desenvolvimento de método para identificação de “off-flavours” em cerveja

Programa de Ps-Graduao Stricto Sensu Mestrado Profissional em Cincia e Tecnologia de Alimentos

Campus Rio de Janeiro

Gisele Chaves da Silva

DESENVOLVIMENTO DE MTODO PARA IDENTIFICAO DE OFF-FLAVOURS EM CERVEJA

Rio de Janeiro - RJ

2013



Trabalho de Concluso de Dissertao apresentado ao Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia como requisito parcial para obteno do ttulo de Mestre em Cincia e Tecnologia de Alimentos.

Orientador: Prof. Dr. Ronoel Luiz de O. Godoy Co-orientadora: Profa. Dra. Renata S. L.Raices

Rio de Janeiro-RJ

2013

S586 Silva, Gisele Chaves da. Desenvolvimento de mtodo para identificao de off-flavours em

cerveja / Gisele Chaves da Silva. 2013. 71 f. : il. ; 21 cm. Dissertao - (Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos)

Instituto Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2013. Bibliografia: f.: 69-71. 1. Cerveja Anlise sensorial. 2. Cerveja Compostos volteis. I.

Ttulo.

CDU 663.4



Trabalho de Concluso de Dissertao

apresentado ao Instituto Federal de Educao,

Cincia e Tecnologia como requisito parcial

para obteno do ttulo de Mestre em Cincia e

Tecnologia de Alimentos.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por tudo que sou e por tudo que conquistei, a Ele toda honra e toda glria. minha famlia, que sempre me inspirou a lutar pelos meus sonhos e me ensinou que para Deus nada impossvel.

Ao meu esposo, que com seu apoio e pacincia, me estimulou a nunca desanimar, mesmo nos momentos mais difceis.

Ao Professor Doutor Ronoel Luiz de O. Godoy, D.Sc. e Professora Doutora Renata S.L. Raices, D.Sc., pela orientao e incentivo na elaborao desta dissertao.

Aos bolsistas Abner Alves Serapio da Silva e Larissa de Souza Nunes da Silva e aos tcnicos Wagner Costa da Silva e Cosme da Costa Santos pelo empenho e dedicao na realizao dos testes analticos.

Aos membros da banca examinadora, pela participao. A todos os amigos que, de forma direta ou indireta, contriburam para a concluso desta etapa da minha vida.

Silva, G.C. Desenvolvimento de mtodo para identificao de off-flavours em cerveja.71p. Trabalho de Concluso de Dissertao apresentado ao Programa de Ps-graduao Stricto Sensu em Cincia e Tecnologia de Alimentos- IFRJ, Campus Rio de Janeiro, 2013.

RESUMO

Atualmente, tem-se disponvel no mercado externo Kits de cpsulas contendo flavours de

possveis defeitos da cerveja. Essas cpsulas podem ser diludas em cerveja e usadas, na anlise

sensorial, para a capacitao de degustadores na identificao de off-flavours indesejveis ao

sabor do produto. Nas cervejarias, essa tcnica usa o homem como nico instrumento de

medio, o que desperta a real necessidade de desenvolver uma metodologia analtica

alternativa para a identificao destes compostos. Este trabalho desenvolveu mtodos de fcil

aplicao que possibilitam a identificao de steres e dicetonas vicinais a um tempo hbil para

atender as necessidades da indstria. Para o seu desenvolvimento, fez-se necessrio investigar

compostos de impacto da cerveja (de menor limiar de percepo) a fim de identificar o aroma

dos mesmos atravs da composio de sua essncia. As anlises de volteis foram realizadas

atravs da tcnica de microextrao em fase slida seguida de cromatografia gasosa de alta

resoluo acoplada a detector e espectrometria de massas (SPME-CGAR-EM) e extrao

Headspace (HS) com posterior cromatografia gasosa de alta resoluo acoplada a detector de

captura de eltrons (HS-CGAR-DCE) em 15 cervejas de marcas conhecidas nos mercados

nacional e internacional. Pde-se observar, para a identificao dos steres acetato de etila,

acetato de isoamila e hexanoato de etila atravs da primeira tcnica aplicada (SPME-CGAR-

EM), resultados abaixo do limiar de percepo do degustador (acetato de etila 90000 ppb,

acetato de isoamila- 4200 ppb e hexanoato de etila- 600 ppb). No entanto, no foram observados

sinais referentes s dicetonas vicinais nos cromatogramas avaliados. Por fim, aplicou-se a

segunda tcnica (HS-CGAR-DCE) para avaliao de dicetonas vicinais, que tambm

apresentaram resultados para a anlise do off-flavour diacetil abaixo do limiar de percepo

do degustador (1455 ppb). As tcnicas empregadas para anlise de volteis, HS-CGAR- DCE

e SPME-CGAR-EM se mostraram eficientes e de fcil aplicabilidade em uma indstria

alimentcia. Critrios de validao usados como instrumento de medio para avaliar o

desempenho do mtodo desenvolvido, possibilitam que o mesmo seja usado na avaliao de

off-flavours em cerveja, visto que , mostrou ser seletivo, linear, preciso, exato e robusto.

Palavras-Chave: Cerveja. Anlise sensorial. Compostos volteis. Silva, GC. Method development for identification of "off-flavors" in cerveja.71p Research Project Master level presented to the Post-graduate studies in Science and Technology-Food IFRJ, Campus Rio de Janeiro, 2013.

ABSTRACT

Currently, there are kits which are available in the external market with capsules containing

flavors of possible beer defects. These capsules can be diluted and used in beer sensory analysis

to train tasters to identify "off-flavors", which are undesirable flavors in the product. In

breweries, this technique uses the man as the sole measuring instrument, which demonstrates

the real need to develop an alternative analytical methodology for the identification of these

compounds. This paper has developed easy-to-apply methods that enable the identification of

esters and vicinal diketones in time to meet the needs of the industry. For the development of

such methods, it was necessary to investigate the impact of beer compunds (of low perception

threshold) in order to identify the aroma of the these compounds through their composing

essence. Volatile analysis were performed using the SPME extraction technique followed by

gas chromatography with mass selective detector (SPME-GC-MS) and Extraction "Headspace"

with subsequent gas chromatography with electron capture detector (HS-GC-ECD) in 15 beers

of known brands in domestic and international markets. The first technique (SPME-CGAR-

EM) demonstrated results below the tasters perception threshold for the identification of the

ethyl acetate, isoamyl acetate and ethyl hexanoate esters (ethyl acetate 90000 ppb, isoamyl

acetate- 4200 ppb and ethyl hexanoate- 600 ppb). However, no signals could be observed for

vicinal diketones in the assessed chromatograms. The second technique used for assessing

vicinal diketones (HS-CGAR-DCE) also demonstrated results below the tasters perception

threshold (1455 ppb) for the identification of the off-flavour diacetyl. The applied techniques

for the volatile analysis (HS-CGAR- DCE e SPME-CGAR-EM) proved to be efficient and easy

to be applied by the food industry. Validation criteria used as measurement instruments to

assess the method developed by this research allow it to be used in off-flavour assessment in

beer, once it proved to be selective, linear, precise and robust.

Keywords: Beer. Sensory analysis. Volatile compounds.

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 Estruturas das Humulonas e Lupulunas.....

17

Figura 2 Esquema de uso do amostrador SPME para processo de extrao ............. e de dessoro do material extrado para anlise por CGAR

43

Figura 3 Cromatograma de steres de amostra cerveja preparada com o ................ Mix de Off-flavours por SPME-CGAR-EM

49

Figura 4 Cromatograma de dicetonas vicinais de amostra preparada com ...................2,3- Butanodiona (Diacetil) e 2,3-Pentanodiona por HS-CGAR ...................DCE

50

Figura 5 Curva de calibrao 1 preparada com 2,3- Butanodiona (Diacetil) ...................e 2,3-Pentanodiona por HS-CGAR-DCE.

53


53


53

Figura 8 Curva de calibrao1, 2 e 3 preparada com Acetato de isoamila ...................por SPME-CGAR-EM.

54

Figura 9 Curva de calibrao 1, 2 e 3 preparada com Acetato de etila por ................ SPME-CGAR-EM.

55

Figura 10 Curva de calibrao 1, 2 e 3 preparada com Hexanoato de etila ...................por SPME-CGAR-EM.

56

Figura 11 Curva de calibrao preparada com Acetato de isoamila por ...................SPME-CGAR-EM fibra quebrada.

60

Figura 12 Curva de calibrao preparada com Acetato de etila por SPME-,............ CGAR-EM fibra quebrada.

60

Figura13 Curva de calibrao preparada com Hexanoato de etila por .................SPME-CGAR-EM fibra quebrada.

60

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Termos descritivos empregados com as suas expectativas definies e ............ ....referncias

24

Tabela 2 Off-flavours relacionados com origem na produo de cerveja..

26

Tabela 3 Valores de concentrao e rea das curvas 1, 2 e 3 de 0,2 a .120 % - 2,3 - ..................Butanodiona (Diacetil) em cerveja por HS-CGAR-DCE

57

Tabela 4 Equaes das curvas 1, 2 e 3-2,3 -Butanodiona (Diacetil) por HS-CGAR-DCE

57

Tabela 5 Valores de concentrao e rea das curvas 1, 2 e 3 de 26,7 a 140 % - Acetato ..................de Isoamila em cerveja por SPME-CGAR-EM

58

Tabela 6 Valores de concentrao e rea das curvas 1, 2 e 3 de 26,7 a 140 % - Acetato ..................de Etila em cerveja por SPME-CGAR-EM

58

Tabela 7 Valores de concentrao e rea das curvas 1, 2 e 3 de 26,7 a 140% - ................ Hexanoato de Etila em cerveja por SPME-CGAR-EM

58

Tabela 8 Equaes das curvas 1, 2 e 3dos steres cerveja por SPME-.CGAR-EM

59

Tabela 9 Repetitividade padro 4 (2,3Butanodiona) nas curvas 1, 2 e 3 em .cerveja ..................HS-CGAR-DCE

61

Tabela 10 Repetitividade padro 4 (Acetato de Isoamila) nas curvas 1, 2 e 3 .em cerveja .................. SPME-CGAR-EM

62

Tabela 11 Repetitividade padro 4 (Acetato de Etila) nas curvas 1, 2 e 3 em .cerveja ..................SPME-CGAR-EM

62

Tabela 12 Repetitividade padro 4 (Hexanoato de Etila) nas curvas 1, 2 e 3 .em cerveja .................. SPME-CGAR-EM

62

Tabela 13 Clculo Preciso e Exatido 63

Tabela 14 Avaliao da Robustez - 2,3-Butanodiona em .cerveja HS-CGAR-DCE

64

Tabela 15 Avaliao da Robustez - Acetato de Isoamila em cerveja SPME-CGAR-EM Tabela 16 Avaliao da Robustez - Acetato de Etila em cerveja SPME-CGAR-EM Tabela 17 Avaliao da Robustez Hexanoato de Etila em cerveja SPME-CGAR-EM

65

65

66

67

Tabela 18 Concentraes dos principais off-flavours encontrados em 15 cervejas de .................marca reconhecida no mercado analisado pelas.tcnicas HS-CGAR-EM e HS-.................CGAR-DCE

LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS

HS Headspace ......

