cromatografia em papel 1
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SUMÁRIO
1. Resumo.................................................................................................................. 01
2. Introdução.............................................................................................................. 02
3. Objetivos................................................................................................................ 08
3.1. Objetivo Geral................................................................................................. 08
3.2. Objetivos Específicos...................................................................................... 08
4. Parte Experimental................................................................................................ 09
4.1. Materiais e Reagentes.................................................................................... 09
4.2. Procedimento Experimental............................................................................ 09
5. Resultados e Discussão......................................................................................... 11
6. Considerações Finais............................................................................................. 13
7. Referências Bibliográficas...................................................................................... 14
8. Apêndice................................................................................................................ 15
8.1. Questionário................................................................................................... 15
1. RESUMO
Os critérios para análises de cromatografia em papel utilizando folhas de chanana e
uma solução de éter de petróleo e álcool metílico na proporção de (50:1), assim como a
separação dos pigmentos foliares, foram devidamente evidenciados, sendo possível
marcar a posição das bandas coradas e identificá-las, compreendendo assim o estudo
a escopo deste relatório. Os resultados mantiveram boa concordância literária.
2. INTRODUÇÃO
O Processo de Cromatografia
Um dos problemas que continuamente desafiam os bioquímicos é a separação e a
purificação de um ou mais compostos de uma mistura complexa. Cromatografia é um
processo físico de separação, no qual os componentes a serem separados distribuem-
se em duas fases: fase estacionária e fase móvel. A fase estacionária pode ser um
sólido ou um líquido disposto sobre um suporte sólido com grande área superficial. A
fase móvel, que pode ser gasosa, líquida ou ainda um fluido supercrítico, passa sobre a
fase estacionária, arrastando consigo os diversos componentes da mistura. (PERES, T.
B., 2002)
De maneira mais completa, a técnica baseia-se no princípio da adsorção seletiva
(que não deve ser confundida com absorção), um tipo de adesão. A técnica foi
descoberta em 1906 pelo botânico italiano naturalizado russo Mikahail Tswett, mas não
foi largamente utilizada até os anos 30. Tswett separou pigmentos de plantas
(clorofilas) adicionando um extrato de folhas verdes em éter de petróleo sobre uma
coluna com carbonato de cálcio em pó em um tubo de vidro vertical. Enquanto a
solução percolou através da coluna os componentes individuais da mistura migraram
para baixo em taxas diferentes de velocidades e então a coluna apresentou-se
marcada com gradientes horizontais de cores. A esse gradiente deu-se o nome de
cromatograma. (STROBEL, 1973)
Portanto, um cromatograma é o resultado de um método de separação de misturas
e identificação de seus componentes. Esta separação depende da diferennça entre o
comportamento dos analitos entre a fase móvel e a fase estacionária. A interação dos
componentes da mistura com estas duas fases é influênciado por diferentes forças
intermoleculares, incluindo iônica, bipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e
solubilidade. (VOGEL, 2002)
Técnicas de Cromatografia
Existem quatro tipos principais de cromatografia: cromatografia em papel,
cromatografia de camada fina, cromatografia gasosa e cromatografia líquida de alta
eficiência. A seleção do tipo de cromatografia adequada depende dos materiais a
serem isolados e, freqüentemente, diversos métodos cromatográficos podem ser
usados seqüencialmente para que seja obtido um composto na forma pura. (PERES, T.
B., 2002)
Há uns cem tipos de cromatografia em papel; a maior parte é de interesse, mas
também são possíveis separações inorgânicas que estão recebendo atenções
crescentes. Seria possível, em princípio, delinear um sistema completo, de análise
qualitativa inorgânica, baseado em separações cromatográficas, especialmente
fazendo uso de papel de filtro impregnado com vários reagentes. Na prática, entretanto,
esse método é melhor quando combinado com outras técnicas, por ser mais vantajoso
em algumas separações que em outras. (EWING, 1982)
Cromatografia em Papel
Como uma alternativa da técnica em coluna, pode realizar a cromatografia em uma
folha ou tira de papel adsorvente. Para várias finalidades, deve-se preferir papel de
filtro celulose. É tão hidrófilo que normalmente mantém um revestimento de água
(totalmente imperceptível) adsorvida do ar. Portanto a cromatografia em papel de filtro
é quase sempre uma partição, um exemplo de cromatografia líquido-líquido. (EWING,
1982)
Essa é uma técnica de partição que utiliza dois líquidos (líquido-líquido) sendo um
fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Útil em separação de compostos polares.
