2 mL de MeOH.
Na figura 14, é possível observar a montagem deste tipo de procedimento.
Figura 14 – Montagem da extração em fase sólida (SPE).
34
O extrato foi então recolhido num vial e concentrado, sob corrente de azoto, até um volume de
aproximadamente 1 mL, sendo de seguida transferido para uma micro. Este volume foi novamente
reduzido, sob corrente de azoto, para 0,3 mL (de MeOH), tendo depois sido adicionado 0,9 mL de água
ultra-pura, perfazendo um volume total de 1,2 mL. A amostra foi então analisada recorrendo ao UPLC-
MS/MS.
- Biota
Para o biota, foram testadas diferentes extrações com base na literatura revista e consoante
os equipamentos, materiais e reagentes disponíveis no laboratório. De um modo genérico, o
procedimento adotado encontra-se esquematizado na figura 15.
Figura 15 – Esquema que resume a metodologia analítica para a deteção de PFOS na matriz biota.
Durante a implementação da metodologia de extração foram testadas variações de diversos
parâmetros, tais como:
Solvente de extração: Foram testados os solventes a utilizar, nomeadamente o metanol
(MeOH), o acetonitrilo (ACN) e misturas de água/acetonitrilo (H2O/ACN) que variaram na
proporção (95% H2O + 5% ACN, 50% H2O + 50% ACN ou 20% H2O + 80% ACN);
Volumes de solvente: Utilizaram-se volumes de 8, 10, 15 e 20 mL;
Condições do banho ultrassons: Variou-se o tempo de extração (30 e 60 min), a frequência
(25 KHz e a 50 KHz) e a intensidade (25%, 40%, 50% e 90%), mantendo o equipamento
sempre no modo de operação normal;
Solvente para injeção no UPLC-MS/MS: Foram realizados testes utilizando diferentes
solventes finais, para injeção do extrato no UPLC;
Pesar cerca de 1g de amostra (biota) num vial
de 40 mL
Adicionar solvente
Colocar em banho de Ultrassons
Filtrar o extrato obtido
Concentrar o extrato
Injectar o extrato no UPLC-MS/MS
35
Re-extração da amostra: Após uma primeira extração da amostra, esta foi filtrada. De
seguida retirou-se o sobrenadante para um outro vial e a parte sólida foi novamente
extraída, como se se tratasse de uma nova amostra. Este passo teve como objetivo verificar
a eficiência da extração.
No procedimento inicial, o extrato era concentrado a 1,2 mL, tal como descrito para a matriz
água, contudo verificou-se que as concentrações nas amostras de biota eram elevadas, o que permitiu
que o extrato fosse concentrado a volumes superiores.
Foram ainda realizados alguns testes complementares, um no qual se substituiu o banho de
ultrassons por uma sonda e outro em que se levou a amostra ao vórtex. Para o primeiro a sonda foi
utilizada durante 3 minutos no modo impulso. Por sua vez, o segundo consistiu em levar a amostra ao
vórtex, durante 1 minuto, seguido de 10 minutos no ultrassons. Este procedimento foi repetido por mais
duas vezes seguindo-se os passos de filtração e concentração da amostra para leitura no UPLC-
MS/MS.
De um modo geral, é possível distinguir dois tipos de metodologias de extração testadas.
Metodologia A
Pesou-se cerca de 1 g de amostra num vial de 40 mL, adicionou-se um determinado volume
de solvente e extraiu-se recorrendo ao ultrassons. Terminado o processo, a amostra foi filtrada
com papel de filtro e o sobrenadante recolhido noutro vial de 40 mL. Este sobrenadante foi
evaporado sob corrente de azoto e retomado, numa fase inicial, para uma micro, tendo depois
sido utilizados balões de 5 mL (sempre numa proporção de 25% solvente e 75% de água). Por
último, dado o aspeto do extrato (aspeto “leitoso”), estes foram filtrados, recorrendo a filtros de
seringa com uma porosidade de 0,22 µm, para os vials utilizados no UPLC.
Metodologia B
Pesou-se igualmente cerca de 1 g de amostra para um vial de 40 mL, adicionou-se 15 mL
de uma solução água/acetonitrilo e extraiu-se a amostra recorrendo ao ultrassons. A amostra
foi, depois filtrada com papel de filtro e retomada para um balão de 20 mL, tendo o volume sido
perfeito com a mesma solução água/acetonitrilo usada na extração. Não foi necessário
concentrar a amostra, pelo que, recorrendo a uma seringa e ao filtro de 0,22 µm, se retirou uma
toma para um vial de 2 mL e procedeu-se à injeção no UPLC.
6.12. NMR
No seguimento do presente trabalho experimental surgiu a oportunidade de testar a deteção
de PFOS no biota através da técnica de NMR. Para a realização destes testes foi necessária a
colaboração do Centro de Química Estrutural (CQE). Recorreu-se, assim, às instalações designadas
IST-UL NMR Facility, e em particular ao equipamento de NMR de líquidos.
36
Foram então testadas duas amostras de biota:
Amostra 18417: esta amostra foi extraída recorrendo ao banho de ultrassons (durante
30 minutos, a uma frequência de 25 kHz, 50% de intensidade e no modo de operação
normal), filtrada e concentrada a 1 mL de ACN. No fim, retirou-se uma toma de cerca de
500 µL de concentrado que seguiu para análise;
Amostra 1590: foi enviado para o laboratório de NMR cerca de 1 g de amostra de biota
liofilizada, com o objetivo dessa massa ser utilizada em vários testes, adicionando, para
tal, a uma determinada quantidade de biota, um certo volume de solvente deuterado,
sendo depois essa mistura (“papa”) analisada no equipamento.
37
7. Apresentação e Discussão de Resultados
Com base na descrição feita no capítulo anterior, segue-se a apresentação e discussão dos
resultados obtidos na realização deste trabalho.
7.1. Metodologias Testadas
O grande desafio deste procedimento experimental residiu na escolha do método de extração
adequado à matriz biota, uma vez que, como já foi referido, para as águas existia no laboratório uma
metodologia aplicada a amostras de águas superficiais e subterrâneas.
Tendo em consideração estas diferenças, dividiu-se a análise das metodologias testadas de
acordo com a matriz em estudo.
7.1.1. Águas
Recorrendo ao procedimento adotado pelo laboratório para águas superficiais e subterrâneas,
testou-se a sua aplicação a águas para consumo.
Na tabela 8 encontram-se os ensaios realizados para este tipo de amostras.
Tabela 8 – Resultados obtidos para os ensaios realizados a águas para consumo.
Amostra Conc.
(µg/L)
Rec.
(%)
Água da torneira 1 0,00011 -
Água da torneira 1 fortificada a 0,05 µg/L 0,00029 97
Água da torneira 1 fortificada a 0,05 µg/L 0,00035 116
Água da torneira 1 fortificada a 0,05 µg/L 0,00032 106
Água da torneira 1 fortificada a 1 µg/L 0,00401 67
Água da torneira 2 0,00008 -
Água da torneira 2 fortificada a 0,05 µg/L 0,00022 74
Para esta matriz foi possível atingir em média recuperações de cerca de 92%, apresentando
um desvio padrão relativo (%RSD) de 23%.
Durante a realização do presente trabalho experimental houve a possibilidade de participar num
ensaio interlaboratorial (EIL) organizado pela LGC Standards.
O EIL consistiu numa amostra de água natural que apresentava uma concentração alvo de
PFOS igual a 2,93 µg/L. Aplicando a metodologia para as águas chegou-se a um resultado de 1,88 µg/L
de PFOS, obtendo-se um z-score de -2,73 que permitiu classificar o desempenho do laboratório como
sendo questionável. Este ensaio foi uma importante ferramenta para a validação do método, pelo que
no ponto 7.2.5 será novamente abordado.
38
7.1.2. Biota
Conforme explicado no ponto 6.11, para esta matriz foram testadas diferentes extrações, sendo
possível agrupar os testes realizados em duas metodologias distintas – metodologia A e B.
- Metodologia A
De forma a testar a metodologia A, inicialmente recorreu-se a um material de referência
certificado (MRC) cuja matriz se tratava de um sedimento. Esta opção deveu-se ao facto do MRC
existente no laboratório para a matriz biota ser insuficiente face ao número de testes que era necessário
realizar. Como tal, tomou-se a decisão de só utilizar este último numa fase mais avançada do estudo
quando a metodologia já tivesse testes com resultados reprodutíveis que a suportassem.
Determinação das condições de extração iniciais
Numa fase inicial utilizou-se o MRC de sedimento e realizaram-se 2 testes distintos de modo a
estudar qual o solvente adequado à extração do composto alvo em estudo. Seguiu-se, assim, a
metodologia A e concentrou-se as amostras a 1,2 mL, não tendo sido necessário recorrer ao filtro de
seringa dado o aspeto límpido do concentrado. Na tabela 9 encontram-se sintetizados os resultados
obtidos para estes testes iniciais.
Tabela 9 - Resultados obtidos para os testes iniciais (A0.1 e A0.2), nos quais se recorreu ao MRC de sedimento e se variou apenas o solvente de extração utilizado.
Teste Solvente de
Extração Condições Ultrassons
Conc.
(µg/kg) %Rec.
A0.1 10 mL MeOH 30 min, 25 kHz, 50%
0,3 50
A0.2 10 mL ACN 0,4 67
Legenda: A0.x ≡ A – metodologia; 0.x - número do teste.
Tendo em conta que o MRC de sedimento apresentava uma concentração de 0,60 µg/kg,
chegou-se a um resultado mais próximo deste valor utilizando como solvente de extração, o ACN, pelo
que, numa primeira fase, foi este o solvente escolhido.
Seguiram-se testes, utilizando novamente o MRC de sedimento, com o objetivo de determinar
as condições de extração, nomeadamente o volume de solvente e os parâmetros do banho de
ultrassons. De notar que para estes testes também ainda não se tinha verificado a necessidade do uso
de filtros de seringa. É possível observar os resultados obtidos para este estudo na tabela 10.
39
Tabela 10 - Testes realizados com o objetivo de determinar as condições de extração. Os testes seguiram a metodologia A, sendo que nas observações se encontram descritas algumas particularidades dos mesmos.
Todos foram concentrados a 1,2 mL.
Teste Solvente Condições
do Ultrassons
Conc. (µg/kg)
%Rec Observações
A1 10 + 10 mL ACN
30 min; 25 kHz; 50%
0,36 61
- 30 min no US com 10 mL de ACN. Como não foi possível proceder à decantação adicionou-se mais 10 mL de ACN no mesmo vial e levou-se novamente ao US;
A2
20 mL ACN
30 min; 25 kHz; 50%
0,36 60 -
A3 30 min;
25 kHz; 50% 0,35 59
- Antes de concentrar adicionou-se 20 mL de água Milli-Q e procedeu-se a SPE.