SPME Microextrao em Fase Slida

CGAR-DCE... Cromatografia Gasosa de Alta Resoluo em Detector de Captura de

..........................Eltrons

CGAR-EM... Cromatografia Gasosa de Alta Resoluo em Espectrometro de Massa

CV ................ Coeficiente de variao

DP ............ .Desvio Padro

DPR .......... Desvio Padro Relativo

SUMRIO

1 INTRODUO.................................................. 12 2 REVISO BIBLIOGRAFICA................................................................... 14 2.1 CERVEJA: DEFINIO E UM BREVE HISTRICO............................. 14

2.2 INGREDIENTES DA CERVEJA 16

2.2.1 Malte........................................................................................................ 16 2.2.2 Lpulo..................................................................................................... 17 2.2.3 Levedura 18 2.2.4 gua 19 2.3 PROCESSO DE PRODUO DA CERVEJA...................................... 19

2.3.1 Brassagem 19

2.3.2 Fermentao 20 2.3.3 Maturao 20 2.3.4 Filtrao 21 2.3.5 Envase e Pasteurizao 21 2.4 ANLISE SENSORIAL E A CERVEJARIA............................................. 22

2.4.1 Off-flavours do processo produtivo.................................................... 24 2.5 TCNICAS PARA ANLISES DE OFF-FLAVOURS EM CERVEJA 34 3 JUSTIFICATIVA.......................................................................................... 38 4 OBJETIVOS.................................................................................................. 39 4.1 OBJETIVO GERAL..................................................................................... 39

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ...................................................................... 39

5 MATERIAIS E MTODOS......................................................................... 40 6 RESULTADOS E DISCUSSO 48 7 CONCLUSO........................................................................................ 68 8 REFERENCIAS..................................................... 69 ............................................................................................

12

1 INTRODUO

A Cerveja, assim como o vinho, uma bebida alcolica obtida atravs de processos

fermentativos. Para a sua produo so usados malte, lpulo, levedura e gua como

ingredientes. Seu processo produtivo engloba diversas etapas, tais como: brassagem,

fermentao, maturao, filtrao e envase.

Esto disponveis no mercado cervejas do tipo Ale e do tipo Lager. As cervejas do

Tipo Ale so oriundas de processos fermentativos considerados de alta fermentao e as do

tipo Lager de baixa fermentao, sendo o sabor e aromas das cervejas tipo Lager mais

suaves e leves (ARAJO, SILVA e MININ, 2003).

O consumidor dessa bebida tem sido cada vez mais exigente quanto qualidade sensorial

dos produtos disponveis nas prateleiras dos mercados. Alm disso, a busca pelo produto que

tenha melhor qualidade e menor preo tem sido crescente. Por esses motivos as cervejarias

preocupam-se em ter no mercado uma cerveja que tenha suas caractersticas sensoriais e fsico-

qumicas inalteradas.

O controle de qualidade de todas as etapas do processo de produo da cerveja

fundamental para a indstria, que deseja manter um produto de reconhecida marca no mercado.

Alm das anlises fsico-qumicas, necessrio garantir tambm a confiabilidade da anlise

sensorial na indstria. Essa anlise realizada pelo painel de degustao, que composto por

cervejeiros com formao externa e leigos, isto , funcionrios selecionados e capacitados para

a degustao.

A capacitao desse painel realizada atravs de treinamentos peridicos com os possveis

off-flavours inerentes da produo da cerveja, os quais so sabores ou odores residuais que

esto fora do perfil caracterstico da cerveja.

Para o preparo desses off-flavours, o gestor de anlise sensorial conta com um kit

disponvel no mercado internacional, de rpida e prtica utilizao, o que o torna adequado

para a rotina dinmica da indstria. No entanto, essa tcnica usa o homem como nico

instrumento de medio para a identificao de off-flavours em cerveja. Em virtude da

preocupao da indstria com a sade de degustador, o nmero de provas a serem degustadas

por pessoa limitado, necessitando um maior nmero de degustadores para degustao de

rotina, o que desperta nas cervejarias a real necessidade de desenvolver uma metodologia

analtica alternativa para a identificao destes, com um maior nmero de resultados liberados.

13

Este trabalho desenvolveu mtodos para a identificao de off-flavours tendo em vista

as necessidades da indstria. Para isso, a identificao de aromas de impacto na cerveja contou

com as anlises de volteis atravs da tcnica de microextrao em fase slida seguida de

cromatografia gasosa de alta resoluo acoplada a detector e espectrometria de massas (SPME-

CGAR-EM) e extrao Headspace (HS) com posterior cromatografia gasosa de alta resoluo

acoplada a detector de captura de eltrons (HS-CGAR-DCE) em 15 cervejas de marcas

conhecidas nos mercados nacional e internacional.

14

2 REVISO BIBLIOGRAFICA 2.1. CERVEJA: DEFINIO E UM BREVE HISTRICO

A cerveja uma bebida carbonatada que possui teor alcolico entre 3% e 8%. Sua produo

exige o uso de cevada germinada (malte), lpulo, levedura e gua. Pode conter tambm outras

fontes de carboidratos tais como: milho, arroz e trigo (SIQUEIRA, BOLINI e MACEDO, 2008;

BELITZ e GROSCH, 1999; FERREIRA, 2007).

Essa bebida pode ser considerada uma boa fonte de polifenis provenientes do malte ou

lpulo e pode trazer alguns benefcios a sade para quem a consome moderadamente. Sua

capacidade antioxidante e baixo teor alcolico permitem melhorar a atividade antioxidante do

plasma evitando doenas coronrias. Seu consumo moderado capaz de influenciar

positivamente o nvel de lipdeos do plasma e sua capacidade anticoagulante (SIQUEIRA,

2008).

Essa capacidade antioxidante pode ser comparada a do vinho branco, no entanto, inferior

a do vinho tinto, alm de possuir compostos antioxidantes diferentes devido a composio de

malte e lpulo. Quanto ao valor nutricional, contm quantidades significativas de vitaminas do

complexo B, carboidratos e minerais (clcio, magnsio, ferro e selnios) (SIQUEIRA, BOLINI

e MACEDO, 2008; BELITZ e GROSCH, 1999).

A maioria das bebidas elaboradas com cereais nos ltimos 8000 anos hoje considerada

como cerveja. Era conhecida pelos sumrios, egpcios e mesopotmios, desde pelo menos 4000

a.C. Como os ingredientes usados para fazer cerveja diferem de acordo com o local, suas

caractersticas (tipo, sabor e cor) variam amplamente. Os babilnios j fabricavam mais de

dezesseis tipos de cerveja de cevada, trigo e mel h mais de 4000 aC. O Cdigo de Hamurabi,

criado entre os anos de 1792 e 1750 a.C., inclua vrias leis de comercializao, fabricao e

consumo da cerveja, relacionando direitos e deveres dos clientes das tabernas. A pena de morte,

por exemplo, poderia ser imposta aqueles que diluam a cerveja que vendiam (HISTORIA DA

CERVEJA,2010; CERVEJAS DO MUNDO,2013).

Posteriormente, no antigo Egito, a cerveja, segundo o escritor grego Ateneu de Nucratis

(sculo III d.C.), teria sido inventada para ajudar a quem no tinha como pagar o vinho.

Inscries em hierglifos e obras artsticas testemunham sobre o gosto deste povo pelo produto.

At um dos faras, Ramss III (1184-1153 a.C.), passou a ser conhecido como "fara-

15

cervejeiro" aps doar aos sacerdotes do Templo de Amon um milho de litros de cerveja

provenientes de suas cervejarias (FERREIRA, 2007).

Na Idade Mdia, a cerveja foi utilizada como mercadoria para comrcio, pagamento e

impostos. Os monges aperfeioaram a tecnologia cervejeira e serviram como vendedores por

atacado (FERREIRA, 2007).

No sculo 14, a cidade de Hamburgo, no norte da Alemanha, era o centro cervejeiro da

Europa, com mais de mil mestres cervejeiros. Considera-se Gambrinus o patrono dos

cervejeiros em todo mundo. Dentre muitas teses para a origem desse nome a mais aceita a de

que deriva do nome Jan Primus, conhecido como Duque Brabant, que viveu em torno do ano

de 1251(Sculo 13). Os cervejeiros de Bruxelas (Blgica) teriam oferecido a ele a posio de

membro honorrio em sua associao, o que foi por ele aceito e considerado por esses

cervejeiros uma grande honra, e desse modo, os cervejeiros passaram a contar com um

poderoso patrono. A Reinheitsgebot, ou Lei da Pureza, foi proclamada em 23 de abril de 1516,

na Alemanha. Essa lei definia que apenas quatro insumos deveriam estar presentes na

fabricao da cerveja: gua, o malte, o lpulo e o fermento (HISTORIA DA CERVEJA, 2010;

CERVEJAS DO MUNDO, 2013).

A cerveja chega ao Brasil, na segunda metade do sculo XIX, em 1808, trazida da Europa

pela famlia Real Portuguesa. Nessa poca seu consumo era restrito uma pequena parcela da

populao e s haviam marcas importadas. Em 1836, surge a primeira notcia sobre fabricao

de cerveja no Brasil, publicada no Jornal do Comrcio, Rio de Janeiro (HISTORIA DA

CERVEJA, 2010; CERVEJAS DO MUNDO, 2013).

