O bago da uva: uma fábrica bioquímica complexa

Responsáveis:

•Ana Cunha

•Hernâni Gerós

•Richard Gonçalves

•António Teixeira

Alunos:

•Ana Paulina

•Inês Coturela

•Rodrigo Silva

• Preparar extractos celulares de bagos de uvas verdes e maduras e dosear teor de proteína

• Determinar a actividade enzimática da MDH

• Dosear açúcares e ácidos orgânicos por HPLC

• Realizar curvas de resposta da fotossíntese à luz por fluorometria de pulso de amplitude modelada (PAM)

• Observar cortes histológicos por microscopia de epifluorescência

• Explicar algumas modificações bioquímicas e fisiológicas que ocorrem durante o desenvolvimento do bago

Objectivos

Determinação da [proteínas]

Medição de actividades enzimáticas

N2(l)

Determinação da concentração de açúcares e ácidos pelo HPLC

Preparação de extractos celulares

Actividade da malato desidrogenase

Tampão Tris-HCl, pH 8

NADH

Extracto celular

Oxaloacetato

Cuvete

Actividade da malato desidrogenase

• Doseamento de [proteína]pelo método de Bradford

[proteína]bago verde = 3,2 mg/ml

l = 595 nm

Actividade da malato desidrogenase

• Espectros de absorção do NADH e do NAD+

Actividade da malato desidrogenase

vi

pH = 8,0[oxaloacetato] = 10 mM

Actividade da malato desidrogenase• Velocidade inicial da reacção

• Gráfico de Michaelis-Menten

Actividade da malato desidrogenase

Km = 118,2 mM oxaloacetatoVmax =21 µmole de NAD+/min/mg de proteína

Actividade da malato desidrogenase• Estimativa de parâmetros cinéticos por modelo matemático

Série de padrões de concentrações conhecidas

bago verde

bago maduro

Doseamento de açúcares e ácidos por HPLC

• Cromatogramas de padrões e extractos

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

verdes maduras

Teo

r (m

g/g

pes

o f

resc

o)

Malato

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

S G F S G F

Teo

r (m

g/g

pes

o f

resc

o)

verdes maduras

Açúcares

Doseamento de açúcares e ácidos por HPLC

Bago verde Folhas (madura/ senescente)

0

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800 1000

ETR

PAR

0

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800 1000

ETR

PAR

Órgão a (eficiência PSII) ETRr máx. (capacidade PSII)

Bago verde grande 0,593 83,7

Bago verde pequeno 0,538 73,0

Folha madura 0,726 100,1

Folha senescente 0,618 61,4

Curvas de resposta da fotossíntese à luz

Fluorometria de Pulso Amplitude Modulado (PAM)

Microscopia

Microscopia

Microscopia

1. Foram obtidos extractos celulares de uvas verdes e de uvas maduras

2. No bago verde a concentração de ácido málico é muito elevado, sendo

residual no bago maduro

3. No bago maduro a concentração de açúcares é muito elevada, sendo

mínima no bago verde

4. Os principais açúcares acumulados no bago maduro são os

monossacarídeos glucose e frutose

5. A actividade da malato desidrogenase é compatível com a acumulação

do malato medida no bago verde

6. Tal como as folhas, o bago verde é fotossinteticamente activo

7. Folhas mais velhas têm actividade fotossintética inferior à dos bagos

verdes

8. A microscopia de fluorescência revelou a presença de clorofila

essencialmente numa zona externa do bago assim como nos tecidos

que envolvem a semente

9. O bago da uva é uma fábrica bioquímica complexa dado que

produz/acumula/metaboliza uma ampla variedade de compostos

Conclusões

Material e Equipamento

Bancada de Trabalho

Centrifuga

Pipetas automáticas

Medidor de pHBalança de precisão

Microscópio de fluorescência