departamento de ciÊncias da saÚde medicina dentária - mestrado integrado – uba 3 bc - mtbarros...

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Medicina Dentária - Mestrado Integrado – UBA 3 BC - MTBarros

1

Cap.9 Karp



2

Citoesqueleto e movimentação celular

•Filamentos intermédios

•Microfilamentos

•Polimerização e despolimerização dos microfilamentos

•Proteínas motoras: miosina. Estrutura e funções

•Mobilidade muscular e contracção

•Movimento celular

• Citoesqueleto e propriedades mecânicas das Células



3

MCB 1801 A – Célula em movimentoMCB 1801 A – Célula em movimento

MCB 1801 N – Mecanismo molecular do MCB 1801 N – Mecanismo molecular do movimento, movimento de queratinócitosmovimento, movimento de queratinócitos

MCB 1801 V – Célula em movimentoMCB 1801 V – Célula em movimento



4

Transporte intracelular

As células tratadas com drogas (colchicina,

nocodazole) perdem a sua forma

característica bem como por exemplo, o

complexo de Golgi fica disperso na

periferia da célula

Pois impedem a organização dos

microtubulos



5

Funções na célula



6

Movimentos

PseudopodosPseudopodos

LamelipodiosLamelipodios



7



8

Microtubulos Filamentos intermédios Microfilamentos

tubulina actinadiversas proteínas



9



10

Filamentos de actinaFilamentos de actina



11

Estrutura e suporte Transporte intracelular

Contracção e mobilidade

Organização espacial

Filamentos de actina -MF

Filamentos intermédios

Microtubulos

Proteína motora

Célula epitelialCélula epitelial

Célula nervosaCélula nervosa

Célula em divisãoCélula em divisão

Proteína motora

Filamentointermédio

Microtubulo

Filamentos de actina

Proteína motora Filamentos de actina

Microtubulos

Funções na célula



12

Peroxissomas em movimento



13

Fibroblasto em movimento

Funções na célula - Movimento

Fibroblastos

Glóbulos Brancos

Espermatozóides



14

Tubulina fluorescenteTubulina fluorescente

Microscopia de FluorescênciaMicroscopia de Fluorescência

Utilizando anticorpos conjugados a fluorescência Utilizando anticorpos conjugados a fluorescência

Micro-injectada nas células Vão constituir microtubulos

MicrofilamentosMicrofilamentos MicrotubulosMicrotubulos



15

Tubulina marcada com rodamina



16

Microscopia e VídeoMicroscopia e Vídeo

Permite medir forças desenvolvidas por uma só proteína motora

Nano-máquinas com 10-100nm

Microtubulo

Proteína motora

Esferas microscópicas



17

Proteína motora alterada



18

MicrotúbulosMicrotúbulos

Citoesqueleto insolúvel em detergentes Citoesqueleto insolúvel em detergentes

não iónicos (Triton X-100)não iónicos (Triton X-100)

Permite fazer réplicas para visualizar ao Permite fazer réplicas para visualizar ao

Microscópio ElectrónicoMicroscópio Electrónico

Identificação dos diferentes elementos Identificação dos diferentes elementos

do citoesqueleto com base do citoesqueleto com base na na

morfologia e diâmetro dos filamentosmorfologia e diâmetro dos filamentos

Podem também ser utilizados Podem também ser utilizados

anticorpos antes da cobertura metálica anticorpos antes da cobertura metálica

da amostra - da amostra - identificação específicaidentificação específica



19

Funções

1. Esqueleto interno

• suporte estrutural

• posicionamento dos organitos

2. Movimento de macromoléculas e organitos

intracelulares

3. Elementos motores de cílios e flagelos

4. Separação dos cromossomas durante a mitose

e a meiose.



20



21



22

• Estruturas tubulares ocas

• Diâmetro de 24 nm

• 13 protofilamentos

• heterodímeros de subunidades globulares

de tubulina e

• Polaridade:

-tubulina numa extremidade (-)

-tubulina na outra extremidade (+)

• Extremidade (+) crescimento rápido

• Extremidade (-) crescimento lento(-)

(+)



23



24

(-)

(+)

GTP GTP

tubulin heterodimer

seam

microtubule 3-start helix

-GDP -GTP

-GTP -GTP

+

JunçãoJunçãoGTP must be bound to both alfa and beta subunits for a tubulin heterodimer to associate with other heterodimers to form a protofilament or microtubule.