A cerveja do tipo Pilsener nasce em Pilsen (Tchecoslovquia) em 1842 e a mais

consumida no mundo. De sabor delicado, leve, clara e de baixo teor alcolico (3 5%),

tambm a preferida dos brasileiros. No Brasil o consumo da pilsen chega a 98% do total

ingerido, ficando o restante para as do tipo bock, light, malzbier e stout (FERREIRA, 2007).

A cincia cervejeira surgiu de fato a partir do sculo XX, o que resultou em um avano das

tecnologias e domnio da produo. Houve tambm aprimoramento no controle de qualidade

de leveduras, matrias-primas e do produto final. Tudo para atender consumidores que buscam

qualidade, variedade e preos atrativos (FERREIRA, 2007).

16

2.2 INGREDIENTES DA CERVEJA

2.2.1 Malte

O Malte o termo tcnico usado para definir a matria-prima resultante da germinao de

qualquer cereal (milho, trigo, cevada, aveia, centeio, triticale - cruzamento de trigo e centeio,

sorgo e at arroz) (FERREIRA, 2007 e ALVISI, 2011).

O principal ingrediente usado na produo de cerveja a cevada maltada. A cevada uma

planta da famlia das gramneas e seu cultivo realizado em climas temperados como o do

Brasil ( Rio Grande do Sul) e Argentina (NOGUEIRA, 2006).

Dentre os demais cereais, a cevada foi a escolhida para a produo da cerveja por possuir

caractersticas particulares, tais como: a) facilita o controle da germinao; b) possibilita a

produo de cerveja com sabor de maior aceitabilidade no mercado; c) apresenta alto teor de

amido; d) apresenta enzimas em sua constituio e possibilita a formao de mais enzimas

durante a germinao; e) possibilita a formao de uma camada filtrante natural, devido sua

casca; f) apresenta teor de protenas em proporo ideal em relao ao teor de amido e g)

apresenta caractersticas superiores tecnolgicas de paladar (ALVISI, 2011).

Quando no h definio do cereal maltado, subentende-se por malte de cevada. Para

avali-los, so considerados dois mtodos: no primeiro, o poder germinativo da cevada igual

ao nmero de gros que germinam num total de 100 gros e o valor deve ser maior que 95%;

e, no segundo, o potencial de germinao deve ser igual percentagem de gros que germinam

em 72h devendo ser de 65 85%, o qual est diretamente ligado atividade enzimtica do gro

(FERREIRA, 2007).

O malteio um processo biolgico controlado da germinao, com o propsito de atingir

alteraes bsicas de metabolismo que abrangem a decomposio do amido e das protenas e

que possui trs etapas: macerao, germinao e secagem. Esse processo possui trs objetivos:

a) formar enzimas; b) ativar enzimas j existentes, transformando substncias de alto peso

molecular e insolveis em gua em sub-produtos de alto, mdio e baixo peso molecular que so

solveis em gua e c) formar os componentes caractersticos de aroma, cor e paladar

(FERREIRA, 2007; ALVISI, 2011).

17

2.2.2 Lpulo

O Lpulo responsvel por conferir a cerveja um sabor amargo e contribui tambm para

o aroma do produto. Encontramos no mercado para a sua comercializao na forma de pellet, extratos de CO2 ou hexano e em flor (FERREIRA, 2007).

Nas cervejarias, o lpulo mais utilizado, Humulus lupulus, pertence famlia das Cannabinaceae . uma trepadeira cujas flores apresentam grandes quantidades de resinas amargas e de leos essenciais que caracterizam o aroma e sabor da cerveja. Seu cultivo feito

em climas frios como em pases do norte europeu e Estados Unidos (NOGUEIRA, 2006).

Perfis amargos na cerveja so bem compreendidos, j que apenas alguns precursores esto

presentes no lpulo: alfa-cidos ou humulonas (1) e beta-cidos ou lupulonas (2). As estruturas

esto representadas na Figura 1 (KEUKELEIRE, 1999).

FIGURA 1 Estruturas das Humulonas e Lupulunas

(KEUKELEIRE, 1999).

O processamento do lpulo possui 4 etapas: colheita, peneiramento, secagem e prensagem.

Primeiro, as vinhas so cortadas do fio principal e transportadas para as mquinas coletoras de

cones; aps isso os cones so separados nessas mquinas especiais (tambores Rotativos) que

movem apenas as flores (cones) da vinhas; na terceira etapa, os rejeitos de folhas, galhos e

outros so peneirados e separados dos cones. Por fim, a secagem realizada de 80% 10%,

semelhantemente ao processo de malteao e comprimido em pellets para reduzir o espao de

estocagem (ALVISI, 2011).

18

O lpulo pode ser analisado pelas seguintes metodologias: precipitao com acetato de

chumbo, ultravioleta e HPLC (cromatografia lquida de alta eficincia) (FERREIRA, 2007 e

MAARSE e BELZ ,1981).

2.2.3 Levedura

A levedura um microorganismo unicelular, pertencente ao gnero da famlia

Saccharomyces, que pode obter a energia que precisa na presena ou na ausncia de oxignio atravs de respirao aerbia e anaerbia, respectivamente (ALVISI, 2011 e NOGUEIRA,

2006).

Sua membrana celular permite assimilar acares, aminocidos, peptdeos simples,

vitaminas e sais minerais, produzindo uma srie de reaes de forma a usar esses nutrientes

para o crescimento e fermentao (NOGUEIRA, 2006).

Existem dois tipos de leveduras que caracterizam o tipo de cerveja: Ale e Lager.

As cervejas de alta fermentao ou Ale so provenientes de leveduras da espcie

Saccharomyces cervevisiae , as quais que no decantam, isto flutuam na superfcie da cerveja no decorrer da fermentao, que dura de 3 a 4 dias. As temperaturas de fermentao so mais

elevadas, variando de 15 25 C. J as cervejas de baixa fermentao (ou Lager) so

provenientes de leveduras pertencentes a espcie Saccharomyces uvarium (antes denominada Saccharomyces carlsbergensis). Essas leveduras decantam e floculam no final da fermentao, que dura de 5 a 8 dias com temperaturas de 10 15C. (ALVISI, 2011 e NOGUEIRA, 2006).

As leveduras de baixa fermentao so diferenciadas de acordo com a sua capacidade

de sedimentao: pulverulentas (baixa floculao) e floculentas (alta floculao, aglutinao)

(ALVISI, 2011).

O fermento ideal deve possuir algumas caractersticas importantes, tais como:

fermentao eficiente, pouca formao de espuma, pequenas perdas de amargor, facilidade para

a reduo do diacetil, floculao, boa sedimentao, facilidade de recolha do fermento,

formao de aroma e sabor compatvel com a marca de cerveja produzida, arranque vigoroso,

queda do pH, menor risco de contaminao, resistncia a contaminao microbiolgica e

resistncia a mutao (alteraes de caractersticas). H tambm algumas caractersticas

indesejveis: formao de aromas desagradveis, dificuldade de recolha do fermento, formao

elevada de espuma, altas perdas de amargor, sensibilidade a contaminao e dificuldade de

reduo do diacetil (ALVISI, 2011).

19

Um dos problemas que podem acontecer com o fermento a autlise. Essa reao

provoca um aumento do pH da cerveja devido a passagem do contedo do citoplasmtico para

o meio extracelular. A causa desse problema devido a formao de CO2 e lcool, que

estressam a levedura (ALVISI, 2011).

2.2.4 gua A gua considerada o principal componente da cerveja em quantidades absolutas,

constituindo uma proporo de 92g em cada 100g de produto. A alterao de suas propriedades

fsico-qumicas pode afetar a qualidade final do produto (NOGUEIRA, 2006).

Por exemplo, os sais da gua usado no preparo do fabrico, exercem ao sobre a qualidade

da cerveja, influenciando as condies enzimticas e coloidais que se passam no decorrer da

fabricao da cerveja. Alm disso, algumas substncias presentes na gua, proveniente de

recursos naturais, podem alterar as propriedades qumicas originais da cerveja, sendo as de

maior importncia: pH, alcalinidade, dureza, condutividade e turbidez (ALVISI, 2011 e

FERREIRA, 2007).

A gua tambm apresenta uma grande variedade de sais ionizados na forma de partculas

carregadas eletricamente ou ons. Os principais ctions presentes so: H+, Ca+, Mg+, , Na+, K+,

Fe 2+ ou Fe 3+, Al 3+, e NH4 +. Os principais nions presentes so: OH-, HCO3-, Cl-, NO3-, SO4-

e SiO32-. A intensidade de alcalinidade ou acidez representam um indicador para a capacidade

de corroso (NOGUEIRA, 2006).

2.3 PROCESSO DE PRODUO DA CERVEJA

2.3.1 Brassagem A primeira etapa do processo produtivo ocorre na chamada sala de fabricao, onde as matrias-primas (malte e adjuntos) so misturadas em gua e dissolvidas, visando a obteno

de uma mistura lquida aucarada chamada mosto, que a base da futura cerveja (FERREIRA,

2007).

O mosto recebe a adio de lpulo e fervido por aproximadamente 3 horas. O objetivo

desta operao concentrar o mosto at o ponto desejado, esteriliz-lo, inativar as enzimas,

coagular certas protenas pelo calor, modificar o odor de malte e extrair o cheiro e tanino das

resinas do lpulo (SHREVE e BRINK, 1997).

20

O malte utilizado na preparao do mosto necessita ser beneficiado antes da utilizao

na brassagem. Esse beneficiamento composto por trs etapas: transporte, limpeza e pesagem

final, que visam garantir o abastecimento de malte para a moagem, executar a mistura dos tipos

de malte (blending), limpar as impurezas da massa de gros e pesar os maltes (ALVISI,

2011).

Os processos envolvidos na brassagem so: moagem do malte e adjuntos, mistura com

gua, aquecimento para facilitar a dissoluo, transformao do amido em acar fermentveis

e no fermentveis pelas enzimas do malte, filtrao com o objetivo de separar as cascas do

malte e dos adjuntos, adio de lpulo, fervura do mosto para esterilizao e dissoluo do

lpulo e, por ltimo, resfriamento (FERREIRA, 2007).

2.3.2 Fermentao Aps o resfriamento o mosto recebe o fermento que acondicionado em grandes tanques chamados de fermentadores, dando inicio a etapa de fermentao. Nessa etapa, ocorre

um processo de transformaes de acares para lcoois, gs carbnico, cidos orgnicos,

cetonas, steres e calor, resultado da ao da levedura (ALVISI, 2011 e FERREIRA, 2007).

