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Profª Eleonora – Slide de aula

CinCinéética Enzimtica Enzimááticatica


Cinética das Reações Bioquímicas

As células vivas dos organismos heterotróficos e dos organismos autotróficos (na ausência de luz) obtêm a energia de que necessitam a partir da oxidação dos poliosídios de reserva a CO2 e água.

Esse conjunto de reações, assim como, as reações de síntese das macromoléculas, só épossível devido à intervenção dos catalisadores bioquímicos � as enzimasas enzimas.Todas as enzimas são proteínas globulares e catalisadores eficientes.

Catalisadores� Energia de ativação necessária para iniciar um processo químico pode ser fornecida

pela elevação da temperatura que aumente a agitação molecular.

� Em Bioquímica, a temperatura dos sistemas não pode ultrapassar os valorescompatíveis com a vida dos organismos (aquecimento ⇒ desnaturação das proteínas).

� Catalisadores bioquímicos ⇒ função de baixar a energia de ativação necessária àreação e permitir que a reação ocorra em velocidade muito mais elevada.


Centro ativo ou sítio ativo� É constituído pelo conjunto de aminoácidos que entram em contato com o substrato.

� Compreende o local de fixação: que se combina com o substrato por ligações fracas; e o centro catalítico: que atua sobre o substrato levando-o a sofrer a reação química.

� A conformação do local e fixação se modifica em conseqüência da ligação ao substrato ⇒ substrato induz a alteração da conformação.

� Nas enzimas que atuam através de um cofator (metal; grupo prostético ou coenzima), essa estrutura se encontra ligada na vizinhança do centro catalítico.


� A determinação experimental da velocidade da reação é feita recolhendo do meio reacional, a intervalos regulares de tempo, alíquotas da solução.

Velocidade da Reação enzimática

A velocidade de uma reação enzimática é, em geral, obtida pela medida da quantidade de produto (ou produtos) formado (s) por unidade de tempo.

S = substrato; E = enzima; P = produto

A velocidade de reação num tempo (t) é: td

[ ]Pdv =

EPES ++

A velocidade pode ser medida, também, a partir do decréscimo da concentração de substrato:

[ ]Sdtd

v =


Representação gráfica:

� Até certo ponto da reação, a variação é linear.

� É vantajoso medir a velocidade no início da reação, quando pouco substrato foi transformado e a velocidade inversa é desprezível.

� A inclinação é então máxima, o que permite ter a velocidade inicial da reação (v0).

vo = tg ααααo velocidade inicial de uma reaçãoenzimática

velocidade num instante tt 11= tg αααα1 v1

Tempot 1

Qua

ntidad

e de

pr

odut

o fo

rmad

o

αο

α1


A velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima

� A velocidade de formação de produto (dp/dt) é constante para E1 e E2 até o tempo t1

� Na determinação de produto formado em intervalo de tempo mais longo, a resposta não será linear em todas as faixas de [E]

Velocidade de uma reação enzimática em presença de quantidades crescentes de enzima(E2 = 2E1; E3 = 3E1; etc..)

t2t1 Tempo

E3E2

E13 x2 x1 x

[P]

E4

4 x

Variação linear de velocidade inicial de uma reação enzimática com a concentração de enzima

[E]

v

E4

E3

E2

E1

=

1t

[ ]Pv


Fatores que Influenciam a Atividade Enzimática

Vários fatores influenciam a atividade de uma enzima. Os mais importantes são a temperatura, pH, concentração de substrato e a presença ou ausência de inibidores.

� Temperatura

A velocidade da maioria das reações químicas aumenta quando a temperatura aumenta. Moléculas se movem mais lentamente a baixas temperaturas do que a altas temperaturas e, portanto, muitas podem não ter energia suficiente para promover a reação química.

Para as reações enzimáticas, entretanto, elevações além de certa temperatura reduz drasticamente a velocidade de reação. A temperatura ótima para a maioria das enzimas se situa entre 35 e 40ºC.

A redução da velocidade de reação acima da temperatura ótima é devida à desnaturação das enzimas, ou seja, a perda de sua estrutura tridimensional característica. A desnaturação de uma proteína envolve o rompimento de ligações de hidrogênio e outras ligações não covalentes.

