UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO UNIVERSITÁRIO DO NORTE DO ESPIRÍTO SANTO

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS NATURAIS

ENGENHARIA QUÍMICA

CAMILA CAROLYNE DE OLIVEIRA SANTOS

FREDERICO KROHLING MAYER

JULIO PANSIERE ZAVARISE

LARISSA BASTOS DE PAULA BOMFIM

RELATÓRIO Nº 6

EXPERIÊNCIA 9: CINÉTICA DE REAÇÕES ENZIMÁTICAS

SÃO MATEUS-2015

RESULTADOS E DISCUSSÕES

As absorbâncias obtidas experimentalmente para os volumes de 0,50 mL ; 0,75mL;

1,0 mL e 1,5mL de solução de catecol com concentração 0,005 molar em função do

tempo estão na tabela 1 abaixo:

Tabela 1.Absorbâncias para o comprimento de onda a 450 nm de cada volume de catecol

0,005 M em função do tempo.

Absorbâncias para cada volume de Catecol

tempo (s) 0,50 mL 0,75 mL 1,0 mL 1,5 mL

30 0,218 0,243 0,285 0,341

60 0,249 0,289 0,331 0,406

90 0,273 0,317 0,370 0,455

120 0,293 0,343 0,402 0,496

150 0,310 0,366 0,430 0,526

180 0,326 0,387 0,456 0,551

210 0,342 0,410 0,482 0,573

240 0,354 0,427 0,499 0,590

270 0,365 0,444 0,518 0,604

300 0,380 0,457 0,534 0,615

330 0,397 0,471 0,545 0,627

360 0,410 0,481 0,555 0,637

390 0,418 0,490 0,572 0,646

420 0,427 0,496 0,578 0,651

450 0,435 0,506 0,585 0,661

480 0,440 0,514 0,590 0,662

510 0,447 0,517 0,598 0,672

540 0,453 0,524 0,604 0,675

570 0,457 0,536 0,610 0,685

600 0,464 0,538 0,614 0,691

Cálculo das concentrações de catecol :

Para cada volume de catecol 0,005 mol/L adicionado a um béquer de 50 mL, antes

de se medir a absorbância, completou-se com água destilada de modo a perfazer

um volume final de 3 mL, conforme consta na tabela 2 as composições de cada

cubeta.

Tabela 2. Composição das cubetas .

Volume inicial de

catecol (Vi)

0,5 mL 0,75 mL 1,0 mL 1,5 mL

Volume de água

destilada (VH2O)

2,5 mL 2,25 mL 2,0 mL 1,5 mL

Dessa maneira assim pode-se calcular as concentrações de catecol usadas na

cubeta , fazendo uso da equação 1 e dos dados da tabela 2 para calcular-se a

concentração da solução de 0,5 mL de catecol 0,005 mol/L como exemplo:

Solução 0,5 mL de Catecol 0,005 molar e 2,5mL de água destilada:

0,005 mol/L.0,5mL=Cf .3,0mL => Cf = 8,33.10-4 mol/L

Onde Ci é a concentração do Catecol antes da adição de água destilada, Vi o

volume inicial de catecol na concentração de 0,005 molar, Vf volume final da solução

após a adição de água que será para todos os experimentos realizados igual a 3,0

mL e Cf a nova concentração da solução de Catecol após diluição.

Realizou-se procedimento análogo para os Vi de 0,75mL; 1,0 mL e 1,5mL obtendo

assim os valores abaixo , dispostos na tabela 3:

Tabela 3. Concentrações finais de catecol na cubeta.

Volume inicial de catecol (Vi) 0,5 mL 0,75 mL 1,0 mL 1,5 mL

Concentração final da

solução(mol/L)

8,33.10-4 1,25.10-3 1,67.10-3 2,50.10-3

Percebe-se o aumento da concentração quanto a maior quantidade de catecol

presente, pois menos água é adicionada para completar o volume fixo de 3,0 mL

ocorrendo assim menos diluição da solução.