Durante todo processo muito importante o controle preciso da temperatura (10 a 13C)

para a obteno de uma cerveja com as caractersticas fsico-qumicas e sensoriais desejadas

(FERREIRA, 2007).

Outros fatores tambm so necessrios para uma boa fermentao: o controle do teor de

oxignio, a gesto de reaproveitamento do fermento, a dosagem do fermento e a quantidade de

nutrientes adequados (acares, aminocidos, vitaminas e metais - Zn, Mg e Fe) (ALVISI,

2011).

2.3.3 Maturao Uma vez concluda a fermentao, a cerveja resfriada a 0C, a maior parte do fermento retirada por decantao (sedimentao) e tem incio a maturao que costuma levar de 6 a 30

dias, variando de uma cervejaria para outra. Ao final dessa etapa, a cerveja est praticamente

concluda, com aroma e sabor finais definidos (FERREIRA, 2007).

Os objetivos principais da maturao so: arredondamento do paladar e aroma,

clarificao da cerveja, amadurecimento e eliminao de substncias sulfonadas que so

arrastadas pelo gs carbnico (ALVISI, 2011).

21

O resfriamento provoca a formao de ligaes entre taninos e protenas (turvao a

frio), os quais somente se tornam insolveis e se precipitam a baixas temperaturas. No entanto,

se essas ligaes no forem precipitadas, elas podero mais tarde levar a turvao (turvao a

quente - estabilidade coloidal). Uma vez que a turvao a frio tenha se precipitado, ela ser

retirada da cerveja no processo de filtrao (ALVISI, 2011).

2.3.4 Filtrao Aps a maturao, a cerveja passa por uma filtrao, que visa eliminar partculas em suspenso, principalmente clulas de fermento, deixando assim a bebida transparente e

brilhante. A filtrao no altera a composio e o sabor da cerveja, mas fundamental para

garantir sua apresentao, conferindo-lhe um aspecto cristalino (FERREIRA, 2007).

A cerveja se aquece na trasfega devido ao bombeamento e deficincia no isolamento

das tubulaes. Devido a esse reaquecimento (1 a 2C), a cerveja re-dissolve parte da turbidez,

inclusive aquela acumulada no filtro. Para evitar isso necessrio resfriar a cerveja antes do

filtro (ALVISI, 2011).

Essa etapa do processo produtivo da cerveja conta com a participao dos auxiliares

de filtrao ou coadjuvantes de filtrao, os quais incluem muitos materias como: placas de

metal, tecidos no metlicos, telas metlicas, papis, celulose, terras diatomceas, perlitas e a

combinao de alguns desses elementos (ALVISI, 2011).

2.3.5 Envase e Pasteurizao

O envase ou enchimento a fase final do processo de produo da cerveja. Pode ser

feito em garrafas de vidro, latas de alumnio e barris de ao inoxidvel (FERREIRA, 2007).

Logo aps o envase, a cerveja submetida ao processo de pasteurizao, principalmente

quando so envasadas em garrafas ou latas. No barril, a cerveja normalmente no pasteurizada

e por isso recebe o nome de Chopp. A pasteurizao um processo no qual a cerveja

submetida a um aquecimento a 60C e posteriormente resfriada para garantir maior

estabilidade, assegurando uma validade de seis meses ao produto (FERREIRA, 2007).

Em alimentos de baixa acidez (pH< 4,5), a pasteurizao usada para minimizar

possveis danos a sade do consumidor devido contaminao com microrganismos

patognicos e para aumentar a vida de prateleira de alimentos por vrios meses. Na cerveja, o

objetivo principal da pasteurizao a destruio de microrganismos deteriorantes (como

22

leveduras selvagens, espcies de lactobacillus) e leveduras residuais (espcies de Saccharomyces) (FELLOWS, 2006).

2.4 ANLISE SENSORIAL E A CERVEJARIA

Para produzir e vender produtos de reconhecida qualidade no mercado, necessrio a

indstria cervejeira ter processos produtivos modernos, matria-prima de primeira linha e

comprometimento com a qualidade (FERREIRA, 2007).

Apesar de existirem no mercado vrios tipos de cerveja, um dos aspectos mais importantes

na qualidade da cerveja a sua estabilidade do sabor. Essa caracterstica influi na deciso do

consumidor e no crescimento do negcio. Sendo a qualidade fator decisivo na compra do

produto, faz-se necessrio uma criteriosa anlise sensorial da cerveja.

A anlise sensorial uma disciplina cientfica usada para evocar, medir, analisar e

interpretar reaes produzidas pelas caractersticas dos alimentos e materiais e como elas so

percebidas pelos rgos da viso, olfato, gosto, tato e audio (FERREIRA, 2007;

NORONHA,2003).

Compostos responsveis pelo gosto so geralmente no volteis em temperatura ambiente.

Portanto, eles interagem somente com receptores localizados na lngua. O gosto a sensao

percebida pelos rgos gustativos quando estimulados por determinadas substncias solveis e

envolve a percepo dos 5 gostos bsicos: doce, salgado, cido, amargo e umami (glutamato

de sdio) (BELITZ e GROSCH, 1999; NICOLINO, 2001).

O odor dos alimentos provm das substncias aromticas que so compostos volteis que

se desprendem, entram nas narinas e acionam milhares de receptores de odor localizados na

mucosa olfativa (BELITZ e GROSCH, 1999; NICOLINO, 2001).

O aroma sentido por duas vias: nariz e boca. Quando um alimento ou um lquido

ingerido, so liberadas vrias substncias volteis que retornam parcialmente ao nariz, neste

fluxo contrrio a respirao, chamado retro nasal e alcanam a mucosa olfativa (BELITZ e

GROSCH, 1999; NICOLINO, 2001).

A anlise sensorial tem sido reconhecida como fator chave para a seleo de produtos na

indstria de alimentos e bebidas. de grande aplicabilidade na pesquisa e no desenvolvimento

de novos produtos, teste de vida de prateleira, controle do processo de fabricao, controle de

qualidade e estudos de mercado com consumidores.

A avaliao sensorial tambm permite: a) garantir uma linguagem comum entre

consumidor e produo; b) detectar problemas, contribuindo com a melhoria do processo

23

produtivo; c) analisar a qualidade do produto antes da liberao para o mercado e d) garantir

que flavours especficos estejam em harmonia com a proposta do flavour geral da marca

(FERREEIRA, 2007; BELITZ e GROSCH, 1999; NICOLINO, 2001).

O principio bsico tratar os degustadores como instrumentos de medida. Como tais, esses

profissionais so altamente variveis e muito propensos a serem tendenciosos. Os testes devem

ser organizados de forma a controlar essas variaes e minimizar favoritismo, ou seja, o

treinamento de provadores uma necessidade permanente, os testes devem ser frequentemente

repetidos e os resultados devem ser avaliados estatisticamente para confiabilidade dos trabalhos

do painel de degustadores (NICOLINO, 2001).

A unio da cincia e cozinha nos treinamentos de anlises sensoriais um recurso que

pode ser usado essencialmente para a divulgao dos defeitos da cerveja ligados ao cotidiano

da preparao de alimentos nas nossas casas. Isso permite facilitar o processo de ensino-

aprendizagem.

Por ser uma bebida que apresenta um equilbrio entre sabor e aroma, a cerveja

quimicamente instvel e sofre diversas reaes qumicas e enzimticas durante seu

processamento e estocagem. Sendo assim, off-flavours como steres, aldedos, dicetonas

vicinais, cidos orgnicos, lcoois superiores, fenis, iso--cidos e outros compostos podem

afetar diretamente sua qualidade. A queda de qualidade pelo surgimento de sabores e aromas

indesejveis e alteraes nas propriedades fsico-qumicas da cerveja um problema que a

indstria cervejeira procura solucionar (SIQUEIRA, BOLINI e MACEDO, 2008).

No Brasil foi realizado um estudo com seis marcas de cervejas do seguimento nacional

com o objetivo de avaliar sua qualidade pelas caractersticas fsico-qumicas e sensoriais. Os

mtodos usados para avaliao sensorial - anlise sensorial descritiva quantitativa (teste de

intensidade) e teste de aceitao - permitiram observar uma maior intensidade de atributos

sensoriais nas marcas de micro cervejarias, fato comprovado pelas anlises fsico-qumicas.

Para que o grupo realizasse uma avaliao sensorial eficiente, fez-se necessrio a aplicao de

um recrutamento e levantamento dos termos descritivos de modo que participantes dos testes

fossem capazes de reconhecer nas cervejas os atributos pesquisados. A tabela 1 apresenta uma

lista de termos descritivos empregados, suas respectivas definies e referncias (ARAJO,

SILVA e MININ, 2003).

TABELA 1 Termos descritivos empregados com as suas expectativas definies e referncias

24

Fonte: ARAJO, SILVA e MININ, 2003.

Recentemente, testes nos quais foram aplicadas as tcnicas de microextrao em fase slida

em headspace esttico e cromatografia gasosa acoplada a EM demonstraram ser eficientes

para a determinao do off-flavour (E)-2-nonenal em cervejas brasileiras (SCHERER et al,

2010). provvel que o uso dessas tcnicas sejam eficientes para aplicao no controle de

qualidade dos demais volteis da cerveja.

No entanto, a literatura apresenta relatos de eficincia na pesquisa de componentes que

contribuem para o sabor sem ser apreciavelmente voltil. Isso ocorre com os componentes do

lpulo na cerveja que foram analisados aplicando a cromatografia lquida de alta eficincia, que

obteve uma boa separao de polifenis, cidos fenlicos e nucleosdeos (MAARSE e BELZ,

1981).

25

2.4.1 Off-flavours do processo

Os off-flavours podem ser definidos como odores ou sabores desagradveis, que so

indesejveis bebida. Esses odores frequentemente so associados a sua deteriorao interna e

inclui componentes de sabor. H tambm substncias precursoras que so materiais a partir dos

quais alguns off-flavours so formados (BROTHERS, 2009).

A combinao dos ingredientes descritos anteriormente (gua, etc.) d origem ao sabor da

cerveja, o qual bem conhecido pelos consumidores. importante destacar que o estudo dos

compostos responsveis pelo sabor da cerveja est no domnio da qumica orgnica e analtica,

permitindo determinar compostos na cerveja para o nvel de compostos isolados ou grupos de

compostos. Em contraposio, a percepo sensorial uma experincia que permite avaliar um

sistema completo e no a separao das respectivas partes componentes (HUGHES e BAXTER,

2001).