Encontra-se bastante difundida devido à sua facilidade experimental e ao seu baixo
custo. (STROBEL, 1973)
A cromatografia em papel (CP) é uma das técnicas mais simples e que requer
menos instrumentos para sua realização, porém é a que apresenta as maiores
restrições para sua utilização em termos analíticos. (PERES, T. B., 2002)
Neste tipo de cromatografia, uma amostra líquida flui por uma tira de papel
adsorvente disposto verticalmente. O papel é composto por moléculas de celulose que
possuem uma forte afinidade pela água presente na mistura de solvente, mas muito
pouca afinidade pela fase orgânica, atuando como suporte inerte contendo a fase
estacionária aquosa (polar). À medida que o solvente contendo o soluto flui através do
papel, uma partição deste composto ocorre entre a fase móvel orgânica (pouco polar) e
a fase estacionária aquosa. Desta forma, parte do soluto deixa o papel e entra na fase
móvel. Quando a fase móvel alcança uma seção do papel que não contém soluto, o
fenômeno de partição ocorre novamente, só que agora o soluto é transferido da fase
móvel para a fase estacionária. Com o fluxo contínuo de solvente, o efeito desta
partição entre as fases móvel e estacionária possibilita a transferência do soluto do seu
ponto de aplicação no papel, para um outro ponto localizado a alguma distância do
local de aplicação no sentido do fluxo de solvente. (PERES, T. B., 2002)
O experimento que envolve análises de cromatografia em folhas provém à extração
das clorofilas e carotenos presentes na mesma com o auxílio de solventes e
posteriores empregos de técnicas cromatográficas para a visualização e separação
desses componentes. (DEGANI, 1998)
A clorofila é facilmente identificada nas plantas, pois é a responsável pela coloração
verde das mesmas. A clorofila a é a mais abundante no reino vegetal, sendo
encontrada, juntamente com a clorofila b, numa proporção de 3:1, respectivamente. O
mais conhecido dos carotenos é o β-caroteno, com ampla ocorrência no reino animal e
vegetal, sendo normalmente encontrado nas plantas, junto com a clorofila. É o mais
importante dos precursores da vitamina A e utilizado como corante na indústria
alimentícia. (DEGANI, 1998)
Essa técnica permite ao aluno entrar em contato com vários conceitos envolvidos,
desde a extração de compostos de plantas com o auxílio de solventes até a
cromatografia do extrato obtido. Conceitos como solubilidade, polaridade, coeficiente
de partição, adsorção e fator de retenção (Rf) podem ser abordados durante a
execução do experimento, que também proporciona ao aluno o conhecimento de uma
poderosa técnica de análise empregada cotidianamente em laboratórios de pesquisa e
em algumas indústrias, como a farmacêutica. (DEGANI, 1998)
Também um procedimento típico desta, é a análise de uma mistura de aminoácidos.
Pode-se fazer como segue: alisa-se uma tira de papel de cerca de 1 por 15 cm, coloca-
se uma pequena gota de solução a ser analisada no centro a aproximadamente 1 cm
de uma das extremidades. Marca-se esse ponto com um lápis para a medida futura.