Cálculo da velocidade inicial (V0 )

Com os dados da tabela 1, pode-se plotar o seguinte gráfico 01 onde cada linha

possui dados de absorbância de acordo com as concentrações na cubeta

calculadas anteriormente ,para cálculo das velocidades iniciais V0 para as cinéticas

realizadas:

Figura 1. Gráfico de Absorbância versus tempo de reação .

Tem-se como inclinação da linha de tendência do gráfico de absorbância versus

tempo a velocidade inicial V0 assim para a concentração de 0,000833 M tem-se a

equação de reta y= 4,108.10-4x + 0,244 portanto V0 = 4,108.10-4 U.A. s-1 , fazendo a

mesma análise para as outras concentrações obtém-se a tabela 4:

Tabela 4.Velocidade inicial V0 para cada concentração.

Concentrações

(mol/L)

8,33.10-4 1,25.10-3 1,67.10-3 2,50.10-3

V0 4,108.10-4 4,74.10-4 5,296.10-4 5,114.10-4

Pelos gráficos absorbâncias versus tempos pode-se observar a variação

praticamente linear da absorbância com o tempo até aproximadamente 90

segundos após esse tempo a absorbância continua aumentando em função do

tempo entretanto mantém-se uma constância nos valores.

Determinação da Vmax e Km

Experimentalmente, os valores de Vmax e Km podem ser determinados utilizando o

inverso da equação de Michaelis-Menten, sendo este método denominado de

método de Lineweaver e Burk:

[ ]

Fazendo o gráfico de 1/Vo versus 1/[S], obtém-se uma reta cujo coeficiente angular

é Km/ Vmax e o coeficiente linear é 1/ Vmax.

Figura 2. Inverso da velocidade inicial pelo inverso da concentração de catecol.

y = 0,6673x + 8,0763 0

200

400

600

800

0 200 400 600 800 1000 1200

1/V

0 (U

-1A

-1s)

1/[S](M-1)

Inverso da velocidade X Inverso da concentração de catecol

O valor para 1/Vmax extrapolado no gráfico foi de 8,0763, então:

Vmax = 1/8,0763

Vmax = 0,1238 U.A. s-1

E o valor do coeficiente angular é igual a 0,6673, então:

Km/ Vmax= 0,6673

Km= 0,6673 *0,1238

Km= 0,0826

Para a mistura na cubeta de 0,50 mL de catecol e 2,50 mL de água, variando o

comprimento de onda de 400nm a 540nm, obtiveram-se as seguintes absorbâncias,

dispostas na tabela 4:

Tabela 4.Absorbância encontrada para cada comprimento de onda para a solução contendo

extrato de batata e 0,5 mL de catecol.

Comprimento de onda (nm) Absorbância (A)

400 0,484

420 0,489

440 0,499

460 0,507

480 0,515

500 0,507

520 0,476

540 0,430

Os dados acima foram dispostos em um gráfico de absorbância versus comprimento

de onda. O gráfico está apresentado na figura 3:

Figura 3.Gráfico da absorbância versus o comprimento de onda para a solução

contendo 0,5 mL de catecol.

As cinéticas foram acompanhadas em 450 nm, apesar desse não ser o

comprimento de onda em que há a maior absorbância. Observando o gráfico

percebe-se que o pico de absorbância está em torno de 470 nm.

O experimento realizado na medida de 450 nm foi feita por conveniência e o fato de

não estar no pico de absorbância introduz um pequeno erro experimental. Porém, a

diferença de absorbância de 450 nm a 470 nm é pequena esse erro é mínimo e os

resultados obtidos são validos.

Pelos gráficos de absorbância versus o tempo podemos observar que a absorbância

varia de acordo com o tempo, sendo que é diretamente proporcional nos primeiros

segundos e depois se mantém constante a partir, de aproximadamente 1 minuto,

sendo desconsiderados alguns pontos que tiveram erro experimental alto.