O equilbrio de compostos volteis e no volteis responsvel pela aceitao e qualidade

da bebida. A composio em steres, aldedos, dicetonas vicinais, cidos orgnicos, lcoois

superiores, fenis, iso-alfa-cidos e outros compostos est relacionada sua qualidade

(SIQUEIRA, BOLINI e MACEDO, 2008).

Alguns compostos como o dixido de carbono, o etanol e os alfa e beta-cidos provenientes

do lpulo desempenham um papel preponderante na definio do sabor da cerveja, no entanto,

outros compostos, decorrentes tanto de defeitos ou por estarem em nveis muito superiores s

unidades de sabores aceitveis podem conferir ao produto um sabor fora dos padres

estabelecidos (off-flavour) (HUGHES e BAXTER, 2001).

A Tabela 2 apresenta uma referncia para termos associados, materiais de referncia e

origem dos off-flavours mais comuns em cerveja (FERREIRA, 2007).

26

TABELA 2 off-flavours relacionados com origem na produo de cerveja

"Off-Flavour" Termos associados Materiais de refernciaOrigem na

cerveja Observaes

Geraniol Brassagem/ Fermentao

um componente do leo de lpulo (leo essencial de Humulus Lupulus). Sua

concentrao na cerveja depende da variedade do

lpulo, da forma de processamento do lpulo, da

fervura do mosto e das condies em que a cerveja

foi fermentada.

Acetato de Isoamila

Hexanoato de Etila Hexanoato de Etila Fermentao

lcool Isoamlico lcool Etlico

lcoois superiores Perfume

Sensao de aquecimento

Banana

FermentaoAcetaldedo Acetaldedo

Alcolico Fermentao

Fermentao

Fermentao2-Feniletanol 2-Feniletanol

Ma verde Solvente

Vinho Branco

Floral Rosas

Geraniol Floral

BrassagemLpulo Floral

lcool Isoamlico

Ma Anis ster

Frutado

Floral Ch de erva

Cidreira

Cetonas Terpenos derivados de lpulo

Produzido pela levedura durante a fermentao.

Produzido pela levedura durante a fermentao. Um

dos steres mais importantes da cerveja.


Produzido pela levedura durante a fermentao. Pode ter origem na incorporao de oxignio no processo ou ser resultante de contaminao

bactriana.


Transmitida a cerveja pela adio deliberada de uma

dose de lpulo (normalmente lpulos de aroma) caldeira mais para o final da fervura.

27

(continuao Tabela 2)


cerveja Observaes

Transmitida a cerveja pela adio deliberada de uma

dose de lpulo (normalmente lpulos de aroma) caldeira mais para o final da fervura.

Pode chegar a este estado durante o perodo de

armazenamento (envelhecimento).

Transmitida a cerveja pelo malte de cevada. Tambm associado ao uso de malte que no foi armazenado

tempo suficiente, antes do uso. Retorno de condensado na fervura pode causar esta

caracterstica.

Cetonas Terpenos derivados de lpulo

Fenlico Cravo

BrassagemGro

BrassagemLpulo Condimentado

ArmazenamentoAmndoaleo de Amndoa Licor Franglico

Licor MaraschinoBenzaldedo

Barro Mato Verde

Extratos de cevada e malte Isobutaldedo

MalteMalte

Extrato de Malte Extratos de Malte Brassagem

Transmitida a cerveja pelo uso de cevada de malte.

Formao influenciada pela fervura.

Mosto Mosto Kronenbier Extratos de Malte Brassagem/ Fermentao

Desenvolvida durante a produo do mosto (taxa de

evaporao) e mtodo de fermentao (normalmente

removido pela levedura durante a fermentao).

Grama Verde Cortada

Grama Verde Cortada E-2-Hexenol Brassagem

A sua presena influenciada pela prtica de fervura do mosto e pela variedade de

lpulo utilizada.

28



cerveja Observaes

Contaminao externa das matrias-primas e/ou materiais

de embalagens com clorofenol. Cerveja em

contato com soluo a base de cloro ou gua clorada

utilizada no processo reagindo com fenis.

Produzido pela levedura durante o acondicionamento

na adega de fermentao.

Transmitida a cerveja pela adio de lpulo antigos

decompostos ou mal estocados (clivagem de alfa-cidos e produo de cido

isovalrico).

Transmitida pela adio de acar caramelizado ou

faberbier. Pode-se formar na produo do mosto e na cerveja pela reao de

Maillard durante a pasteurizao e armazenamento.

Originado pela adio de cereais torrados (cevada , malte chocolate e malte

preto). Tambm pode ter pela adio de algumas espcies

de caramelos.

Produzido por leveduras selvagens ou fermentos

especiais.

FermentaoCaprlico

Isovalrico BrassagemQueijo Parmeso cido Isovalrico

cido OctanicoSabo

Sabo de coco Cera

FermentaoFenlico

Armazenamento de Matrias-

primas/Todas as etapas de processo.

Clorofenol

Brassagem/ Pasteurizao/

ArmazenamentoCaramelo

BrassagemQueimado

Bala Toffee Algodo doce

Caramelos comerciais Maltose de Etilo

Queimado Torrado

Extratos de Malte

Cravo Tempero

Especiarias4-vinil-guaiacol

Medicinal Antissptico

"Cheiro de Hospital"2,6-Diclorofenol

Mosto Mosto Kronenbier Extratos de Malte Brassagem/ Desenvolvida durante a

29



cerveja Observaes

Produzido pela levedura durante a fermentao e/ou

maturao. Pode ser formada por autlise do fermento ou

por bactria quando os padres de higiene so

inadequados.

Produzido pela levedura durante a fermentao e tambm pela autlise do

fermento durante a maturao.

Pode ser produzido por bactrias nos moinhos,

durante a produo do mosto ou nos xaropes de acar durante o armazenamento.

Formado na cerveja por um precursor produzido pelo

fermento durante a fermentao. Seus nveis

elevados podem ter origem em problemas com a levedura

na reduo do Diacetil, alto teor de aminocidos e

contaminao bacteriana quando os padres de higiene

so inadequados.

Podem ser adicionados cerveja na forma de

antioxidante. Os fermentos de cervejas claras produzem

naturalmente sulfitos dependendo das condies de

fermentao e da cepa do fermento.

MercaptanaFermentao/

Maturao

Sulftico Fermentao

SulfdricoFermentao/

Maturao

Poluio Sensao de

irritao nas vias nasais

Butrico Brassagem

Diacetil FermentaoManteiga 2,3- Butanodiona

Vmito de criana "Golfada"

cido Butrico

Dixido de enxofre

Ovo Ovo Podre

Enxofre Fsforo queimado

cido Sulfdrico

Gs de cozinha Esgoto

Rato MortoEtanotiol


30



cerveja Observaes

Aroma tpico de fermento fresco.

Contaminao de matrias-primas com precursor de aroma Catty. Risco de

migrao de tintas de paredes, pisos para o malte, mosto ou

cerveja.

Formada na cerveja pela exposio a luz. Cervejas que

foram adicionadas exclusivamente com lpulos reduzidos no desenvolvem este sabor, se processadas sem contato com lpulos

regutares.

Pode ser transmitido a cerveja quando em contato com

juntas e tubos de borracha que possuam compostos

sulfurados.

Formado por um precursor derivado do malte durante a produo do mosto ou por

bactria durante a fermentao.

Produzida durante a fervura do mosto a partir de

aminocidos que contenham enxofre. Removido da cerveja durante fervura do mosto e/ou

durante a fermentao pela ao deo CO2. Pode ter

origem na autlise do fermento. Tambm est

presente no leo de lpulo.

Catty BrassagemMaracuj

Urina de gato p-Metano-8-tiol-3-ona

CebolaBrassagem/

Fermentao

Levedura Fermentao

Borracha queimada

Todas as etapas de processo

DMSBrassagem/

Fermentao

Borracha queimada Propanoditiol

Lightstruck ArmazenamentoGamb Suor

3-Metilo-2-buteno-1-tiol

Vegetais cozidos Milho cozido Dimetil Sulfeto

Cebola Cebola cozida Trissulfeto de trimetila

Fermento Po

Levedura Extratos de Levedura

Extrato de fermento


31



cerveja Observaes

Produzido pela levedura durante a fermentao e

tambm por contaminao com as bactrias durante a

fermentao, maturao e na cerveja envasada.

Produzido na fermentao e tambm por contaminao bactriana do produto ou

processo. Tambm pode ter origem nas matrias-primas.

Doura derivada dos acares com origem no malte e

auxiliares de fermentao. Os nveis residuais de acar so determinados pela atividade

fermentativa da levedura.

Formado durante o armazenamento da cerveja

dependendo do tempo, temperatura e teor de oxignio

da cerveja processada ou envasada.

Pode ser produzido por contaminao microbiana da gua ou das paredes midas

da adegas.

Contaminao externa das matrias-primas e/ou materiais

de embalagens com cloroanisol.

Produzido pela levedura durante a fermentao e

tambm por contaminao com as bactrias Acetobacter

e Gluconobacter.

cidoBrassagem/

Fermentao

DoceBrassagem/

Fermentao

Actico Fermentao

LcticoFermentao/

Maturao/ Envase

Vinagre cido Actico

TerraFermentao/

Maturao

Mofado Brassagem

Papelo ArmazenamentoPapelo

Papelo Molhado E-2-nonenal

2-etilo de fenolTerra

Terra Molhada Terra Filtrante

Mofo Mofado 2,4,6-tricloroanisol

cido Iogurte

cido lctico

cido Limo

cido Ctrico

Doce Sacarose


32



cerveja Observaes

Contaminao externa da cerveja com produto custico

(resduo de limpeza).

Derivado pelo contato da cerveja com substncias contendo caractersticas

metlicas. Podem tambm derivar do processo de

oxidao.

Sua origem est nos polifenis provenientes do malte e

lpulo.

Produzido por leveduras selvagens ou de cultivo durante a fermentao.

Atravs de matria-prima exposta fumao. Pode ser extrado durante a mostura ou

fervura do mosto.Ocasionalmente,

formado por ao bacteriana na fermentao.

Sanilidade derivada da adio de sal a soluo em

fabricao ou a mistura de farinha de malte com gua.