A4 30 min;
25 kHz; 90% 0,26 44 -
A6
15 mL ACN
30 min; 25 kHz; 40%
0,28 46 -
A7 60 min;
25 kHz; 25% 0,32 54 -
A8 30 min;
45 kHz; 25% 0,33 55 -
Legenda: Ax ≡ A – metodologia; x - número do teste.
Os valores obtidos para a recuperação dos ensaios encontram-se todos dentro de um intervalo
de 44 a 61%. Verificou-se ainda que, para o caso do MRC de sedimento, adicionar passos como extrair
por duas vezes (teste A1), ou um passo de limpeza, como SPE (teste A3), não influencia
significativamente o resultado final.
Dada a concordância entre os resultados obtidos, considerou-se que as condições de extração,
que se apresentam de seguida, na tabela 11, permitem obter recuperações reprodutíveis do analito em
estudo, implicando um menor tempo despendido e um diminuto gasto de solvente.
Tabela 11 – Condições de extração (nomeadamente, o solvente escolhido, o volume utilizado e as condições banho de ultrassons) definidas para a Metodologia A.
Solvente ACN
Volume de solvente (mL) 15
Condições do US 30 min; 25 kHz; 50%
Aplicação da metodologia à matriz biota
Devido às condições de extração terem sido determinadas para uma matriz de sedimento,
testaram-se estes parâmetros utilizando amostras de biota e, deste modo, averiguou-se as possíveis
diferenças entre estes dois tipos de matrizes.
Assim sendo, procedeu-se à preparação de um ensaio (teste A9) e uma recuperação
(teste A10), concentrando as amostras a 1,2 mL. Os resultados obtidos apresentam-se na tabela 12.
De salientar que, dado as amostras de biota terem sido liofilizadas, os valores de concentração final
apresentados ao longo deste subcapítulo correspondem a µg/kg de massa seca.
40
Tabela 12 – Resultados obtidos para os primeiros testes realizados a amostras de biota, de acordo com a metodologia A.
Teste Amostra Solvente de
Extração
Condições do
Ultrassons
Conc. final
(µg/kg) %Rec
A9 1584
15 mL ACN 30 min; 25kHz;
50%
3,03 -
A10 1584 fortificada
(0,225 µg/L) 3,64 147
Legenda:Ax ≡ A – metodologia; x - número do teste.
No final da preparação destes testes, ao adicionar a água, a gordura existente na amostra
precipitou pelo que se injetou o sobrenadante. Em paralelo, prepararam-se outros dois testes, A11 e
A12 (sendo um deles um ensaio de recuperação), com a variante de, após concentrar sob corrente de
azoto, terem sido adicionados a cada 20 mL de água Milli-Q e procedido a um passo de SPE. No
entanto, não foi possível injetar estes testes devido às amostras se apresentarem muito sujas.
Uma vez que, os valores obtidos para a concentração de PFOS na amostra de biota nos
testes A9 e A10 estavam muito próximos do máximo da curva de calibração, optou-se por concentrar
as amostras em balões de 5 mL. Tendo esta alteração em conta, prepararam-se novos testes, entre
eles réplicas e ensaios de recuperação e, realizou-se ainda um outro teste recorrendo ao MRC de
sedimento (teste A24).
Quanto às diferenças entre a matriz biota e sedimento estas observaram-se logo após o passo
de extração no ultrassons, dado existir uma separação muito mais nítida entre a amostra de biota sólida
e o sobrenadante, o que não se verificava para o sedimento. Tal é possível comprovar na figura 16.
Figura 16 – Exemplo de testes realizados recorrendo a amostras de matriz biota (5 primeiros vials à esquerda) e ao MRC de sedimento (1º vial à direita).
Outro detalhe a salientar é que as amostras de biota, após concentradas, apresentavam um
aspeto “leitoso”, conforme se observa na figura 17. Como tal, foi necessário recorrer ao filtro de seringa
de forma a preservar o bom funcionamento do UPLC. Para confirmar que o uso deste filtro de seringa
não iria afetar os resultados das amostras, filtraram-se ensaios em branco e padrões ao nível do limite
de quantificação (LQ) e máximo da curva, tendo-se verificado que o mesmo não constituía uma fonte
de interferências.
41
Figura 17 – Exemplo de duas amostras de biota após estas sofrerem o passo de concentração.
Foram também testados diferentes passos de limpeza na tentativa de diminuir a gordura
existente no concentrado final. Estes testes passaram pela adição de florisil (teste A13 e A14), de
carvão ativado (A20 + carvão ativado) e de um passo de congelamento (A15 e A16). Da análise da
tabela 13, verificou-se que o único ensaio de recuperação razoavelmente bem sucedido corresponde
ao teste A18, que apresentou uma percentagem de recuperação de 138%. No final, concluiu-se que o
procedimento mais simples, a metodologia A sem adição de passo de limpeza (testes A17 e A18),
levava à obtenção de melhores resultados.
Tabela 13 – Resultados obtidos para os testes referentes ao estudo de diferentes passos de limpeza no âmbito
da metodologia A.
Teste Amostra Conc. (µg/L)
A13 18417 4,93
A14 18417 fortificada
(0,5 µg/L) 4,82
A15 18417 4,14
A16 18417 fortificada
(0,5 µg/L) 3,28
A17 18417 6,73
A18 18417 fortificada
(0,5 µg/L) 10,17
A20 18417 6,43
A20 +
Carvão ativado 18417 3,14
Legenda: Ax ≡ A – metodologia; x - número do teste.
Como já foi referido no capítulo anterior, também se voltou a testar o MeOH como solvente de
extração para a matriz biota, de modo a verificar se a escolha feita para a matriz sedimento também se
aplicava a esta. Outra abordagem passou por realizar testes nos quais não se mudou o solvente final,
tendo a amostra sido analisada numa proporção 25% ACN e 75% H2O. No fim, verificou-se que a
mudança de solvente de extração ou de solvente final não conduzia a variações significativas nos
resultados finais, pelo que se manteve as condições da metodologia inicial, ou seja, extrair em ACN e
42
concentrar a 25% MeOH e 75% H2O. Os resultados deste estudos encontram-se na tabela 38 do Anexo
D, juntamente com os resultados obtidos para os testes do próximo ponto.
Testes complementares
Dado existir uma sonda de ultrassons no laboratório, realizou-se um teste em que se utilizou
este equipamento, aplicando a metodologia A. A sonda foi usada no modo impulso e durante cerca de
3 minutos. No fim, o resultado obtido foi muito semelhante ao da metodologia inicial e, não existindo
grandes vantagens na utilização da sonda, não se efetuaram modificações à metodologia referida.
Outra tentativa de otimização desta metodologia consistiu em levar a amostra ao vórtex,
durante 1 minuto, seguido de 10 minutos no banho de ultrassons. Estes dois passos foram repetidos
por mais duas vezes, seguindo-se a filtração e a concentração da amostra. Também nestes testes não
se verificaram grandes diferenças nos resultados e, dado esta alternativa exigir uma maior
disponibilidade do técnico do laboratório, resolveu-se permanecer com a metodologia inicial.
Os resultados obtidos para estes testes, conforme mencionado, encontram-se na tabela 38 do
Anexo D.
Ensaios Replicados
Com o objetivo de testar a reprodutibilidade dos resultados, repetiu-se várias preparações de
determinadas amostras (replicados), nomeadamente da 18417 (testes A20, A21 e A22), 1584 (teste
A25 e A26) e 18418 (teste A31 e A32). Na tabela 14 apresentam-se os valores obtidos para estas
réplicas.
Tabela 14 – Resultados obtidos para os ensaios replicados, de acordo com a metodologia A.
Teste Amostra Conc
(µg/kg)
A17
18417
6,73
A20 8,40
A21 6,65
A22 6,53
A25 1584
2,39
A26 2,20
A31 18418
5,96
A32 6,35
A79 1585
3,80
A80 3,54
A85 18407
3,78
A86 4,23
Legenda:Ax ≡ A – metodologia; x - número do teste
43
Figura 18 - Exemplo da heterogeneidade de uma amostra de biota.
Com base nos resultados da tabela 14, calculou-se um desvio padrão relativo para cada
conjunto de ensaios replicados, tendo-se obtido uma média para este valor de cerca de 5%. Devido ao
aspeto heterogéneo das amostras de biota (conforme se observa na figura 18), é possível considerar
que os resultados obtidos para os diferentes ensaios realizados para uma mesma amostra são
concordantes. Esta constatação permite, de certa forma, identificar que se está na presença de um
método preciso
Ensaios de recuperação
No âmbito desta metodologia foram realizados ensaios de recuperação para as amostras de
biota. Na tabela 15 apresentam-se organizados os resultados deste tipo de ensaios.
Tabela 15 - Resultados obtidos para os ensaios de recuperação realizados em amostras de biota segundo a metodologia A.
Teste Amostra Conc. (µg/kg)
Rec (%)
A18 18417 fortificada
(0,5 µg/L) 10,17 138
A23 18417 fortificada
(1,0 µg/L) 13,89 152
A27 1584 fortificada
(1,0 µg/L) 3,45 25
A33 18418 fortificada
(1,0 µg/L) 8,71 43
A55 18416 fortificada
(1,0 µg/L) 5,38 63
A78 1577 fortificada
(1,0 µg/L) 9,36 85
A81 1585 fortificada
(1,0 µg/L) 8,32 89
Legenda: Ax ≡ A – metodologia; x - número do teste.
No geral obtiveram-se recuperações aceitáveis, tendo em conta novamente o aspeto
heterogéneo da amostra. Assim sendo, tem-se um valor médio para este parâmetro de cerca de 85%
(apresentando um desvio padrão de 47).
44
Re-extrações
O estudo das re-extrações, tabela 16, apresenta uma importância extrema para a consolidação
desta metodologia, de forma a comprovar se a primeira extração é eficaz ou se uma concentração
considerável de PFOS não é extraída, ficando retida na amostra sólida.
Tabela 16 - Estudos de re-extração realizados para amostras de biota de acordo com a metodologia A.
Teste Amostra Conc. obtida
na 1ª Extração (µg/kg)
Conc. obtida na re-extração
(µg/kg)
Contribuição para o valor
final (%)
A36 18409 2,74 0,35 11
A73 18403 4,50 0,51 10
A76 1576 14,98 1,35 8
Legenda: Ax ≡ A – metodologia; x - número do teste.
No geral, a re-extração na metodologia A tem pouca influência no resultado final, sendo que a
sua contribuição nunca é superior a 11%.
