cromatografia final b

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Introduo a tcnicas cromatogrficas

CROMATOGRAFIA = mtodo de separao no qual os constituintes de uma amostra a serem separados so distribudos entre 2 fases:

Estacionria: geralmente de grande rea, slida ou lquida Mvel: um fluido que percola atravs da fase estacionria

1903 - TSWETT, botnico russo: separao e isolamento de pigmentos de plantas em colunas de slica gel (cromatografia = color writing)ter de petrleo

mistura de pigmentos pigmentos separados

CaCO3

Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever] (grego)

Dcadas de 30 40 MARTIN & SYNGE: cromatografia partio Dcada de 50: TLC e GC

Dcada de 60: cromatografia permeao em gel Dcadas de 70 e 80: HPLC moderna

Cromatograma

o resultado da cromatografia.

Cromatgrafo

o equipamento atravs do qual se faz a cromatografia.

Tempo de reteno

o tempo que um analito fica em contato com a fase estacionria

Fase Estacionria: Slica (polar) Fase Mvel: Hexano (apolar)

Frente do solvente

Nvel do solvente

Amostra Fase mvel Fase estacionria Detetor

FASE MVEL:

Lquido Cromatografia Lquida (CL) HPLC Gs Cromatografia Gasosa (CG) CGAR Gs em condies supercrticas SFC (Cromatografia a fluido supercrtico)

Fluxo por gravidade

Cromatografia Clssica Tempo Volume de(min)0 5 10

FM (ml)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Massa residual (mg)0 0 23 61 36 88 40 4 0 11 20 10 3

C B AFE = CaCO3 FM = ter de Petrleo

15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Cromatografia ClssicaCromatograma120 Massa residual (mg) 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Tempo (min)

Separao dos componentes da amostra

CROMATOGRAFIA

CFS Cromatografia a Fluido Supercrtico

CL Cromatografia a Lquido

CG Cromatografia a Gs

CL Planar

CL Coluna

Cromatografia Papel

CCD Cromatografia Camada Delgada

Coluna Empacotada

Coluna "Open Tubular" Capilar dc < 350 um

Coluna Capilar empacotada dc = 8 mm

FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.

Tcnica Pr-requisito GC

Analitos Interao Fase estacionria

Volteis e termicamente estveis (nas condies de operao)

HPLC

Solveis na fase mvel

Fase estacionria e fase mvel

Sensvel

a diversas amostras, incluindo orgnicas, biomolculas e ons - Pode-se analisar um universo de substncias significativamente maior do que por GC

Cromatografia de adsoro (slido-lquido) Cromatografia de partio (lquido-lquido) Cromatografia de troca inica Cromatografia por excluso de tamanho

Ligao Inica = transferncia de eltrons Na Cl Na+ction ons

Clnion

-

Ligao Covalente = compartilhamento de um par de eltrons entre 2 tomos APOLAR: H H F F O O H POLAR: + H Cl O + H N + H H F F O O

Descrio dos grupos de substncias Apolares

EXEMPLOS Hidrocarbonetos, lipdeos, polmeros plsticos... steres, cetonas, aldedos, lcoois, amidas, aminas, heterocclicos... Sais, cidos, bases... Ismeros estruturais, geomtricos e ticos. Protenas, enzimas, polissacardeos...

Polares

Inicos Ismeros Biopolmeros

ADSORO = tendncia de acmulo de uma substncia sobre a superfcie de outra, quando 2 fases imiscveis so colocadas em contatoFASE MVEL

FASE ESTACIONRIA (slida)

QUMICA = formao de ligaes qumicas FSICA = envolve interaes como pontes de hidrognio, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, etc

* temperatura : adsoro fsica adsoro qumica

Slida Apresenta na superfcie cargas inicas ou polares. Slica gel Alumina Florisil Carvo Carbonato de clcio

Exemplos:

polarFluxo

apolar

Separao de misturas em classes de compostos de diferentes polaridadesEstrutura -CH3 -F -Cl -NO2 -CH O -O-COCH3 -OH -CO-NH2 -COOHP O L A R I D A D E