Pelos outros resultados é possível observar que a cinética enzimática de uma

reação depende da concentração, sendo diretamente proporcional a esta nos

primeiros valores, e tendendo a manter-se constante conforme aumentamos a

concentração.

0,42

0,43

0,44

0,45

0,46

0,47

0,48

0,49

0,5

0,51

0,52

0 100 200 300 400 500 600

Ab

sorb

ânci

a

Comprimento de Onda (nm)

Absorbância x Comprimento de Onda

QUESTIONÁRIO

1. Como podem ser definidas as enzimas? O que é substrato?

As enzimas são proteínas especializadas em catalisar reações biológicas, ou seja

aumentam a velocidade de uma reação química sem interferir no processo. Elas

estão associadas a biomoléculas, devido as suas extraordinária especificidade e

poder catalítico. A enzima provoca uma diminuição da energia livre de ativação

necessária para que uma reação química aconteça e isso facilita a ocorrência da

reação.

À substância inicial, que é transformada na reação catalisada pela enzima, dá-se o

nome de SUBSTRATO. O mecanismo de ação é praticamente o mesmo para todas

as enzimas: a enzima forma um complexo com o substrato(ES), a reação

desenvolve-se e obtém-se o (s) produto (s). A equação geral do processo descrito

pode ser representada assim:

2. Que fatores podem explicar a alta eficiência das enzimas como

catalisadores?

Pode-se citar como alguns dos fatores que contribuem para tornar as enzimas

eficientes catalisadores de reações biológicas:

Atuam em concentrações muito baixas ;

Atuam em condições suaves de temperatura e pH ;

Possuem todas as características das proteínas ;

Podem ter sua atividade regulada.

Além dessas caracterísiticas apresentadas acima , uma característica faz das

enzimas moléculas tão funcionais : elas apresentam especificidade notável diante

dos substratos e produtos. Esta especificidade é muito maior que a da maioria dos

catalisadores químicos. Isso quer dizer que uma dada enzima catalisa uma única

reação das várias que um único substrato pode sofrer. Essa especificidade é

determinada pela estreita relação que existe entre a estrutura da molécula

enzimática e suas propriedades biológicas, pois provavelmente, apenas uma fração

(denominada sítio ativo) da molécula é responsável pela ligação da enzima ao (s)

substrato (s). Diante disso, Emil Fischer propôs, em 1894, a hipótese da chave e

fechadura, que diz que a especificidade de uma enzima (fechadura) e do seu

substrato (chave) provém da complementaridade das respectivas formas.

Tanto a enzima quanto o substrato sofrem conformação para o encaixe. A enzima

não aceita simplesmente o substrato, o substrato é distorcido para conformação

exata do estado de transição, denominado encaixe por indução, proposto por

Koshland (1958), como visto na figura 4.

Figura 4 . a.Modelo chave fechadura para a enzima. b. Modelo de ajuste induzido .

Imagem disponível em

http://www2.dracena.unesp.br/graduacao/arquivos/bioquimica_animal/en zimas.pdf

Ao completar a reação catalítica a enzima libera o produto e retorna a forma original.

O processo ocorre em duas etapas:

(1) S + E→ES* (etapa reversível)

(2) ES→E + P (etapa irreversível)

3. Qual a definição e o significado de Km e Vmax na reação (veja as

unidades)?

A equação matemática que expressa a relação entre velocidade inicial e a

concentração de substrato é conhecida como equação de Michaelis-Menten:

o = Vmax[S]/ Km + [S]

Onde Vmax é o valor máximo da velocidade inicial quando todos os sítios ativos estão

ocupados, Km é a constante de Michaelis e [S] é a concentração do substrato.