Estudo de Estabilidade
Foram ainda realizadas segundas leituras, de modo a verificar a estabilidade do PFOS (ou seja,
qual a influência que o fator tempo tem na sua concentração). Como tal, analisou-se os testes A20,
A22 e A23, com cerca de um mês de diferença entre a primeira e a segunda leitura, tendo-se obtido
um decréscimo significativo na concentração de PFOS que rondou os 20%, conforme se observa na
tabela 17.
Tabela 17 - Estudo da influência do fator tempo na concentração de PFOS nas amostras de biota, no âmbito da metodologia A.
Teste Amostra Conc. obtida inicialmente
(µg/kg)
Conc. obtida após 30 dias
(µg/kg)
Perdas (%)
A20 18417 8,40 6,43 23
A22 18417 6,53 5,16 21
A23 18417 fortificada
(1,0 µg/L) 13,89 10,53 24
Legenda: Ax ≡ A – metodologia; x - número do teste.
- Metodologia B
Para a metodologia B testaram-se diferentes proporções da solução água/acetonitrilo, usada
como solvente de extração. Para o caso extremo de 95% H2O e 5% ACN (teste B42), a extração não
foi bem sucedida, quando comparando com o teste B41 em que se tinha uma proporção H2O/ACN de
50:50. Por sua vez, para soluções com um teor de 20% de H2O e 80% de ACN obtiveram-se valores
de concentração semelhantes aos conseguidos para a proporção 50:50, no entanto, estes testes
apresentavam um aspeto menos límpido. Assim sendo, optou-se por realizar a extração com uma
45
solução de teor intermédio (50% água e 50% ACN). Todos os resultados obtidos para estes testes
encontram-se organizados na tabela 18.
Tabela 18 – Ensaios realizados para diferentes proporções da solução água/acetonitrilo no âmbito da metodologia B.
Teste Amostra Solução de extração Conc
(µg/kg) Rec (%)
B41 18409 15 mL
50% H2O + 50% ACN 5,40 -
B42 18409 15 mL
95% H2O + 5% ACN 0,26 -
B64 18403 15 mL
50% H2O + 50% ACN 6,78 -
B66 18403
fortificada (1,0 µg/L)
15 mL 50% H2O + 50% ACN
22,37 80
B70 18403 15 mL
20% H2O + 80% ACN 5,45 -
B71 18403
fortificada (1,0 µg/L)
15 mL 20% H2O + 80% ACN
22,91 89
Legenda: Bx ≡ B – metodologia; x - número do teste.
Ensaios de Recuperação
Foram realizados ensaios de recuperação utilizando para tal amostras de biota. Para esta
metodologia obtiveram-se em média recuperações de 80%, apresentando um desvio padrão igual a
11. Na tabela 19 apresentam-se os resultados obtidos para este tipo de ensaios.
Tabela 19 – Resultados obtidos para ensaios de recuperação realizados para amostras de biota de acordo com a metodologia B.
Teste Amostra Conc
(µg/kg)
Rec
(%)
B50 18406 fortificada (1,0 µg/L) 23,36 79
B56 18416 fortificada (1,0 µg/L) 24,51 93
B66 18403 fortificada (1,0 µg/L) 22,37 80
B84 1585 fortificada (1,0 µg/L) 19,32 66
Legenda: Bx ≡ B – metodologia; x - número do teste.
Re-extrações
As re-extrações, foram igualmente estudadas. Conforme se observa na tabela 20, este passo
apresenta uma contribuição significativa para o valor de concentração final (compreendida entre 16 e
25%) o que põe em causa a eficiência da primeira extração.
46
Tabela 20 – Resultados obtidos para o estudo do passo de re-extração na metodologia B.
Teste Amostra Conc obtida
na 1ª extração (µg/kg)
Conc obtida
na re-extração (µg/kg)
Contribuição
para o valor final (%)
B52 18410 2,46 0,81 25
B64 18403 6,78 1,31 16
B67 1576 16,17 3,96 20
Legenda: Bx ≡ B – metodologia; x - número do teste.
- Comparação entre as Metodologia A e B
Em média, as metodologias A e B apresentaram recuperações para a matriz biota próximas
de, respetivamente, 85 e 80%.
De modo a destacar os diferentes resultados obtidos pelas duas metodologias para uma
mesma amostra, construiu-se a tabela 21.
Tabela 21 – Comparação de resultados obtidos pelas duas metodologias para uma mesma amostra. Dif = diferença percentual dos resultados obtidos calculada com base na metodologia B.
Teste Amostra Solvente de extração
(15 mL)
Conc
(µg/kg)
Dif.
(%)
A76 1576
ACN 14,98 7
B67 50% H2O + 50% ACN 16,17
A77 1577
ACN 5,26 27
B69 50% H2O + 50% ACN 7,16
A79 1585
ACN 3,80 37
B82 50% H2O + 50% ACN 6,19
A73 18403
ACN 4,50 34
B64 50% H2O + 50% ACN 6,78
A46 18404
ACN 5,86 60
B47 50% H2O + 50% ACN 14,53
A48 18406
ACN 3,89 50
B49 50% H2O + 50% ACN 7,78
A51 18410
ACN 0,94 62
B52 50% H2O + 50% ACN 2,46
A53 18416
ACN 2,31 62
B54 50% H2O + 50% ACN 6,08
Para uma completa comparação entre metodologias, realizou-se testes recorrendo a amostras
de MRC de sedimento e biota, conforme se observa na tabela abaixo.
47
Tabela 22 – Comparação entre metodologias recorrendo a amostras de MRC de sedimento e biota.
Teste Amostra Solvente de
extração
Conc
(µg/kg)
Rec
(%)
A2
MRC
(sedimento)
20 mL ACN 0,36 60
A3 20 mL ACN 0,35 59
A24 15 mL ACN 0,38 63
B45 15 mL
50% H2O + 50% ACN 0,51 84
B63 15 mL
50% H2O + 50% ACN 0,41 69
A62 MRC
(biota)
15 mL ACN 9,53 118
B61 15 mL
50% H2O + 50% ACN 16,34 202
De destacar que o valor alvo a atingir para o MRC de sedimento e de biota é de 0,6 µg/kg e
8,1 µg/kg, respetivamente.
Numa primeira análise às tabelas 21 e 22, verifica-se que, regra geral, os resultados obtidos
para a concentração de PFOS pela metodologia B foram superiores aos da metodologia A. Com base
nesta constatação, poder-se-ia concluir que a metodologia B apresenta um maior poder de extração
que a A. No entanto, esta afirmação pode não corresponder a uma verdade absoluta, na medida em
que na metodologia B se identificou a existência de interferentes que aumentavam a área dos picos
obtidos pelo UPLC-MS/MS.
A titulo de exemplo tem-se as figuras 19 e 20, nas quais é possível verificar as diferenças nos
cromatogramas obtidos para a matriz biota, pela metodologia A e B, respetivamente.
As razões de massa obtidas (MRM1/MRM2) também se revelaram uma ferramenta importante
para a reconhecimento da existência destes interferentes que influenciavam os resultados da
metodologia B, na medida em que se revelaram diferentes da esperada de acordo com o Anexo E. A
título de exemplo, no Anexo F é possível observar um espectro de massa obtido para o analito em
estudo.
48
Figura 19 – Cromatograma obtido para a amostra 18403 (matriz biota) recorrendo à metodologia A.
Figura 20 - Cromatograma obtido para a amostra 18403 (matriz biota) recorrendo à metodologia B.
Na sequência desta observação, experimentou-se trabalhar em função de alturas de pico, em
vez de áreas, tendo-se obtido valores de concentração mais baixos e mais próximos dos da
metodologia A. Também recorrendo às alturas de pico foi possível chegar a razões MRM1/MRM2
concordantes com as do composto alvo em estudo. No Anexo G encontra-se um exemplo de uma
sessão de trabalho na qual se procedeu ao tratamento de resultados com base nas áreas e nas alturas
dos picos.
49
Devido aos motivos explicados anteriormente, concluiu-se que a metodologia A é a mais
indicada para a correta extração da matriz biota. Em suma, as condições definidas para esta
metodologia são as seguintes:
Solvente de extração: ACN;
Volume de solvente: 15 mL;
Condições do banho de ultrassons: 30 minutos de extração a uma
frequência de 25 kHz, intensidade igual a 50% e modo de operação normal;
Concentrar a amostra a 5 mL (25% MeOH e 75% H2O);
Sem necessidade de re-extrair a amostra.
7.2. Validação do Método
A validação do método baseou-se nos critérios referidos no capítulo 5 que se encontram
explicados em detalhe no Anexo B.
7.2.1. Gama de Trabalho
Definiu-se como gama de trabalho as concentrações de 0,05 a 2 µg/L, pelo que se procedeu à
sua verificação através dos respetivos estudos de linearidade e dos cálculos de exatidão e precisão
associados ao método.
7.2.2. Calibração Analítica
As curvas de calibração foram traçadas com base na concentração das soluções padrão e na
resposta dada pelo instrumento de medição (área), recorrendo para tal ao método dos mínimos
quadrados.
Para cada sessão de trabalho foi realizada uma calibração. Esta necessidade de calibração
diária deve-se à ausência de reprodutibilidade que se verifica nas variações dos declives das curvas
de calibração (CCs). Na tabela 23 é possível constatar esta diferença.
Tabela 23 - Coeficiente de correlação (r2), declive (a) e ordenada na origem (b) obtida para cada curva de
calibração tendo em conta a gama de trabalho adotada.
Sessão de Trabalho Coef. de
Correlação (r2)
Declive
(a)
Ordenada
na Origem (b)
20/07/2017 0,999 (78 ± 1) × 10 19 ± 8
27/07/2017 0,998 (136 ± 3) × 10 (3 ± 2) × 10
04/08/2017 1,000 1563 ± 3 8 ± 3
22/08/2017 1,000 1595 ± 6 4 ± 5
24/08/2017 1,000 (183 ± 2) × 10 (- 0,8 ± 1,2) × 10
Quanto ao coeficiente de correlação, obteve-se para todas as sessões de trabalho um valor
superior a 0,998.
50
Numa fase inicial da validação do método começou-se por avaliar a linearidade do mesmo,
recorrendo para tal à análise de resíduos, teste de Mandel e teste de Rikilt.
Análise de resíduos
No caso do presente trabalho experimental este tipo de análise acompanhou sempre a curva
de calibração. Verificou-se que os resíduos se distribuíam aleatoriamente em torno da linha de
ordenada zero, nunca atingindo valores, em módulo, superiores a 20%, pelo que se comprovou a
linearidade para o intervalo de concentrações de 0,05 a 2 µg/L. Nas figuras 21 e 22 observam-se as
representações gráficas da curva de calibração (CC) e da correspondente análise dos resíduos, para
uma determinada sessão de trabalho.