Velocida

de da re

ação

Temperatura (ºC)

0 10 20 30 40 50 60


� pH

A maioria das enzimas tem um pH ótimo no qual sua atividade é máxima. Acima ou abaixo deste valor de pH a atividade enzimática, e portanto a velocidade de reação, diminui.

Quando a concentração de H+ (pH) no meio é drasticamente alterada, a estrutura tridimensional da proteína também é alterada. Mudanças extremas na concentração de ácidos (ou bases) modificam a estrutura tridimensional de proteínas porque o H+ (ou OH-) compete com o hidrogênio nas pontes de hidrogênio e ligações iônicas presentes na estrutura da enzima, resultando na sua desnaturação.

pH4 6 8 10

Ativida

deEn

zimát

ica


� Concentração de Substrato

Existe uma taxa máxima na qual certa quantidade de enzima pode catalisar uma reação específica. Apenas quando a concentração de substrato é extremamente alta, esta taxa máxima pode ser alcançada.

Sob condições de alta concentração de substrato, a enzima está em saturação, isto é, seus sítios ativos estão todos ocupados por moléculas de substrato ou produto. Nesta condição, um aumento na concentração de substrato não afetará a taxa de reação porque todos os sítios ativos já estarão sendo utilizados. Em condições celulares normais, as enzimas não estão saturadas com o substrato. Em um determinado tempo, algumas das moléculas de enzima poderão estar inoperantes por falta de substrato, assim, a velocidade de reação éinfluenciada pela concentração de substrato.

� Inibidores

Uma forma efetiva de controlar o crescimento de um microrganismo, por exemplo, écontrolar suas enzimas.

Qualquer substância que reduza a velocidade de uma reação enzimática pode ser considerada como inibidor.


Cinética EnzimáticaNa reação enzimática se forma um complexo transitório entre enzima e substrato.

O estudo das reações enzimáticas se baseia em medidas de velocidade da reação catalisada.

Velocidade de uma reação ⇒ quantidade de produto formado em um tempo determinado.

Velocidade inicial de uma reação ⇒ medida em tempos suficientemente curtos para que no máximo 5% do substrato sejam transformados em produto.

Em uma reação enzimática típica, a 1ª fase ocorre a velocidades muito maiores do que a 2ª fase. Equações de velocidade para estas fases são:

[ ][ ]ESkv

[ ]SEkv

33

11

==

PEES k +→ 3

k2

ESSEk

+1

PEESSE kk

+→+ 31

k 2

A reação catalisada enzimaticamente se processa em duas etapas:

� A enzima se liga reversivelmente ao substrato formando um complexo enzima-substrato (ES)

� O produto é liberado e a enzima volta à forma livre podendo, então, se ligar a outra molécula de substrato.


� A medida real da velocidade da reação, ou seja, a medida da velocidade de formação do produto é igual a v3, que é a etapa mais lenta e limitante do processo.

� Nas reações enzimáticas, a concentração de enzima é, normalmente, muito menor que a concentração de substrato.Um equilíbrio entre E, S e ES (com concentrações definidas e constantes de cada espécie) se estabelece muito rapidamente.

� Tendo ocorrido a formação de ES, se inicia a segunda parte da reação enzimática, aquela que efetivamente forma o produto, com uma velocidade proporcional à concentração de ES.

� O fato de ES estar sendo consumido na formação do produto não provoca diminuição da sua concentração, uma vez que há excesso de substrato para se combinar com a enzima liberada quando se forma o produto.

� Esta situação se mantém por algum tempo (tempo inicial): contínua formação do produto e concentrações estáveis de ES e S. A pequena e contínua diminuição da concentração de S não é significativa, face ao seu grande excesso.

PEESSEk

k

++ k31

2


� Existirá uma determinada concentração de substrato que provocará a formação de uma concentração de ES igual à metade da máxima possível. Nestas condições, a velocidade será, naturalmente, a metade da maior velocidade possível.

Esta concentração definida de substrato é igual à Constante de Michaelis-Menten ou Km.

a – cinética de 1ª ordem (velocidade proporcional à concentração de substrato)b – cinética de ordem zero (velocidade independente da concentração de substrato)

� À medida que se aumenta a concentração inicial do substrato, as velocidades de formação do produto se tornarão cada vez maiores. No equilíbrio da 1ª etapa existirá cada vez mais complexo ES. Nestas condições haverá a maior concentração possível do complexo ES; a reação será processada na máxima velocidade possível.