Independentemente da quantidade de reagente transformado em produto, as

enzimas somente atuam na velocidade da reação e esta última é dependente da

concentração do substrato. Essa dependência possui um valor máximo a partir do

qual a velocidade é independente da concentração e é constante se mantidas as

condições de reação, indicando que as enzimas estão em condição de saturação. A

essa velocidade denomina-se velocidade máxima Vmax da reação catalisada. Essa

relação é não linear e é expressa de várias formas, mas sempre relacionando as

quantidades estequiométricas do reagente consumido por unidade de tempo, ou

quantidade estequiométrica de produto gerado por unidade de tempo, por exemplo,

mol reagente/s, sendo negativa para reagentes e positiva para produtos.

A constante Km possui a mesma unidade que a concentração da enzima (mol/L),

pois está sendo somada a ela no denominador da equação e é definida como a

concentração para a qual a velocidade da reação enzimática é metade de Vmax.

substituindo Km na equação pode-se perceber que ela gera o valor correspondente

à metade do vaor máximo da velocidade.

4.O que é inibidor enzimático, quais os tipos de inibição e os principais fatores

que diminuem a atividade de uma enzima para atuar como catalisador?

Inibidores são substâncias que reduzem a atividade das enzimas . Distinguemse

dois tipos de inibição : reversível e irreversível, segundo a estabilidade da ligação

entre o inibidor e a molécula de enzima . Na inibição reversível ocorre interações

não-covalentes entre o inibidor e a enzima , enquanto na inibição irreversível

envolve modificações químicas da mólecula enzimática , levando a uma inativação

definitiva . Na inibição reversível , a enzima retoma sua atividade após dissociação

do inibidor . Três classes de inibidores reversíveis são descritos : competitivo e não-

competitivo e incopetitivo. Na inibição competitiva o inibidor compete pelo sítio ativo

da enzima por apresentar uma mólecula estruturalmente semelhante ao

substrato.Na inibição competitiva , a Km do subtrato sofre um aumento aparente pois

o substrato e o inibidor competem pelo mesmo sítio de ligação na enzima. Já o

inibidor não competitivo se liga tanto ao à enzima como ao complexo em um sítio

diferente de ligação , que provoca a mudança da conformação da enzima , que evita

a formação de produto.O inibidor não-competivo reduz a concentração da enzima e

diminui a Vmax aparente .Já o inibidor incompetitivo liga-se ao complexo da enzima

originando um novo complexo inativo. O resutado é a modificação aparente do Km e

Vmax. Os principais fatores que afetam a atividade de uma enzima são : temperatura

, pH , tempo e concentrações do substrato e produto .

5.O que acontece se você mudar o pH ou a temperatura do meio reacional e

mantiver a concentração de enzima e substrato constantes. Explique.

As enzimas possuem uma faixa ótima de desempenho que depende, entre outras

coisas, da temperatura de do pH do meio. A velocidade das reações catalisadas por

enzimas em geral aumenta com o aumento de temperatura até atingir a velocidade

máxima. Essa é aquela que corresponde à temperatura ótima de atuação da

enzima, pois esta última, por ser formada por estruturas proteicas, principalmente

nos seres vivos, tendem a se desnaturar (perda da sua geometria usual) em

temperaturas altas relativas àquela de bom funcionamento da mesma. Da mesma

forma, variações de pH também desnaturam enzimas e numa variação, geralmente,

bem menor que a temperatura. Desta forma, enzimas possuem uma faixa bem

específica de desempenho e o meio tende a ser tamponado, pois usualmente,

reações químicas causam variação no pH. Desta forma, mantidas as concentrações

de subtrato e enzima, a variação da temperatura e pH, para mais ou para menos,

tende a causar diminuição da velocidade da reação. Essa diminuição é mais tênue

com a temperatura e mais drástica com o pH e tende a ser irreversível nos dois

casos, pois, na maioria das situações, a desnaturação é um processo irreversível.

6. Cite dois exemplos de enzimas que atuam em sistemas biológicos e

explique a sua atuação.