25

GTP GDP GTP GTP

protofilament ( ) (+)

Subunit addition brings Subunit addition brings -tubulin that was exposed at the -tubulin that was exposed at the plus end into contact with plus end into contact with -tubulin.-tubulin.

This promotes This promotes hydrolysis of GTPhydrolysis of GTP bound to the now interior bound to the now interior -tubulin. P-tubulin. Pii dissociates. dissociates.

-tubulin within a microtubule cannot exchange its bound -tubulin within a microtubule cannot exchange its bound GDP for GTP. GDP for GTP.

The GTP on The GTP on -tubulin does not hydrolyze.-tubulin does not hydrolyze.

PiPi

Actividade GTPaseActividade GTPase



26

Each nucleotide in the protofilament is at an - interface.

The inability of GTP to dissociate from the -subunit is

consistent with occlusion by a loop from the -subunit.

A similar occlusion would account for the inability of -tubulin

within a protofilament to exchange GDP/GTP.

GTP GDP

taxol tubulin dimer

PDB 1JFF

minus end

plus end

GTP GDP GTP GTP




27

View an animation depicting assembly of microtubules.

Then explore the structure of the ,-tubulin heterodimer, using Chime.



28

Proteínas associadas

Domínio globular (cabeça) que se liga ao microtúbulo

Domínio filamentoso que se projecta da superfície do microtúbulo

Função:

• Ligam microtúbulos entre si

• Aumentam a estabilidade ou alteram a rigidez

• Influenciam a velocidade da sua organização

Actividade é controlada por adição ou remoção

de grupos fosfato (cinases e fosfatases)

• MAP (microtubule associated protein).MAP 4 presente em vários tipos de células

3 locais de ligação a tubulina



29

MicrotúbulosMicrotúbulos

A ColchicinaA Colchicina é um alcalóide que se liga aos dímeros da tubulina e impede

a polimerização dos microtúbulos mais sensíveis como os do fuso mitótico.

Ela é utilizada para se estudar células em mitose.

O TaxolO Taxol é um alcalóide utilizado no tratamento de tumores pois também

impede a mitose.

Acelera a polimerização e estabiliza os microtúbulos, impedindo a

despolimerização. Outras drogas utilizadas no tratamento de tumores, que

também interferem com a dinâmica de microtúbulos, são a Vincristina Vincristina e a

VimblastinaVimblastina.



30

Suporte estrutural

A distribuição dos

microtúbulos na

célula determina a

sua forma

Célula em cultura



31

Suporte estrutural e transporte

Porção de axónio evidenciando 2

vesículas que estavam a ser

transportadasmicrotúbulosvesículas



32




33


Transporte de um organito ao longo de um axónio



34

Motores moleculares

carga

Local de ligação

•ATP (ATP ADP+Pi)Convertem a energia química do ATP em energia mecânica

Uma só célula contém dezenas destas proteínas motoras, Uma só célula contém dezenas destas proteínas motoras,

especializadas para o movimentoespecializadas para o movimento

ATP



35

Motores moleculares

Proteínas motorasProteínas motoras

• Movimento unidireccional através do citoesqueletoMovimento unidireccional através do citoesqueleto

• Alterações conformacionais (ciclo mecânico)Alterações conformacionais (ciclo mecânico)

• Tipos: Tipos: cinesinas e dineínascinesinas e dineínas (ao longo dos (ao longo dos microtubulos)microtubulos) e e

miosinasmiosinas (ao longo(ao longo

dos microfilamentos de actina)dos microfilamentos de actina)

• Carga (material a transportar): Carga (material a transportar):

vesículas, mitocôndrias, lisossomas, cromossomas, vesículas, mitocôndrias, lisossomas, cromossomas,

filamentos do citoesqueletofilamentos do citoesqueleto



36

CinesinasCinesinasCadeias pesadas Cadeia leve

Cabeça

Zona flexível

Braço Cauda

Movimento de vesículas e

organitos a partir do corpo celular

para os terminais (por ex.

