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1
Cap.9 Karp
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2
Citoesqueleto e movimentação celular
•Filamentos intermédios
•Microfilamentos
•Polimerização e despolimerização dos microfilamentos
•Proteínas motoras: miosina. Estrutura e funções
•Mobilidade muscular e contracção
•Movimento celular
• Citoesqueleto e propriedades mecânicas das Células
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3
MCB 1801 A – Célula em movimentoMCB 1801 A – Célula em movimento
MCB 1801 N – Mecanismo molecular do MCB 1801 N – Mecanismo molecular do movimento, movimento de queratinócitosmovimento, movimento de queratinócitos
MCB 1801 V – Célula em movimentoMCB 1801 V – Célula em movimento
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4
Transporte intracelular
As células tratadas com drogas (colchicina,
nocodazole) perdem a sua forma
característica bem como por exemplo, o
complexo de Golgi fica disperso na
periferia da célula
Pois impedem a organização dos
microtubulos
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5
Funções na célula
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6
Movimentos
PseudopodosPseudopodos
LamelipodiosLamelipodios
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7
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8
Microtubulos Filamentos intermédios Microfilamentos
tubulina actinadiversas proteínas
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9
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10
Filamentos de actinaFilamentos de actina
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11
Estrutura e suporte Transporte intracelular
Contracção e mobilidade
Organização espacial
Filamentos de actina -MF
Filamentos intermédios
Microtubulos
Proteína motora
Célula epitelialCélula epitelial
Célula nervosaCélula nervosa
Célula em divisãoCélula em divisão
Proteína motora
Filamentointermédio
Microtubulo
Filamentos de actina
Proteína motora Filamentos de actina
Microtubulos
Funções na célula
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12
Peroxissomas em movimento
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13
Fibroblasto em movimento
Funções na célula - Movimento
Fibroblastos
Glóbulos Brancos
Espermatozóides
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14
Tubulina fluorescenteTubulina fluorescente
Microscopia de FluorescênciaMicroscopia de Fluorescência
Utilizando anticorpos conjugados a fluorescência Utilizando anticorpos conjugados a fluorescência
Micro-injectada nas células Vão constituir microtubulos
MicrofilamentosMicrofilamentos MicrotubulosMicrotubulos
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15
Tubulina marcada com rodamina
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16
Microscopia e VídeoMicroscopia e Vídeo
Permite medir forças desenvolvidas por uma só proteína motora
Nano-máquinas com 10-100nm
Microtubulo
Proteína motora
Esferas microscópicas
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Proteína motora alterada
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MicrotúbulosMicrotúbulos
Citoesqueleto insolúvel em detergentes Citoesqueleto insolúvel em detergentes
não iónicos (Triton X-100)não iónicos (Triton X-100)
Permite fazer réplicas para visualizar ao Permite fazer réplicas para visualizar ao
Microscópio ElectrónicoMicroscópio Electrónico
Identificação dos diferentes elementos Identificação dos diferentes elementos
do citoesqueleto com base do citoesqueleto com base na na
morfologia e diâmetro dos filamentosmorfologia e diâmetro dos filamentos
Podem também ser utilizados Podem também ser utilizados
anticorpos antes da cobertura metálica anticorpos antes da cobertura metálica
da amostra - da amostra - identificação específicaidentificação específica
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Funções
1. Esqueleto interno
• suporte estrutural
• posicionamento dos organitos
2. Movimento de macromoléculas e organitos
intracelulares
3. Elementos motores de cílios e flagelos
4. Separação dos cromossomas durante a mitose
e a meiose.
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• Estruturas tubulares ocas
• Diâmetro de 24 nm
• 13 protofilamentos
• heterodímeros de subunidades globulares
de tubulina e
• Polaridade:
-tubulina numa extremidade (-)
-tubulina na outra extremidade (+)
• Extremidade (+) crescimento rápido
• Extremidade (-) crescimento lento(-)
(+)
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(-)
(+)
GTP GTP
tubulin heterodimer
seam
microtubule 3-start helix
-GDP -GTP
-GTP -GTP
+
JunçãoJunçãoGTP must be bound to both alfa and beta subunits for a tubulin heterodimer to associate with other heterodimers to form a protofilament or microtubule.