Figura 21 - CC obtida na sessão de trabalho de dia 22
de Agosto de 2017, para um intervalo de concentrações de 0,05 a 2 µg/L.
Figura 22 - Representação gráfica da análise de
resíduos efetuada para a mesma sessão de trabalho de dia 22 de Agosto de 2017.
Teste de Mandel
O teste de Mandel, também realizado para um intervalo de concentrações de 0,05 a 2 µg/L,
permitiu obter as funções de calibração linear e não linear que se encontram representadas nas
figuras 23 e 24.
Figura 23 – Representação gráfica da função obtida por ajuste linear para a sessão de trabalho de 20 de
Julho de 2017.
Figura 24 - Representação gráfica da função obtida
por ajuste polinomial para a sessão de trabalho de 20 de Julho de 2017.
y = 1595,1x + 4,2099R² = 0,9999
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 0,5 1 1,5 2
Áre
a
Concentração (µg/L)
Curva de Calibração
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
0 0,5 1 1,5 2
Desvio
(%
)
Concentração (µg/L)
Resíduos
y = 779,86x + 18,911R² = 0,999
0
500
1000
1500
2000
0 0,5 1 1,5 2
Áre
a
Concentração (µg/L)
Ajuste Linear
y = 4,4151x2 + 771,03x + 20,686R² = 0,999
0
500
1000
1500
2000
0 0,5 1 1,5 2
Áre
a
Concentração (µg/L)
Ajuste Polinomial
51
Calculou-se um desvio padrão de 17,6 e 19,2 para o ajuste linear (𝑆𝑦/𝑥) e polinomial (𝑆𝑦2),
respetivamente. Desta forma foi possível determinar uma diferença de variâncias (DS2) de 17,6 e um
valor teste (VT) igual a 0,05. Verificou-se, assim, que este valor teste é inferior ao valor tabelado da
distribuição F de Fisher/Snedecor, para um grau de confiança de 95% (valor esse igual a 6,6), o que
permitiu concluir que se trata de uma função é linear.
Teste de Rikilt
O teste de Rikilt obtido para uma determinada sessão de trabalho encontra-se representado na
figura 25. Como se pode verificar, os valores de desvio obtidos para a razão área/concentração não
são superiores a 10%, o que permite novamente concluir que se está na presença de linearidade.
Figura 25- Representação gráfica do teste de Rikilt realizado para a sessão de trabalho de dia 4 de Agosto de 2017, para um intervalo de concentrações de 0,05 a 2 µg/L.
Na tabela 24 encontram-se agrupados os resultados obtidos para os testes de linearidade
realizados para todas as sessões de trabalho.
Tabela 24 - Resumo dos resultados obtidos para os testes de linearidade para todas as sessões de trabalho.
Análise de Resíduos Teste de Mandel Teste de Rikilt
Critério < 20% VT < F 90 – 110 %
Resultados - 18 a 18% - 4,99 < VT < 4,27
5,99 < F < 7,71 91 - 108 %
Deste modo, verificou-se a linearidade do procedimento no intervalo de concentrações de 0,05
a 2 µg/L.
7.2.3. Limiares Analíticos
Para o presente trabalho determinou-se o LQ e LD com base na curvas de calibração (CCs),
nos padrões de controlo (PCs) e nos ensaios de repetibilidade, recorrendo para tal às equações (8)-(11)
do Anexo B. Os valores obtidos para estes limites encontram-se agrupados na tabela 25.
97
98
99
100
101
102
103
104
105
0 0,5 1 1,5 2
Desvio
(%
)
Concentração (µg/L)
Teste de Rikilt
52
Tabela 25 - Valores obtidos para o LQ e LD com base nas CC, PCs e ensaios repetidos.
LQ
(µg/L) LD
(µg/L)
CCs 0,038 0,011
PCs 0,064 0,019
Repetibilidade 0,052 0,016
O laboratório assumiu como LQ o primeiro ponto da reta (0,05 µg/L) o que permitiu chegar a
um LD de 0,015 µg/L, valores que foram comprovados estatisticamente de acordo com a tabela acima.
7.2.4. Precisão
Para o presente trabalho a precisão foi avaliada em termos de repetibilidade, reprodutibilidade
e precisão intermédia.
A repetibilidade foi estudada para dois pontos distintos da gama de trabalho (0,05 e 2 µg/L,
mínimo e máximo), estando os valores obtidos discriminado na tabela 26.
Tabela 26 – Valores determinados para o estudo da repetibilidade.
Valor esperado (µg/L) 0,05 2,00
Média de Conc. Ensaios para n=6 (µg/L) 0,053 1,898
Desvio Padrão dos Ensaios 0,005 0,015
Repetibilidade (r) 0,014 0,042
Coef. de Variância (CVr) 9,70% 0,80%
Uma vez que se obteve um coeficiente de variância menor que 10% para os dois pontos da
gama de trabalho é possível considerar que estamos na presença de um método repetível.
Quanto à reprodutibilidade, esta foi calculada através dos dados disponibilizados pelo ensaio
interlaboratorial no qual o LAIST participou, nomeadamente, o número de ensaios realizados (n), a
média de concentrações obtida e o desvio padrão entre laboratórios (sL) e de repetibilidade (sr). Estes
valores e os resultados obtidos para este estudo encontram-se agrupados na tabela 27.
Tabela 27 – Tabela resumo do estudo da reprodutibilidade.
n 8
Média de Conc. (µg/L) 2,84
sL 0,293
sr 0,68
sR 0,74
Reprodutibilidade (R) 4,10
CVR 26,07%
Por último, para calcular a precisão intermédia recorreu-se aos resultados obtidos, em sessões
de trabalho distintas, para 15 padrões de controlo de concentração 0,05 µg/L. Obteve-se, assim, um
coeficiente de variância de 12% e um desvio padrão de 0,01.
53
7.2.5. Exatidão
A exatidão foi estudada com base em ensaios de recuperação, materiais de referência
certificados e ensaios interlaboratoriais.
Foram realizados ensaios de recuperação para a matriz água de consumo e biota, os
resultados obtidos encontram-se na tabela 28.
Tabela 28 - Resultados obtidos para o estudo de exatidão nas matrizes água de consumo e biota.
Águas para consumo
Biota
n 5 7
Média Rec (%) 92 85
Desvio Padrão 20,89 46,84
%RSD 23 55
Por sua vez, para o MRC de biota, de acordo com a equação (18), calculou-se um erro relativo
médio de 18%.
Como já foi mencionado, durante a realização do presente trabalho experimental houve a
possibilidade de participar num ensaio interlaboratorial. Seguindo a metodologia para as águas,
analisou-se a amostra, tendo-se obtido um resultado para a concentração de PFOS igual a 1,88 µg/L.
Atendendo ao valor alvo de 2,93 µg/L, calculou-se um z-score de -2,73 o que, de acordo com o Anexo B,
permite classificar o desempenho do laboratório como questionável.
7.2.6. Incertezas
A estimativa da incerteza foi calculada com base nos resultados do controlo de qualidade.
Para a componente da precisão usaram-se os resultados do desvio do padrão de controlo de
concentração 0,05 µg/L e o valor da amplitude dos duplicados das amostras. Por sua vez, para a
componente da exatidão, foram utilizados os dados obtidos para os ensaios de recuperação.
De acordo com as equações (21)-(25), presentes no Anexo B, calculou-se um valor para as
incertezas das amostras de matriz de água de consumo e de biota.
Tem-se, assim, uma incerteza relativa expandida para as águas para consumo de 36% e para
a matriz biota de 76%. Os valores calculados encontram-se organizados em detalhe na tabela 29.
54
Tabela 29 - Incertezas estimadas para a determinação de PFOS na matriz água de consumo e biota.
Biota Águas para consumo
Precisão (PC) %RSD 12,47
u precisão 0,07
Precisão (Replicados) %RSD 5,85 22,33
u precisão 0,03 0,13
Exatidão
n 5,00 5,00
Média Rec. 85,00 92,00
srec 35,58 20,89
snativa 1,84 -
sobs 1,82 -
Conc. Obs 8,71 -
Conc. Nativa 5,26 -
u exatidão 0,37 0,10
Incerteza combinada 0,38 0,18
Incerteza expandida 0,76 0,36
Para terminar este ponto, apresenta-se uma tabela resumo com os principais resultados obtidos
no âmbito da validação do método implementado.
Tabela 30 - Resumo dos resultados obtidos para a validação do método.
Gama de trabalho 0,05 a 2 µg/L
Limiares Analíticos
LQ
0,05 µg/L (instrumental)
0,0003 µg/L (experimental - águas)
0,25 µg/kg massa seca (experimental - biota)*
LD
0,015 µg/L (instrumental)
0,00009 µg/L (experimental – águas)
0,075 µg/kg massa seca (experimental - biota)*
Precisão
Repetibilidade (CV) < 10 %
Reprodutibilidade (CV) 26%
Precisão Intermédia 12%
Exatidão
Ensaios de Recuperação (%RSD) 23% (águas)
55% (biota)
MRC biota (%Er) 18%
EIL águas (z-score) - 2,73
Incerteza Relativa Expandida 36% (águas)
76% (biota)
Nota: * Para efeitos da estimativa do LQ e LD experimental do biota foi utilizada 1 g de massa seca.
55
7.3. Interligação Biota-Águas
Foram analisadas algumas amostras de biota cujos resultados para as concentrações de PFOS
se apresentam na tabela 31. Uma vez que a NQA é expressa em µg/kg de peso húmido, é importante
ter em conta a humidade do peixe no valor final de concentração de PFOS. Assim, para cada amostra
de biota analisada (de acordo com a metodologia adotada) foi necessário calcular a concentração final
de PFOS em µg/kg de massa húmida.
Tabela 31 – Concentrações obtidas para as amostras de biota analisadas expressas em µg/kg de massa seca e em µg/kg de húmida.
Amostra Conc. em µg/kg de Massa Seca
Conc. final em µg/kg de
Massa Húmida
1576 14,98 3,78
1577 5,26 1,67
1584 2,39 0,71
1585 3,67 0,71
18403 4,50 1,44
18404 5,86 1,66
18406 3,89 1,02
18407 4,01 1,13
18410 0,94 0,26
18416 2,31 0,87
18417 6,73 2,56
18418 6,16 1,89
Tendo em conta que o valor da NQA para o biota é 9,1 µg/kg de peso húmido, verifica-se que
as amostras analisadas apresentam uma concentração final inferior, pelo que a norma referente a esta
matriz está a ser cumprida.
