aplicações enzimáticas

Aplicações Enzimáticas

Maria Alice Zarur Coelho

Priscilla Filomena Fonseca Amaral

Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos

IntroduçãoEnzimas podem ser aplicadas em várias áreas:

• Indústria de curtumes,• Indústria têxtil,• Indústria de papel e celulose,• Produção de detergentes,

• Indústria de alimentos,

• Óleos e gorduras,• Produção de álcool,• Indústria de Cosméticos,• Biossensores,• Em análises,• Em medicina


- Panificação,- Cervejaria,- Sucos- Vinho- Laticínios- Modificação de Proteínas

Introdução


Indústria Consumo em %

Detergentes 40 – 45

Processamento do amido 20 – 25

Laticínios 12 – 15

Cervejarias 2 – 4

Suco de frutas e vinho 3 – 5

Panificação 1 – 2

Têxtil e papel 4 – 6

Couro 1 – 2

Outras 6 – 10

Principais indústrias consumidoras de enzimas:

Produção de detergentes

• Aplicação mais conhecida das enzimas (desde os anos 60)

• Detergentes industriais com enzimas:- Lavagem de roupas em domicílio – segmento mais importante- Lavagem de roupas industriais e institucionais- Lavagem de pratos e talheres em domicílios

• Enzimas em detergentes atuam em condições drásticas de meio reacional- Presença de tensoativos, alcalinizantes, perfumes, pigmentos,...- elevado pH, - elevada temperatura

• No Brasil: - Organon (1968)- Biopresto (Unilever)- Henkel – Viva (1978-1984)- Gessy lever: Omo (1989) – líder de mercado


Produção de detergentes

Tipos de enzimas usadas em detergentes

• Proteases:- Mais utilizadas em detergentes- Removem manchas de ovo, sangue, suor, extratos vegetais,...- Detergentes sem enzimas: ineficiente para remover manchas de ptn- Proteases Alcalinas:

Possuem pH ótimo alcalino e atuam em T elevada (Europa)

- Microrganismo produtor: Bacillus sp. Fermentação submersa- Ex.: savinase, alcalase, subtilisin novo


- Atuação sinergística:Hidrólise limitada: manchas mais acessíveisProteínas agem como cola

Produção de detergentesTipos de enzimas usadas em detergentes

• Lipases:- Lavagem de roupas em T baixa: difícil remoção de óleo e gorduras

- Primeira lipase em detergente: produzida por Humicola lanuginosa

- Engenharia genética: gen introduzido em Aspergillus oryzae

- LIPOLASE (Novo Nordisk) - 1988Remove manchas de batom, frituras, azeite, molhos, etc

TG Ácidos graxos, mono, di- glicerídeos e glicerol

- Estáveis em pH alcalino


lipase


• Lipases:

- LIPOLASE ULTRA (Novo Nordisk) - 1995Desempenho melhor em baixas temperaturas (10ºC, ¼ da [lipolase]

requerida)Engenharia de proteínas:

Lipolase: enzima com 269 aminoácidos; Modificação de um aa próximo ao centro ativoAlteração da força iônica na zona de contato com o lipídeo


Asparagina-

Leucinaneutra

Posição 96: Molécula mais hidrofóbica


• Amilases:

- Remoção de resíduos de alimentos que contém amido- Amido: atua como cola - Produção por: Bacilus licheniformis, B. amyloliquefaciens- Hidrolisam amido transformando em oligômeros de cadeia curta- Resistência a pH alcalino e T elevadas



• Celulases:

- Produzida por Bacillus sp. ou Humicola sp.- pH ótimo = 7; resistente a pH mais elevado- Modificação das fibrilas celulósicas (algodão)

Degradam o tecido das roupas de algodão: remoção das fibrilas de celulose

- Efeitos:Intensificação da corAmaciamentoRemoção de partículas de sujeiras


Produção de detergentesTipos de detergentes industriais

• Detergente em pó:

- Década de 60: Enzima em pó adicionadaProblema: formação de poeira – reações alérgicas

- Aperfeiçoamento das técnicas T-granulado: enzima revestida com substância inerte

altamente resistente a impacto e abrasãonão forma poeira

Tamanho do grânulo: similar às partículas do detergentepara não segregar durante o transporte

Partículas devem se dissolver rapidamente no líquido



• Detergente líquido:

- Mais difícil preservar a estabilidade da enzimaAlta atividade da águapH alcalinoCompostos iônicos desnaturantes