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GTP GDP GTP GTP
protofilament ( ) (+)
Subunit addition brings Subunit addition brings -tubulin that was exposed at the -tubulin that was exposed at the plus end into contact with plus end into contact with -tubulin.-tubulin.
This promotes This promotes hydrolysis of GTPhydrolysis of GTP bound to the now interior bound to the now interior -tubulin. P-tubulin. Pii dissociates. dissociates.
-tubulin within a microtubule cannot exchange its bound -tubulin within a microtubule cannot exchange its bound GDP for GTP. GDP for GTP.
The GTP on The GTP on -tubulin does not hydrolyze.-tubulin does not hydrolyze.
PiPi
Actividade GTPaseActividade GTPase
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Each nucleotide in the protofilament is at an - interface.
The inability of GTP to dissociate from the -subunit is
consistent with occlusion by a loop from the -subunit.
A similar occlusion would account for the inability of -tubulin
within a protofilament to exchange GDP/GTP.
GTP GDP
taxol tubulin dimer
PDB 1JFF
minus end
plus end
GTP GDP GTP GTP
protofilament ( ) (+)
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View an animation depicting assembly of microtubules.
Then explore the structure of the ,-tubulin heterodimer, using Chime.
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Proteínas associadas
Domínio globular (cabeça) que se liga ao microtúbulo
Domínio filamentoso que se projecta da superfície do microtúbulo
Função:
• Ligam microtúbulos entre si
• Aumentam a estabilidade ou alteram a rigidez
• Influenciam a velocidade da sua organização
Actividade é controlada por adição ou remoção
de grupos fosfato (cinases e fosfatases)
• MAP (microtubule associated protein).MAP 4 presente em vários tipos de células
3 locais de ligação a tubulina
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MicrotúbulosMicrotúbulos
A ColchicinaA Colchicina é um alcalóide que se liga aos dímeros da tubulina e impede
a polimerização dos microtúbulos mais sensíveis como os do fuso mitótico.
Ela é utilizada para se estudar células em mitose.
O TaxolO Taxol é um alcalóide utilizado no tratamento de tumores pois também
impede a mitose.
Acelera a polimerização e estabiliza os microtúbulos, impedindo a
despolimerização. Outras drogas utilizadas no tratamento de tumores, que
também interferem com a dinâmica de microtúbulos, são a Vincristina Vincristina e a
VimblastinaVimblastina.
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Suporte estrutural
A distribuição dos
microtúbulos na
célula determina a
sua forma
Célula em cultura
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Suporte estrutural e transporte
Porção de axónio evidenciando 2
vesículas que estavam a ser
transportadasmicrotúbulosvesículas
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32
Transporte intracelular
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33
Transporte intracelular
Transporte de um organito ao longo de um axónio
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Motores moleculares
carga
Local de ligação
•ATP (ATP ADP+Pi)Convertem a energia química do ATP em energia mecânica
Uma só célula contém dezenas destas proteínas motoras, Uma só célula contém dezenas destas proteínas motoras,
especializadas para o movimentoespecializadas para o movimento
ATP
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Motores moleculares
Proteínas motorasProteínas motoras
• Movimento unidireccional através do citoesqueletoMovimento unidireccional através do citoesqueleto
• Alterações conformacionais (ciclo mecânico)Alterações conformacionais (ciclo mecânico)
• Tipos: Tipos: cinesinas e dineínascinesinas e dineínas (ao longo dos (ao longo dos microtubulos)microtubulos) e e
miosinasmiosinas (ao longo(ao longo
dos microfilamentos de actina)dos microfilamentos de actina)
• Carga (material a transportar): Carga (material a transportar):
vesículas, mitocôndrias, lisossomas, cromossomas, vesículas, mitocôndrias, lisossomas, cromossomas,
filamentos do citoesqueletofilamentos do citoesqueleto
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CinesinasCinesinasCadeias pesadas Cadeia leve
Cabeça
Zona flexível
Braço Cauda
Movimento de vesículas e
organitos a partir do corpo celular
para os terminais (por ex.