Grupo funcional Metil Fluoro Cloro Nitro Aldedo Acetil Hidroxi Ceto Amino Carbonila

Fluorocarbonos Hidrocarbonetos saturados Olefinas Hidrocarbonetos aromticos Compostos halogenados teres Nitrocompostos steres ~ Cetonas ~ Aldedos lcoois ~ Aminas Amidas Lista em ordem crescente de tempo de reteno

PARTIO = distribuio de uma substncia entre 2 fases heterogneas fluidas, imiscveis entre si. Por exemplo: um gs e um lquido, ou 2 lquidos imiscveis

FASE ESTACIONRIA Fina camada de lquido que cobre as partculas de um suporte slido Este lquido pode ser: polar: polietilenoglicol, ODPN ( , -

oxidipropionitrila) apolar: hexano

FASE MVEL Sempre de polaridade contrria Alta estabilidade

FASE ESTACIONRIA Lquido quimicamente ligado ao suporte slido. FASE MVEL Sempre de polaridade contrria Alta estabilidade

MODO

GRUPO FUNCIONAL Dimetil silil

ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO Si CH3 CH3

FASE REVERSA

Octil silil Octadecil silil

Si Si

CH2 CH2

(CH2)6 (CH2)16

CH3 CH3

Fenil silil

Si

MODO

GRUPO FUNCIONAL Amino Ciano (nitrila)

ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO NH2 CN

FASE NORMAL Diol

Si O Si O

O

CH2

CH OH

CH2OH

O

CH2

CH OH

CH2OH

1. 2. 3. 4.

Si OH + ROH Si OH + R3SiCl Si OH + SOCl2 Si Cl + RLi

Si OR

+ H2O

Si OSiR3 + HCl Si Cl Si R + SO2 + LiCl

apolar

polar polar

Fluxo

Hidrocarbonetos

aromticos, leos, esterides, plsticos, polmeros, alcalides (C18) urinrios, cidos carboxlicos, sulfonamidas, hormnios tireide, azocorantes (C8)

cidos

Classificao baseada na Natureza das Fases NPC RPC

Fase mvel Apolar hexano, isooctano Fase estacionria Polar slica, alumina Fase mvel Polar acetonitrila, metanol,

gua Fase estacionria Apolar C8, C18

GERALMENTE: NPC RPC

Cromatografia Adsoro Cromatografia Partio

FASE ESTACIONRIA = grupos inicos quimicamente ligados a um suporte (slica ou polmeros de alto PM). Pode ser: trocadora de ctions: grupo inico = sulfonato trocadora de nions: grupo inico = amnia quaternria

FASE MVEL = solues tampo (controle pH). Por exemplo: cido ctrico, fosfato de amnia, acetato de sdio, borato de sdio, etc. APLICAES = compostos inicos, aminocidos, protenas, peptdeos, etc

SO Na +

Suporte Polimrico ou de Slica

3

pH

Fluxo

+ SO 3 Na

A separao baseada no tamanho da molcula e no em fenmenos de interaes fsicas ou qumicas FASE ESTACIONRIA = partculas com dimetro mdio de poro fabricado sob medida. Assim, algumas molculas (menores) podem entrar nos poros pequenos, outras nos poros mdios, ou seja, so permeadas seletivamente. As molculas grandes so excludas excluso por tamanho.

FLUXO

Gel

Poro

Originalmente: separao de materiais biolgicos fase mvel = aquosa fase estacionria = gel de dextran/epicloridrina

FILTRAO EM GEL

Posteriormente: separao de polmeros fase mvel = solventes orgnicos fase estacionria = polmero tipo poliestireno

PERMEAO EM GEL

Controle

qualidade de polmeros de alto PM (assegurar propriedades fsicas) polmeros de baixo PM (poliestireno, ftalatos)

Separao

Tempo de reteno (tr) Largura do pico (wb)

Fator de Capacidade (k) Seletividade ( ) Resoluo (Rs) Fator de Simetria

Formato Ideal do Pico (Gaussiana)

Distribuio estatstica das molculas

A difuso pode causar alargamento do pico cromatogrfico

O Cromatograma

Rs = 2 ( tr2 tr1 ) / wb2 + wb1 Rs = separao real dos picos Rs = 0 (sem separao), Rs = 0,75 (separao ruim), Rs = 1,00 (separao parcial), Rs = 1,25 (separao da linha base).