- Europa: concentração 4-10 g/Lcom alvejantelavagem com aquecimento

- EUA e Japão: concentrações mais baixasalvejante separado


Condições favoráveis a autodigestão das proteases

(exceto pH 7-8)


• Detergente para máquinas de lavar louça (automática):

- Formulação: metasilicato, fosfatos e cloro alvejante

- Metassilicato substituído por disilicato (redução do pH)

- Alvejante de cloro e fosfatos abandonados (razão ambiental)

Prejuízo no desempenho da lavagem

Adição de enzimas(remoção de amido e manchas de proteínas)


Produção de detergentesPerformance de Lavagem

• Quantificação do efeito das enzimas: difícil

- Lavagem teste: manchas artificiais (leite, sangue, cacau, etc)

aplicação em tecidos de algodão ou poliester

- EMPA 116: estudo de remoção de proteínaroupa de algodão com leite, sangue e tinta (tinta “colada” pelas ptn´s)Hidrolise da proteína necessária para remoção da tinta


enfraquecimento da cor

indicador da contribuição da enzima

Quantidade de tinta deixada após lavagem

Indústria de Curtumes• Couros crus e peles contêm proteínas e gorduras entre as fibras de colágeno;

• Cabelo- alfa-queratina: estrutura fibrosa

resíduos de cisteína,conformação em alfa-hélice

• Pele- colágeno,- alfa-queratina,- elastina- albumina,- globulina,- glicoproteínas

• Uso de enzima: hidrólise seletiva dos constituintes não-colagenosos da pele


Glicina, alanina, prolina, hidroxiprolina; tríplice hélice

Indústria de Curtumes


Salga

Remolho

Desengraxe

Depilação

Purga

Curtimento

Pele Couro cru

Couro wet-blue

Tripsina

Lipases

Proteases

ProteasesÁguaSurfactantes

CaINa2S

CromoTanino

Indústria Têxtil

• Fibras naturais: algodão, lã, seda;• Fibras sintéticas: polyester, nylon, lycra


Limpeza Fiação

Engomagem Tecelagem

ChamuscagemDesemgomagem

PurgaAlvejamentoTingimento

Fio

Tecido Acabado

FibraMatéria-prima

Costura

Lavagem

Tecido Cru

Roupa Roupa Acabada

Indústria Têxtil

• Limpeza: Remover sujeiras do algodão e tornar as fibras paralelas

- Liberação de fibras celulósicas: destruição da parede secundária (substâncias pécticas)

- Tradicional: soda cáustica sob pressão e temperatura elevada;Problema: segurança e poluição ambiental

- Enzimático: uso de enzimas pectinolíticasBusca por microrganismos produtor de pectinase e com

baixa atividade de celulases Penicilium


Indústria Têxtil



Limpeza Fiação

Engomagem Tecelagem

ChamuscagemDesengomagem


Fio

Tecido Acabado

FibraMatéria-prima

Costura

Lavagem

Tecido Cru

Roupa Roupa Acabada

Indústria Têxtil

• Desengomagem: Remover goma (fécula de mandioca ou goma sintética) aplicada ao tecido antes da tecelagem

- Tradicional: produtos químicos fortes: ácidos, bases ou agentes oxidantes;Problema: segurança e poluição ambiental

- Enzimático: uso de enzimas que hidrolisam amidoNão causam estragos no tecidoMais utilizadas: alfa-amilases bacterianas termotolerantes


Tipo de enzima temperatura de operação

(ºC)

pH inibidores ativadores

Amilase de malte 55-65 4,5-5,5 íons metálicos, alcali, contaminantes do

amido

íons cálcio

Amilase de pâncreas

40-55 6,5-7,0 íons metálicos, ácidos -

Amilase fúngica 50-55 4,5-5,5 íons metálicos, alcali, sequestrantes

íons cálcio

Amilase bacteriana

60-75 5,5-7,0 sequestrantes, surfactantes aniônicos

íons cálcio

Amilase bacteriana

termoestável

85-110 5,0-7,5 surfactantes aniônicos íons cálcio

Indústria Têxtil

• Desengomagem:


Indústria Têxtil



Limpeza Fiação

Engomagem Tecelagem



Fio

Tecido Acabado

FibraMatéria-prima

Costura

Lavagem

Tecido Cru

Roupa Roupa Acabada

Indústria Têxtil

• Alvejamento: Branqueamento do pano

- Tradicional: Hipoclorito de sódio, peróxido de hidrogênio;Problema: resíduo pode interferir no processo de tingimento

- Enzimático: Catalase para decompor o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio.