Amargor derivado da adio de lpulos durante a fervura do mosto, ou pela adio de mosto ou cerveja de extratos

de lpulo.

DefumadoBrassagem/

Fermentao

Adstringente Brassagem

Acetato de Etila Fermentao

cido Tnico

Caqui e banana verde

Boca seca Sensao de cica na

boca

AlcalinoTodas as etapas de

processo

MetlicoTodas as etapas de

processo

Salgado Brassagem

Amargo Brassagem

Salgado Cloreto de sdio

Amargo Iso-alfa-cidos

Oleoso Escorregadio

FlatBicarbonato de sdio

Ferro Metlico

AmlgamaSulfato Ferroso

Esmalte Solvente de esmalte Acetato de Etila

Defumado Guaiacol


33


Fonte: FERREIRA, 2007.


cerveja Observaes

Os materiais responsveis pelo corpo so extrados na brassagem, para restringir a

fermentao ou inibir a levedura de degrad-los, eles

so parcialmente deixados sem degradao na cerveja

final.

Ocasionado pelo rompimento da parede celular do malte.

Pode ser formado pela degradao de compostos fenlicos produzidos por

levedura selvagem.

Produzido pela levedura durante a fermentao. Esse efeito pode ser controlado

aps a fermentao dependendo de blendagem e

estilo de cerveja.

Carbonatao Fermentao

Corpo Brassagem

BaunilhaBrassagem/

FermentaoSorvete de Baunilha

Bala Vanilin

Gs carbnico Dixido de carbono

Dextrinas


34

2.5 TCNICAS PARA ANALISES DE OFF-FLAVOUS EM CERVEJA

2.5.1 Tcnicas de extrao de volteis

2.5.1.1 Headspace (HS)

A tcnica de HS consiste em amostrar a atmosfera gasosa que circunda uma amostra de

interesse. Essa coleta pode ser feita de modo esttico ou dinmico, utilizando no segundo modo

um gs inerte que tem como funo o arraste dos compostos volteis, em geral para um

adsorvente. Os compostos volteis podem ser retidos em adsorventes, condensados em

superfcie fria ou transferidos diretamente para o cromatgrafo. A vantagem desta tcnica a

obteno de uma amostra rica em compostos volteis sem necessidade de aquecimento da

matriz (BELITZ e GROSCH, 1999; MIRANDA, 1999).

2.5.1.2 Microextrao em fase slida (SPME)

A SPME tem sido a tcnica de amostragem de volteis mais utilizada nos ltimos 10

anos na literatura cientfica. Facilidades como a ausncia de solvente, alto poder de

concentrao, aplicao a diversos tipos de analitos, uso de aparelhagem em fase gasosa ou

lquida (por contato), fases slidas de natureza qumica distintas e facilidade de transporte do

material extrado para o cromatgrafo explicam seu sucesso (AUGUSTO e VALENTE,1998).

O dispositivo bsico da SPME uma fibra, de slica fundida, cuja espessura varia entre

30 a 100m, recoberta com um filme fino de um polmero [(e.g.,polidemetilsiloxano (PDMS),

poliacrilato (PA) ou Carbowax (Cwx)] ou de slido adsorvente [e.g., carvo ativo

microparticulado (Carboxen)] na extremidade da agulha. A extrao ocorre mergulhando-se a

seo recoberta na amostra, ou no seu HS. Realizada a extrao, a fibra recolhida e inserida

no injetor do cromatgrafo, onde os analitos so termicamente dessorvidos sob fluxo do gs de

arraste e carregados para a coluna cromatogrfica (VALENTE e AUGUSTO, 2000).

As vantagens do mtodo de SPME prendem-se ao fato de o procedimento analtico ser

simples, rpido e no usar solventes orgnicos no processo de extrao (ZAMBONIN,

QUINTO e VIETRO, 2003).

35

2.5.1.3 Cromatografia gasosa de alta resoluo acoplada a detector de captura de eltrons

(HS-CGAR-DCE)

A cromatografia gasosa uma tcnica usada na separao e determinao de compostos volteis e/ou volatilizveis. Os componentes de um cromatgrafo gasoso so: cilindro de gs,

injetor, coluna, detector e integrador. Podemos considerar a separao cromatogrfica como

resultado de uma interao entre a fase mvel (gs de arraste) e fase estacionria. O gs de

arraste passa por um regulador de presso e vai para o injetor de amostra, arrastando-a para a

coluna. Os componentes da amostra so separados durante sua passagem pela coluna e, um

aps o outro passam pelo detector que, por sua vez, envia um sinal eltrico que registrado

graficamente sob a forma de picos pelo integrador. (PENTEADO, MAGALHES e MASINI,

2008; CIOLA,1985).

De acordo com a natureza da fase estacionria, a cromatografia gasosa pode ser

classificada em: a) em cromatografia gs-slido fase estacionria um slido e b)

cromatografia gs-lquido - fase estacionria um lquido imobilizado sobre um suporte inerte

integrador (PENTEADO, MAGALHES e MASINI, 2008).

O detector de captura de eltrons (DCE) possui uma fonte de ionizao que emite eltrons (). A passagem de gs de arraste no altera a corrente devido emisso (10 -8 A);

no entanto, ao passar um aceptor de eltrons, essa corrente diminui o valor da ordem de 10 -10,

10 -12 e 10 -13 A. O valor de queda da corrente proporcional queda do composto o que permite

o clculo de espcies que tenham afinidade por eltrons. Esse detector muito usado na anlise

de compostos que apresentam halognios em sua estrutura, ou em compostos oxigenados, para

os quais sua sensibilidade bem menor (CIOLA,1985).

Anlises de poluentes de gua como o trihalometano (THM) geralmente so realizadas

com o DCE devido a sua sensibilidade e seletividade, para anlise de compostos halogenados

(AUGUSTO e VALENTE, 1998).

Multirresduo em amostras de uva, foram analisados por CGAR-DCE e os

resultados obtidos mostraram que a tcnica eficiente para anlise de agrotxicos em uva

(SOARES, 2011).

36

2.5.1.4 Microextrao em fase slida seguida de cromatografia gasosa de alta resoluo acoplada a detector e espectrometria de massas (SPME-CGAR-EM)

A SPME-CGAR-EM uma ferramenta analtica usada na separao e determinao de

compostos volteis e/ou volatilizveis. No entanto, a qualidade de um mtodo analtico depende

da tcnica de amostragem, pois quase nenhuma matriz pode ser diretamente injetada no

cromatgrafo gasoso, isso porque possuem constituintes no volteis, termodegradveis, etc e

gua em quantidade incompatveis com as colunas cromatogrficas e com os detectores de

cromatografia gasosa (PENTEADO, MAGALHES e MASINI, 2008; VALENTE e

AUGUSTO, 2000 ; BELITZ e GROSCH, 1999; MIRANDA, 1999; CIOLA,1985;).

A espectrometria de massa uma tcnica que demonstra ser eficiente na identificao

de substncias, aplicveis a slidos, lquidos e gases. baseada na fragmentao de molculas

que seguem padres previsveis para cada tipo de substncias segundo sua funcionalidade.

Possui recursos de biblioteca de espectros com dezenas de milhares de espectros padres

arquivados, que podem ser acessveis rapidamente e permitem validar uma identificao ou

confirmar a estrutura de uma substncia (FRAGA, 2005).

A utilizao da SPME-CGAR-EM relativamente simples, levando-se em considerao

que o funcionamento do cromatgrafo a gs compatvel com a necessidade de alto vcuo do

espectrmetro de massas (CHIARADIA, COLLIN e JARDIM, 2008).

Quando so utilizadas colunas capilares, pode-se conectar a sada da coluna diretamente

fonte do espectrmetro, sendo isso possvel ao sistema de bombeamento do espectrmetro de

massas, que capaz de captar todo o eluente da coluna (CHIARADIA, COLLIN e JARDIM,

2008).

Quando so utilizadas colunas recheadas, a vazo do eluente deve ser reduzida antes da sua

entrada na fonte de ionizao do espectrmetro, atravs do uso de divisores de fluxo; no entanto,

seu desempenho no to satisfatrio por gerar perdas na detectabilidade. Para minimizar esse

efeito, o interfaceamento pode ser feito por meio de um separador de jato, que constitudo por

dois capilares alinhados e separados por uma distncia de cerca de 1 mm, tendo vcuo

estabelecido entre eles por meio de uma bomba. Deste modo, quando o eluente da coluna

atravessa o primeiro capilar, grande parte do gs carregador (geralmente He), que possui baixa

massa atmica, bombeado para fora dos capilares, enquanto as molculas de analito (com

maior massa) mantm-se em fluxo linear e penetram no segundo capilar que as direciona para

a fonte de ons do espectrmetro de massas (CHIARADIA, COLLIN e JARDIM, 2008).

37

Relatos apontam para a eficincia da tcnica SPME-CGAR-EM para separar e identificar

volteis presentes nas amostras de sucos de frutas e refrigerantes durante o processo de

envelhecimento (natural e acelerado). Para sucos, os resultados obtidos mostraram a presena

de compostos volteis obtidos durante o processo de envelhecimento: nonanal, -pineno, -

terpinoleno, terpineol-octanal, linalol, 2--pineno, -p-dimetilestireno e geraniol. Para o refrigerante, foram determinados os compostos volteis responsveis por sua fragrncia

especfica: hexanoato de etila, valenceno, 1-hexanol, 2-pentanol, acetato de -terpineol,

butanoato de etila, terpinoleno, hexylacetate, decanal, hexilo butirato, linalol, mirceno e -

pineno (SEQUEIRA, 2009).

O E-2-nonenal um off-flavour relacionado a cerveja envelhecida, conferindo ao produto aroma de papelo. Foi desenvolvido e aplicado em amostras de cerveja brasileiras, um

novo mtodo para determinao de (E)-2-nonenal usando HS-SPME-GCAR-EM. O mtodo

desenvolvido mostrou ser simples, eficiente e altamente sensvel para a determinao deste

analito, o qual tambm pode ser facilmente aplicado no controle de qualidade da fabricao de

cerveja. (E)-2-nonenal foi encontrada em todas as amostras de cerveja analisadas, com nveis

entre 0,17 e 0,42 gL -1 (SCHERE et al, 2010).