Então se evapora o solvente e a tira é suspensa pela extremidade mais afastada em
um recipiente alto. Mergulha-se a extremidade inferior em um depósito de uma mistura
de água e butanol. Cobre-se o topo do cilindro com papelão, de modo que os vapores
de ambos os solventes banhem a tira pendente. Após repouso, o líquido começa a
subir a tira por capilaridade, arrastando os constituintes da amostra com ele, em várias
velocidades, de acordo com seus coeficientes de partição entre a água adsorvida e
butanol intersticial. Quando a frente avançada de solvente se aproxima do toco,
remove-se a tira e marca-se sobre ela o ponto de avanço mais afastado. Então a tira é
secada ao ar é pulverizada com uma solução de ninidrina. Algumas manchas se
encontraram distribuídas ao longo da tira; deveram ser marcadas a lápis para um
registro permanente. (EWING, 1982)
A ordem de separação das substâncias depende das combinações de solvente
utilizadas. Sob condições constantes de temperatura, sistema de solventes e
adsorvente, qualquer soluto (uma droga, um corante, um esteróide etc.) move-se com
uma razão constante em relação à frente do solvente. Esta razão é conhecida como
valor Rf (frente relativa ou fator de retardamento) onde
distância percorrida pelo componente
Rf = _________________________________________________________
distância percorrida pela frente do solvente
(VOGEL, 2002)
Pode-se entender essa técnica pelo uso de grandes quadrados de papel de filtro de
15 a 30 cm de lado. Aplica-se a amostra em um ponto próximo a um canto e suspende-
se o papel de modo que uma extremidade mergulhe no solvente. Os constituintes da
amostra se movem para cima como antes. Após essa etapa, o papel é secado, girado
de 90º e suspenso com a outra extremidade adjacente ao canto contendo a amostra
mergulhada em um segundo solvente, no qual os valores de Rf são diferentes. Isso fará
com que as manchas se movam, através do papel, em uma direção em ângulo reto em
relação ao primeiro movimento e assim produziram um cromatograma bidimensional
correspondentemente com melhor separação de uma mistura complexa. Recipientes
de vidro retangulares são convenientes para esse trabalho e podem-se tratar varias
folhas simultaneamente. (EWING, 1982)
Descrevendo-se a técnica do solvente ascendente; também é possível realizar uma
preparação cromatográfica em papel com solvente descendente. Pendura-se o papel
em um tanque com solvente e monta-se o conjunto todo em um recipiente fechado,
onde se satura o ar com vapor do solvente, para evitar a evaporação. Os
cromatogramas em papel podem-se traduzir quantitativamente em um gráfico de
absorbância óptica em função da posição da mancha no papel, medindo-se a
transmissão de comprimentos de onda selecionados diretamente através do papel.
Planejaram-se vários fotômetros de filtro especificamente para essa aplicação; além
disso, dispõe-se de adaptadores prendedores de papel para vários espectrofotômetros
comerciais. (EWING, 1982)
Fatores Importantes em Cromatografia
A cromatografia funciona graças ao fato das moléculas possuírem uma propriedade
chamada polaridade em comum e tenderem a se atrair mutuamente. Uma molécula
polar é simplesmente aquela que possui uma região rica em elétrons e uma outra
região que é pobre em elétrons. Estas regiões às vezes são representadas como
sendo negativamente e positivamente carregadas, respectivamente. Moléculas polares
são unidas por forças de atração entre cargas opostas de moléculas diferentes.
Moléculas de água têm regiões ricas em elétrons nos átomos de oxigênio e regiões
pobres em elétrons nos átomos de hidrogênio. Assim, as moléculas de água são
polares e, por conseguinte organizam-se de maneira que a região de carga positiva de
uma molécula é atraída pela região de carga negativa de outra. (STROBEL, 1973)
Na cromatografia em papel algumas vezes, devem-se preferir outros tipos de papel
em substituição à celulose. O papel feito de fibra de vidro permite a localização de
substâncias orgânicas através de uma pulverização com ácido sulfúrico concentrado, o
que produz manchas carbonizadas facilmente visíveis na superfície branca. Dispõe-se
de papéis em que se adicionaram resinas de troca iônica para usar com substâncias
iônicas. (EWING, 1982)
O termo coeficiente de partição ou coeficiente de distribuição é normalmente usado
para descrever a forma pela qual um composto se distribui entre duas fases imiscíveis.
(VOGEL, 2002)
Em cromatografia, é conveniente usar o termo para descrever a distribuição de um
soluto entre duas fases quaisquer. Por exemplo, o coeficiente de distribuição de uma
substância entre álcool e alumina pode ser 0,1, significando que a concentração da
substância em álcool (em peso por volume - p/v) é 1/10 de sua concentração em
alumina (em p/v). Assim, o coeficiente de distribuição do álcool etílico entre o ar (em
p/v) e a água (também em p/v) a 30°C é de 3,05 . 10-4, por que 1 litro de ar conterá
3,05.10-4 vezes tanto álcool etílico do que um litro de água com a qual está em
equilíbrio. O coeficiente de distribuição (K) será sempre expresso, para propósitos
cromatográficos, como a concentração na fase móvel dividido pela concentração na
fase estacionária. (STROBEL, 1973)
A técnica de cromatografia em papel foi quase completamente superada pela
cromatografia em camada fina nos laboratórios analíticos, embora seja ainda útil para
fins demonstrativos (como misturas de corantes, por exemplo). A química legal tem
sido muito beneficiada pelo desenvolvimento da cromatografia em camada fina, por
causa de seu uso extensivo na análise preliminar de drogas. Particularmente
importantes são as aplicações especializadas no estudo da composição de pontas de
fibras de canetas, de fitas de máquinas de escrever e de impressoras de computador.