A/B Ideal = 1

Rs

Cromatografia gasosa de alta resoluo

Substncias que podem ser arrastadas por um fluxo de um gs; Misturas cujos constituintes sejam volteis; De forma geral, CG aplicvel para separao e anlise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIO de at 300oC e sejam termicamente estveis.

2 1 3 4

6

5

1 - Reservatrio de Gs e Controles de Vazo / Presso. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatogrfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrnica de Tratamento (Amplificao) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

1. 2. 3. 4.

Temperatura do forno Vazo do gs de arraste Escolha da fase estacionria Temperatura de injeo e do detector

A Fase Mvel em CG no interage com a amostra; ela apenas a carrega atravs da coluna. Assim usualmente referida como GS DE ARRASTE; Requisitos:

INERTE No deve reagir com a amostra, fase

estacionria ou superfcies do instrumento; PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionria.

2 4

1 3

1 - Septo (silicone) 2 - Alimentao de gs de arraste)

TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposio; Regra Geral: Tin = 50oC acima da j temperatura de ebulio do componente menos voltil; VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado fsico da amostra. Tpico: poucos microlitros (amostra lquida em coluna capilar)

Microsseringa de 10 L:

mbolo

agulha (inox 316)

corpo (pirex)

Coluna

EMPACOTADA (pouco usada) = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m

CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 mParedes internas recobertas

Depositados sobre a superfcie de: s-lidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares)FE lquida SUPORTE Slido inerte poroso Tubo capilar de material inerte

LQUIDOS

Para minimizar a perda de FE lquida por volatilizao, normalmente ela : Entrecruzada: as cadeias polimricas so quimicamente ligadas entre si Quimicamente ligadas: as cadeias polimricas so presas ao suporte por ligaes qumicas

Colunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou depositado sobre a superfcie

SLIDOS

AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO Maior flexibilidade na otimizao da separao; BOA ESTABILIDADE QUMICA E TRMICA Maior durabilidade da coluna, no reage com componentes da amostra; POUCO VISCOSA Colunas mais eficientes (menor resistncia transferncia do analito entre fases); DISPONVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA Colunas reprodutveis; ausncia de picos fantasma nos cromatogramas.

ColunaAlm da interao com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna Estrutura depende de sua PRESSO DE VAPOR p0 = f qumica (p0). Temperatur do analito a da colunaTemperatura da coluna Presso de vapor Velocidade de migrao

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR

FE Slidas: AdsoroO fenmemo fsico-qumico responsvel pela interao analito + FE slida a

ADSORO

A adsoro ocorre na interface entre o gs de arraste e a FE slida Slidos com grandes reas superficiais (partculas finas, poros) ADSORO Solutos polares Slidos com grande nmero de stios ativos (hidroxilas, pares de eletrons...)

- Grandes reas superficiais (at 102 m2/g).

Caractersticas - Slidos finamente granulados (dimetros de parGerais: tculas tpicos de 105 m a 420 m). Mais usados:

Polmeros Porosos Porapak (copolmero estireno-divinilbenzeno), Tenax (polixido de difenileno) Slidos Inorgnicos Carboplot, Carboxen (carves ativos grafitizados), Alumina, Peneira Molecular (argila microporosa) Principais Aplicaes:- Separao de gases fixos - Compostos leves - Sries homlogasGASES DE REFINARIA Coluna:Carboxen-1000 60-80 mesh; 15 x 1/8 TCO : 35oC a 225oC / 20oC. min-1 L Gs de Arraste: He @ 30 ml.min-1 Detector: TCD