Km [S]

v

Vmax

½ Vmax

a

b


Variação de velocidade da reação com a concentração de substrato

Teoria de Michaelis-Menten (com um único substrato)

E = Enzima S = Substrato ES = Complexo enzima-substrato P = Produto

� Propostas

� A enzima e o substrato reagem rapidamente para formar o complexo enzima-substrato (ES)

� A fase mais lenta é a formação de produto (P)

� Há excesso de substrato (S)

� Todas as determinações de produto (P) são feitas no início da reação quando a velocidade de formação do complexo enzima-substrato (ES) a partir de enzima (E) + produto (P) é muito pequena e pode ser desprezada ⇒ velocidades iniciais

PEESSEk

k

k

k

++3

4

1

2


� Dedução

[ ] [ ] [ ][ ]

[ ]t

t

EkV

ESkv

ESEE

3max

3

==

+=

Qual a velocidade de formação de [ES] ? ⇒ [ ][ ]SEk1

Qual a velocidade de decomposição de [ES] ? ⇒ [ ] [ ]ESkESk 32 +

Variação de [ES] com o tempo: [ ] [ ][ ] [ ] [ ]ESkESkSEktd

ESd321 −−=

Como no estado estacionário [ES] não varia ⇒ [ ]0=

tdESd

[ ][ ] ( )[ ][ ][ ] [ ]

[ ][ ] [ ]ESKmSE

ESk

kkSE

ESkkSEk

=

+=

+=

1

32

321

KmKm = Constante de MichaelisConstante de Michaelis ou Constante de dissociação do complexo ES (Ks)

32

1kkk + = Km

PEESSE ++k 3

k 1

k 2


É muito difícil quantificar [ES], porém, se sabe que: [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]tt EESEESEE +−=⇒+=

Substituindo em : [ ][ ] [ ]ESKmSE =

[ ] [ ] [ ]( ) [ ][ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] vS

KmV

ESkESkS

KmEk

ESS

KmESE

ESKmESES

t

t

t

+=

+=

=−

=−

1max

333

k× 3

[ ][ ]SV

vSKm +

.= max Equação de Michaelis-Menten

v = velocidade observada na reação quando a concentração de substrato é [S]Km = Constante de Michaelis-MentenVmax = velocidade máxima da reação. Ocorre quando o substrato está presente em

concentrações de saturação.

� A equação de Michaelis e Menten permite, após a determinação experimental das variáveis v em função de [S], obter o valor de Vmax e calcular Km.Em geral, os valores de Km estão compreendidos entre 10-2 e 10-8 M. Atribui-se a Km unidades de concentração.


a

b

cVmax

[S]

v

Km

½ Vmax

Curva de Michaelis-Mentem� Variação da velocidade de reação em função da concentração do substrato

Equação de Michaelis-Mentem:

[ ][ ]SV

vSKm +

.= max

Analisando a curva:

b. Quando v = ½ Vmax][

][2][

SKm

SSKm

==+ � Km tem dimensões de

concentração][

][

2

1 maxmax

SKm

SVV

+⋅=

c. Quando [S] >> Km][][max

SKmSV

v+⋅=

maxVv =

� negligenciável� não depende da [S]

� Ordem zero

][

][max

SKm

SVv

+⋅= ⋅ ][S

KmmaxVv ⋅=

� desprezado

� 1ª ordema. Quando [S] << Km


Substrato 1

Substrato 2

Vmax

[S]

v

½ Vmax

Km1 Km2

Por que determinar Km ?

� Km estabelece o valor aproximado para o nível de substrato intracelular.[S]intracelular << Km ⇒ v seria muito sensível a variações de S (1ª ordem) e o poder catalítico da enzima seria desperdiçado, pois v << Vmax.[S]intracelular >> Km ⇒ não há sentido fisiológico pois v não pode exceder Vmax. Quando [S] >> Km; v se torna insensível a variações de S.

� Km é específico para uma dada enzima.Serve de meio de comparação entre enzimas extraídas de diferentes fontes, mas que catalisam a mesma reação.Pode-se determinar se duas enzimas são idênticas ou se são proteínas diferentes que catalisam a mesma reação.