Estes resultados foram, então, comparados com os valores determinados para as amostras de
água referentes aos locais de recolha do biota. Esta comparação teve como objetivo verificar se
efetivamente existe alguma relação entre a concentração de PFOS observada nos peixes e o local
onde eles foram capturados. De notar que os valores obtidos para essas amostras de água foram
gentilmente disponibilizados pelo LAIST.
Para efeitos desta comparação calculou-se o fator de bioconcentração (BCF) através do
quociente entre a concentração de PFOS nas amostras de biota e nas águas. Este parâmetro foi
determinado apenas para os locais onde as amostras de água analisadas apresentavam valores de
concentração do composto em estudo superiores ao LQ do método. Os dados utilizados para este
cálculo encontram-se na tabela abaixo. De notar que, de acordo com os resultados da tabela 32,
consoante o local de colheita, foram calculados valores médios para as concentrações de PFOS no
biota (µg/kg de massa húmida).
56
Tabela 32 – Concentrações de PFOS obtidas para as amostras de biota e água consoante o local de colheita e respetivo fator de bioconcentração (BCF).
Biota (µg/kg) Águas (µg/L) BCF (L/kg)
Tejo 3,78 0,0021 1800
Sado 1,67 0,0007 2386
Douro 0,71 0,0005 1420
Mondego 1,29 0,0004 3213
Cávado 0,26 < 0,0003 -
Guadiana 1,89 0,0015 1260
Através das concentrações de PFOS nestas amostras e recorrendo ao respetivo local de
colheita, foi possível construir a figura 26. De salientar que, esta representação não se trata de uma
imagem à escala, pelo que a sua análise deve ser acompanhada pela tabela 32.
Figura 26 – Mapa que relaciona as concentrações de PFOS obtidas para as amostras de biota (µg/kg) e
água (µg/L) de acordo com o local de colheita.
57
Da observação da tabela 32 e da figura 26, facilmente se verifica que existe uma relação entre
o biota e as águas dos rios onde estes foram colhidos. Construi-se, então, a representação gráfica da
figura 27, na qual se representou a concentração de PFOS no biota (µg/kg) e nas águas dos rios (µg/L),
tendo-se observado a existência de uma correlação positiva entre as duas variáveis. Verificou-se ainda
que o coeficiente de correlação experimental (0,937) é superior ao Coeficiente de Correlação de
Pearson (0,811), comprovando assim a existência de uma relação entre estas variáveis.
Figura 27 – Representação gráfica que relaciona a concentração de PFOS no biota (µg/kg) e nas águas dos rios (µg/L).
Como seria de esperar, dadas as características deste composto, observou-se que as maiores
concentrações de PFOS no biota ocorreram nos rios cujas amostras de água também apresentavam
concentrações deste composto elevadas.
Quanto aos valores do BCF, estes apresentaram-se superiores a 1000 L/kg o que, de acordo
com a U.S. Environmental Protection Agency, permite classificar o PFOS como sendo bioacumulável,
reforçando deste modo o que foi referido ao longo deste trabalho.
7.4. Testes recorrendo ao NMR
Como foi referido no ponto 6.12, foram enviadas duas amostras para analisar recorrendo a um
equipamento de NMR.
Num primeiro teste, analisou-se uma amostra concentrada em ACN. Conforme esperado,
devido às baixas concentrações de PFOS presentes na amostra (cerca de 1 µg/L), não foi possível
observar nenhum sinal referente ao 19F recorrendo a este equipamento.
Numa segunda fase, foi testada a mistura de amostra liofilizada com solvente deuterado e
novamente não foi possível detetar nenhum sinal.
y = 0,0006x - 9E-05
0
0,0005
0,001
0,0015
0,002
0,0025
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Concentr
ação d
e P
FO
S n
as á
guas
(µg/L
)
Concentração de PFOS no biota (µg/kg)
Interligação Biota/Águas
58
59
8. Conclusões e Perspetivas Futuras
O objetivo do presente trabalho foi alcançado, na medida em que foi possível implementar e
validar um método para a determinação do ácido perfluorooctanossulfónico (PFOS), na matriz água e
biota, recorrendo para tal à cromatografia líquida de ultra eficiência com deteção por espectrometria de
massa em tandem (UPLC-MS/MS).
Para a realização desta dissertação utilizaram-se as condições vigentes no LAIST, previamente
determinadas para a deteção de PFOS em matrizes de águas superficiais e subterrâneas.
Numa primeira fase, estendeu-se a determinação de PFOS a águas para consumo, tendo-se
obtido recuperações médias para esta matriz de 92%.
O grande desafio deste trabalho residiu na escolha do procedimento experimental adequado à
extração da matriz biota. Como tal, numa outra fase, foram testadas diferentes metodologias de
extração fazendo variar o solvente de extração, o volume deste solvente, as condições do banho de
ultrassons e, em última análise, o solvente para injeção no UPLC-MS/MS.
Os testes realizados foram agrupados em duas metodologias distintas, a metodologia A e B.
As diferenças mais significativas entre estas metodologias consistiram no solvente de extração utilizado
(ACN ou MeOH, para a A, e uma mistura H2O/ACN, para a B) e nas condições de concentração da
amostra (5 mL numa proporção 25% solvente e 75% água ou 20 mL perfeitos com a mesma solução
H2O/ACN usada na extração).
Para a metodologia A, concluiu-se que as melhores condições de extração envolviam 15 mL
de ACN e 30 minutos no banho de ultrassons a 25 kHz, 50% de intensidade e no modo de operação
normal. Por sua vez, para a metodologia B optou-se por recorrer a uma solução de 50% H2O e
50% ACN, mantendo as condições do banho de ultrassons.
Para as duas metodologias estudou-se a necessidade de re-extrair a amostra, pelo que se
verificou que as re-extrações tinham um maior peso na metodologia B, contribuindo em média cerca
de 20% para o resultado final, enquanto que para metodologia A este valor não ultrapassava os 11%.
Em média as metodologias A e B apresentaram recuperações para as amostras de biota
próximas de 85 e 80%, respetivamente. Para o MRC de sedimento obteve-se recuperações de cerca
de 61%, para a A, e 77%, para a B. Por fim, para o MRC de biota foram realizados apenas dois testes,
um para cada metodologia, tendo-se atingido uma recuperação de 118% na A e 202% na B.
Regra geral, os resultados obtidos pela metodologia B foram superiores aos da A. No entanto,
verificou-se que a metodologia B apresentava interferentes que aumentavam a área dos picos obtidos
pelo UPLC-MS/MS. Esta constatação foi suportada pelas razões de massa obtidas para esta
metodologia, que se revelaram diferentes da esperada de acordo com o estudo realizado para este
parâmetro (diferentes de 1,534). Como tal, concluiu-se que a metodologia A era a mais indicada para
a correta extração da matriz biota.
60
Quanto à validação, verificou-se que o método desenvolvido apresenta boa linearidade na
gama de trabalho adotada (de 0,05 a 2 µg/L), o que se traduz em coeficientes de correlação superiores
a 0,998 e, que se comprova igualmente através dos resultados obtidos na análise de resíduos, no teste
de Mandel e, por último, no teste de Rikilt.
Em relação aos limiares analíticos tem-se um LQ (instrumental) de 0,05 µg/L e um LD
(instrumental) de 0,015 µg/L.
O método implementado mostrou-se preciso, conforme se comprova pelos valores que foram
obtidos para os critérios de repetibilidade (CVr < 10%), reprodutibilidade (CVR = 26%) e precisão
intermédia (CV = 12%).
Quanto à exatidão, esta foi avaliada em termos de ensaios de recuperação, resultados obtidos
para o MRC de biota e ensaio interlaboratorial. Teve-se, assim, como já foi referido, valores médios de
recuperação de 85%, para o biota, e 92%, para as águas, apresentando um desvio padrão relativo de
55% e 23%, respetivamente. Há que ter em atenção que o valor elevado obtido para o %RSD do biota
é prontamente justificado pelo aspeto heterogéneo da amostra. Por sua vez, para o MRC de biota
calculou-se um erro relativo de 18%, um valor aceitável para este tipo de matrizes. Houve ainda a
possibilidade de participar num ensaio interlaboratorial no qual se analisou uma amostra de água
natural. Com base no resultado obtido para a concentração de PFOS, calculou-se um z-score de -2,73,
valor que permitiu classificar o desempenho do laboratório como questionável.
A estimativa da incerteza foi calculada com base nos resultados do controlo de qualidade.
Assim, obteve-se uma incerteza relativa expandida para as águas para consumo de 36% e para a
matriz biota de 76%. De notar que, a existência de poucos dados condicionou o cálculo destas
incertezas.
Para as amostras de biota analisadas verificou-se que todas apresentam concentrações
inferiores às NQA (9,1 µg/kg de peso húmido). Quanto às amostras de águas superficiais, dos
resultados disponibilizados pelo LAIST para os locais de colheita do biota, averiguou-se que estes
também cumprem a norma (inferiores a 6,5 × 10-4 µg/L). Quanto às águas para consumo, atualmente,
não existe legislação que imponha um limite para a concentração de PFOS neste tipo de amostras.
Concluiu-se que as maiores concentrações de PFOS no biota ocorreram nos rios cujas
amostras de água também apresentavam concentrações deste composto elevadas, tendo-se verificado
a existência de uma correlação entre as duas variáveis. Calculou-se ainda um fator de bioconcentração
e verificou-se que os valores para este parâmetro se apresentavam superiores a 1000 L/kg, o que
sustenta a afirmação feita ao longo deste trabalho de que o PFOS se trata de um composto
bioacumulável. Um aspeto interessante passa por, futuramente, explorar com maior detalhe a relação
existente entre a concentração de PFOS no biota e nas águas dos rios que habitam
Quanto aos testes realizados recorrendo ao NMR de líquidos, tendo em conta os elevados
limites de deteção associados a este equipamento, não foi possível detetar o analito em estudo – o
61
PFOS – nas amostras analisadas. Como tal, sugere-se no futuro a utilização de NMR para semi-sólidos
ou sólidos.
Como perspetivas futuras para o procedimento adotado destaca-se a necessidade de realizar
um estudo para aprofundar os efeitos de matriz que, como se comprovou pelos testes realizados,
podem influenciar a determinação de PFOS nas amostras analisadas. As soluções podem passar pela
utilização de isótopos para avaliar a compensação do enriquecimento iónico ou a adição de um passo
de limpeza exaustivo.
Destaca-se ainda a possibilidade de, no futuro, transitar a aplicação deste método para outro
tipo de matrizes como sedimentos, solo e ar.
62
63
9. Referências Bibliográficas
[1] National Toxicology Program, “NTP Monograph On Immunotoxicity Associated With Exposure
To Perfluorooctanoic Acid (PFOA) Or Perfluorooctane Sulfonate (PFOS),” U.S. Department of Health
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[43] Relacre, “Guia Relacre 13: Validação de Métodos Internos de Ensaio em Análise Química,”
Relacre, Lisboa, 2000.