sinápticos)
Proteínas Motoras
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CinesinasCinesinas
Proteínas Motoras
• Tetrâmero: duas cadeias pesadas e duas cadeias leves (380 kDa)
• Cabeças globulares: domínios de formação da força motriz (hidrólise de ATP)
• Caudas: ligação da carga
• Movimento: no sentido da extremidade positiva (-tubulina)
• Movimento: ao longo de um microtubulo, com velocidade (1 m/s)
- dependente da concentração de ATP
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CinesinasCinesinas Proteínas Motoras
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39
CinesinasCinesinas Proteínas Motoras
Movimentos propostosMovimentos propostos
(Simulação do movimento molecular)(Simulação do movimento molecular)
kinwalk_ribbon
Cinesina monomérica ligada a GFP
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Verde - anticorpo anti-tubulina (Microtubulos)
Amarelo - anticorpo anti-cinesina (identifica as vesículas associadas)
Laranja - marcação dupla, correspondente aos 2 anticorpos
Microtubulos
• Extremidade positiva no sentido da membrana plasmática
• Promovem movimento para “fora”
CinesinasCinesinas
Proteínas Motoras
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DineínasDineínas
Proteínas Motoras
•Duas cadeias pesadas e diversas cadeias leves
• Cabeça globular: domínios de formação da força motriz
• Caudas: ligação da carga
• Movimento: sentido da extremidade negativa
• Movimento: para o centro da célula
• Carga: endossomas, lisossomas, vesículas do Golgi, movimento dos cromossomas na mitose...
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Proteínas Motoras
Cadeias leves
DineínasDineínas
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Proteínas Motoras
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Proteínas Motoras
CinesinasCinesinas
DineínasDineínas
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DineínasDineínas
• Movimento: para o centro da célula, no sentido da
extremidade negativa
CinesinasCinesinas
• Movimento: sentido da extremidade positiva (-tubulina)
Carga: endossomas, lisossomas, vesículas do Golgi, movimento dos cromossomas na mitose...
Um organito pode ligar cinesinas e dineínas simultaneamente embora actuem independentemente
Cada Cada tipo de vesícula membranartipo de vesícula membranar é transportada é transportada por uma cinesina específicapor uma cinesina específica
Proteínas Motoras
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A funçãoA função depende da orientação e localização dos microtubulos
A formação dos microtubulos a partir dos dímeros de -tubulina é realizada em duas fases:
• nucleação: fase lenta• forma-se uma pequena porção
• elongação: fase rápida
Centros Organizadores de Microtubulos (MTOCs)O melhor conhecido é o Centrossoma
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CentrossomasCentrossomas
• 2 Centríolos• Material pericentriolar (PCM)
Centríolos
• estruturas cilíndricas• 0,2 m Ø• nove fibras• fibra: 3 microtubulos A, B, C• tubulo A: microtubulo completo e ligado à zona central (filamento
radial periférico)• 1 par por célula• orientação perpendicular entre si
Centros Organizadoresde Microtubulos
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centríolo
CentrossomasCentrossomas
Centros Organizadores de Microtubulos
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49
Crescimento dos
microtubulos
• Adição de dímeros à
extremidade positiva
• crescimento em todas as
direcções da célula
• extremidade negativa
junto dos centríolos
• extremidade positiva
exterior da célula
CentrossomasCentrossomas
Centros Organizadores de Microtubulos
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Papel da Papel da -tubulina-tubulina
Centros Organizadoresde Microtubulos
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Outros Centros Organizadores
Corpos basais (com estrutura semelhante aos
centríolos)
• estrutura base dos cílios e flagelos
• Funções dos MTOCs:
• controlo do número de microtubulos
• polaridade do microtubulo
• número de protofilamentos que os constituem
• tempo e localização de organização de novos
microtubulos
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Propriedades dinâmicas
Microtubulos do aparelho mitótico ou do citoesqueleto
• estruturas lábeis (sensíveis à
desorganização)
• Microtubulos dos axónios• estruturas menos lábeis
• Microtubulos dos cílios e flagelos
• estruturas estáveis
• Do Citoesqueleto• microtubulos polimerizam e despolimerizam rapidamente consoante as variações e necessidades da célula -
Instabilidade dinâmicaInstabilidade dinâmica
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Polimerização/Despolimerização
Dímeros de GTP
Dímeros de GDP
Polimerização
Despolimerização
Na polimerização
Requer GTP• ligada à subunidade
Hidrólise do GTP• após incorporação do dímero no microtubulo (“fecho” do microtubulo)
Na despolimerização
Após a saída do dímero do microtubulo• a molécula de GDP é substituída por GTP (dímeros/GTP disponíveis)
• Controlo independente da Controlo independente da polimerização e despolimerização dos polimerização e despolimerização dos microtubulosmicrotubulos
A alteração conformacional resultante da A alteração conformacional resultante da hidrólise do GTP e do fecho do microtubulo hidrólise do GTP e do fecho do microtubulo fornecem a energia mecânica necessária para fornecem a energia mecânica necessária para a destabilização do microtubulo.a destabilização do microtubulo.