38

3 JUSTIFICATIVA

A falta de um mtodo preciso para a identificao e quantificao de off-flavours um

problema para cervejarias que desejam assegurar a qualidade de seus produtos nas prateleiras

do mercado. Faz-se necessrio um estudo aprofundado para o desenvolvimento de mtodos que

atendam as necessidades da indstria.

O presente trabalho pretende suprir a lacuna em relao a mtodos que possam identificar

e quantificar off-flavours de maior incidncia em cervejarias, abaixo do limiar de percepo

dos degustadores: 2,3-Butanodiona (Diacetil), 2,3-Pentanodiona, Acetato de Etila, Hexanoato

de Etila e Acetato de Isoamila. Para tal, a identificao de aromas de impacto na cerveja contar

com as anlises de volteis atravs da tcnica de HS-CGAR-DCE e SPME seguida por CGAR-

EM). A vantagem do mtodo indica a tendncia de aumento dessas substncias antes da

percepo do cervejeiro.

No Brasil, a preferncia nacional de consumo de cerveja, dentre os diversos tipos

existentes, a do tipo pilsen. Por essa razo, todos os testes sero realizados somente com esse

tipo de cerveja (ALVISI, 2011).

Aps este estudo, espera-se ter um mtodo preciso para a identificao e quantificao de

off-flavours em cerveja tipo pilsen.

39

4 OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolver mtodos para identificao e quantificao dos principais off-flavours de

impacto na cerveja tipo pilsen.

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Os objetivos especficos referem-se a um estudo abrangente que possibilitem:

a) Desenvolver mtodos alternativos que otimizem a identificao de off-flavours em

cerveja tipo pilsen.

b) Investigar os off-flavours de maior incidncia em cervejarias: 2,3-Butanodiona

(Diacetil), 2,3-Pentanodiona, Acetato de Etila, Hexanoato de Etila e Acetato de

Isoamila,

c) Operacionalizar anlises de steres e dicetonas vicinais atravs da tcnica de HS-

CGAR-DCE e SPME seguida por CGAR-EM).

40

5 MATERIAIS E MTODOS 5.1 MATRIA-PRIMA

15 cervejas tipo pilsen de marcas reconhecidas do mercado local.

5.2 MTODOS

5.2.1 Anlises de volteis em gua e cerveja

5.2.1.1 Extrao SPME (ou MEFS)

5.2.1.1.1 Preparo da soluo estoque do Mix de off-flavours

Transferiu-se cerca de 10 mL de metanol para um balo volumtrico de 25 mL.

Pesou-se, no mesmo balo, 0,025g de 2,3-Butanodiona, 0,105g de Acetato de Isoamila,

0,015g de Hexanoato de Etila e 2,25g de Acetato de Etila.

Completou-se o volume at a linha de referncia com metanol 20,0 1,0C e

homogenezou-se [M1].

5.2.1.1.2 Preparo da soluo diluda do Mix de off-flavours


Adicionou-se, ao mesmo balo, 1,00mL da soluo estoque [M1].

Completou-se o volume at o trao de aferio com metanol 20,0 1,0C e

homogenezou-se [E1].

5.2.1.1.3 Preparo da soluo estoque do Padro Interno (2,3- Pentanodiona)


Pesou-se, no mesmo balo, 0,0125g de 2,3-Pentanodiona.

Completou-se o volume at a linha de referncia com metanol 20,0 1,0C e


5.2.1.1.4 Preparo da soluo diluida do Padro Interno (2,3- Pentanodiona)

41





5.2.1.1.5 Preparo dos padres da curva de calibrao do em gua

Transferiu-se cerca de 10 mL de gua deionizada para um balo volumtrico de 25 mL.

Adicionou-se, ao mesmo balo, uma alquota de 150L da soluo diluda do Mix de

off-flavors [E1] e 250 L da soluo diluda do Padro Interno de 2,3-Pentanodiona

Completou-se o volume com gua destilada 20,0 1,0C at o trao de aferio e

homogenezou-se [PAD1] .

Repetiram-se os procedimentos anteriores, substituindo-se o volume da alquota da

soluo diluda do Mix de off-flavour [E1] para 4 bales de 25 mL os seguintes volumes:

200L, 250L, 300L e 350L. Essas solues corresponderam aos padres PAD2, PAD3,

PAD4 e PAD5 respectivamente. Prepararam-se mais 5 amostras do PAD3 para avaliao do

coeficiente de variao(CV).

Pesou-se, em 05 frascos de HS 30mL, 3,0g de Cloreto de Sdio em cada um.

Adicionou-se a cada um deles os padres: PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 e PAD5

respectivamente.

Tamparam-se rapidamente os frascos de HS com septo de silicone e lacrou-se com

tampa de polietileno com rosca, a medida em que foram transferidos os padres a cada vial.

5.2.1.1.6 Preparo dos padres da curva de calibrao do em cerveja

Transferiu-se cerca de 10 mL de cerveja tipo pilsen gelada para um balo volumtrico

de 25 mL.

Adicionou-se, ao mesmo balo, uma alquota de 66 L da soluo diluda do Mix de

off-flavors [E1] e 250 L da soluo diluda do Padro Interno de 2,3-Pentanodiona

Completou-se o volume com gua destilada 20,0 1,0C at o trao de aferio e

homogenezou-se [PAD0] .


soluo diluda do Mix de off-flavour [E1], para 4 bales de 25 mL, os seguintes volumes:

42

100L , 150L, 200L, 250L, 300L e 350L. Essas solues corresponderam aos padres

PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, PAD5 e PAD 6 respectivamente. Prepararam-se mais 5 amostras

do PAD4 para avaliao do coeficiente de variao(CV).

Pesou-se, em 05 frascos de HS 30 mL, 3,0g de Cloreto de Sdio em cada um.

Adicionou-se a cada um deles os padres: PAD2, PAD3, PAD4 e PAD5

respectivamente.


tampa de polietileno com rosca, a medida em que foram transferidos os padres a cada vial.

5.2.1.1.7 Preparo da amostra

Transferiu-se cerca de 10 mL de cerveja tipo pilsen gelada a ser avaliada para um balo

volumtrico de 25 mL.

Completou-se o volume com gua destilada 20,0 1,0C at o trao de aferio [A1].

Repetiram-se os procedimentos anteriores, substituindo-se o volume da alquota de

cerveja a ser avaliada por mais 14 cervejas de marca reconhecida no mercado.

Pesou-se, em 15 frascos de HS 30mL, 3,0g de Cloreto de Sdio em cada um.

Adicionou-se a cada um deles as amostras: A2, A3, A4, ... e A15 respectivamente.


tampa de polietileno com rosca, a medida em que foram transferidas as amostras a cada vial.

5.2.1.1.8. Microextrao em fase slida seguida de cromatografia gasosa de alta resoluo

acoplada a detector e espectrometria de massas (SPME-CGAR-EM)

Climatizaram-se as amostras e padres em banho termosttico 70 1,0C.


Perfurou-se o septo que recobre o frasco de headspace com a fibra retrada na agulha

e ento a fibra foi exposta amostra por aproximadamente 30 minutos a temperatura de 60

1,0C.

Terminado o tempo de extrao, retirou-se a agulha do septo com a fibra retrada.

Perfurou-se o septo do injetor do CGAR e ento a fibra foi exposta para a dessoro

trmica por 1 minuto.

Terminada a dessoro, retirou-se a agulha com a fibra retrada. O processo de extrao

est representado na Figura 2 (VALENTE e AUGUSTO, 2000).

43

FIGURA 2 Esquema de uso do amostrador SPME para processo de extrao e de dessoro

do material extrado para anlise por CG (VALENTE e AUGUSTO, 2000).

5.2.1.1.9. Condies cromatogrficas (SPME-CGAR-EM)

Modo de varredura: scan

Coluna : Agilent HP-5 (19091J-413): polissiloxano: 350C: 30m comprimento, 250 m

dimetro interno e 1 m espessura filme.

Detector: MSD (Mass Selective Detector)

Gs de arraste: Hlio

Presso na cabea da coluna: 6,8 psi

Temperatura da linha de transferncia: 250C

Programao da temperatura no forno cromatogrfico

44

Temperatura(C) Taxa de aquecimento(C/min) Tempo(min) 35 - 2

100 8 0 160 20 0 220 30 0

5.2.1.2 Tcnica Headspace Cromatografia Gasosa com detector de captura de eltrons (HS-CG-

ECD)

5.2.1.2.1 Preparo da soluo estoque de 2,3-Butanodiona (Diacetil)

Transferiu-se cerca de 10 mL de etanol para um balo volumtrico de 25 mL.

Pesou-se 0,025g de 2,3-Butanodiona.

Completou-se o volume at a linha de referncia com etanol 20,0 1,0C e


5.2.1.2.2 Preparo da soluo diluda de 2,3-Butanodiona (Diacetil)





5.2.1.2.3 Preparo da soluo estoque do Padro Interno (2,3- Pentanodiona) Transferiu-se cerca de 10 mL de etanol para um balo volumtrico de 25 mL.

Pesou-se, no mesmo balo, 0,0125g de 2,3-Pentanodiona.

Completou-se o volume at a linha de referncia com etanol 20,0 1,0C e homogenezou-

se [M2].

5.2.1.2.4 Preparo da soluo diluda do Padro Interno (2,3- Pentanodiona)



45



5.2.1.2.5 Preparo dos padres da curva de calibrao em gua

Transferiu-se cerca de 10 mL de gua deionizada para um balo volumtrico de 25 mL.

Adicionou-se, ao mesmo balo, uma alquota de 66 L da soluo diluda de 2,3-

Butanodiona[E1] e 250 L da soluo diluda do Padro Interno de 2,3-Pentanodiona

Completou-se o volume com gua destilada 20,0 1,0C e homogenezou-se at o

trao de aferio [PAD0] .


soluo diluda de 2,3-Butanodiona [E1], para 4 bales de 25 mL, os seguintes volumes: 100L

, 150L, 200L, 250L, 300L e 350L. Estas solues corresponderam aos padres PAD2,

PAD3, PAD4 e PAD5 respectivamente. Prepararam-se mais 5 amostras do PAD4 para

avaliao do coeficiente de variao(CV).

Transferiu-se para frascos de HS cada um deles os padres: PAD1, PAD2, PAD3,

PAD4, PAD5 e PAD6 respectivamente.

Tampou-se rapidamente os frascos de HS com septo de silicone e lacre de alumnio, a

medida em que os padres foram transferidos para cada vial.