67
Anexo A – Ocorrência de PFOS
Tabela 33 - Concentrações de PFOS para diferentes espécies de peixes no âmbito de diversos estudos. [15]
68
Tabela 34 – (Continuação) Concentrações de PFOS para diferentes espécies de peixes no âmbito de diversos estudos. [15]
69
Tabela 35 - Ocorrência de PFOS nos diversos grupos de alimentos com base num estudo realizado pela EFSA [16].
70
Tabela 36 – (Continuação) Ocorrência de PFOS nos diversos grupos de alimentos com base num estudo realizado pela EFSA [16].
71
Anexo B – Validação
Critérios de Validação
Para que uma metodologia analítica esteja validada, devem-se avaliar os seguintes pontos:
- Âmbito do Método
Neste ponto deve ser feita uma descrição e caraterização do método, nomeadamente o tipo de
amostras a que este se aplica e as espécies químicas que se pretende identificar e/ou quantificar. Para
o presente trabalho pretende-se efetuar a determinação de PFOS em amostras de águas e biota. [42]
- Gama de Trabalho
A gama de trabalho pode ser obtida através de estudos de linearidade e estabelecida
verificando a exatidão e precisão nos seus extremos (ponto mínimo e máximo), sendo que o seu
intervalo deve corresponder à concentração expetável das amostras. Os valores determinados para a
concentração mais baixa deverão ser significativamente diferentes dos do branco. Caso o valor obtido
para a amostra supere, até cerca de 10%, o valor máximo imposto pela gama de trabalho poderá
proceder-se à extrapolação de resultados (se se tiver comprovado a linearidade do método). Caso
contrário, terá de se diluir a amostra de forma a que esta apresente um valor que se insira na gama de
trabalho. [42]
- Calibração Analítica
A calibração entende-se como o processo que relaciona a resposta dada por um instrumento
de medição com uma concentração ou quantidade de substância conhecida. Para tal recorre-se a
padrões químicos e/ou materiais de referência. Regra geral, preparam-se uma serie de soluções padrão
com concentrações conhecidas, as quais são analisadas num equipamento analítico nas mesmas
condições que as amostras e permitem estabelecer uma reta ou curva de calibração (sinal do
equipamento em função da concentração) que, posteriormente possibilita determinar as concentrações
das amostras por interpolação do seu sinal determinado no equipamento. A matriz utilizada para a
preparação de padrões deverá ser o mais parecida possível com as amostras.
Existem diversos modelos de calibração, sendo o mais utilizado a regressão linear pelo método
dos mínimos quadrados.
As curvas de calibração devem apresentar no mínimo 5 pontos com concentrações distribuídas
ao longo de toda a gama de trabalho. No final obtém-se uma equação como a equação (1), na qual m
corresponde ao declive e o b à ordenada na origem. A curva de calibração é aceite caso o coeficiente
de correlação, r2, seja maior que 0,995.
𝑦 = 𝑚 ∙ 𝑥 + 𝑏 (1)
Para avaliar a linearidade podem-se aplicar diversos testes, tais como a avaliação visual,
análise dos coeficiente de correlação ou resíduos, teste de Mandel (ou teste de Fisher/Snedecor) ou
teste de Rikilt.
72
Análise de resíduos
Este teste consiste em calcular a diferença entre o valor observado e o valor estimado pela
equação obtida por regressão linear. Considera-se que a equação está bem ajustada aos valores
experimentais se os resíduos se distribuírem de forma aleatória em torno da linha de ordenada zero e
se estes desvios não forem superiores a 20%. Caso estes apresentem uma linha de tendência deve
proceder-se a uma nova calibração e, se necessário, ajustar a gama de trabalho.
Teste de Mandel
Outro teste para avaliar a linearidade realiza-se através de uma ferramenta estatística, de
acordo com a norma ISO 8466-1. A partir dos resultados obtidos (pares ordenados, no qual as abcissas
correspondem à concentração e as ordenadas ao sinal do equipamento), calcula-se a função de
calibração linear e não linear (ISO 8466-1 e 8466-2, respetivamente). Para cada função de calibração
calculam-se os respetivos desvios padrão residuais (𝑆𝑦/𝑥 e 𝑆𝑦2) de acordo com as equações (2) e (3).
𝑆𝑦/𝑥 = √∑(𝑦𝑖 − 𝑦�̅�)
2
𝑁 − 2 (2)
𝑆𝑦2 = √∑(𝑦𝑖 − 𝑦𝑖2̅̅ ̅̅ )2
𝑁 − 3 (3)
Onde N é o número de padrões de calibração, 𝑦𝑖 o sinal obtido para um padrão de determinada
concentração, 𝑦�̅� o sinal estimado pela função de calibração linear para um padrão de igual
concentração e 𝑦𝑖2̅̅ ̅̅ o sinal estimado pela função de calibração polinomial do segundo grau para um
padrão da mesma concentração.
De seguida determina-se o valor de teste (VT) através da equação (5), sendo que para chegar
a esse valor é necessário calcular previamente a diferença de variâncias (DS2) através da equação (4).
𝐷𝑆2 = (𝑁 − 2) ∙ 𝑆𝑦/𝑥2 − (𝑁 − 3) ∙ 𝑆𝑦2
2 (4)
𝑉𝑇 =𝐷𝑆2
𝑆𝑦22 (5)
Por fim, este valor teste (VT) é comparado com o valor tabelado da distribuição F de
Fisher/Snedecor, para um grau de confiança de 95%. Se o valor teste for inferior ou igual a F, então a
função é linear. Caso contrário trata-se de uma função de calibração não linear e, se possível, deve
reduzir-se a gama de trabalho de forma a verificar-se a linearidade.
Teste de Rikilt
O teste de Rikilt permite efetuar uma análise da linearidade em cada ponto da reta de calibração
recorrendo para tal ao método dos mínimos quadrados. Para cada concentração xi e respetivo sinal yi
tem-se assim uma determinada razão 𝑅𝑖, equação (6).
73
𝑅𝑖 =𝑦𝑖
𝑥𝑖
(6)
De seguida calcula-se o valor médio de todas as razões 𝑅𝑖 e com este é possível determinar a
percentagem das razões 𝑅𝑖 de acordo com a equação (7).
% =𝑅𝑖
�̅�× 100 (7)
Para admitir linearidade, os valores obtidos não podem apresentar um desvio superior a 10%,
caso contrario a gama de trabalho deve ser reduzida até este requisito se verificar.
- Limiares Analíticos
A determinação dos limiares analíticos é de extrema importância, pois nem sempre um sinal
instrumental pode ser transformado num resultado analítico.
Limite de Deteção (LD)
O LD habitualmente corresponde ao início da gama de trabalho, a partir do qual é possível
detetar a presença do analito com uma dada confiança estatística (normalmente 95%), ou seja, é
possível distinguir o sinal da amostra do sinal do branco. Trata-se assim, da mais pequena quantidade
de substância a analisar que pode ser detetada numa amostra. Experimentalmente uma das formas
mais utilizadas para calcular este limite encontra-se transcrita na equação (8).
𝐿𝐷 = 3,3 × 𝑆𝑦/𝑥
𝑚 (8)
Onde 𝑆𝑦/𝑥 corresponde ao desvio padrão residual da curva de calibração e 𝑚 ao declive.
Limite de Quantificação (LQ)
Por sua vez o LQ corresponde à menor concentração medida pelo equipamento analítico a
partir da qual é possível efetuar uma avaliação quantitativa exata e precisa do analito. Habitualmente
corresponde ao padrão de calibração de menor concentração, mas também pode ser calculado através
da equação (9).
𝐿𝑄 = 3,3 × 𝐿𝐷 (9)
Este limite pode ainda ser calculado com base na curva de calibração linear e através das
medições repetidas de uma solução padrão de acordo com a equações (10) e (11), respetivamente.
𝐿𝑄 = |10 × 𝑆𝑐𝑐
𝑚| (10)
𝐿𝑄 = |10 × 𝑆𝑟𝑒𝑝| (11)
Sendo 𝑆𝑐𝑐 e 𝑆𝑟𝑒𝑝, respetivamente, o desvio padrão da curva de calibração e o desvio para os
ensaios de repetibilidade.
74
Uma forma de verificar o valor do limite de quantificação pode ser feita com base, por exemplo,
em medições repetidas de uma solução com concentração igual ao LQ. Assim, o LQ está validado
quando %RSD é inferior ou igual a 20%. A equação (12) apresenta a fórmula que permite calcular o
%RSD, sendo 𝑆 o desvio padrão e �̅� o valor médio obtido para as várias medições da solução.
Desvio padrão relativo = %𝑅𝑆𝐷 =𝑆
�̅�× 100 (12)
Precisão
A precisão (ou fidelidade) está relacionada com a dispersão de resultados entre ensaios
independentes, realizados na mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, em condições bem
definidas. Como tal está associada aos erros aleatórios.
A precisão pode ser avaliada pela repetibilidade e reprodutibilidade. Entre estas duas medidas
define-se o conceito de precisão intermédia ou variabilidade intralaboratorial. De salientar que,
normalmente, a precisão é apresentada em termos de desvio padrão ou desvio padrão relativo
(coeficiente de variação).
- Repetibilidade
A Repetibilidade exprime a precisão de um método de ensaio efetuado em condições
semelhantes, nomeadamente no mesmo laboratório, mesmo equipamento, mesmo analista, mesmo
tipo de reagentes, com o mesmo procedimento de medição, mesmas condições de trabalho e num
curto intervalo de tempo. Por sua vez, a sua determinação (repetibilidade de um ensaio) é calculada
através do desvio padrão de uma serie de medições realizadas sobre uma mesma amostra ou sobre
padrões independentes, em condições de repetibilidade. Este procedimento deverá ser repetido sobre
uma serie de amostras, em diversos níveis de concentração de forma a cobrir toda a gama de trabalho
do método.
Assumindo uma distribuição normal de resultados e uma probabilidade de 95% tem-se:
𝑅𝑒𝑝𝑒𝑡𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 = 𝑟 = 1,96 ∙ √2 ∙ 𝑠𝑟 = 2,8 ∙ 𝑠𝑟 (13)
Sendo 𝑠𝑟 o desvio padrão da repetibilidade.
O coeficiente de variação de repetibilidade (CVr), para uma determinada concentração é dado
pela equação (14).
𝐶𝑉𝑟 =𝑠𝑟
�̅�∙ 100 (14)
- Reprodutibilidade
A Reprodutibilidade exprime a precisão de um método de ensaio efetuado na mesma amostra
ou amostras semelhantes, mas em condições diferentes, as quais incluem diferentes laboratórios,
operadores, equipamentos e/ou diferentes dias de análise.