sinápticos)

Proteínas Motoras



37

CinesinasCinesinas

Proteínas Motoras

• Tetrâmero: duas cadeias pesadas e duas cadeias leves (380 kDa)

• Cabeças globulares: domínios de formação da força motriz (hidrólise de ATP)

• Caudas: ligação da carga

• Movimento: no sentido da extremidade positiva (-tubulina)

• Movimento: ao longo de um microtubulo, com velocidade (1 m/s)

- dependente da concentração de ATP



38

CinesinasCinesinas Proteínas Motoras



39

CinesinasCinesinas Proteínas Motoras

Movimentos propostosMovimentos propostos

(Simulação do movimento molecular)(Simulação do movimento molecular)

kinwalk_ribbon

Cinesina monomérica ligada a GFP



40

Verde - anticorpo anti-tubulina (Microtubulos)

Amarelo - anticorpo anti-cinesina (identifica as vesículas associadas)

Laranja - marcação dupla, correspondente aos 2 anticorpos

Microtubulos

• Extremidade positiva no sentido da membrana plasmática

• Promovem movimento para “fora”

CinesinasCinesinas

Proteínas Motoras



41

DineínasDineínas

Proteínas Motoras

•Duas cadeias pesadas e diversas cadeias leves

• Cabeça globular: domínios de formação da força motriz

• Caudas: ligação da carga

• Movimento: sentido da extremidade negativa

• Movimento: para o centro da célula

• Carga: endossomas, lisossomas, vesículas do Golgi, movimento dos cromossomas na mitose...



42

Proteínas Motoras

Cadeias leves

DineínasDineínas



43

Proteínas Motoras



44

Proteínas Motoras

CinesinasCinesinas

DineínasDineínas



45

DineínasDineínas

• Movimento: para o centro da célula, no sentido da

extremidade negativa

CinesinasCinesinas

• Movimento: sentido da extremidade positiva (-tubulina)

Carga: endossomas, lisossomas, vesículas do Golgi, movimento dos cromossomas na mitose...

Um organito pode ligar cinesinas e dineínas simultaneamente embora actuem independentemente

Cada Cada tipo de vesícula membranartipo de vesícula membranar é transportada é transportada por uma cinesina específicapor uma cinesina específica

Proteínas Motoras



46

A funçãoA função depende da orientação e localização dos microtubulos

A formação dos microtubulos a partir dos dímeros de -tubulina é realizada em duas fases:

• nucleação: fase lenta• forma-se uma pequena porção

• elongação: fase rápida

Centros Organizadores de Microtubulos (MTOCs)O melhor conhecido é o Centrossoma



47

CentrossomasCentrossomas

• 2 Centríolos• Material pericentriolar (PCM)

Centríolos

• estruturas cilíndricas• 0,2 m Ø• nove fibras• fibra: 3 microtubulos A, B, C• tubulo A: microtubulo completo e ligado à zona central (filamento

radial periférico)• 1 par por célula• orientação perpendicular entre si

Centros Organizadoresde Microtubulos



48

centríolo


Centros Organizadores de Microtubulos



49

Crescimento dos

microtubulos

• Adição de dímeros à

extremidade positiva

• crescimento em todas as

direcções da célula

• extremidade negativa

junto dos centríolos

• extremidade positiva

exterior da célula


Centros Organizadores de Microtubulos



50

Papel da Papel da -tubulina-tubulina

Centros Organizadoresde Microtubulos



51

Outros Centros Organizadores

Corpos basais (com estrutura semelhante aos

centríolos)

• estrutura base dos cílios e flagelos

• Funções dos MTOCs:

• controlo do número de microtubulos

• polaridade do microtubulo

• número de protofilamentos que os constituem

• tempo e localização de organização de novos

microtubulos



52

Propriedades dinâmicas

Microtubulos do aparelho mitótico ou do citoesqueleto

• estruturas lábeis (sensíveis à

desorganização)