Indústria Têxtil



Limpeza Fiação

Engomagem Tecelagem



Fio

Tecido Acabado

FibraMatéria-prima

Costura

Lavagem

Tecido Cru

Roupa Roupa Acabada

Indústria Têxtil

• Tingimento:

- Biopolishing: Tratamento enzimático com celulases(em algodão) Confere uma aparência mais regular e lustrosa

Remove o fuzz: filamentos minúsculos da fibra que se projetam para fora da superfície do fio


Indústria Têxtil

• Tingimento:

- Lã: Composta de proteínasFacing up: franzimento da superfície de tecidos de lãTratamento com proteases


Indústria Têxtil

• Acabamento do jeans:

- Tradicionalmente: Feito pela abrasão com pedra-pomes

- Bio-lavagem:Tratamento enzimático com celulasedissolução da tinta azul-índico do brimreduz a quantidade de pedra necessáriamenor dano às roupas e às máquinas

- Celulases usadas: Produzidas por Trichoderma sp. Humicola sp.


Indústrias de Papel e Celulose


• Matéria-prima: madeira

- Celulose Pequenas frações- Hemicelulose + de extrativos- Lignina

Processo de remoção da celulose: desintegração da madeira e formação de suspensão de fibras



Processo Kraft:Cavacos + NaOH + Na2SO4pH = 8 – 11; T = 55-65oC



• Descascamento:

- Remoção das cascas

- Enzimas pectinolíticas: poligalacturonase



Processo Kraft:- Cavacos + NaOH + Na2SO4 T elevada

- Dissolução da lignina

- Liberação das fibras de celulose

- Pasta de celulose marrom, pH = 8 – 11; T = 55-65oC



• Branqueamento de polpa:

- Cloro: mais barato,formação de substâncias cloradas = pressão para redução do uso

- Hemicelulose: polímeros de xilana (polímero de xilose) – inibidor do branqueamento (re-precipita sobre as fibras)

- Tratamento enzimático: Xilanases sobre a polpa KRAFT

- Possibilita:Retirar mais ligninaCelulose mais susceptível aos

branqueadores químicosReduz a necessidade de agentes

químicos

- Xilanase alcalina e termoestável



• Redução do teor de resinas:

- Pitch: resinas orgânicas e seus depósitos(ácidos graxos, resinas ácidas, ésteres de ácidos graxos, graxas e ceras)

- Glóbulos de pitch: perfuração de máquinas, alteração na qualidade do papel, velocidade de produção, etc

- Tratamento enzimático: Lipases

- Possibilita:Reduzir os depósitos de pitchaumento na produtividade e qualidade



• Reciclagem de papel:

- Celulases e hemicelulases: processamento de fibras secundáriasAtuam sobre a superfície das fibras (peeling)

- Destingimento

Remoção da tinta: solução altamente alcalina – escurecimento da celulose

Tratamento enzimático: Celulases alcalinasNão agem sobre a tinta,Agem sobre a celulose que retêm as partículas de

tinta do papel (microfibrilas)

Indústria de Alimentos

Panificação

• Células dos grãos de cereais da farinha contém enzimas amilaseproteases

• Quantidades: nem sempre ideais adição necessária


TrigoFibras, proteFibras, proteíínas, nas, vitaminas e mineraisvitaminas e mineraisCascaCasca

Fonte de enzimasFonte de enzimas

•• AmidoAmido

•• GlGlúútenten• Glutenina: tenacidade e elasticidade

• Gliadina: extensibilidade e viscosidade

Transformado em farinha no processo de moagem

Triticum durum Gluten

Triticum aestivum Amido

GLGLÚÚTENTEN GLIADINAGLIADINA GLUTENINAGLUTENINA



Panificação

Ligação -1,6

Ligação -1,4



Panificação

• O papel das amilases Grânulos de amido

amilose amilopectina 15 a 30% 70-85%

Amilose: polissacarídeo de cadeia linear -500 unidades de glicose (ligações do tipo alfa-1,4); estrutura tridimensional: torções ou desdobramentos

Amilopectina: Ramificações de 20 a 40 unidades de glicose ligadas entre si através de ligações alfa-1,4, ligada à cadeia principal por ligações alfa-1,6;