A enzima SOD – Superóxido Dismutase, presente em algumas plantas e também

em quase todos os animais, transforma o ânion superóxido, cujo tempo de meia

vida é bastante curto, mas capaz de causar dano à lipídeos, DNA e proteínas, em

peróxido de hidrogênio, que apesar de não ser um radical livre é uma molécula

muito tóxica às células. O peróxido de hidrogênio é neutralizado pela enzima CAT –

Catalase, que degrada o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. Estas duas

enzimas, também com o GPx e o GR (Glutationa peroxidase e Glutationa redutase)

formam a barreira enzimática aos danos causados pelos radicais livres.

Nas temperaturas entre 0 e 40 graus Celsius, as atividades destas duas enzimas

não mudam significativamente, e estima-se que milhares de enzimas estão

presentes em cada molécula de substrato, para aumentar a chance de encontro

substrato/enzima.

7. As enzimas podem ser desnaturadas quando em contato com solução de

surfactantes. Como isso pode ser explicado?

Os surfactantes são substancias que interagem tanto com sítios hidrofóbicos quanto

com sítios hidrofílicos. As proteínas podem ser desnaturadas pelo calor ou por

extremos de pH, e também por certos solutos ou solventes orgânicos e surfactantes,

onde atuam principalmente promovendo o rompimento de interações hidrofóbicas

que estabilizam as proteínas.

8. Com a ajuda da literatura, descreva sucintamente os 04 mecanismos

principais através dos quais as enzimas podem acelerar uma reação: Catálise

Ácido-Base; Torção de Substrato; Catálise Covalente; Diminuição da Entropia.

Catálise ácido-base: processo no qual a transferência parcial de prótons de um

ácido para o estado de transição diminui a energia livre do estado de transição

de uma reação. em reações catalisadas por enzimas os ácidos e bases

catalisadores sçao grupos específicos ionizáveis da enzima localizadas no seu

sítio ativo.

Torção de substrato: está inserido no modelo de ajuste induzido que prevê um

sítio de ligação não totalmente pré-formado, mas sim moldável à molécula do

substrato, no qual a ezima se ajustaria à molécula do substrato na sua presença.

Deste modo, há uma combinação desde modelo com o qual se denomina torção

de substrato, que além de haver o molde da enzima haveria uma torção do

substrato para que ele se adequar ao sítio ativo da enzima que o prepararia para

sua transformação em produto.

Catálise Covalente: resulta do ataque nucleofílico ou eletrofílico de um radical

do sítio catalítico sobre o substrato, ligando-o covalentemente à enzima e

induzindo a sua transformação em produto. Envolve com frequência a

participação de coenzimas.

Diminuição da entropia: sabe-se se o sistema caminha para a maior entropia.

Deste modo, as enzimas “organizam” os reagentes de modo a conformarem uma

estrutura propícia à reação, consequentemente, a transformação dos produtos

se eleva a um estado de maior entropia, facilitando a reação. Esse mecanismo

está presente juntamente com os descritos anteriores.

9.Que tipo de resíduos químicos foram gerados neste experimento e como

foram tratados ou armazenados. Explique.

Foram gerados resíduos de solução de catecol + H2O2 + H2O + enzima + quinona

correspondente. Os reagentes estavam bastante diluídos e o volume de resíduos

gerados foi em quantidade pequena. Sendo assim, os resíduos foram descartados

em um recipiente específico.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. CHANG, R.,Physical-Chemistry with Applications to Biological Systems.

Macmillan Publishing Co. New York, 1981.

2. TINOCO, I. JR., SAUER, K.,WONG, J. C. -Physical Chemistry - Principles and

Applications in Biological Sciencies Prentice - Hall, London.

3. MOORE, Walter J. Físico-Química. Rio de Janeiro: Ao Livro Técnico e S.A. e

Editora da Universidade de São Paulo, 1968.

Prática CINÉTICA DE REAÇÕES ENZIMÁTICAS

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CAMILA CAROLYNE DE OLIVEIRA SANTOS

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