• Microtubulos dos axónios• estruturas menos lábeis

• Microtubulos dos cílios e flagelos

• estruturas estáveis

• Do Citoesqueleto• microtubulos polimerizam e despolimerizam rapidamente consoante as variações e necessidades da célula -

Instabilidade dinâmicaInstabilidade dinâmica



53

Polimerização/Despolimerização

Dímeros de GTP

Dímeros de GDP

Polimerização

Despolimerização

Na polimerização

Requer GTP• ligada à subunidade

Hidrólise do GTP• após incorporação do dímero no microtubulo (“fecho” do microtubulo)

Na despolimerização

Após a saída do dímero do microtubulo• a molécula de GDP é substituída por GTP (dímeros/GTP disponíveis)

• Controlo independente da Controlo independente da polimerização e despolimerização dos polimerização e despolimerização dos microtubulosmicrotubulos

A alteração conformacional resultante da A alteração conformacional resultante da hidrólise do GTP e do fecho do microtubulo hidrólise do GTP e do fecho do microtubulo fornecem a energia mecânica necessária para fornecem a energia mecânica necessária para a destabilização do microtubulo.a destabilização do microtubulo.



54

A GTP cap stabilizes the (+) end of a microtubule. If [tubulin dimer] is low, dissociation of tubulin-GTP may expose tubulin-GDP at the (+) end, causing that end to be unstable. Rapid shrinkage ensues.

Hydrolysis of GTP by -tubulin, as subunit addition brings it into contact with -tubulin, takes time.

A rapidly growing microtubule may A rapidly growing microtubule may accumulate a few layers of tubulin-accumulate a few layers of tubulin-GTP at the (+) end.GTP at the (+) end.

seam

microtubule 3-start helix

-GDP -GTP

-GTP -GTP

+

GTP GDP GTP GTP




55

Fraying or curving of protofilaments is observed at the ends of rapidly disassembling microtubules.

This may be due to a change in conformation when -subunits of heterodimers at the plus end have bound GDP instead of GTP.

microtubule during rapid shortening at the plus end

protofilament

Tubulin heterodimers with GDP on the subunit form ring shaped assemblies in vitro. Straight protofilaments form only when both tubulins have bound GTP.



56

Funções



57

Cílios

Os flagelos dos procariotas são filamentos simples sem qualquer relação evolutiva com o dos eucariotas



58

Sistema flagelar



59

Sistema ciliar e flagelar

Túbulo A – completo(13 subunidades)

Túbulo B – incompleto(10-11 subunidades)

Proteína elásticaProteína elástica



60

Túbulo A - completo



61

Centrosomal material also has an essential role in nucleating formation of cilia & flagella.

The ciliary axoneme grows out from one centriole cylinder, called a basal body.

plasma membrane axoneme basal body (centriole)

Cilium

cytosol



62

Cílos e flagelos Cílos e flagelos

têm origem num têm origem num

corpo basalcorpo basal

Túbulo A - completo

Túbulo B e C – incompletos



63

Dineína do axonema (cílios e flagelos)Dineína do axonema (cílios e flagelos)



64

Dineína do axonema (cílios e flagelos)Dineína do axonema (cílios e flagelos)

Ligação aos tubulos

Actividade de ATPaseActividade de ATPase



65

Dineína do axonemaDineína do axonema

Deslocação alternada de cada Deslocação alternada de cada metade do axonemametade do axonema



66

(Cap 14 – Karp)(Cap 14 – Karp)

Dinâmica dos MicrotubulosDinâmica dos Microtubulos e Proteínas Motoras na Mitosee Proteínas Motoras na Mitose



67

MCB 1901V – Video Mitose

MCB 1902 Mitose-aspectos moleculares

MCB 1901 - Animação Mitose



68

A mitose é o último passo do ciclo celular e demora cerca de 1h

Neste período a célula constrói e desorganiza os microtubulos que constituem o aparelho mitótico

MicrotubulosMicrotubulos e Aparelho Mitótico e Aparelho Mitótico

Estrutura com a função de ligar e alinhar os cromossomas e de os separar para cada célula filha

A separação dos cromossomas no ciclo mitótico tem 2 pontos de controlo cruciais:

