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DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Medicina Dentária - Mestrado Integrado – UBA 1 BQ - MTBarros

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A BIOQUÍMICA ESTRUTURAL

para as CIÊNCIAS da SAÚDE



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Capítulo III. A Cinética Enzimática



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Catalisadores biológicos

Poder catalítico e especificidade

Reguladas

Nem todas as enzimas são proteínasRibozimas...



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As enzimas podem aumentar a velocidade das reacções pelo menos 1 milhão de vezes... COMO ?



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PROTEÍNAS - Enzimas: cofactores

Muitas enzimas (APOENZIMAS) necessitam de

cofactores - Metais



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…Metais

Anidrase carbónica humana: requer zinco, que está ligado aos anéis imidazol de 3 resíduos de histidina e a uma molécula de água

Enzimas: cofactores



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Muitas enzimas (APOENZIMAS) necessitam de

Pequenas moléculas orgânicas - COENZIMAS

Enzimas: cofactores



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… Pequenas moléculas orgânicas (coenzimas)

Fosforilase do glicogénio: envolvida na utilização de glicogénio para produzir

energia, requer a coenzima piridoxal fosfato (PLP)

Enzimas: cofactores



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Enzimas: cofactores

COFACTORES

Iões Metálicos Coenzimas

Iões ActivadoresIões do

local activoCosubstratos

Grupos prostéticos



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Enzimas: classificação



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Depende de interacções precisas com o substrato...

... As interacções com o substrato, envolvem:

• forças de van der Waals• forças electrostáticas• pontes de hidrogénio• interacções hidrofóbicas

Enzimas: funcionamento

Catálise Enzimática



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Especificidade - Definida pela estrutura 3D (ou 4D)

Enzimas: especificidade



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As enzimas não conseguem alterar as leis da termodinâmica → não alteram o equilíbrio de uma reacção química

Uma enzima acelera os dois sentidos da reacção exactamente na mesma proporção


A + B AB



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Formação de um complexo que representa o estado de transição...

E + P ES E + S




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Facilitam a ocorrência do estado de transição, diminuindo a energia de activação, e consequentemente, aumentando a velocidade da reacção




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O estado de transição existe?O estado de transição existe?

Para uma concentração constante de enzima, a velocidade da reacção aumenta com o aumento da concentração do substrato, até se atingir uma velocidade máxima...

•... todos os centros catalíticos estão preenchidos e, consequentemente, a velocidade da reacção …




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Alterações nas características

espectroscópicas de enzimas quando se

adiciona substrato - complexo enzima

substrato.

A intensidade da fluorescência

da sintetase do triptofano

varia com a adição de serina e

de indol (substratos)


O estado de transição existe?O estado de transição existe?



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Enzimas: local activo

Resolução de estruturas Resolução de estruturas por cristalografia de por cristalografia de

raios-Xraios-X



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LisosimaEnzimas: local

activo



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8-10 aminoácidos no local activo

Preferência por resíduos hidrofóbicos

Nomenclatura dos aminoácidos no local activo P3-P2-P1 – P`1-P`2-P´3



Asp catalíticos

Protease aspártica



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S3S3

S`3S`3

S2S2

S`2S`2

S1S1

S`1S`1

S`1S`1



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S1 Pepsina : I30, D32, Y75, T77, F111, F117, - , D215, G217, T218

Catepsina D: - , D32, Y75, S77, F112, F117, I120, D215, G217, T218

Cardosina A : - , D32, Y75, T77, F112, F117, I120, D215, G217, T218 S`1 Pepsina : G34, G76, - ,Y189, I213, D215, - , M289, Y291, I300

Catepsina D: G34, G76, - , - , I213, D215, T218, M289, I291, I300

Cardosina A : - , G76, - ,Y189, F213, D215, - , M289, - , I300

Loop Flexível para coordenação com o substrato Pepsina : L71, S, I, T, Y, G76, T, G, S, M, T, G82

Catepsina D: F71, A, I, H, Y, G76, S, G, S, L, S, G82

Cardosina A: G71, A, I, I, Y, G76, T, G, S, I, T, G82 Cardosina B: A71, S, I, Q, Y, G76, T, G, A, I, V, G82

S2 na cardosina e pepsina



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...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença.

Modelo do encaixe induzido




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...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença.




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O que se passa no local activo?