(VOGEL, 2002)
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Compreender o estudo de cromatografia em papel.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Interpretar experimentalmente análises de cromatogramas em papel;
Analisar a ocorrência de diferentes bandas coradas originárias de um sistema de
solvente e adsorvente em um papel de filtro.
Evidenciar características quantitativas e qualitativas de uma cromatografia;
Estimar, a partir de critérios e dados fornecidos, a razão constante a relação à
frente do solvente (movimento), ou seja, o fator relativo Rf, e assim identificar os
compostos presentes numa cromatografia em papel;
4. PARTE EXPERIMENTAL
4.1. MATERIAIS E REAGENTES
10 folhas de chanana;
Tesoura;
Béquer de 250 mL;
Béquer de 50 mL;
Proveta de 100 mL;
Papel absorvente;
Papel de filtro;
Almofariz;
Vidro de relógio;
Pistilo;
Régua;
Éter de petróleo (65 – 110°) ou hexano;
Álcool metílico;
4.2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1. Picaram-se dez folhas de chanana e mergulharam-nas durante alguns minutos
em água a ferver, para matar as células.
2. Retirou-se o material, despejando-o foliadamente em um vidro de relógio e
obsorveu-se o excesso de água com papel absorvente.
3. A seguir, com a utilização de um almofariz triturou-se o material usando várias
quantidades sucessivas de 10 a 15 mL de uma solução de éter de petróleo e
álcool metílico a 50:1. Triturou-se muito bem e depois de juntar a última porção da
mistura de éter petróleo e álcool metílico, continuou-se a triturar até restarem
apenas alguns mililitros de solvente.
4. Decantou-se cerca de 1 mL deste extrato de pigmento para dentro de um béquer
de 50 mL e introduziu-se uma tira de papel de filtro ligeiramente mais estreita que
o diâmetro do béquer, logo, observaram-se o desenvolvimento de bandas
coradas.
5. A clorofila b é absorvida mais fortemente do que a clorofila a, os carotenos não
são fortemente retidos na fase estacionária, acompanham o solvente e
concentram-se no topo da tira.
6. À medida que o solvente evaporara-se, marcou-se a posição das bandas com
uma régua, ambas foram devidamente identificadas, e colou-se o cromatograma
no escopo deste relatório.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com a finalidade de se obter uma melhor compreensão, o cromatograma foi
anexado abaixo mostrando a diferença na bandagem de coloração:
Feita a medição descobriu-se que a distância percorrida pelo extrato no papel foi de
4,1 cm. Ao observar as cores neste cromatograma, o verde mostra a presença de
clorofilas do tipo “a” e “b”, apesar de não se apresentar muito nítida tal coloração e a
linha amarela mais acima, demonstra a presença de carotenos na mesma amostra. A
clorofila “a” apresentou uma distância percorrida de aproximadamente 1,8 cm e R f igual
a 0,44, a clorofila “b” mostrou cerca de 0,5 cm e R f 0,12 e para os carotenos a distância
foi de 2,6 cm apresentando fator de retenção 0,63. (COLLINS, 1995)
A partir da análise do cromatograma torna-se possível discutir a causa de tal
distribuição das cores. Foi utilizada uma mistura de um solvente apolar (Éter de
petróleo) e polar (Metanol) na proporção de 50:1, porém como o éter se apresenta em
uma maior proporção na mistura, o solvente mostrará característica apolar. Essa
mistura arrastará consigo as substâncias que tiverem polaridade semelhante à sua,
fato que ocorre com os carotenos, uma vez que estes apresentam longas cadeias
carbônicas, sendo assim apolares. Em contrapartida as clorofilas apresentam estrutura
deveras complexa, porém os heteroátomos presentes na sua estrutura fazem com que
esse composto apresente característica polar, fator esse que explica o fato de que a
mesma substância seja a menos arrastada pelo solvente.