75
A reprodutibilidade de um método é determinada através de ensaios interlaboratoriais. Na
equação (15) é possível observar como o desvio padrão de reprodutibilidade (𝑠𝑅) se relaciona com o
desvio padrão entre laboratórios (𝑠𝐿) e de repetibilidade (𝑠𝑟), sendo que estes desvios são vulgarmente
disponibilizados nestes tipos de ensaios.
𝑠𝑅 = √𝑠𝐿2 + 𝑠𝑟
2 (15)
Esta medida pode ser determinada de modo semelhante à repetibilidade, como se comprova
na equação (16).
Sendo 𝑛 o número de medições realizadas e 𝑠𝑅 o desvio padrão de reprodutibilidade.
Por sua vez, o coeficiente de variação de reprodutibilidade é calculado de acordo com a
equação (14), substituindo 𝑠𝑟 por 𝑠𝑅.
- Precisão intermédia
A precisão intermédia é determinada sobre a mesma amostra, amostras semelhantes ou
padrões independentes, utilizando o mesmo método, no mesmo laboratório ou em laboratórios
diferentes, sendo definidas as condições a variar. Esta precisão pode ser calculada através do desvio
padrão relativo dos resultados obtidos para réplicas de uma amostra ou padrão de controlo, de acordo
com a equação (14).
Exatidão
A Exatidão (ou Veracidade) pode ser definida como a concordância entre o valor real do analito
na amostra e o resultado obtido para esta concentração através do método de análise. Como tal está
relacionada com os erros associados a uma dada medição e pode ser avaliada com base em ensaios
de recuperação, materiais de referência certificados, ensaios interlaboratoriais e métodos de referência.
- Ensaios de Recuperação
Neste tipo de ensaios adicionam-se quantidades conhecidas do analito em estudo a amostras
reais, sendo que a concentração de analito a adicionar deve corresponder a diferentes pontos da gama
de trabalho (LQ, ponto médio e máximo da gama de trabalho).
A amostra tal-e-qual e a amostra fortificada são então analisadas e com base nos seus
resultados é calculada a taxa de recuperação através da equação (17).
%𝑅𝑒𝑐 =𝐶𝑠 − 𝐶𝑟
𝐶𝑎
(17)
Onde 𝐶𝑠, 𝐶𝑟 e 𝐶𝑎 são respetivamente a concentração de analito na amostra fortificada, a
concentração de analito na amostra tal e qual e a concentração de analito que foi adicionada à amostra.
𝑅𝑒𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑡𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 = 𝑅 = 1,96 ∙ √𝑛 ∙ 𝑠𝑅 (16)
76
Estes ensaios são repetidos 𝑛 vezes o que permite efetuar uma análise estatística da taxa de
recuperação observada com a taxa de recuperação teórica (a qual se assume ser 100%). De notar que
a realização apenas de este tipo de ensaios leva a uma avaliação incompleta da exatidão do método.
- Materiais de Referência Certificados (MRC)
Um material de referência certificado deve apresentar uma matriz natural semelhante à matriz
das amostras às quais o método de análise irá ser aplicado e uma concentração do analito em estudo
dentro da gama de trabalho. Neste tipo de materiais a concentração do analito em estudo é conhecida,
bem como a incerteza associada, sendo através da comparação entre o valor obtido e o valor certificado
que se consegue avaliar o erro e a exatidão do ensaio. Trata-se assim de uma ferramenta de avaliação
de extrema importância, que deve ser usada na validação de um método de análise sempre que
possível. O desempenho do laboratório com base nos MRCs pode ser calculado, por exemplo, através
do erro relativo.
Erro Relativo
O erro relativo (𝐸𝑟) ou Bias é uma forma de avaliar a exatidão de um método e calcula-se
através da equação (18).
𝐸𝑟(%) =𝑋𝑙𝑎𝑏 − 𝑋𝑣
𝑋𝑣
(18)
Sendo 𝑋𝑙𝑎𝑏 o valor obtido experimentalmente ou a média aritmética de valores obtidos e 𝑋𝑣 o
valor aceite como verdadeiro.
O valor aceite para este tipo de erro é definido pelo próprio laboratório.
- Ensaios Interlaboratoriais
Este tipo de ensaios são organizados por entidades competentes e consistem em analisar uma
determinada amostra na qual é conhecida a concentração do analito em estudo, comparando depois o
resultado obtido com o real. Trata-se assim de uma medida que permite avaliar o desempenho dos
laboratórios calculando para isso o fator de desempenho Z-score.
Z-score
Este parâmetro é calculado com base na equação (19),
𝑍 − 𝑠𝑐𝑜𝑟𝑒 =𝑋𝐿𝑎𝑏 − 𝑋𝑟𝑒𝑓
𝑠 (19)
Sendo 𝑋𝐿𝑎𝑏 o valor obtido pelo laboratório para a concentração do analito em estudo, 𝑋𝑅𝑒𝑓 o
valor referenciado que é estabelecido pela entidade organizadora do ensaio e 𝑠 o desvio padrão
observado.
O desempenho é considerado satisfatório se o módulo do valor obtido para o Z-score for inferior
ou igual a 2, caso seja maior que 3 considera-se insatisfatório. Por sua vez, se o valor do módulo deste
77
parâmetro estiver compreendido entre 2 e 3 (este último inclusive), tem-se um desempenho
questionável.
Robustez
A robustez de um método está associada à sensibilidade que este apresenta quando ocorrem
pequenas variações na sua execução. A robustez está relacionada com a precisão na medida em que
um aumento da robustez traduz-se num aumento da precisão, devido à pouca influência dos erros
aleatórios nos resultados do método. Regra geral, em cromatografia as variáveis que podem afetar este
parâmetro são o tipo de colunas, as temperaturas, o fluxo e os eluentes. O estudo da robustez pode
ser efetuado usando MRC’s (ou outra amostra na qual a concentração do analito em estudo é
conhecida) e fazendo variar uma variável, garantido que as restantes se mantêm constantes, é possível
verificar a influência de cada parâmetro em estudo.
Sensibilidade
A sensibilidade define-se como sendo o quociente entre a variação observada no valor lido (Δ𝐿)
e a correspondente variação da concentração (Δ𝐶).
Deste modo, a sensibilidade é uma ferramenta que permite avaliar a capacidade que um
método (ou equipamento) tem de distinguir pequenas diferenças de concentração do analito em estudo.
Da equação (20) retira-se que a sensibilidade corresponde à derivada de primeira ordem da reta de
calibração para uma determinada gama de concentrações.
Assim, é possível afirmar que um método é mais sensível que outro se, para a mesma variação
de concentração, a variação do sinal lido for maior.
Seletividade e Especificidade
A seletividade é a capacidade que o método de análise tem de, na presença de uma mistura
complexa, identificar e distinguir um determinado analito sem apresentar interferências de outros
compostos. Por sua vez, a especificidade é a capacidade que um método tem de conseguir discriminar
um determinado analito de outras substâncias presentes na amostra, ou seja, um método é especifico
se garantir que o sinal lido provém apenas do analito. De forma a confirmar a existência, ou não, desses
possíveis interferentes geralmente recorre-se a ensaios de recuperação ao longo de toda a gama de
trabalho. Quando estas taxas de recuperação rondam os 100% diz-se que o método é especifico e
seletivo.
Incertezas
O cálculo das incertezas pode ser efetuado com base na norma ISO 11352. Segundo esta a
incerteza associada ao método é estimada com base nas incertezas da precisão e da exatidão.
𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 =Δ𝐿
Δ𝐶 (20)
78
A incerteza associada à precisão é calculada através da equação (21). Para o cálculo da
incerteza associada à exatidão, há diferenças entre as amostras de água e as de biota. Uma vez que
nas primeiras estamos na presença de uma matriz sem analito recorre-se à equação (22), sendo que
nas amostras de matriz biota segue-se a equação (23).
Sendo:
𝑅𝑒𝑐̅̅ ̅̅ ̅ - média da recuperação do analito;
𝑠𝑅𝑒𝑐 - desvio padrão das recuperações;
𝑛 - número de ensaios realizados à amostra fortificada;
𝑐𝑓𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎 - concentração da amostra fortificada;
𝑢(𝑐𝑓𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎) - incerteza padrão associada ao teor das amostras fortificadas;
𝑐�̅�𝑏𝑠 - concentração média de uma serie de análises de amostras fortificadas;
𝑠𝑜𝑏𝑠 - desvio padrão de uma serie de analises de amostras fortificadas;
𝑐�̅�𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 - concentração média de analito na amostra não fortificada;
𝑠𝑛𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 – desvio padrão de uma série de análises a amostras não fortificadas.
Para efeitos de cálculo o laboratório considerou o último termo das equações (22) e (23)
desprezável.
Segue-se o cálculo da incerteza combinada de acordo com a equação (24).
De seguida calcula-se a incerteza expandida, equação (25) que consiste em afetar o valor de
incerteza combinada por um fator multiplicativo denominado fator de expansão. Neste caso tomou-se
esse fator como sendo igual a 2.
𝑈𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠ã𝑜 =%𝑅𝑆𝐷
√3 (21)
𝑈𝑒𝑥𝑎𝑡𝑖𝑑ã𝑜 = 𝑅𝑒𝑐̅̅ ̅̅ ̅ × √𝑠𝑅𝑒𝑐
2
𝑛+ (
𝑢(𝑐𝑓𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎)
𝑐𝑓𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎)
2
(22)
𝑈𝑒𝑥𝑎𝑡𝑖𝑑ã𝑜 = 𝑅𝑒𝑐̅̅ ̅̅ ̅ × √𝑠𝑜𝑏𝑠
2
𝑛⁄ + 𝑠𝑛𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎2
𝑐�̅�𝑏𝑠 − 𝑐�̅�𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎
+ (𝑢(𝑐𝑓𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎)
𝑐𝑓𝑜𝑟𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑑𝑎
)
2
(23)
𝑈𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎 = √𝑈𝑒𝑥𝑎𝑡𝑖𝑑ã𝑜2 + 𝑈𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠ã𝑜
2 (24)
𝑈𝑒𝑥𝑝𝑎𝑛𝑑𝑖𝑑𝑎 = 2 × 𝑈𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎 (25)
79
Anexo C – Amostras de Biota
Tabela 37 - Correspondência entre o número da amostra, o local de colheita, a sua massa seca e %H2O (humidade).