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Para promover interacções efectivas com o substrato

Ribulose-1,5-bifosfato



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Definida pela estrutura 3D (ou 4D)Enzimas:

especificidade



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Enzimas: Cinética Enzimática

Modelo de Michaelis e MentenModelo de Michaelis e Menten



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Modelo de Michaelis e Menten

VV, varia com a [S] para uma concentração fixa de enzima [E0]




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... Em geral, KM estão compreendidos entre 10-2 M e 10-8 M

KKMM é uma medida da afinidade da enzima para o substrato é uma medida da afinidade da enzima para o substrato




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... Em geral, KM estão compreendidos entre 10-2 M e 10-8 M

KKcatcat - “turnover number” - “turnover number”




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Como medir a eficiência de uma enzima?

...usando a razão Kcat/KM (Kcat –velocidade de catálise máxima)

Perfeição enzimática

Algumas enzimas aproximam-se destes valores...




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Estas enzimas são limitadas apenas pela velocidade com que encontram o substrato em solução




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Influência da temperatura e pH



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Enzimas: Cinética EnzimáticaInfluência da temperatura



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Influência do pH

Os pH extremos modificam irremediavelmente a estrutura das enzimas, quer devido a desnaturação, quer devido a alterações na ligação entre apoenzima e coenzima




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Influência do pH – Regula a actividade



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Substratos múltiplos

Reacções com transferência de grupos funcionais de um substrato para o outro...

...nas reacções de oxidação redução, são transferidos electrões

Reacções que envolvem substratos múltiplos, classificam-se em duas classes:

• Deslocamento sequencial• Deslocamento duplo




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Deslocamento sequencial

Todos os substratos têm que estar ligados antes da libertação de qualquer produto

Dividem-se em duas subclasses:• Sequencial ordenado• Sequencial aleatório

Enzimas: Cinética EnzimáticaSubstratos múltiplos



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Enzimas: Substratos múltiplos


• Deslocamento sequencial

• Deslocamento duplo



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Num mecanismo sequencial ordenado, a ordem de ligação do substrato e de libertação do produto é importante

Enzimas: Cinética EnzimáticaSubstratos múltiplos

Forma-se um complexo ternário



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Enzimas: Substratos múltiplos


Num mecanismo sequencial aleatório, a ordem de ligação do substrato e de libertação do produto não é importante




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Deslocamento duplo

Também designadas de reacções “ping pong”

Um dos produtos é libertado antes de todos os substratos estarem ligados

Neste tipo de reacções, forma-se um complexo enzima - substituída

1. Um grupo funcional é transferido do primeiro substrato para a enzima

2. O primeiro produto é libertado3. Liga-se o segundo substrato e o grupo funcional ligado à

enzima é transferido para ele




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Deslocamento duplo

Catalisa a transferência de um grupo amina do aspartato para o -Cetoglutarato




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Deslocamento duplo


Deslocamento sequencialordenado



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Enzimas: Cinética EnzimáticaRegulação e Inibidores

A actividade de diversas enzimas pode ser inibida pela ligação de pequenas moléculas específicas e de iões

Algumas drogas e agentes tóxicos podem inibir o funcionamento de certas enzimas

A inibição pode ser reversível ou irreversível



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O complexo enzima – inibidor dissocia-se rapidamente

Dois tipos de inibição:1. Competitiva2. Não competitiva

Inibição reversível




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Inibição reversível: Competitiva


Regulação e Inibidores



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Inibição reversível: Não - Competitiva




56

Inibição reversível




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Inibição reversível: Mista




Gly76

Inibidor

Gly76

Inibidor

C-terminal

Loop flexível

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Inibição irreversível

Desenho Racional de Fármacos

Os inibidores irreversíveis ligam-se covalentemente aos resíduos dos locais activos




Inibidor



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Existem três classe de inibidores irreversíveis:

Específicos de grupos

Ligam-se a cadeias laterais específicas




Proteases tiólicas



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Marcadores de afinidade

Moléculas estruturalmente semelhantes ao substrato e que modificam covalentemente o local activo

Mais selectivos que os específicos de grupos

O TPCK é um marcador de afinidade para a quimotripsina – DIAGNÓSTICO?






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Inibidores suicidas

São substratos modificados e são os mais específicos para marcar o local activo

Ligam-se como se fossem substrato e o mecanismo catalítico normal é activado, produzindo uma espécie reactiva que posteriormente se liga covalentemente à enzima






64

Desenho Racional de Fármacos -

Inibidores para o

estado de transição




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Desenho Racional de Fármacos - Inibidores para o estado de transição


Moléculas que imitam o estado de transição do substrato, são inibidores potentes

Biblioteca de péptidos



66

Desenho Racional de Fármacos -

Inibidores para o estado de transição

Como são feitos os estudos?

PROPOSTA PELOS ALUNOS


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