FE Lquidas: PartioPOLIGLICISMuito polares; sensveis a umidade e oxidao; ainda muito importantes. Principal: Polietilenoglicol (nomes comerciais: H O OH Carbowax, DB-Wax, Supelcowax,CH2 CH2 etc.) HP-Wax, Estrutura Qumica:n

AMINAS ALIFTICAS Coluna:4 % Carbowax 20M s/ Carbopack B + 0,8% KOH TCO : 200oC L (isotrmico) Gs de Arraste: N2 @ 20 mL.min-1 Detector: FID Amostra: 0,01 L da mistura de aminas

Maior parte das aplicaes em CG moderna Quatro grandes grupos estruturais:

PARAFINAS

Apolares; alta inrcia qumica; praticamente abandonadas. Principais: esqua-lano (C30 H62 ), Apiezon (graxas para vcuo).

POLISTERES

steres de dilcoois com dicidos. Polares; altamente sensveis a umidade e oxidao; uso em declnio. Principais: DEGS, EGA, EGS.STERES METLICOS DE CIDOS GRAXOS Coluna:5%DEGS-PS s/ Supel-coport 100/120 mesh; 6 x 1/8 TCO : 200oC (isotrmico) L Gs de Arraste: N2 @ 20 ml.min-1 Detector: FID Amostra: 0,5 L de soluo em clorofrmio contendo 0,5 g de cada

O fenmemo fsico-qumico responsvel pela interao analito + FE lquida a

Partio

A partio ocorre no interior do filme de FE lquida Filmes espessos de FE lquida ABSORO Grande superfcie lquida exposta ao gs de arraste Interao forte entre a FE lquida e o analito (grande solubilidade)

SILICONES (polisiloxanas)CH3 Si CH3 R1 Si R2 CH3 Si CH3 H3C O O n CH3

As FE mais empregadas em CG. Cobrem ampla faixa de polaridades e propriedades qumicas diversas. R1, R2 = qualquer radical orgnico

- Ligao Si-O extremamente estvel = elevada estabilidade trmica e qumica das FE. - Silicones so fabricados em larga escala para diversas aplicaes = minimizao de custo do produto + tecnologia de produo e purificao largamente estudada e conhecida. - Praticamente qualquer radical orgnico ou inorgnico pode ser ligado cadeia polimrica = FE ajustveis a separaes especficas + facilidade de imobilizao por entrecruzamento

FE derivadas de polidimetilsiloxano (PDMS) por substituio de -CH3 por radicais orgnicos, em ordem crescente aproximada de polaridade:

Su Diferenas entre FE de composio similar provenientes de fornecedores diferentes:

Separao de pesticidas - FE = 100 % PDMS1 - TCNB 2 - Dichloram 3 - Lindano 4 - PCNB 5 - Pentacloroanilina 6 - Ronilano 7 - Antor 8 - pp-DDE 9 - Rovral 10 - Cypermetrin 11 - Decametrin

17 min

Coluna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 m) o o o o -1 TCO :195 C (6,5 min) / 195 C a 275 C (10 C.min ) L Gs de Arraste: He @ 35 cm.min-1 Detector: FID

Separao de piridinas - FE = 100 % CNpropilsilicone1 2 3 4 5 6 piridina 2-metilpiridina 2,6-dimetilpiridina 2-etilpiridina 3-metilpiridina 4-metilpiridina

3 min

Coluna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 m) o TCO :110 C (isotrmico) L Detector: FID Gs de Arraste: N2 @ 16 cm.min-1 Amostra: 0,1

L de soluo 1-2% das piridinas em 3-

Separao de fenis - FE = fenilmetilsilicones

50% Ph 50% Me 5% Ph 95% Me

Colunas empacotadasTubo de material inerte recheado com FE slida granulada ou FE lquida depositada sobre suporte slido. MATERIAL DO TUBOao inox vidro pirex nquel TEFLON MESH