Com a utilização da cromatografia em papel, foi difícil diferenciar as clorofilas “a” e
“b”. As clorofilas são polares e logo terão uma maior interação com o papel já que o
mesmo é constituído de celulose (polar), assim apresentarão maior fator de retenção
ficando mais retidas no papel e sendo mais difícil de serem arrastadas em um solvente
apolar (éter). O Caroteno apresentou o maior fator de retenção, já que o mesmo sofrerá
influência maior do eluente apolar, fazendo assim com que ocupe a parte mais alta do
papel, onde se encontra geralmente substâncias de caráter apolar como é o tal.
(COLLINS, 1995)
Baseando-se na cromatografia em papel, onde o solvente era apolar, foi observado
que as clorofilas “a” e “b” apresentam menor fator de retenção, pois foram mais difíceis
de serem arrastadas já que apresentaram uma maior interação com o papel, indicando
que as mesmas são substâncias polares. Porém, os carotenos apresentaram maior Rf,
ocupando a parte superior do papel, caracterizando uma substância apolar e como tal
terá pouca ou nenhuma interação com o papel. (COLLINS, 1995)
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Por conseguinte a uma seqüência de análises em 1 mL de extrato de pigmento
obtido a partir da trituração de folhas de chanana com uma solução de éter de petróleo
e álcool metílico na proporção de (50:1), e usufruindo da utilização de um papel filtro,
fora possível estimar uma interpretação experimental de um cromatograma, onde
partindo-se deste, marcou-se as bandas coradas e por dados fornecidos fizera-se a
identificação dos compostos de clorofila a e b e os carotenos presentes. Os resultados
foram bastante representativos com os dados reportados na literatura.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
DEGANI, A. L. G.; CASS, Q.B.; VIEIRA, P. C. Química Nova na Escola, 1978.
7, 21.
EWING, Galen W. Métodos instrumentais de análise química. Ed. da
Universidade de São Paulo, 1982. 2v ilust.
PERES, T. P.; Palestra, Noções básicas de cromatografia, Centro de pesquisas
e desenvolvimento de proteção Ambiental – Instituto Biológico, v. 64, n° 2, p.
227 - 229, jul/ dez, São - Paulo SP, 2002.
STROBEL, Howard A.; Chemical Instrumentation: A Systematic Approach. 2a
edição. Addison – Wesley Publishing company, 1973
VOGEL; MENDHAM, J.; DENNEY, C. R.; BARNES, J. D.; THOMAS M. Análise
Química Quantitativa. 6a edição, Editora S.A. Rio de Janeiro, 2002.
8. APÊNDICE
8.1. QUESTIONÁRIO – Cromatografia em Papel
1. Pesquisar a estrutura das clorofilas e carotenos e justificar a cor observada
para estas substâncias.
A clorofila a apresenta quatro anéis pirrólicos substituintes, sendo que um deles se
encontra reduzido, e ainda um quinto anel não pirrólico. A clorofila b apresenta um
grupo aldeído ao invés do grupo metila. Os carotenos possuem muitas ligações duplas
conjugadas que o tornam capazes de absorver a luz e transmitir éxcitons.
Figura 1: R para a clorofila “a” é CH3 e para a clorofila “b” é CHO.
Caroteno
2. Qual é o estado físico da fase móvel e da fase estacionária na cromatografia
em papel?
Como na cromatografia de papel há adsorção, a fase móvel e a fase estacionária
estão no estado líquido.
3. Qual é o mecanismo de separação da cromatografia em papel?
Promove-se a separação das substâncias a partir das diferenças de polaridade, de
acordo com a polaridade predominante do solvente, é possível determinar quais
substâncias serão facilmente arrastadas e quais serão retidas.
4. Como se define o Rf (fator de retenção)?
Fator de retenção é a razão entre a distância percorrida pela substância e a
distância percorrida pela fase móvel.
5. Com base na estrutura molecular, explicar a ordem de R f observada para as
clorofilas a, b e carotenos na cromatografia em papel.
Utilizando-se a cromatografia em papel, foi difícil diferenciar as clorofilas a e b. As
clorofilas são polares e logo apresentam menor fator de retenção, sendo mais difícil de
serem arrastadas em um solvente apolar (éter) já que apresentarão maior interação
com o papel. O Caroteno possui o maior fator de retenção, ocupando a parte mais alta
do papel (a parte menos polar), pois é o menos polar dentre os três pigmentos sofrendo
menos interação com o papel e logo sendo mais facilmente arrastado.