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A GTP cap stabilizes the (+) end of a microtubule. If [tubulin dimer] is low, dissociation of tubulin-GTP may expose tubulin-GDP at the (+) end, causing that end to be unstable. Rapid shrinkage ensues.
Hydrolysis of GTP by -tubulin, as subunit addition brings it into contact with -tubulin, takes time.
A rapidly growing microtubule may A rapidly growing microtubule may accumulate a few layers of tubulin-accumulate a few layers of tubulin-GTP at the (+) end.GTP at the (+) end.
seam
microtubule 3-start helix
-GDP -GTP
-GTP -GTP
+
GTP GDP GTP GTP
protofilament ( ) (+)
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Fraying or curving of protofilaments is observed at the ends of rapidly disassembling microtubules.
This may be due to a change in conformation when -subunits of heterodimers at the plus end have bound GDP instead of GTP.
microtubule during rapid shortening at the plus end
protofilament
Tubulin heterodimers with GDP on the subunit form ring shaped assemblies in vitro. Straight protofilaments form only when both tubulins have bound GTP.
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56
Funções
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57
Cílios
Os flagelos dos procariotas são filamentos simples sem qualquer relação evolutiva com o dos eucariotas
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58
Sistema flagelar
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59
Sistema ciliar e flagelar
Túbulo A – completo(13 subunidades)
Túbulo B – incompleto(10-11 subunidades)
Proteína elásticaProteína elástica
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60
Túbulo A - completo
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Centrosomal material also has an essential role in nucleating formation of cilia & flagella.
The ciliary axoneme grows out from one centriole cylinder, called a basal body.
plasma membrane axoneme basal body (centriole)
Cilium
cytosol
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Cílos e flagelos Cílos e flagelos
têm origem num têm origem num
corpo basalcorpo basal
Túbulo A - completo
Túbulo B e C – incompletos
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Dineína do axonema (cílios e flagelos)Dineína do axonema (cílios e flagelos)
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64
Dineína do axonema (cílios e flagelos)Dineína do axonema (cílios e flagelos)
Ligação aos tubulos
Actividade de ATPaseActividade de ATPase
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Dineína do axonemaDineína do axonema
Deslocação alternada de cada Deslocação alternada de cada metade do axonemametade do axonema
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66
(Cap 14 – Karp)(Cap 14 – Karp)
Dinâmica dos MicrotubulosDinâmica dos Microtubulos e Proteínas Motoras na Mitosee Proteínas Motoras na Mitose
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MCB 1901V – Video Mitose
MCB 1902 Mitose-aspectos moleculares
MCB 1901 - Animação Mitose
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68
A mitose é o último passo do ciclo celular e demora cerca de 1h
Neste período a célula constrói e desorganiza os microtubulos que constituem o aparelho mitótico
MicrotubulosMicrotubulos e Aparelho Mitótico e Aparelho Mitótico
Estrutura com a função de ligar e alinhar os cromossomas e de os separar para cada célula filha
A separação dos cromossomas no ciclo mitótico tem 2 pontos de controlo cruciais:
- ruptura do envelope nuclear no fim da profase- ligação dos microtubulos aos cinetocoros dos
cramatídeos irmãos na fase de transição metafase-anafase
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Cinetocoro Placa externa do cinetocoro
Cinesina
Dineína
Microtubulo
Fibra
MicrotubulMicrotubuloo
CoronaCoronafibrosafibrosa
Zona intermédia
Placa externaPlaca interna
Cinetocoro- localizado na superfície externa do centrómero de cada cromatídeo (mitótico)- local de ligação do cromossoma aos microtubulos do fuso mitótico- possuí várias proteínas motoras- promove o movimento dos cromossomas durante a mitose