- ruptura do envelope nuclear no fim da profase- ligação dos microtubulos aos cinetocoros dos

cramatídeos irmãos na fase de transição metafase-anafase



69

Cinetocoro Placa externa do cinetocoro

Cinesina

Dineína

Microtubulo

Fibra

MicrotubulMicrotubuloo

CoronaCoronafibrosafibrosa

Zona intermédia

Placa externaPlaca interna

Cinetocoro- localizado na superfície externa do centrómero de cada cromatídeo (mitótico)- local de ligação do cromossoma aos microtubulos do fuso mitótico- possuí várias proteínas motoras- promove o movimento dos cromossomas durante a mitose

Microtubulos e Aparelho MitóticoMicrotubulos e Aparelho Mitótico



70



71

-




72




73

Metafase

Cinetocoro é um local com grande

actividade, mesmo em plena

metafase

São adicionadas mais unidades de

tubulina , do que as perdidas



74

Metafase

Despolimerização lenta

Polimerização lenta



Cinetocoros

Adição rápida de dimeros de

tubulina

Perdarápida de

dimeros de tubulina


O encurtamento e o alongamento dos microtubulos para dispor os cromossomas na ”placa equatorial”



75

Anafase



76

Microtubulos

Tubos rígidos constituídos de subunidades da proteína tubulina


Fibras com uma estrutura do tipo corda constituídas por diversas proteínas

Microfilamentos

Estruturas sólidas e finas compostas da proteína actina



77

Monómero

Dímero

Tetrâmero

Estrutura do filamento intermédio


• 10 nm • Não ramificados

• Tetrâmero formado por dois

dímeros com orientação

antiparalela

• Proteínas de diferentes tipos

• Tetrameros associados - Sem

polaridade

• Resistentes a forças de

tensão

• Queratina, nestina, vimentina,

desmina, laminina, NF-L(M,H)



78

Células epiteliais• queratina Tipo I e Tipo II

Células nervosas• neurofilamentos (NF-L, NF-H, NF-M)• suporte


Filamentos intermédios de queratinaFilamentos intermédios de queratina



79



80



81

Inicialmente pensou-se que os FI eram estruturas permanentes.

Posteriormente verificou-se que actuam de uma forma dinâmica “in vivo”

Injectando culturas de células epiteliais com subunidades de queratina marcadas com fluorescência, elas são rapidamente incorporadas nos filamentos intermédios existentes

A incorporação faz-se não na extremidade dos filamentos, A incorporação faz-se não na extremidade dos filamentos, mas no seu interiormas no seu interior

Existe então um “pool” de subunidades de queratina que Existe então um “pool” de subunidades de queratina que estão em equilíbrio dinâmico com as suas formas estão em equilíbrio dinâmico com as suas formas polimerizadaspolimerizadas



82

Microfilamentos

• 8 nm • Subunidades globulares de actina• Requer ATP para polimerizar • Dupla hélice de filamento de actina• Polaridade• Proteína principal na contracção muscular• Proteína muito abundante em todas as células, em especial nas células motoras



83



84

Polimerização dos microfilamentos

• Monómero de actina liga ATP• ATP é hidrolisado algum tempo após a incorporação no novo filamento

++

-

Extremidade positiva– crescimento rápido

Extremidade negativa- crescimento lento

S1 da miosina



85

MCB 1802 – polimerização da G-actina



86

Polimerização dos microfilamentos

Equilíbrio entre subunidades livres e filamento – controlo na reorganização do citoesqueleto de microfilamentos

Processos dinâmicos: movimento celular, alterações da forma celular, citocinese.

Exemplos de movimento celular através da

polimerização da actina

- Espermatozóide – reacção acrossomal

(Formação de pequeno filamento na zona

frontal formado por polimerização dos

monómeros de actina).

- Propulsão da bactéria Listeria

monocytogenes no citoplasma de um

fagócito

actina



87

Miosina-Proteina MotoraMiosina-Proteina Motora

Fragmento S1

Cadeia leve

Cabeça

Cadeia leve reguladora

Cauda

Proteína Motora dos MicrofilamentosMovimento para a extremidade positiva do microfilamento.