Panificação

• O papel das amilases

• a-amilase: hidrolise do amido em dextrinas

• ß-amilase: Obtenção de maltose


Panificação

• Fabricação do pão


ÁÁguagua

Farinha de trigoFarinha de trigo

SalSal

AAçúçúcarcar

FermentoFermento

FornoForno

COCO22

Problemas:Problemas:

• a-amilase pão mole demais e aberto

• a-amilase pão “solado”

SoluSoluçção:ão:Adição de a-amilase de origem fúngica ou de malte


Panificação

• Fabricação do pão


ÁÁguagua

Farinha de trigoFarinha de trigo

SalSal

AAçúçúcarcar

FermentoFermento

FornoForno

COCO22

•• Cor da casca do pãoCor da casca do pão

•• Massas refrigeradas e congeladasMassas refrigeradas e congeladas

AmiloglicosidaseAmiloglicosidase

aa--Amilase Amilase

AmiloglicosidaseAmiloglicosidase



Panificação

•• Retardamento do processo Retardamento do processo de envelhecimentode envelhecimento

•• Melhoramento da massaMelhoramento da massa

•• BiscoitosBiscoitos

Exoamilase Exoamilase maltogênica maltogênica bacterianabacteriana

ProteasesProteases

PentosanasePentosanase



Panificação



Cervejaria

MALTEAÇÃO RECEBIMENTODE MALTE

MOAGEM DOMALTE

COZIMENTO DOMALTE

FILTRAÇÃO DOMACERADO

FERVURA DOMOSTO

SEPARAÇÃO DOTRUB

RESFRIAMENTODO MOSTO

FERMENTAÇÃO /MATURAÇÃO

FILTRAÇÃODE CERVEJA

ARMAZENAMENTO / ENVIODE CERVEJA FILTRADA ENVASAMENTO

( -Glucana)

(Amido)Cotilédone

Casca

Endosperma

Radícula

Epicotiledone



Cervejaria• Maltagem:- Maceração: elevação da umidade- Germinação: ponto ótimo radícula da semente = 2/3 do grão

produção enzimática é grande- Secagem: interrupção da germinação sem destruir as enzimas ( - e -amilases)



Cervejaria

Componentes Cevada Malte

Massa do grão (mg) 32 – 36 29 – 33

Umidade (%) 10 – 14 4 – 6

Amido (%) 55 – 60 50 – 55

Açúcares (%) 0,5 – 1,0 8 – 10

Nitrogênio total (%) 1,8 – 2,3 1,8 – 2,3

Nitrogênio solúvel (% Ntot)

10 – 12 35 – 50

Poder diastasico, °%L 50 – 60 100 – 250

-Amilase (unidades de DE produzidas)

Traços 30 – 60

Atividade Proteolítica Traços 15 – 30

Malteação Malte é moído para aquecido e filtrado Mostotornar elementos

constituintes acessíveisà ação enzimática



Cervejaria

Malte: único agente sacarificante permitido na fabricação da cerveja;

Propostas atuais: substituição por enzimas puras ou substituição por cevada(processo de malteação é caro)

Ação das enzimas do malte: a-amilase, ß-amilase e maltase

- a-amilase: tem ação sobre as cadeias da amilopectina nas extremidades não-redutoras dando origem a dextrinas (ligações a-1,6), glicose e maltose

Preparação do material para a ação da ß-amilase- ß-amilase: tem ação sobre as dextrinas, somente nas ligações a-1,4, gerando maltose, e dextrinas menores- maltase: atua sobre a maltose, gerando glicose.Dextrinas: dão “corpo” a cerveja, aroma e sabor



CervejariaUso de enzimas:

- Degradação do amidoEnzimas específicas para as ligações (1-6):

ENDO (1-6) GLUCANASES (pululanases e isoamilases)EXO (1-6) GLUCANASES (exopululanases)Enzimas específicas para as ligações (1-4) e (1-6):Glicoamilases

- Aperfeiçoamento da filtraçãoA filtragem lenta: presença de certos polissacarídeos, principalmente -glucanas e pentosanas, encontrados na cevada e no malte de cevada pobremente modificadoSolução: adição de uma -glucanase à maceração ou no início da fermentação



CervejariaUso de enzimas:

Cerveja Light

Sob condições normais na produção de cerveja, as enzimas naturais do malte não podem hidrolisar todo amido em açúcares fermentáveis. Cerca de 1/3 do amido é convertido em dextrinas não fermentáveis, que são repassadas à cerveja final. As dextrinas são carboidratos, o que significa calorias.