Microtubulos e Aparelho MitóticoMicrotubulos e Aparelho Mitótico
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-
Microtubulos e Aparelho MitóticoMicrotubulos e Aparelho Mitótico
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Microtubulos e Aparelho MitóticoMicrotubulos e Aparelho Mitótico
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Metafase
Cinetocoro é um local com grande
actividade, mesmo em plena
metafase
São adicionadas mais unidades de
tubulina , do que as perdidas
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Metafase
Despolimerização lenta
Polimerização lenta
Despolimerização lenta
Despolimerização lenta
Cinetocoros
Adição rápida de dimeros de
tubulina
Perdarápida de
dimeros de tubulina
Despolimerização lenta
O encurtamento e o alongamento dos microtubulos para dispor os cromossomas na ”placa equatorial”
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Anafase
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Microtubulos
Tubos rígidos constituídos de subunidades da proteína tubulina
Filamentos intermédios
Fibras com uma estrutura do tipo corda constituídas por diversas proteínas
Microfilamentos
Estruturas sólidas e finas compostas da proteína actina
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Monómero
Dímero
Tetrâmero
Estrutura do filamento intermédio
Filamentos intermédios
• 10 nm • Não ramificados
• Tetrâmero formado por dois
dímeros com orientação
antiparalela
• Proteínas de diferentes tipos
• Tetrameros associados - Sem
polaridade
• Resistentes a forças de
tensão
• Queratina, nestina, vimentina,
desmina, laminina, NF-L(M,H)
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Células epiteliais• queratina Tipo I e Tipo II
Células nervosas• neurofilamentos (NF-L, NF-H, NF-M)• suporte
Filamentos intermédios
Filamentos intermédios de queratinaFilamentos intermédios de queratina
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Inicialmente pensou-se que os FI eram estruturas permanentes.
Posteriormente verificou-se que actuam de uma forma dinâmica “in vivo”
Injectando culturas de células epiteliais com subunidades de queratina marcadas com fluorescência, elas são rapidamente incorporadas nos filamentos intermédios existentes
A incorporação faz-se não na extremidade dos filamentos, A incorporação faz-se não na extremidade dos filamentos, mas no seu interiormas no seu interior
Existe então um “pool” de subunidades de queratina que Existe então um “pool” de subunidades de queratina que estão em equilíbrio dinâmico com as suas formas estão em equilíbrio dinâmico com as suas formas polimerizadaspolimerizadas
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Microfilamentos
• 8 nm • Subunidades globulares de actina• Requer ATP para polimerizar • Dupla hélice de filamento de actina• Polaridade• Proteína principal na contracção muscular• Proteína muito abundante em todas as células, em especial nas células motoras
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Polimerização dos microfilamentos
• Monómero de actina liga ATP• ATP é hidrolisado algum tempo após a incorporação no novo filamento
++
-
Extremidade positiva– crescimento rápido
Extremidade negativa- crescimento lento
S1 da miosina
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MCB 1802 – polimerização da G-actina
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Polimerização dos microfilamentos
Equilíbrio entre subunidades livres e filamento – controlo na reorganização do citoesqueleto de microfilamentos
Processos dinâmicos: movimento celular, alterações da forma celular, citocinese.
Exemplos de movimento celular através da
polimerização da actina
- Espermatozóide – reacção acrossomal
(Formação de pequeno filamento na zona
frontal formado por polimerização dos
monómeros de actina).
- Propulsão da bactéria Listeria
monocytogenes no citoplasma de um
fagócito
actina
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Miosina-Proteina MotoraMiosina-Proteina Motora
Fragmento S1
Cadeia leve
Cabeça
Cadeia leve reguladora
Cauda
Proteína Motora dos MicrofilamentosMovimento para a extremidade positiva do microfilamento.