= 3 mm a 6 mm L = 0,5 m a 5 mdp 177 - 250 m 149 - 177 m 125 - 149 m

Granulometria do recheio

60 - 80 mesh 80 - 100 mesh 100 - 120 mesh

Eficincia maximizada com: - Diminuio de dC - Diminuio de dp - Recheio regularLimitados pela resistncia passagem de gs de arraste

Colunas empacotadasA FE lquida deve ser disposta sobre um

SUPORTE slidoUso quase universal:

rea superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1 microporos regulares (~ 1 m) NO interagir com a amostra boa resistncia mecnica

TERRA DIATOMCEA

Esqueletos fsseis (SiO2 + xidos metlicos) de algas microscpicas

secagem calcinao fuso com soda lavagem com cido silanizao

Chromosorb Anachrom Supelcoport ...

COLUNAS EMPACOTADASFE Lquidas: SuporteTamanho de Poro Densidade Aparente

Chromosorb - caractersticas geraisrea Superficial

NM OEC r ms r P ho o ob C r ms r W ho o ob C r ms r G ho o ob

m

2

.g

1

g l .m

1

m

Tratamentos especiais:

4 ,0 1 ,0 0 ,5

04 ,7 02 ,4 05 ,8

04- 2 , 8- 9 -

3 0 1 5 5

AW Lavado com cido, para remoo de metais NAW Sem lavagem com cido HP ou DMCS ou HDMS Silanizados (menor adsoro)

% M x. de FE

Chromosorb P Rseo, muito ativo. Chromosorb W Branco, mais inerte que o P. Chromosorb G Similar ao W, maior resistncia mecnicaOrdem crescente de inrcia

Colunas capilaresTubo fino de material inerte com FE lquida ou slida depositada sobre as paredes internas. MATERIAL DO TUBOslica fundida vidro pirex ao inox Nylon Silcosteel

= 0,1 mm a 0,5 mm L=5m a 100 m

Colunas de slica so revestidas externamente com camada de polmero (poliimida) para aumentar resistncia mecnica e qumica

Colunas Capilares x Empacotadas:CAPILARE S L = N Colunas mais eficientes Vi Dispositivos especiais de injeo

Separao de PAH com LVI (Vinj = 25 L, soluo 400 ppb em CH2Cl2)

Coluna: HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 m) TCO : 5 min a 50C / 20C min-1 / 2 min A 320C L Gs de Arraste: He @ 2 ml.min-1 Detector: FID

Temperatura de colunaTEMPERATUR A DA COLUNACONTROLE CONFIVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA

Forno da colunaCaractersticas Desejveis de um AMPLA FAIXA DE TEMPERATURA Forno: DE USO Pelo menos de Tamiente at b 400oC. Sistemas criognicos (T < Tamiente ) podem ser necessrios em b casos especiais. TEMPERATURA INDEPENDENTE DOS DEMAIS MDULOS No deve ser afetado pela temperatura do

TCO BAIXA: L

- Componentes mais volteis so separados - Componentes menos vol-teis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos

TCO ALTA: L

- Componentes mais volteis no so separados - Componentes menos volteis eluem mais rapidamente

Programao linear de Temperatura de colunaConsegue-se boa separao dos componentes da amostra em menor tempo Parmetros de uma programao de temperatura: TIN Temperatura Inicial I TFIM Temperatura Final tIN Tempo Isotrmico Inicial I tFIM Tempo Final do Programa R Velocidade de AquecimentoTEMPERAT URATFIM R TIN I tIN I tFIM

TEMPO

DetectoresDispositivos que examinam continuamente o material que sai da coluna, gerando sinal quando da passagem de substncias que no o gs de arraste

Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA dealmente: cada substncia separada aparece

Desempenho de detectoresQUANTIDADE MNIMA DETECTVELMassa de um analito que gera um pico com altura igual a trs vezes o nvel de rudoSINA L (S)

= S N 3RUDO (N)

RUDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que no se origina da amostra

Fontes de Rudo

Contaminantes nos gases Impurezas acumuladas no detector Aterramento eltrico deficiente

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU TCD): Variao da condutividade trmica

do gs de arraste.

DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID) ons gerados durante a queima dos

eluatos em uma chama de H2 + ar. DETECTOR

OU ECD) Supresso de corrente causada pela

POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE

absoro de eltrons por eluatos altamente eletroflicos.

PRINCPIO:

DCT

Variao na condutividade trmica do gs quando da eluio de um analito.A taxa de transferncia de calor entre um corpo quente e um corpo frio depende da condutividade trmica do gs no espao que separa os corpos

Se a condutividade trmica do gs diminui, a quantidade de calor transferido tambm diminui - o corpo quente se aquece.

Cela de Deteco do DCT:

i5 4 2 1 3

1 Bloco metlico (ao) 2 Entrada de gs de arraste 3 Sada de gs de arraste 4 Filamento metlico (liga W-Re)aquecido

5 Alimentao de corrente eltricapara aquecimento do filamento

PRINCPIO

DIC

Formao de ons quando um composto queimado em uma chama de hidrognio e oxignioO efluente da coluna misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 + O2 no existem ons, ela no conduz corrente eltrica.

Quando um composto orgnico elui, ele tambm queimado. Como na sua queima so formados ons, a chama passa a conduzir corrente eltrica

COLETOR

ARFLAME TIP

H2BLOCO

COLUNAO ar e o H2 difundem para o interior do coletor, onde se misturam ao efluente da coluna e queimam: Uma diferena de potencial eltrico aplicada entre o flame tip e o coletor - quando se formam ons na chama, flui uma corrente eltrica:

Compostos que NO produzem resposta no DIC:Gases nobres NH3, NxOy

H2, O2, N2

SiX4 (X = halognio)

CO, CO2, CS2

H2 O

CCl4, peralogenados

HCOOH, HCHO *

PRINCPIO

Captura de eltrons

Supresso de um fluxo de eletrons lentos (termais) causada pela sua absoro por espcies eletroflicas Um fluxo contnuo de eletrons lentos estabelecido entre um ando (fonte radioativa -emissora) e um catodo.

Na passagem de uma substncia eletroflica alguns eletrons so absorvidos, resultando uma supresso de corrente eltrica.

2 3

1

4 5 1 2 4Anodo (fonte radioativa - emissora)

Sada de gases Cavidade

3 5

Catodo Coluna cromatogrfica

HPLC

CLAECromatografia Lquida de Alta Eficincia

HPLC ModernaInjetor Pr-coluna

Reservatrios para os solventes

Bomba HPLC Coluna Analtica

Sistema de Tratamento de Dados

Detector Filtro em linha Scavenger

Velocidade

fluxo

0,1-3,0 mL/mim para colunas analticas > 5,0 mL/min para colunas preparativas

Presso

operao

500-2000 psi para colunas analticas

Entrada

Filtros

Tubo

Recheio

Filtro Sada

Serve para proteger a coluna de separao. Fase e dimetro iguais aos da coluna de separao. 10-20% do comprimento da coluna de separao

ISOCRTICA = a composio da fase mvel no muda durante a corrida. = a composio da fase mvel varia durante a anlise, de acordo com a natureza dos analitos.

GRADIENTE

Passo Solve

1

30

Solvatante Baixa Viscosidade Transparncia no UV No Fluorescncia

Baixa presso de vapor Atxico No corrosivo No inflamvel Baixo Custo

Agitao mecnica ou magntica

Aquecimento Banho

de ultrassom a vcuo de gs inerte

Filtrao

Borbulhamento

Solvente de base gua / tampo Metanol Acetonitrila THFFora de eluio

Solventes moduladores

Solvente de base n-hexano Solventes moduladores Clorofrmio Acetato de etila MetanolFora de eluio

Equipamento com uma pequena clula de fluxo conectado na sada da coluna e que monitora a concentrao dos analitos. mais comuns: UV/Vis (absorvncia) ndice de Refrao Espectrmetro de Massas Fluorescncia Outros: Eletroqumico, Condutividade,

Detectores

Infravermelho, etc.