� Conhecendo-se o valor de Km pode-se determinar Vmaxque é função da [E]totalUtilizando [S] >> Km determina-se Vmax.

� Km indica a adequacidade relativa de substratos a uma enzima.Quando mais baixo o valor de Km maior a afinidade do substrato com a enzima.

� Variação no valor de Km induzida por um ligante é uma maneira de regular a atividade de uma enzima. Se Km determinada “in vitro” for diferente da determinada em condições fisiológicas, isto pode indicar a falta de um efetor. Vários efetores podem ser testados para a identificação de quais atuam como inibidores ou ativadores.


Método gráfico para determinação das constantes cinéticas

Em virtude da curva v versus [S] ser uma hipérbole é muito difícil determinar Vmax com precisão e, portanto, a [S] que fornece ½ Vmax ou o Km.

Para facilitar a determinação das constantes cinéticas, os dados são lançados em gráfico utilizando um dos métodos gráficos disponíveis.

Gráfico dos recíprocos de Lineweaver-Burk:

1[

]1S

versusv

Rearranjo da equação de Michaelis-Menten numa forma linear � baxy +=

][

][

max S

SKm

V

v +=Invertendo:

Multiplicando os dois termos: ][

][1

max SV

SKm

v ⋅

+=

Separando os termos: ][

][1

maxmax SV

S

V

Km

v ⋅+=

][

][

maxSKm

S

V

v

+=

�][

][

SKm

SmaxV

v+⋅=


Michaelis-Menten

[S]

v

Vmax

½ Vmax

Km

][

][

SKm

SmaxV

v+⋅=

Onde: a = inclinação da retab = interseção da reta em y

1/[S]

1/Vmax

-1/Km

1/v

tg = Km/Vmax

Lineweaver-Burk

maxmax

1

][

11

VSV

Km

v+

×=


Questão de cinética enzimática

Os seguintes dados foram obtidos para a reação enzimática de transformação de um substrato (S) em produto (P):

a) Calcule Vmax e Km.b) Qual seria v com [S] = 2,5 x 10-5M e com [S] = 5,0 x 10-5M?c) Qual seria a v com [S] = 5,0 x 10-5M, se a concentração de enzima fosse o dobro?d) A v dada na tabela a lado foi determinada pela medida da concentração de produto que se acumulou por um período de 10 minutos. Veja se v representa uma velocidade inicial verdadeira.

75,0074,9060,0056,2515,00

V (nmoles x litro-1x min-1)

1,00 x 10-2

1,00 x 10-3

1,00 x 10-4

7,50 x 10-5

6,25 x 10-6

[S] (M)


a) v se torna insensível a mudanças da [S] acima de 10-3M. Portanto, na faixa de [S] de 10-3 a 10-2, v deve ser próximo a Vmax

Para calcular Km ⇒ escolha qualquer valor de v e a correspondente [S]

1max

min75 −1− ××= litronmolesV

Resposta da questão

Km4

1025,060

1015 4−−

×=×

= ∴Km 1060601075 4−4− ×+=×

4−

Km 410

10

75

60−+

=∴[ ]SKm

[ ]SV

v

max +=

MKm 105,2 5−×=

∴max5,0= Vve= Km105,2 5−×= M[ ]Sb) min 1−××= 1−litro5,37 nmolesv

∴( ) ( )

5,7

755=v5,7

510575

5−=( )5105 −×+( )5105,2 −×

×=v100,5 5−×= M[ ]S 50 min 1−××= 1−litronmolesv


et

[ ]Ek[ ]SKm

[ ]Sv

3+=∴

t[ ]EkV

3max=

[ ]SKm

[ ]S

V

v

max+

=c)

v é diretamente proporcional à concentração de enzima, para todas as concentrações de substrato. Portanto, dobrando-se [E]t para a [S] = 5 x 10-5M ⇒ v dobra

∴ min100 1−1− ××= litronmolesv

d) Vamos utilizar os valores mais baixos de [S].

∴ 1150min10 −×⇒ litronmolesEm1 min15 1−− ××= litronmolesve1025,6 6−×= M[ ]S

ou %4,2024,0==1025,6

10150,0

×

×

6−

6−

M ( )litropresententeoriginalmeSde /1025,6 6× −

M ( utilizadoSde )litro/10150× 9−

SubstratodeutilizadosForam %4,2∴

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