5.2.1.2.6 Preparo dos padres da curva de calibrao em cerveja

Transferiu-se cerca de 10 mL de cerveja tipo pilsen gelada para um balo volumtrico

de 25 mL.

Adicionou-se, ao mesmo balo, uma alquota de 0,5L da soluo diluda de 2,3-

Butanodiona [E1] e 250 L da soluo diluda do Padro Interno de 2,3-Pentanodiona

Completou-se o volume com gua destilada 20,0 1,0C e homogeneizou-se at o

trao de aferio [PAD 0] .


soluo diluda de 2,3-Butanodiona [E1], para 6 bales de 25 mL, os seguintes volumes:

200L, 250L, 300L e 350L. Estas solues corresponderam aos padres PAD1, PAD2,

PAD3, PAD4, PAD5 e PAD6 respectivamente. Prepararam-se mais 5 amostras do PAD4 para

avaliao do coeficiente de variao(CV).

46

Transferiu-se para frascos de HS cada um deles os padres:PAD0, PAD1, PAD2, PAD3,

PAD4, PAD5 e PAD6 respectivamente.

Tampou-se rapidamente os frascos de HS com septo de silicone e lacre de alumnio, a

medida em que os padres foram transferidos para cada vial.

5.2.1.2.7 Preparo da amostra

Transferiu-se cerca de 10 mL de cerveja tipo pilsen gelada a ser avaliada para um balo

volumtrico de 25 mL.

Completou-se o volume com gua destilada 20,0 1,0C at o trao de aferio [A1].

Repetiram-se os procedimentos anteriores, substituindo-se o volume da alquota de

cerveja a ser avaliada por mais 14 cervejas de marcas reconhecidas no mercado.

Adicionou-se a cada um deles as amostras: A2, A3, A4, ... e A15 respectivamente.


tampa de polietileno com rosca, a medida em que foram transferidas as amostras a cada vial.

5.2.1.2.8. Extrao Headspace (HS) com posterior cromatografia gasosa de alta resoluo

acoplada a detector de captura de eltrons (HS-CGAR-DCE)



Transferiram-se as amostras e os padres para o cromatgrafo gasoso.

5.2.1.2.9. Condies cromatogrficas (HS-CGAR-DCE) Modo de varredura: scan

Coluna : Agilent DB-5 (125-5062): polissiloxano; 320C: 60 m comprimento, 530 m

dimetro interno e 1.5 m espessura filme.

Detector: ECD ( Electron Capture Detector)

Gs de arraste: Nitrognio

Presso na cabea da coluna: 15 psi

Temperatura da linha de transferncia: 150C

Programao da temperatura no forno cromatogrfico

Temperatura(C) Taxa de aquecimento(C/min) Tempo(min) 50 - 10

47

6. RESULTADOS E DISCUSSO

A qualidade de um mtodo analtico depende da qualidade de execuo de todas as etapas

analticas e seus erros experimentais. Dentre essas podemos destacar a etapa de amostragem

em que a tcnica escolhida que pode ser determinante para a eficcia de um mtodo. A primeira

tcnica escolhida para iniciar os testes foi a SPME no HS, por ser uma tcnica utilizada para

muitos tipos de analitos e por facilitar o transporte dos mesmos para o cromatgrafo gasoso

(VALENTE e AUGUSTO, 2000).

Foram realizados testes com o Mix de off-flavors contendo os steres (acetato de etila,

acetato de isoamila, e hexanoato de etila) e as dicetonas vicinais (2,3-butanodiona e 2,3-

pentanodiona) em gua e cerveja do tipo pilsen.

No processo de determinao do mtodo SPME a ser adotado para o avaliao dos off-

flavours, foram realizados diversos testes alterando os seguintes parmetros: a) tempo de

anlise em gua e cerveja; b) temperatura e tempo de dessoro no injetor; e c) fibras SPME.

No CGAR foram otimizados as condies cromatogrficas, no entanto, o tempo de anlise

grande porque necessrio ativar a fibra para a prxima injeo. Esse tempo pode se otimizado

com o uso de mais de uma fibra para agilizar a rotina.

Esto disponveis na literatura diversas fibras para anlise de volteis em bebidas e

alimentos, entre as quais as mais utilizadas so: fibras no-polares (polidimetilsiloxano-

PDMS), polares (poliacrialto- PA) e bi-polares (polidimetilsiloxano- PDMS, carboxen-

divinilbenzeno-CAR/DVB). A melhor resposta em termos de nmero de constituintes e

separao cromatogrfica foi obtida com a fibra a fibra bi-polar, cuja aplicao sugerida para

volteis e no volteis de baixa a alta polaridade (VALENTE e AUGUSTO, 2000).

Aps o preparo das amostras para a anlise por SPME seguida por CGAR-EM, foi

realizada a saturao das amostras com 3,0g de cloreto de sdio, por ser um sal muito solvel

em gua e por poder influenciar a eficincia da extrao mudando a polaridade do meio,

forando a passagem dos off-flavors para o headspace. Essa tcnica conhecida como

salting-out (MIRANDA,1999; STERCKX,SAISON e DELVAUX,2010).

Durante o preparo das amostras e de padres em cerveja foi observada uma dificuldade

para avolumar estas solues em virtude da formao de espuma proveniente da cerveja

adicionada. Para minimizar este efeito, foram usadas amostras de cerveja gelada, o que

demonstrou ser importante para a obteno de linearidade da curva.

48

Na Figura 3 pode-se observar o cromatograma relativos aos volteis de amostra de cerveja

preparada com o Mix de off-flavour obtidos pela tcnica SPME seguida por CGAR-EM. Os

resultados obtidos foram satisfatrios para os steres acetato de etila (tr: 2,275 min-90000 ppb),

acetato de isoamila (tr: 6,783 min- 4200 ppb) e hexanoato de etila (tr: 9,410min - 600 ppb)

apresentando R2>0,99 para estes em cerveja e gua. No entanto, no foi observado sinal

referente as dicetonas vicinais: 2,3-Butanodiona (Diacetil- 1455 ppb) e 2,3-Pentanodiona (100

ppb).

FIGURA 3 Cromatograma de steres de amostra de cerveja preparada com o Mix de Off-flavours por SPME-CGAR-EM

No processo de extrao SPME as molculas do analito se deslocam da matriz e penetram

no recobrimento vencendo resistncias a transferncias de massa at que seja estabelecido um

equilbrio de partio (ou adsoro). Na aplicao dessa tcnica, tambm foram analisados os

compostos individualmente com essa mesma fibra e foram observados sinais referentes aos

Aceta

to de

etila

Aceta

to de

Isoa

mila

Hexa

noato

de E

tila

49

steres e dicetonas vicinais. Por esse motivo, razovel considerar que s foram identificados

steres nas anlises do Mix de off-flavous devido a uma provvel competio entre steres

e dicetonas vicinais pela fibra, dando essa preferncia aos steres (VALENTE e AUGUSTO,

2000).

Em virtude do fato mencionado anteriormente, adotamos a tcnica HS-CG-DCE para

anlises das dicetonas vicinais: 2,3-Butanodiona (Diacetil) e 2,3-Pentanodiona, a qual tambm

apresentou R2>0,99 em cerveja e gua Diacetil( tr:2,595 min -1455 ppb) e Pentanodiona (tr:

4,527 min - 100 ppb), conforme apresentado na Figura 4.

FIGURA 4 Cromatogramas de dicetonas vicinais de amostra de cerveja preparada com 2,3-

Butanodiona (Diacetil) e 2,3-Pentanodiona por HS-CGAR-DCE.

As cervejas do tipo pilsen usadas nos procedimentos analticos descritos nos procedimentos

precisam estar geladas( 0C) para que sejam evitadas perdas indesejveis de volteis a serem

analisados.

50

Visando verificar o bom desempenho da metodologia desenvolvida, alguns parmetros

de validao foram avaliados (DOQ-CGCRE-008- rev. 04, JULHO,2011 ; RE n 899, 29, MAIO, 2003):

x SELETIVIDADE/ESPECIFICIDADE - a capacidade que o mtodo possui de medir exatamente um composto em presena de outros componentes tais como impurezas,

produtos de degradao e componentes da matriz.

Critrios de aceitao: A aceitao da seletividade atribuda ausncia de sinais interferentes no tempo de

reteno da substncia de interesse.

Para a avaliao da seletividade foram comparados os cromatogramas obtidos da curva

de calibrao do"off-flavours" Diacetil em gua e em cerveja. Para essas amostras foram

observados sinais referentes ao tempo de reteno do padro Diacetil( tr:2,595min) pela tcnica

HS-CGAR-DCE( Figura 4) e ao tempo de reteno do padro dos steres acetato de etila (tr:

2,275 min- prob.%: 95,7), acetato de isoamila (tr: 6,783 min- prob.%: 96,0) e hexanoato de etila

(tr: 9,410min prob.%: 86,8) pela tcnica SPME seguida de CGAR-EM no sendo detectado

sinais interferentes no tempo de reteno da substncia de interesse (Figura 3).

O efeito da resposta cromatogrfica acentuada induzida pela matriz um dos parmetros

de desempenho que devem ser avaliados, visto que esse pode afetar acentuadamente as

concentraes da amostra. Comparando-se as concentraes das amostras obtidas pela curva de

calibrao realizada em gua e em cerveja, observa-se o efeito de matriz. A inclinao da curva

de calibrao difere em gua e em cerveja, indicando que h efeito de matriz. O que esperado,

uma vez que a cerveja possui outros volteis que certamente competem com o analito pela fibra.

A vantagem que esse efeito incorpora uma correo de recuperao dos resultados obtidos

demostrando um valor mais prximo do real (MORELLI, ARMI e ABRANTES, 2008).

x LINEARIDADE - Consiste na demonstrao de que a relao entre a concentrao do analito (x) e a resposta medida (y) se ajusta a uma equao do tipo y=a+bx, onde a e b so os

parmetros prprios da equao obtida.

51

Critrios de aceitao: O coeficiente de correlao (r) deve ser superior a 0,99.

A linearidade foi estabelecida por regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados

a partir da relao entre a concentrao e rea e obtida por padronizao interna ou externa, no

caso em questo, foi utilizado como padro interno a 2,3-Pentanodiona.

As curvas de calibrao foram preparadas em cada dia de validao

desenvolvimento de método para identificação de “off-flavours” em cerveja

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