PRINCPIO: quando vrios grupos funcionais so expostos radiao, sofrem excitao eletrnica a qual resulta na absoro de energia em comprimentos de onda especficos para os grupos. Comprimento de onda: 210-380 nm UV Comprimento de onda: 380-800 nm Visvel 90% compostos orgnicos absorvem luz em alguma regio do UV-Vis 65% das amostras analisadas por CL absorvem luz na regio de comprimento de onda = 254 nm

Detector UV-VIS

Detectam compostos com fluorescncia natural (aflatoxinas) ou que se tornam fluorescentes aps reao de derivao (cloreto dansyl, fluorescena, OPA)

PRINCPIO: mede a mudana do ndice de refrao do efluente da coluna IR : caracterstica fsica de cada composto IR da substncia analisada IR da fase mvel Anlise isocrtica, controle de temperatura Detector universal, no seletivo e pouco sensvel Aplicaes: separaes preparativas, cromatografia de excluso por tamanho, acares, etc.

SENSIBILIDADE Fluorescncia: 1.000 vezes mais sensvel que

UV-Vis UV-Vis: 1.000 vezes mais sensvel que IR ESPECIFICIDADE

Aumenta com a sensibilidade

Amostra: Coluna:

quantidades indicadas ao lado

50 l,

SB-C18 4,6 x 75 mm 3,5 m

Fase Mvel:

70 mM KH2PO4 1 mM EDTA/ACN:gua 97/3 pH 4,5; ml/min; 1,5

Fluxo:

Temperatura: ambiente Eletroqumico Detetor:

Fluorescencia.

Pode-se efetuar anlises qualitativas e quantitativas com rapidez mais moderna

Tecnologia Pode-se

fazer identificaes de substncias de forma inequvoca

e- 70 eV70 e- < eV A+

ABC

A B C+ . e- de baixa energia.

+BC A.

AB.

.

+ C+

+ B C+ A B+ + C A+ + B

B+ + C B + C+

A + B+

Partculas

da fase estacionria extremamente pequenas (dimetro < 10 m) bombas para operaes a altas presses (at 2000 psi) e baixas vazes (0,1 a 10 mL / min) especiais e ultra-puros

Solventes

Detectores

seletivos e supersensveis, com tamanho de clula de deteco < 10 L

Vantagens da HPLC: Alta resoluo

resolve (separa) at centenas de componentes em amostras complexas Deteco de alta sensibilidade detecta at nos limites de pg - ng Anlises rpidas e precisas anlises de 1 - 60 min, preciso de 1% RSD Anlises automatizadas usando injetor automtico e sistema de tratamento de dados

Substncias qumicas Pouco volteis Polares ou inica Macromolculas Termicamente instveis Enanciomricas Biomolculas

Requisito: A mistura a ser analisada deve ser solvel na fase mvel.

Amostra

PM < 1.000 Insolvel gua Solvel hexano Solvel metanol Amostra no-aquosa NPC (slica) NPC (fase ligada) Solvel gua

PM > 1.000

No-inica

Inica

Amostra aquosa RPC RPC "ion-pair" Cromatografia troca inica

Biopolmeros solveis gua Polmeros insolveis gua Condies no-desnaturantes Preparativa Informao tamanho Cromatografia permeao gel Cromatografia filtrao gel Preparativa Cromatografia troca inica RPC Condies desnaturantes (separao analtica)

Todos os clculos so feitos a partir da rea de um pico, fornecida ao final da corrida; Os compostos de interesse no podem sofrer adsoro, decomposio trmica ou decomposio cataltica no sistema cromatogrfico; Os padres devem ter alta pureza; O pico de interesse deve corresponder a somente uma substncia, ou seja, no deve ocorrer coeluio.

A quantidade de massa analisada deve estar na faixa linear de resposta do detector, do amplificador e do sistema de integrao; Conhecimento mximo possvel da amostra (presena de substncias no detectveis e /ou no eludas); Repetibilidade.

Do

volume injetado; Da concentrao da substncia; Do fator de resposta de uma dada substncia em determinado detector.