Nº da Amostra Ponto de Colheita Massa Seca (g) % H2O
1576 Santarém - Rio Tejo 12,67 70,9
1577 Ermidas do Sado – Rio Sado 1 12,7 73,2
1578 Ermidas do Sado – Rio Sado 2 12,56 72,6
1579 Ermidas do Sado – Rio Sado 3 12,75 70,3
1580 Ermidas do Sado – Rio Sado 4 12,71 71,1
1581 Ermidas do Sado – Rio Sado 5 12,83 71,8
1582 Ermidas do Sado – Rio Sado 6 12,98 72,1
1583 Ermidas do Sado – Rio Sado 7 8,26 72,5
1584 Lever – Rio Douro 1 24,32 67,7
1585 Lever – Rio Douro 2 14,55 73,2
1586 Lever – Rio Douro 3 13,77 69,3
1587 Lever – Rio Douro 4 12,9 70,6
1588 Lever – Rio Douro 5 13,41 72,5
1589 Lever – Rio Douro 6 13,29 72,6
1590 Lever – Rio Douro 7 14,19 71,9
1591 Ponte Nova – Rio Vez 1 2,35 72,8
1592 Ponte Nova – Rio Vez 2 2,09 72,2
1593 Ponte Nova – Rio Vez 3 1,6 73,1
18402 Ponte de Formoselha – Rio Mondego 1 13,74 69,8
18403 Ponte de Formoselha – Rio Mondego 2 17,39 67,4
18404 Ponte de Formoselha – Rio Mondego 3 17,62 71,6
18405 Ponte de Formoselha – Rio Mondego 4 14,27 72,2
18406 Ponte de Formoselha – Rio Mondego 5 17,58 73,7
18407 Ponte de Formoselha – Rio Mondego 6 13,2 71,8
18408 Ponte de Formoselha – Rio Mondego 7 4,49 72,8
18409 Areias de Vilar – Rio Cávado 1 30,56 73,5
18410 Areias de Vilar – Rio Cávado 2 17,57 72,4
18411 Areias de Vilar – Rio Cávado 3 15,51 71,9
18412 Areias de Vilar – Rio Cávado 4 14,89 74,0
18413 Areias de Vilar – Rio Cávado 5 15,72 73,1
18414 Areias de Vilar – Rio Cávado 6 16,26 73,2
18415 Areias de Vilar – Rio Cávado 7 13,12 73,2
18416 Monte da Vinha – Rio Guadiana 1 18,3 62,2
18417 Monte da Vinha – Rio Guadiana 2 37,03 62,0
18418 Monte da Vinha – Rio Guadiana 3 35,45 69,2
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Anexo D – Metodologias Testadas
Tabela 38 – Resultados obtidos durante o desenvolvimento da metodologia de extração para a matriz biota que envolveram o estudo do solvente de extração, do solvente de
injeção no UPLC e testes complementares (que passaram pelo uso do vórtex e sonda). Legenda: NA = Não Aplicável.
Teste Amostra Solvente extração
Condições do Ultrassons
Observações Conc final
(µg/kg) %Rec
A28 1584 15 mL ACN
30 min; 25kHz; 50%;
- NÃO SE MUDOU O SOLVENTE; - Concentrou-se a 5 mL (1,25 mL ACN + 3,75 mL H2O); - Filtrado 0,22 µm.
2,13 NA
A29 1584
fortificada (1,0 µg/L)
15 mL ACN
30 min; 25kHz; 50%;
- Ensaio de recuperação com procedimento igual ao teste A28. 2,41 6
A34 18418 10 mL ACN
(10 min; 25kHz; 50%) x 3
- Teste complementar: levou-se a amostra ao vortex seguido de 10 min ultrassons (repetiu-se este procedimento 3x); - NÃO SE MUDOU O SOLVENTE; - Concentrou-se a 5 mL (1,25 mL ACN + 3,75 mL H2O); - Filtrado 0,22 µm.
4,36 NA
A35 18409 15 mL MeOH
30 min; 25kHz; 50%;
- Extraiu-se a amostra utilizando MeOH, deixou-se ficar nesse solvente e concentrou-se a 5 mL (1,25 mL MeOH + 3,75 mL H2O); - Filtrado 0,22 µm.
3,44 NA
A36 18409 15 mL ACN
30 min; 25kHz; 50%;
-NÃO SE MUDOU O SOLVENTE; - Extraiu-se a amostra utilizando ACN, deixou-se ficar nesse solvente e concentrou-se a 5 mL (1,25 mL ACN + 3,75 mL H2O); - Filtrado 0,22 µm.
2,74 NA
A37 18409
fortificada (1,0 µg/L)
15 mL MeOH
30 min; 25kHz; 50%;
- Ensaio de recuperação com procedimento igual ao teste A35. 5,78 62
A38 18409
fortificada (1,0 µg/L)
15 mL ACN
30 min; 25kHz; 50%;
- Ensaio de recuperação com procedimento igual ao teste A36. 6,17 70
A39 18409 15 mL MeOH
30 min; 25kHz; 50%;
- Re-extração do teste A35 no qual a amostra foi extraída utilizando MeOH; - Concentrou-se a 1,2mL (300 µL MeOH + 900 µL H2O).
0,31 NA
A40 18409 15 mL ACN
30 min; 25kHz; 50%;
- Re-extração do teste A36 para o qual não se mudou o solvente de injeção; - Concentrou-se a 1,2mL (300 µL ACN + 900 µL H2O).
0,35 NA
A43 18409 8 mL ACN
3 min US Sonda por impulsos
- Teste complementar: NÃO SE MUDOU O SOLVENTE; - Extraiu-se a amostra utilizando ACN, deixou-se ficar nesse solvente e concentrou-se a 5 mL (1,25 mL ACN + 3,75 mL H2O); - Filtrado 0,22 µm.
2,90 NA
82
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Anexo E – Razões MRM
As razões de massa são uma ferramenta importante que permite uma correta identificação do
composto em estudo. Como tal, para cada sessão de trabalho recolheu-se os valores obtidos para este
parâmetro, os quais se encontram organizados na tabela abaixo. Com base nestes valores foi possível
calcular uma razão de massas de 1,535.
Tabela 39 - Razões MRM1/MRM2 obtidas para os diversos pontos das curvas de calibração por sessão de trabalho.
07/06/2017 Razão 14/07/2017 Razão 04/08/2017 Razão 25/08/2017 Razão
CC1 2,37 CC1 1,299 CC1 1,467 CC1 1,468
CC2 1,487 CC2 1,525 CC2 1,552 CC2 1,582
CC3 1,401 CC3 1,478 CC3 1,497 CC3 1,513
CC4 1,515 CC4 1,471 CC4 1,484 CC4 1,8
CC5 1,317 CC5 1,554 CC5 1,554 CC5 1,514
CC6 1,462 CC6 1,582 CC6 1,555 CC6 1,501
CC7 1,61 CC7 1,527 CC7 1,52 CC7 1,49
CC8 1,61
CC8 1,558 CC8 1,554
03/07/2017 Razão 20/07/2017 Razão 22/08/2017 Razão 30/08/2017 Razão
CC1 1,529 CC1 1,812 CC1 1,298 CC1 1,505
CC2 1,577 CC2 1,457 CC2 1,503 CC2 1,555
CC3 1,409 CC3 1,66 CC3 1,495 CC3 1,541
CC4 1,532 CC4 1,605 CC4 1,476 CC4 1,508
CC5 1,516 CC5 1,484 CC5 1,572 CC5 1,51
CC6 1,513 CC6 1,508 CC6 1,535 CC6 1,509
CC7 1,549 CC7 1,586 CC7 1,514 CC7 1,467
CC8 1,497 CC8 1,523 CC8 1,506
CC9 1,528
10/07/2017 Razão 27/07/2017 Razão 24/08/2017 Razão 14/09/2017 Razão
CC1 1,626 CC1 1,605 CC1 1,446 CC1 1,679
CC2 1,533 CC2 1,441 CC2 1,509 CC2 1,651
CC3 1,656 CC3 1,597 CC3 1,497 CC3 1,536
CC4 1,561 CC4 1,481 CC4 1,486 CC4 1,423
CC5 1,568 CC5 1,593 CC5 1,527 CC5 1,514
CC6 1,612 CC6 1,492 CC6 1,514 CC6 1,529
CC7 1,558 CC7 1,509 CC7 1,492 CC7 1,502
CC8 1,558 CC8 1,512 CC8 1,487
CC9 1,518
n 95 Média 1,534 DesvPad 0,116 %RSD 7,563
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Anexo F – Espectro de Massa
Figura 28 - Exemplo de um espectro de massa obtido para uma determinada amostra de biota.
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Anexo G - Tratamento de Resultados (Área/Altura)
Tabela 40 - Exemplo de uma sessão de trabalho em que se tratou os resultados com base na altura e na área do pico.
Altura Área
Amostra Tempo de Retenção (s) Conc. lida
(µg/L) Razão MRM
Conc. lida (µg/L)
Razão MRM
Branco4 5,29 0,008 1,143 0,000 1,443
CC1 5,3 0,031 1,729 0,020 1,505
CC2 5,29 0,05 1,361 0,050 1,555
CC3 5,29 0,076 1,578 0,070 1,541
CC4 5,29 0,107 1,462 0,100 1,508
CC5 5,29 0,243 1,426 0,250 1,51
CC6 5,29 0,389 1,409 0,400 1,509
CC7 5,29 0,472 1,39 0,490 1,467
CC8 5,29 0,998 1,433 1,000 1,506
CC9 5,29 2,008 1,428 2,000 1,528
PC1 5,29 0,034 1,602 0,030 1,587
PC2 5,29 0,947 1,384 0,970 1,486
Branco5 5,3 0,009 1,809 0,000 1,756
Teste B58 5,29 0,01 2,136 0,000 1,416
Teste B59 5,29 0,983 1,422 0,890 1,548
Teste A60 5,28 0,78 1,406 0,700 1,568
Teste B61 5,27 0,893 1,561 0,830 1,858
Teste A62 5,27 2,405 1,476 1,720 1,502
Teste B63 5,28 0,06 1,528 0,040 1,78
Teste B64 5,27 0,271 1,467 0,350 2,792
Teste B65 5,28 0,052 1,421 0,070 2,437
Teste B66 5,27 1,189 1,476 1,150 1,74
PC1 5,28 0,032 1,634 0,030 1,454
Teste B67 5,26 0,93 1,424 0,820 1,733
Teste B68 5,27 0,201 1,54 0,200 2,13
Teste B69 5,26 0,294 1,405 0,370 2,008
Teste B70 5,26 0,219 1,448 0,280 1,793
Teste B71 5,26 0,948 1,46 1,170 1,58
PC2 5,27 0,88 1,4 0,910 1,498
PC3 5,28 1,931 1,441 1,910 1,538
Branco6 5,29 0,009 7,727 0,000 11,296