Miosina II



88

Filamento bipolar

Cadeias leves

Cadeias pesadas

Miosina II

• Associação de miosinas formando um filamento

bipolar

• Contracção muscular

Miosina-Proteina MotoraMiosina-Proteina Motora



89

• Músculo esquelético

• Célula muscular ou fibra

• Composta por miofibrilhas.

• Miofibrilas - unidades

contrácteis: sarcómeros

• Sarcómeros: filamentos

finos (actina) e grossos (miosina)

Músculo

Feixe de células musculares

Fibra muscularBaínha

Núcleo

Banda I

Linha Z

Sarcómero

Miofibrila

Banda I

Banda A

Contracção muscular



90

MCB 1804 Demonstração experimental do movimento

Contracção muscular



91

Sarcómeros

Banda I Banda I Banda A

Zona H

Ext.negativa

Linha Z Linha Z

Ext.negativa

Ext. positiva Ext.positiva

Filamento de actina Filamento grossoMiosina



92

Modelo decontracção muscular

• Contracção por encurtamento do sarcómero• Contracção: banda A permanece inalterada (corresponde à miosina), bandas I e H diminuem• Linhas Z movem-se para o

centro do sarcómero

Contracção: deslizamento de filamentos de actina e miosina



93

Modelo de contracção muscular

• Filamentos finos: actina , tropomiosina e troponina

• Troponina: composta por 3 subunidades, espaçada cada 7

subunidades de actina

• Tropomiosina: molécula filamentosa

encaixa nas depressões da hélice de actina

Actina TropomiosinaTroponina



94

Contracção• cabeça da miosina movimenta-se para fora e liga-se ao

filamento de actina, formando pontes transversais• 1 filamento de miosina liga-se a 6 filamentos de actina• após ligação a cabeça da miosina dobra-se para o interior

do sarcómero• movimento do filamento de actina 5 a 15 nm sobre o filamento de miosina

miosinaFilamento de actina

Cabeça

Modelo de contracção muscular



95

Energética da contracção muscular

Miosina requer energia do ATP para conversão da energia química em mecânica

Ciclo de formação de pontes transversais – 50 msegundos

1.Ligação de ATP – dissociação com filamento de actina2.Hidrólise do ATP em ADP+Pi3.Absorção da energia libertada e ligação à actina4.Liberta o fosfato, altera conformação, impulsiona o filamento de actina para o centro do sarcómero5. ADP dissocia-se da miosina, liga-se novo ATP



96

Energética da contracção muscular



97

Regulação da contracção muscular

• Relaxado – tropomiosina bloqueia local de ligação da miosina à actina

• Posição da tropomiosina é controlada pela troponina

• Cálcio aumenta, liga-se à troponina

• Deslocamento da tropomiosina

• Exposição do local de ligação da miosina

• Após a estimulação nervosa ocorre a remoção do cálcio do citoplasma

• Cálcio dissocia-se da troponina

• Tropomiosina bloqueia a ligação da miosina

Actina TropomiosinaTroponina



98

Actina, miosina e citocinese

Citocinese

• divisão das células após

divisão dos cromossomas

•Anel contráctil

• mesmo local da placa

equatorial

• microfilamentos e

miosina

• contração até à união

das duas

membranas



99

Actina, miosina e citocinese

Anel contráctil

Actina Miosina



100



101

Doenças associadas a alterações do citoesqueletoDoenças associadas a alterações do citoesqueleto

MicrofilamentosMicrofilamentos

Produtos de fungos como as citocalasinascitocalasinas e as faloidinasfaloidinas interferem com a

dinâmica de polimerização e despolimerização da actina, interferindo com o

movimento celular. As citocalasinas ligam-se à actina impedindo a

polimerização, enquanto as faloidinas ligam-se lateralmente aos

microfilamentos estabilizando-os.

Filamentos intermediáriosFilamentos intermediários

A disposição dos filamentos intermediários depende da presença de

microtúbulos.



102

Microvilosidades com actina



103



104



105



106

Família das Família das EspectrinasEspectrinas

- Servem de - Servem de esqueleto esqueleto membranarmembranar

- Suporte às - Suporte às proteínas integraisproteínas integrais

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