Considera que o fator de resposta o mesmo para todas as substncias. Assim, a composio percentual de um composto A dada por:

SA %A = x100 S Onde SA a rea do pico correspondente substncia A e S a rea total do cromatograma.

VANTAGENS

DESVANTAGENS

Simples e prtica; Independe do volume injetado; Independe da estabilidade do aparelho; No necessria a utilizao de padres.

No serve para amostras complexas; Exige o registro de todos os componentes da amostra; No adequada para anlise de pequenas concentraes; Normalmente a exatido baixa; Presume que todos os constituintes tem a mesma resposta no detector.

Em

uma anlise do progresso da reao A B, retirou-se uma alquota do meio reacional e realizouse uma anlise por CGAR, resultando em um pico de rea 3500 para o composto A e 5000 para o composto B. Qual o rendimento da reao?

Anloga

normalizao interna, mas leva em considerao os diferentes fatores de resposta de cada substncia. Esses fatores so determinados atravs da injeo de padres de concentrao conhecida de todos os constituintes da amostra.

Uma amostra de duas substncias, A e B foi analisada cromatograficamente, obtendo-se dois picos distintos, de reas iguais a 200 e 400 respectivamente. A fim de se determinar os fatores de resposta, foi injetada uma amostra contendo a mesma concentrao de cada substncia, resultando em reas iguais a 120 e 80. Qual a composio da amostra?

Anloga

utilizada em espectrofotometria. Desta vez, temse a curva de calibrao em rea x concentrao. Para facilitar os clculos, injeta-se sempre o mesmo volume; As condies do cromatgrafo devem ser mantidas constantes.

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possvel quantificar apenas um pico; Independe da deteco de todos os constituintes da amostra (serve para amostras mais complexas); Possvel anlise de concentraes pequenas (traos).

Depende do volume injetado (evitvel), que carrega uma incerteza; Depende da estabilidade do cromatgrafo e do detector durante todo o anlise.

muito difcil analisar amostras exatamente nas mesmas condies dos padres; Um padro injetado concomitantemente amostra de concentrao desconhecida; Escolha do padro interno:

No deve estar presente na amostra; Deve ter comportamento cromatogrfico similar ao

da substncia a ser analisada; Estar numa concentrao conhecida; Ser termicamente estvel; No ficar adsorvido na fase estacionria; T.R. diferente dos constituintes da amostra.

A curva de calibrao tem a forma:Sx CX = f X / PI S PI C PI

Onde

Sx a rea do pico correspondente substncia x; SPI a rea do padro interno; C as concentraes e f o fator relativo.

Preparam-se vrios padres com vrias concentraes conhecidas da substncia a ser analisada; Adiciona-se uma quantidade conhecida do padro interno, de modo que as reas (do padro e do PI) sejam semelhantes; Constroi-se um grfico em que o eixo X a razo da concentrao (ou massa) da substncia em anlise pela concentrao (ou massa) do padro interno e o eixo y a relao entre as reas da substncia X e do padro interno; Para anlise da amostra desconhecida introduz-se, de preferncia, a mesma quantidade de padro interno utilizada no preparo dos padres; Injeta-se a mistura, calculam-se as reas da substncia e do PI e as relaes entre elas e interpola-se no grfico obtido anteriormente, de modo a se obter a relao de concentrao. E, a partir do resultado obtido, calcula-se a concentrao de X na amostra desconhecida.

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No so necessrios vrios padres, como acontece na normalizao das reas; As mesmas da padronizao externa e mais: Volume injetado e

Dificuldade na escolha de um padro interno que atenda a todos os requisitos necessrios para uma dada anlise;

estabilidade do cromatgrafo deixam de ser um fator limitante

Anlise

de cloreto de vinila, usando hexano como padro interno. Construo da curva:

Y

= 1,1436x 0,0125 Pela relao das reas obtidas, y = 1,458. Nesse ponto, X = 1,286. Assim:Cx = 1,286 C PI C x = 1,286C PI = 1,286 x 2 = 2,573 ppm