Miosina II
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Filamento bipolar
Cadeias leves
Cadeias pesadas
Miosina II
• Associação de miosinas formando um filamento
bipolar
• Contracção muscular
Miosina-Proteina MotoraMiosina-Proteina Motora
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• Músculo esquelético
• Célula muscular ou fibra
• Composta por miofibrilhas.
• Miofibrilas - unidades
contrácteis: sarcómeros
• Sarcómeros: filamentos
finos (actina) e grossos (miosina)
Músculo
Feixe de células musculares
Fibra muscularBaínha
Núcleo
Banda I
Linha Z
Sarcómero
Miofibrila
Banda I
Banda A
Contracção muscular
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MCB 1804 Demonstração experimental do movimento
Contracção muscular
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Sarcómeros
Banda I Banda I Banda A
Zona H
Ext.negativa
Linha Z Linha Z
Ext.negativa
Ext. positiva Ext.positiva
Filamento de actina Filamento grossoMiosina
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Modelo decontracção muscular
• Contracção por encurtamento do sarcómero• Contracção: banda A permanece inalterada (corresponde à miosina), bandas I e H diminuem• Linhas Z movem-se para o
centro do sarcómero
Contracção: deslizamento de filamentos de actina e miosina
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Modelo de contracção muscular
• Filamentos finos: actina , tropomiosina e troponina
• Troponina: composta por 3 subunidades, espaçada cada 7
subunidades de actina
• Tropomiosina: molécula filamentosa
encaixa nas depressões da hélice de actina
Actina TropomiosinaTroponina
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Contracção• cabeça da miosina movimenta-se para fora e liga-se ao
filamento de actina, formando pontes transversais• 1 filamento de miosina liga-se a 6 filamentos de actina• após ligação a cabeça da miosina dobra-se para o interior
do sarcómero• movimento do filamento de actina 5 a 15 nm sobre o filamento de miosina
miosinaFilamento de actina
Cabeça
Modelo de contracção muscular
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Energética da contracção muscular
Miosina requer energia do ATP para conversão da energia química em mecânica
Ciclo de formação de pontes transversais – 50 msegundos
1.Ligação de ATP – dissociação com filamento de actina2.Hidrólise do ATP em ADP+Pi3.Absorção da energia libertada e ligação à actina4.Liberta o fosfato, altera conformação, impulsiona o filamento de actina para o centro do sarcómero5. ADP dissocia-se da miosina, liga-se novo ATP
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Energética da contracção muscular
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Regulação da contracção muscular
• Relaxado – tropomiosina bloqueia local de ligação da miosina à actina
• Posição da tropomiosina é controlada pela troponina
• Cálcio aumenta, liga-se à troponina
• Deslocamento da tropomiosina
• Exposição do local de ligação da miosina
• Após a estimulação nervosa ocorre a remoção do cálcio do citoplasma
• Cálcio dissocia-se da troponina
• Tropomiosina bloqueia a ligação da miosina
Actina TropomiosinaTroponina
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Actina, miosina e citocinese
Citocinese
• divisão das células após
divisão dos cromossomas
•Anel contráctil
• mesmo local da placa
equatorial
• microfilamentos e
miosina
• contração até à união
das duas
membranas
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Actina, miosina e citocinese
Anel contráctil
Actina Miosina
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Doenças associadas a alterações do citoesqueletoDoenças associadas a alterações do citoesqueleto
MicrofilamentosMicrofilamentos
Produtos de fungos como as citocalasinascitocalasinas e as faloidinasfaloidinas interferem com a
dinâmica de polimerização e despolimerização da actina, interferindo com o
movimento celular. As citocalasinas ligam-se à actina impedindo a
polimerização, enquanto as faloidinas ligam-se lateralmente aos
microfilamentos estabilizando-os.
Filamentos intermediáriosFilamentos intermediários
A disposição dos filamentos intermediários depende da presença de
microtúbulos.
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Microvilosidades com actina
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Família das Família das EspectrinasEspectrinas
- Servem de - Servem de esqueleto esqueleto membranarmembranar
- Suporte às - Suporte às proteínas integraisproteínas integrais