A fim de hidrolisar as dextrinas em glicose, as enzimas também podem ser adicionadas durante a maceração ou fermentação. A glicose é quase completamente transformada em etanol e CO2 pelas leveduras. Se isto for levado em consideração na preparação do mosto, isto é, se o mosto for ajustado para um extrato mais baixo, torna-se possível produzir uma cerveja com teor normal de álcool, mas com 1/3 a menos de calorias.

Esta cerveja com baixo teor de carboidratos é do interesse não somente dos diabéticos, que precisam limitar seu consumo de carboidratos, mas também a de todos os consumidores de cerveja que queiram manter a forma física.



Indústria de Sucos

celulose

hemicelulose

pectina

Lamelamédia

Paredeprimária

Membranaplasmática

Estrutura da parede celular vegetal



Indústria de Sucos

PectinesterasePectinesterase

PoligalacturonasePoligalacturonase

PectinaPectina liaseliase



Indústria de Sucos

•• MaceraMaceraçção e Liquefaão e Liquefaççãoão

•• Digestão das PolpasDigestão das Polpas

PoligalacturonasePoligalacturonase e e CelulasesCelulases

PrensagemPrensagem, , viscosidadeviscosidade, , rendimentorendimento

RetenRetençção parcial suco na polpa ão parcial suco na polpa gelatinizagelatinizaççãoão PectinasesPectinases

HemicelulasesHemicelulasesPresenPresençça de a de arabanaarabana turvaturvaçção no concentradoão no concentrado

Protopectina Pectina



Indústria de Sucos

•• ClarificaClarificaçção dos Sucosão dos SucosFloculaFloculaçção e precipitaão e precipitaçção do ão do complexo materiais suspensos complexo materiais suspensos ––polifenpolifenóóisis FiltraFiltraççãoão

Problema Protopectina e pectina Protopectina e pectina impedem e/ou diminuem a impedem e/ou diminuem a floculafloculaçção e a precipitaão e a precipitaçção ão do complexo do complexo

SoluSoluçção:ão:

PectinasesPectinases Gelatina Gelatina BentonitaBentonita ou Terra Diatomou Terra Diatomááceacea

Características adequadas:

• Baixa afinidade imunológica, com afinidade dirigida ao problema em questão.

• Serem provenientes de organismos não patogênicos, que contenhampouca ou nenhuma toxina.

• Alta atividade e estabilidade em pH fisiológico, com retenção da atividade e estabilidade em soro animal.

Medicamentos e análises clínicas


Características adequadas:

• Alta afinidade pelo substrato (baixo KM)

• Pouca inibição pelos produtos ou constituintes normais encontrados em fluidos corporais.

• Não tenham necessidade de cofatores exógenos

• Terem efetiva irreversibilidade da reação enzimática sob condições fisiológicas





Enzimas em medicamentos

Enzima Fonte Utilização

Amilase

Asparaginase

Pâncreas bovino ou suíno

Fúngica

Microbiana

Auxiliar digestivo

Leucemia

Bromelina

Celulase

Abacaxi

Fúngica

Auxiliar digestivo

Auxiliar digestivo

Debridamento de feridas

Papaína

Quimiotripsina

Hialuronidase

Lisozima

Mamão

Mamão

Testículos de bovinos

Clara de ovo

Hérnia de disco

Agente dispersante

Infecções

Pancreatina Pâncreas bovino ou suíno Insuficiência pancreática

Uroquinase Urina humana

Cultura de células

Agente fibrinolítico



Enzimas em medicamentos

Tratamento de leucemia: Degradação da L-asparagina (no plasma: essencial para sobrevida das células tumorais) Uso de L-asparaginase

Tratamento de tromboembolias (inclusive infarto do miocardio)Streptoquinase e uroquinase: dissolução de coágulos por ativação da

fibrinolisina

Condições inflamatórias: tripsina e quimotripsina



Enzimas utilizadas em diagnósticos

Enzima Fonte Substrato Medido

Álcool desidrogenase

Levedura Etanol, álcoois e aldeídos

Colesterol oxidase Fúngica Colesterol

Esterase Fígado suíno Triglicerídeos

Glicose 6-fosfato desidrogenase

Levedura Glicose

Glicose oxidase Fúngica Glicose

Glicerol desidrogenase

Bacteriana Glicerol

Hexoquinase Levedura ATP, glicose

Nitrato redutase Fúngica Nitrato

Ureato oxidase Bacteriana Ureatos

Urease Feijão-de-porco (Jack bean) Uréia

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